departamento de nutricion y bromatología ii
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DEPARTAMENTO DE NUTRICION Y BROMATOLOGíA II:BROMATOLOGíA
«INFLUENCIA DEL TRATAMIENTO TERMICO EN LA FIBRA ALIMENTARIAY AZUCARES SOLUBLES DE PRODUCTOSVEGETALES»
Tesis Doctoralque presenta
Dña María DoloresRodríguezSevilla
paraoptaral gradode Doctor en Farmacia.
DIRECTORAS
Dña.Araceli RedondoCLICIICaDña.María JoséVillanuevaSuárez
ProfesorasTitulares
UNIVERSIDAD COMPLUTENSEDE MADRID
FACULTAD DE FARMACIA
MADRID, 1993
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRIDFACULTAD DE FARMACIA
DEPARTAMENTO DE NUTRIC~0N Y BROMATOLOGIA ‘1Bromatología
MARIA ESPERANZA TORIJA ISASA, CATEDRATICAY DIRECTORADEL DEPARTAMENTODENUTRICIONY BROMATOLOGíA II: BROMATOLOGíA DE LAFACULTAD DE FARMACIA DE LA UNIVERSIDADCOMPLUTENSEDE MADRID.
CERTIFICA: Queel presentetrabajotitulado“Influencia deltratamiento térmico en la flbra alimentaria y azúcaressolubles de productos vegetales»se ha realizado en esteDepartamentobajo la dirección de la Dra. Dña. AraceliRedondoCuencay Dra.Dña.MaríaJoséVillanuevaSuárezy Constituye la memoria que presentala LicenciadaDña.María Dolores RodríguezSevilla para optar al Grado deDoctor en Farmacia
Y paraque constea los efectosoportunosfirmo el presentecertificadoen Madrid aveintisietede septiembrede mil novecientosnoventay tres.
ÉZZAst
UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRIDFACULTAD DE FARMACIA
DEPARTAMENTO DE NUTRICION Y BROMATOLOGíA II
Bromatología
ARACELI REDONDO CUENCA Y MARIA JOSEVILLANUEVA SUAREZ, PROFESORASTITULARESDEL DEPARTAMENTO DE NUTRICION YBROMATOLOGíA II: BROMATOLOGIA DE LAFACULTAD DE FARMACIA DE LA UNIVERSIDADCOMPLUTENSEDE MADRID.
CERTIFICAN: Queel presentetrabajo titulado “Influenciadel tratamientotérmicoen la fibra alimentariay azúcaressolubles de productos vegetales»se ha realizado en esteDepartamentobajo nuestradireccióny constituyela memoriaque presentala LicenciadaDña. María DoloresRodríguezSevilla paraoptaral Gradode Doctor en Farmacia.
Y paraqueconstea los efectosoportunosfirmamosel presentecertificadoen Madrida veintisietede septiembrede mil novecientosnoventay tres.
Deseoexpresarmi agradecimiento:
— A las Dras D~ Araceli RedondoCuencay D~ María JoséVillanuevaSuárezpor sudirecciónque ha contribuidode forma muy significativaa mi formación científica,así comopor su colaboracióny ayudaen todo momento.
— A laDra D~ MaríaEsperanzaTorija Isasa,Catedráticay Directoradel I)epartamentode Nutrición y BromatologíaII: Bromatología,por su interésy valiososconsejos.
— A la Dra DR María DoloresSacoSierra, ProfesoraTitular de BiologíaVegetal, porsu colaboracióny asesoramientoen el estudiomicroscópico.
— Al Dr. W.J. Klopper, director del CIVO-INO Food Analysis Institutey al doctorP.Slump director del General Food Analysis Departmentdel CIVO-TNO, Zeist(Holanda)poraceptarmi estanciaen su departamento.Al Dr. K. D. Bos y a M.C.E.Wolters por la dirección del trabajo que realicéen dicho centroasí como por suhospitalidady consejos.
— A D. JorgeZapico por su asesoramientoen el estudioestadístico
— A D. David Blanco y D. José Antonio Budia por su colaboración en lainformatizaciónde estamemoria.
— A D. JoséManuel de Prádenaporsu colaboracióna lo largo del desarrollode estatesis.
— A todos mis compañerosdel departamentoque de algunamanerahan contribuidoalquehacerdiario.
— Al Ministerio de Educacióny Cienciapor la concesiónde una BecaparaFormaciónde Personal Investigador así como por la Ayuda para estanciasbreves en elextranjero.
A mispadresy a Arturo,a Mercedesy a JuanAngelIII,a Amadeoy a mi hijo Amadeo.
INDICE
página
1 PARTE GENERAL
1. INTRODUCCION
2. MATERIALES VEGETALES ESTUDIADOS 4
2.1. Zanahoria 4
2.1.1. Característicasmorfológicasde la planta 4
2.1.2. Variedades 5
2.1.3. Cultivo 6
2.1.4. Operacionesposteosecha 8
2.1.5. Produccióny consumo 9
2.2. Remolachade mesa 10
2.2.1. Característicasmorfológicasde la planta 10
2.2.2. Variedades 11
2.2.3. Cultivo 11
2.2.4. Operacionespostcosecha 12
2.2.5. Produccióny consumo 13
2.3. Nabo 13
2.3. 1. Característicasmorfológicasde la planta 13
2.3.2. Variedades 14
2.3.3. Cultivo 14
2.3.4. Operacionespostcosecha 14
2.3.5. Produccióny consumo 15
2.4. Aspectoshistológicosde la raíz 15
2.4.1. Estructuraprimaria 16
2.4.2. Estructurasecundaria 22
2.4.3. Estructurade las raícesde almacenamiento 24
2.4.3.1. Zanahoria 25
2.4.3.2.Remolacha 27
2.4.3.3.Nabo 30
3. Estudiode la paredcelular vegetal 32
3.1. Característicasgenerales 32
1
3.2. Ontogenia 32
3.3. Composiciónquímicade la paredcelular 36
3.3.1. Polisacáridosestucturales 36
3.3.1.1. Celulosa 36
3.3.1.2. Hemicelulosas 39
3.3.1.3. Sustancias pécticas 40
3.3.2. Glicoproteinas 45
3.3.2. 1. Glicoproteinas estructurales 45
3.3.2.2. Glicoproteinas enzimáticas 47
3.3.3. Otros componentes asociados 47
3.3.3.1. Lignina 47
3.3.3.2. Cutina. Suberina.Ceras 48
3.3.3.3. Taninos 50
3.3.3.4. Sales minerales 50
3.4. Biosíntesis de los principales componentes 50
3.4.1. Biosíntesis de los polisacáridos de la pared celular 51
3.4.1.1. Síntesisde precursores.Polimerización 51
3.4.1.2. Biosíntesisde celulosa 56
3.4.1.3. Biosíntesisde hemicelulosas 57
3.4.1.4. Bisíntesisde pectinas 57
3.4.2. Biosíntesisde glicoproteinas 59
3.4.3. Biosíntesisde lignina 60
3.5. Estructurade la paredcelular 60
3.5.1. Paredprimaria 60
3.5.1.1. Paredprimaria de plantasdicotiledóneas 62
3.5.1.2.Paredprimaria de plantasmonocotiledóneas 68
3.5.2. Paredsecundaria 70
4. Evolucióndel conceptode fibra alimentaria 71
4.1. Investigacionespreliminares 71
4.2. Estudiosepidemiológicosy primerasdefiniciones 73
4.3. Nuevasdefinicionesy discusiónsobrelos componentes 74
5. Efectosfisiológicos de la fibra alimentaria: investigacionesactuales 78
II
5.1. Aspectos generales 78
5.2. Efectosfisiológicos más importantes 84
5.2.1. Retardodel vaciamientogástrico 84
5.2.2. Descensode la absorciónde nutrientes 84
5.2.3. Descensodel colesterolplasmático 85
5.2.4. Aumentodel pesode las heces 86
6. Métodosanalíticosparala determinaciónde fibra alimentaria 89
6. 1. Métodosparala determinaciónde fibra bruta 89
6.2. Métodos detergentes 90
6.3. Métodosenzimático-gravimétricos 94
6.4. Métodosde fraccionamiento 103
6.4.1. Método de Soutligate 103
6.4.2. Otros métodosde fraccionamiento 104
6.5. Métodoscromatográficos 104
6.5.1. Cromatografíade gas-líquido:GLC 105
6.5.2. Cromatografíalíquida de alta eficacia: HPLC 115
‘7. Influenciade los tratamientostérmicossobrela fibra alimentaria 118
7.1. Modificacionescuantitativas 119
7.2. Modificacionescualitativas 124
II PARTE EXPERIMENTAL
1. Diseñoexperimental 128
1.1. Planteamiento 128
1.2. Preparaciónde las muestras 129
2. Métodosanalíticos 131
2.1. Humedad 131
2.2. Fibra alimentaria 133
2.2.1. Métodosgravimétricos 133
2.2.1.1. Métodosdetergentes 133
2.2.1.2. Método enzimático-gravimétrico:métodode Asp 134
2.2.2. Métodoscromatográficos 138
Hl
2.2.3. Métodoespectrofotométrico:determinaciónde sustancias
pécticas 152
2.3. Azticaressolubles 156
2.3.1. CromatografíaLíquida de Alta Eficacia (HPLC) 156
2.3.2. Espectrofotometríavisible 157
2.4. Estudiohistológicoy citológico por microscopia 161
2.4.1. Preparaciónde las muestrasparasu observacióndirecta
al microscopio 161
2.4.2. Preparaciónde las muestraspara inclusión en parafina 161
2.4.3. Microtomía: realizacióny recogidade los cortes 164
2.4.4. Desparafinado,hidratacióny montajede las preparaciones 165
2.4.5. Tinciones utilizadas 166
3. Estudiode los métodosde análisis 167
3.1. Estudiode los métodosde análisis de fibra alimentaria 167
3. 1. 1. Ensayode los métodosgravimétricos 167
3.1.1.1. Ensayode precisión 167
3.1.2. Ensayosde los métodoscromatográficos 169
3.1.2.1. Análisis de fibra alimentariapor Cromatografía
Líquida de Alta Eficacia (HPLC) 169
3.1.2.2. Análisis de fibra alimentariapor Cromatografía
de Gases(GLC) 180
3.1.2.3. Resumencomparativode los ensayosrealizados
a los métodoscromatográficos 185
3.1.3. Métodosespectrofotométricos 186
3.1.3.1.Extracciónde sustanciaspécticas 186
3.1.3.2. Cuantificaciónde sustanciaspécticaspor el
métododel 3,5-dimetilfenol 186
3.2. Estudiodel métodode análisis de azúcaressolubles 191
3.2.1. CromatografíaLíquida de Alta Eficacia (HPLC) 191
3.2.2. Espectrofotometríavisible: métododel ferricianuro potásico.... 194
Apéndicede reactivos 197
IV
III RESULTADOS Y DISCUSION
1. Resultados
1.1. Tablas
1.2. Gráficos
1.3. Estudio estadístico
2. Discusiónde los resultados
2.1. Estudiocomparativode los métodosde análisisempleados
2.1.1. Estudiode los resultadosobtenidosparala fibra alimentaria
2.1.1.1. Métodosdetergentes
2.1.1.2. Método enzimático-gravimétricode Asp
2.1.1.3. Método cromatográfico(HPLC)
2.1.1.4. Método espectrofotométricopara sustanciaspécticas:
3,5-dimetilfenol
2.1.1.5. Estudiode los valoresde fibra total
2.1.2. Estudiode los resultadosobtenidosparaazúcaressolubles
2.1.2.1. Método cromatográfico(HPLC)
2.1.2.2. Método espectrofotométrico:ferricianuropotásico
2.1.2.3. Comparaciónde los resultadosobtenidospara
azúcaressolublespor el métodode HPLC y porel
métododel ferricianuropotásico
los resultadosobtenidosen las hortalizasfrescas2.2. Comparaciónde
y en las procesadas
2.2.1. Expresiónde los resultados
2.2.1.1. Cálculo del factor de corrección
2.2.2. Comparaciónde los valoresde humedadobtenidosen fresco
y en procesado
2.2.3. Comparaciónde los valoresde fibra alimentariaen las muestras
frescasy en las procesadasobtenidospor diferentesmétodos
2.2.3.1. Métodosdetergentes
2.2.3.2. Método enzimático-gravimétricode Asp
2.2.3.3. Método crornatográfico(HPLC)
199
199
202
203
320
320
320
320
325
332
350
351
354
354
359
360
361
361
362
364
365
366
370
373
y
2.2.3.4.Método espectrofotométricoparasustanciaspécticas:
3,5-dimetilfenol 376
2.2.3.5. Comparaciónde los valoresde fibra alimentariatotal .. 378
2.2.4. Estudiodel contenidoen azúcaressolublesen las hortalizas
frescasy procesadas 383
2.2.4.1. Método cromatográfico(HPLC) 383
2.2.4.2. Método espectrofotométricodel ferricianuro
potasico 385
2.2.4.3. Estudiode la distribución de azúcaressolublesy
monosacáridosque forman la fibra alimentaria 386
2.3. Discusiónde los resuladosobtenidospor microscopiaóptica 387
2.3.1. Generalidades 387
2.3.2. Celulosay hemicelulosas 388
2.3.3. Sustanciaspécticas 389
2.3.4. Lignina 389
IV CONCLUSIONES 402
y BIBLIOGRAFíA 407
VI
1 PARTE GENERAL
1. INTRODUCCION
La fibra alimentariaha suscitado,desde haceaños, un interés progresivodentro de la
comunidadcientífica internacional a raíz de los estudiosepidemiológicosque establecieron
unarelaciónentrela carenciade estecomponenteen la dietay la mayorincidenciade ciertas
enfermedadesy transtornosfisiológicos característicosde las sociedadesdesarrolladas.
No esextraño,por tanto, que una seriede gruposde investigaciónhayacentradosu atención
en estafracción de los alimentosconsiderada,hastaese momento,sin ningún valor por el
hechode no serdigerible. Su esfuerzoseencuentraplasmadoen la abundantebibliografía
existentesobreel tema.Dichasinvestigacioneshan ido encaminadasadelimitar la definición
de fibra alimentaria(‘dietary fibre”), desarrollartécnicasanalíticasadecuadas,estudiarlas
propiedadesfisicoquímicasy profundizaren los efectosfisiológicos. En la actualidadlos
proyectos más aventajadostratan de aislar e identificar cada uno de los polisacáridos
constituyentesde dicha fracción y el resto de los componentesasociadosa ella, así como
determinarla forma en que se encuentranen las paredescelularesde diferentestejidos.
Sin embargo,apesarde los esfuerzosrealizados,quedanaún sin respuestamuchascuestiones
relacionadas,por unaparte,con la aceptaciónunánimede una definición y, porotra, con la
analítica de estos compuestos,donde tampoco hay acuerdo, proponiéndosediversas
modificacionespor partede los científicos.
El auge de la fibra alimentaria se debe, sin duda, a la trascendenciade sus efectos
fisiológicos. Se ha indicadoque su consumopuedepreveniruna serie de enfermedadesde
gran importancia, sobre todo en la civilización occidental, como el cáncerde colon, la
arteriopatíacoronaria y la diabetes. La relación entre la acción fisiológica de la fibra
alimentaria y el descenso de determinadas dolencias tiene un origen puramente
epidemiológico; es necesario, por tanto, un conocimiento más profundo sobre su
comportamientoreal en el organismo.Actualmentese están llevando a cabo estudiosde
distinta amplitud para conocer las propiedadesfisicoquímicas de la fibra y trabajos
experimentalessobreel comportamientode susdiferentescomponentesen el tractodigestivo
1
humano.El estadoactualdel tema estal que sedebeexigir a los científicos,y cuantomás
a los profanos,unaciertaprudenciaa la horade informara los consumidores.
Cada día el término “fibra alimentaria” es más discutido y, como se ha indicado
anteriormente,no hay acuerdosobresu definición y los componentesquela forman.Diversos
estudioshan señaladoque laverdaderaimportanciaresideen laparedcelularde los vegetales.
No sólo hay que teneren cuentaque los componentesque constituyenla fibra alimentaria
proceden,en su mayoría,de lapared, sinoquees degran trascendenciafisiológicacomose
encuentranen dichapared.
Como se acabade indicar la tendenciade las investigacionesactualesseencaminahacia el
conocimientode la pared celular, ya que se debeentenderla fibra alimentariano como la
sumade una seriede compuestosaisladossino comointegrantesdecomplejasestructuras;de
ahíel interésdel estudiode los productosde origen vegetaldestinadosal consumohumano.
En el presentetrabajosetratade profundizaren el conocimientode los materialesvegetales
seleccionadospara el mismo: zanahoria(Daucus carota L. var. sativa), remolacha(Beta
vulgaris L. var. cruenta)y nabo (Brassicanapus L. var. sculenta).Seda unavisión general
de las característicasmorfológicasy de cultivo, así como de las manipulacionesque sufren
dichashortalizasencaminadasa su comercialización.
Una vez conocidosel origen y los aspectosgeneralesde los materialescon los que seva a
trabajaren esteestudio,seprocedea desarrollarlos aspectosmás importantesde la la pared
celular: propiedades,ontogenia,composiciónquímicay estructura.Despuésde revisar los
fundamentosprincipales de la pared, se puede entender mejor el concepto de fibra
alimentaria, su composición, incluso los efectos fisiológicos que se le atribuyen y los
problemasligadosa su determinaciónanalítica,ya quelos componentesde la fibra proceden
principalmentede la paredcelular de los vegetales.
Existe un interéscrecienteporpartede los consumidorespor los problemasrelacionadoscon
su alimentacióncomo sonel conocimientode la composiciónde los alimentos,el efectoque
los distintosconstituyentesejercenen el organismo,asícomo los requerimientosnecesarios
2
paraconseguiruna dieta sanay equilibrada.En estecontextolos estudiosrelativosa la fibra
alimentariaocupanun lugar relevante.Es más, la importanciade su consumoha motivado
a la industriaalimentariaparaque desarrollenuevosproductoscon alto contenidoen fibra,
que a vecesprocede de suplementoscon fibras vegetales.
Si el estudiode la composiciónde los alimentosesun temaprioritario, no menosimportante
esdeterminarel contenidopormenorizadoque poseendespuésde serelaboradoso sometidos
a un tratamientotérmico, ya que los procesospuedenmodificar determinadoscompuestos
debidoa reaccionescon otros elementos,degradaciones,solubilizaciones,etc. Además,hoy
en díaexisteunatendenciaa introducir en los productosalimenticiosfinalizadosel etiquetado
nutritivo de los mismos,en dondecabríaincluir el componentefibra alimentaria.
El objetivo planteadoen el presentetrabajo es el conocimiento de la fibra alimentariay
azúcaressolublesdetreshortalizasde gran consumoy las posiblesmodificacionesquepuede
sufrir por el procesado.Esteobjetivo generalse concretaen los siguientespuntos:
-Estudio de los conocimientosactuales sobre los diversos aspectosde la fibra
alimentaria,teniendoen cuentala estructurade la que procede,esdecir, la paredcelular.
- Estudioy comparacióndelas diversasmetodologíasempleadasparala determinación
de fibra alimentariay azúcaressolubles, con especialhincapiéen la puestaa punto de la
CromatografíaLíquidade Alta Eficaciaporestarmenosexperimentadaen estecampoy por
las grandesposibilidadesque presenta.
-Cuantificacióny caracterizaciónde la fibra alimentariay azúcaressolublesde tres
hortalizas:zanahoria,remolachay nabo.
-Estudio de la influencia del tratamientotérmico en la fibra alimentariay en los
diversoscomponentesde la misma, así como de los azúcaressolubles, de los vegetales
estudiados.
3
2. MATERIALES VEGETALES ESTUDIADOS
En esteapartadose describirándistintos aspectosreferentesa cadauno de los materiales
vegetalesobjetodeesteestudio:zanahoria,remolachay nabo.Finalmente,dadoquela parte
de la planta destinada al consumo, en los tres casos, es la raíz, se hará un breve estudio de
las característicasmorfológicase histológicasde la misma.
A continuaciónsedescribiránbrevementealgunosde los aspectosmásinteresantesde las tres
hortalizas a estudiar, como son las característicasmorfológicas, variedades, cultivo,
operacionespostcosecha,produccióny consumo(Holdsworth, 1988; Maroto, 1989; Maroto,
1990; Southgate1992).
2,1. ZANAHORIA
2.1.1. Características morfolóEicas de la olanta
Su origen sesitúaen Asia Menor y su nombrecientífico es Daucuscarota L. Perteneceala
familia Umbelijé rae.
Es una plantabianual. Presentala raíz hipertrofiada,principalmentea basede parénquima
cortical; las hojascon pecioloslargos, doble ó triplementepinnado-partidasy dispuestasen
roseta, y el tallo floral que en el segundo año se desarrolla ampliamente pudiendo alcanzar
una altura de 1,5 m.
Las flores en umbelapuedenserblancas,amarillentasó azuladasy las semillasde pequeño
tamaño, son decolor verde oscuroy con doscarasasimétricas,una planay otra convexa,
provistaen sus extremosde aguijonescurvados.Su capacidadgerminativainedia esde tres
años.
4
2.1.2. Variedades
En general,las variedadesmásapreciadasson las de raícesrojo-anaranjadas,dentrode las
cualesexiste una gran variabilidaden función de su longitud quepuedeser:
- Largas,de longitud superiora los 20-25cm como:Hicolor, Becoro,Flacoro, Sainí
Vale¡y, Scarla.
- Semilargas, con una longitud de 15-20cm como:Primato, Nantesa,Tip-Top,Forto,
Fspress,Siendero,Mar/co, Romosa.
- Semicortas,cuya longitud es de 10-12 cm como: Obtusa de guerande, Foram,
chaníenay.
- Cortascuya longitud esinferior a los 10 cm como: Roja de Nancy, Early Frenc/i
Frame, Coría de Guerande.
De estegrupo, sin dudaalguna,las de mayor aceptaciónparael mercado en fresco son las
semilargas, mientras que para la industria se cultivan principalmente variedades de unos 10
cm de longitud y de 1 a 2 cm de diámetro.
En Estados Unidos se prefiere un tipo de zanahoria cónica, puntiaguda y larga, mientras que
en algunos países de Europa se tiende hacia variedades cilíndricas y semilargas.
La adaptación varietal a una determinadacircunstanciaclimática(mesescálidos ó fríos) es
asimismo un carácter importante de cara a la clasificación de los distintos cultivares.
En los últimos añosseestándesarrollandoampliamentelos cultivareshíbridos. Entre los
muchosexistentespuedencitarse las variedades:Spartan, TuneanNunciar, Reva, Nunca,
Camilla, F4~aw, Montan, Pioneer,Bumr, (‘onunander, Rondino, Tiana, Tamino, Ncresto,
Bingo, (‘aropak, Paramouní,Mokum,Lady, Cellobunch,etc., que suelen pertenecera los
grupos de raíceslargas y semi-largas.
2.1.3. Cultivo
Las zanahorias se siembran entre los meses de febrero y noviembre aunque, si las
temperaturasde la zonason suaves,puedesembrarsedurantetodo el año.
Las distintasvariedadesde zanahoriatienen un ciclo decultivo variable,entre75 y 100 días.
Su temperaturaóptima de crecimientoestácomprendidaentre 16 y 180C. Puedesoportar
heladassiemprey cuandono seande intensidadexcesiva.Poseeexigenciasimportantesde
humedady, en casode sufrir sequía,la raíz adquiereun aspectoquedepreciasu valor.
En cuantoal suelo convieneque sea profundo,de textura ligera, con la suficientecantidad
de arenacapaz de reteneradecuadamentela humedad.Se han estudiadolos efectosde la
compactacióndel sueloen la producciónde zanahoriascomprobandoque, al incrementarse
el grado de compactaciónlas raícesproducidasson de un peso, longitud y diámetromás
pequeño;así los terrenospedregososdan lugara la formaciónde raícesbifurcadas.Estetipo
dehortalizano resistelos terrenosácidos,si bien hay quedecirque tampocoson adecuados
los suelosexcesivamentealcalinos.Además,es consideradageneralmentecomo unahortaliza
sensiblea la salinidad.
A continuaciónsedescribende una forma resumidalas técnicasde cultivo más frecuentes
paraobtenercosechasde elevadorendimientoy calidad,asícomo los factoresligadosa ellas.
Paraconseguirun buendesarrollode la raízsedebe,primeramente,acondicionarel terreno
aplicandoaquellas técnicas que consigan airearlo, mullirlo y lo dejen suelto hasta una
adecuadaprofundidad,que será mayor en las variedadeslargasy semilargas.Comonorma
generalseaplicaráuna labor en profundidadcon vertederao aradode discos, que dará un
volteo a la tierra enterrandola partesuperiorjunto con los restosde cosechasanteriores,
seguidode varias laboresde vibrocultivadoro una labor de rotavatorque desmenuzarálos
posiblesterronesque hayanquedadode laslaboresde profundidady deestamaneraquedarán
las capassuperioresdel sueloadecuadamentemullidas y preparadas.
6
Para realizar la siembra, debe procedersepreviamenteal asurcado.La siembra puede
realizarsede distintas formas. Una posibilidad es sembraren surcos separados,por el
procedimientodenominado“al chorrillo’t con máquinasen las que la semillacaeen formade
chorrodespuésde habersido dosificadaen función de la velocidadde trabajo,lo quesupone
un gran consumode semilla y la necesidadde realizarun aclareogrande,o sembrarcon
máquinasdeprecisiónque seleccionanuna a una las semillasy las dejacaeral sueloa la
distancia requerida,lo que suponeun consumomenor de semilla y un aclareoposterior
escaso.La distanciaa la que deben quedar las plantasentre sí dependede la variedad
empleada,la finalidad de las zanahorias,es decir, si sedestinanal consumodirecto o a la
industria, asícomo de la fertilidad del suelo.
La fertilización se calcula en basea las necesidadesde elementosnutritivos que requierela
cosecha,fundamentalmentenitrógeno,P205 y K20 en cantidadesque dependende diversos
condicionantes;si se detectasebajo nivel de boro en el suelo, se hará alguna aplicación
poniendoespecialcuidadode no sobrepasarlos nivelesóptimos.Estareposicióndeelementos
fertilizantes puede realizarse con aplicaciones de materia orgánica o sales minerales,
comprobándosela no convenienciade la aplicaciónde estiércolfresco salvo si se aplica en
el cultivo precedente.
En estahortalizaesde especialimportanciael momentode la fertilización,especialmentela
aplicación del nitrógeno debidoa la influenciaque ejerceen la formación de carotenosy
vitaminas,así como en el contenidoen nitratos de la propiazanahoria,lo que hay que tener
en cuentasobretodo cuandova a ir destinadaa la alimentacióninfantil (Grangery Quinche,
1983).
El aclareoescon frecuenciaunaoperaciónobligada,debidoa quesurgeun númerodeplantas
superiora las necesariasy por tanto se impide el desarrolloóptimo de la cosecha.
La escardaes otra labor a realizarpara eliminar las malashierbasque competiríancon el
cultivo por los nutrientesy humedaddel suelo, así como por la luz del sol. Es una labor
aconsejabley sepuederealizarpor métodosfísicos, o pormétodosquímicoscon herbicidas
selectivos.
‘7
Finalmente, la recolecciónpuederealizarsede forma manual ó mecanizada,dependiendo
sobre todo de que las extensiones sembradas puedanrentabilizar lautilización de máquinas.
Los rendimientos de estos cultivos pueden verse afectados por distintos factores:
encharcamientosy sequía,deformacionesy necrosisde las raíces,plagasde determinados
insectosy nemátodos,así como algunasenfermedadescriptogámicas,bacterianasy víricas.
Las técnicasde cultivo aquíresumidasson muy similaresen las tres hortalizasobjeto de este
trabajo, debidoa la característicacomúndeaprovechamientode sus raíces,por lo que no se
incidirá nuevamenteen su comentarioen los siguientesapartados.
2.1.4. Operacionespostcosecha
Las zanahorias recolectadas, antes de serdestinadasal consumo,debensufrir una seriede
operacioneso manipulacionesque asegurensu adecuadacomercialización.
Las exigenciascomercialespara las zanahoriasestánreguladaspor una norma de calidad,
cuyo objetivo es definir las característicasde calidad, envasadoy presentaciónque deben
reunir estasraícescomestiblesdespuésde su acondicionamientoy manipulacióndestinadas
al mercadointerior (Ordende 2 dejulio de 1985, B.O.E. n0162).
La aplicaciónde la normade calidada los productoshortícolasesun instrumentoadecuado
para mejorar su comercialización, orientar la producción de manera que satisfagalas
exigenciasde los consumidoresy facilitar las relacionescomerciales.
Entre las operacionesque requierenlas zanahoriasseseñalan,en primer lugar, la limpieza
o lavadoque va a eliminar los restosde tierra y materiasextrañasque suelenacompañara
estosproductoshortícolas.
La operaciónde selecciónserealiza manualmentey su finalidad es separartodas aquellas
raicesque no cumplan las condicionesmínimaspara su comercializacióncomoel gradode
firmeza, la presenciade raíces defectuosas(rotas, torcidas, bifurcadas, manchadas),o
8
aquellasotras afectadasde podredumbre.
Sedefineel calibradocomo la operaciónque determinala separacióndel productosegúnlos
distintostamañosy serealizaen función del diámetrode secciónmáximaperpendicularal eje
o porel pesoneto de la raíz sin hojas.
La normade calidad paralas zanahoriasestablecevarias categoríassegúnlas calidadesdel
producto: Extra, 1 y II a las que atribuyeuna serie de característicasque deben reunir y
admite un margende toleranciapara los productosno conformescon las exigenciasde la
categoríaindicada.
Finalmente, el envasadodebe asegurar una protección convenientede forma que los
materiales no causen a los productos alteraciones internas o externas. La forma de
presentacióncomercialpuedeseren envasesen bolsasde polietilenoquesedepositanen cajas
o bien sin envasar,en cuyo casopuedenpresentarsealgunasvecesen manojossin deshojar.
El envaseo embalajedebepresentarun etiquetadoque incluya en, caracteresclarosy bien
visibles, la informaciónobligadapor la norma anteriormentemencionada(denominaciónde
producto, origen, identificaciónde la empresa,característicascomerciales).
La conservaciónen cámarafrigorífica a Ot’C y 90-95% de humedadrelativapuedepermitir
un almacenamientoen buenascondicionesdurantedos o tres meses.
2.1.5. Producción y consumo
En Españala produccióntotal de zanahoriasasciendea 252.228Tm, destacandoSegovia
(63.120Tm) y Valladolid (30.186Tm), dentrode la Comunidadde Castilla-Leónque esla
de mayor volumen de producción (96.152 Tm). Son también importantes las cifras
correspondientesa Cádiz(49.122Tm) dentrode la ComunidadAutónomade Andalucía,que
presentauna produccióntotal de 74.316Tm (Anuario de estadísticaagraria, 1990).
Las cifras destinadasa exportación son importantes siendo Francia el principal país
9
destinatario.
2.2. REMOLACHA DE MESA
2.2.1. Características morfoló2icas de la planta
Pertenece a la familia Chenopodiaceaey su nombre científico es el de Beta vulgaris L,
variedad cruenta Alef.
Es una planta bianual que durante el primer año de cultivo produce una roseta de hojas de
márgenesenteros o sinuosos, de forma oval, con peciolos alargadosy limbo liso ó
abullonado.Paralelamente,en esteprimer año, hipertrofiala partesuperiorde su raízjunto
con elementoscaulinares,formandoun tubérculohipocotfleocuyaformapuedeseralargada,
redondeadaó aplastada,que es de color rojizo o amarillento, según la proporción de
betacianina/betaxantina,estandocontroladoel contenidoen betaxantinapor un gen recesivo
sencillo.
Si se haceun cortetransversalen el tubérculohipocotfieo, se puedenobservaruna seriede
capasconcéntricas,quepuedenalternarel color rojo con capasde coloraciónrosapálido. Si
estecontrastede color es muy acusado,se manifiestalo que seconocecomo “zonificación”
de la remolachade mesa, característicaque depreciacomercialmentea estahortaliza. Las
capas concéntricascorrespondenalternativamentea elementosde tejido vascular y de
parénquimade reservaen el que seacumula el azúcar.
En el segundoaño de cultivo, la planta emiteel tallo floral que aloja una inflorescencia
compleja, larga y laxa, en la que las flores, son de color verde-amarillento. Como
consecuenciadel crecimiento ininterrumpido de los cálices tras la floración, se forman
glomérulos que engloban,cada tino de ellos 2 ó 3 semillas reniformes, cuya capacidad
germinativaes decuatro-seisaños.
Aunquesetrata de una plantaprobablemeneoriginaria de Europa, no fue empleadacomo
10
hortalizahastael siglo XVI.
2.2.2. Variedades
En función de la forma de sus raíces,comercialmentesedistinguendos grupos:
- Alargadas:Larga Roja Virtudes,Larga de CoventGarden, C’yiindra, Crapaudine,
Cheltenham(pueden llegar a tener hasta 30-40 cm de longitud).
- Redondeadaso aplastadas:Roja de Egipto, Roja Globo, Detroit Mejorada, Bikores,
Glohe-Rondar/ca,Dwergina, Boltardy, Redpack,Globe-Faro,Detroit-Precoz,Detroit-Alero,
Detroit Dark Red, Negrade Egipto raza Emir, Monopoly,Aplastadade Egipto. Estesegundo
tipo de remolachasde mesa son las más cultivadas y las más aceptadascon miras a la
exportación.
2.2.3. Cultivo
La siembrade la remolachade mesa se hacedesdeenero-febrerohastamediadosde otoño
en zonastempladas,comoesel litoral mediterráneoespañol,siemprey cuandoel régimen
de temperaturasbajasno sea muy intenso. El ciclo de cultivo quedacubiertoentre65 y 90
días.
Prefiereclimatologíassuaves,húmedas,aunquees de adaptaciónrelativamentefácil . La
temperatura óptima de germinación es de 250C, si bien es poco exigente para iniciarla (5-
80C). Durante los primeros estadios de desarrollo resiste muy poco el frío.
En lo referente a suelos puede indicarse lo mismo que se dijo en el caso de la zanahoria, es
decir, suelosligeros,profundos,homogéneosy frescos.La remolachaesunaplantaaltamente
resistentea la salinidad.
11
En términosgenerales,las remolachasde mesaredondasse cosechancuandohan adquirido
un diámetrocomprendidoentre3 y 6 cm, aunqueéstoesvariablesegúnlas variedades,el
destino a que van dirigidas y las exigenciasdel mercado.En conjunto las remolachasmás
apreciadas son las que pesan entre 100 y 300 gramos.
2.2.4. Operaciones uostcosecha
Las remolachasdebensertransportadaslo másrápidamenteposiblea la centralhortofrutícola
dondeserealizarán las operacionespreviasa su comercialización.
Es frecuente que una elevadaproporción de remolacha se comercialiceya procesada,
mejorandocon el procesadosu aspectoy presentaciónasícomo su facilidad de utilización y
consumo.Paraobtenerproductosde buenacalidadesrecomendablequelas remolachasestén
reciénrecolectadasy con madurezadecuada,queno presentensíntomasde reblandecimiento
o decoloracióny que sean suficientementetiernas,es decir, es imprescindiblepartir de
materiaprima adecuada.
Es aconsejableque estos productoshortícolas sufran, en la medida de lo posible, las
operacionespost-cosechaque van a mejorar sus características,concretamente,aquellas
partidasde remolachaque no seanprocesadasy sedestinendirectamenteal consumo,quees
como han sido adquiridaspara esteestudio.
En las raícescomestiblesla operaciónde limpieza es muy importante,ya que presentan
elevadascantidadesde tierra, barro, etc. adheridosa su superficie.
La seleccióninteresarealizarlaparaeliminarlos productosqueno satisfaganunasexigencias
de calidad mínimas (podredumbres,magulladuras,etc.)para favorecerla comercialización.
No existen normas oficiales para clasificar las remolachas,pero puede realizarsesegun
criterios aceptadospor los operadoresde mercado.Además se podría recurrir al Decreto
2257/1972,disposicióngeneral que regula la normalizaciónde productosagrícolasen el
12
mercadointerior.
La conservación a 00C y 90-95% de humedad relativa permite mantener en buenas
condiciones la remolacha de mesa durante uno a tres meses.En el almacenamientodeben
evitarse aglomeraciones de raíces, prefiriéndose los embalajes planos que permiten una buena
circulacióndeaire.
2.2.5. Producción y consumo
La superficie y producciónde estecultivo ha sufrido altibajos desde1968, pero se observa
cierta tendenciaa su mantenimiento.
La producciónnacionalasciendea20.272Tm. Dentrode las comunidadesautónomasdestaca
la producciónde Andalucía(10.236Tm), siendola principal productoraCádiz(5.420Tm).
Tambiénes importantela producciónde la ComunidadValenciana(4.523Tm), estandoen
cabezala provincia de Valencia (3.774Tm) (Anuario de estadísticaagraria, 1990).
2.3. NABO
2.3.1. Característicasmorfoló2icasde la níanta
Se creeque el origen de estaespeciese localiza en Europao Asia Central. Pertenecea la
familia Cruel/trae y su nombrecientífico es BrassicanapasL.
Es unaplantabianual,con hojasnormalmentehendidasy de márgenesfestoneados.El tallo
floral esliso y las flores sondecolor amarillo. La fructificación esen silicuas y las semillas
son redondeadasde color rojizo oscuro. Su capacidadgerminativamediaesde cuatroaños.
Su sistemaradicularestáengrosado,existiendodos tipos varietalesdistintos,unosglobulosos
y otros alargados.Su coloraciónvaríaentreel blancoy el rojo.
13
2.3.2. Variedades
-De estructuraradicular alargada:Virtudes, Virtudes-Martillo, Fuencarral, Nantais,
Semilargode Croissyraza Paros, Alantés raza Candía.
-De estructuraradicularredondeada:Bola de Nive, Rojo de Milán, Bola de oro, Just
Righr (híbrido) DeNancy,Shogoin,SupertopBency,Pingpong(híbrido japonésde color muy
blanco).
En la agrupación varietal debe señalarseque cada cultivar muestrauna determinada
adaptacióna su producción,en los mesesmáscálidosy en los más fríos.
2.3.3. Cultivo
La siembra se hace normalmenteentre julio y octubre, para recoleccionesotoñalese
invernales,y entremarzoy abril pararecolectaren verano.El ciclo de cultivo varíaentre40
y 100 días.
Requiereun clima fresco y húmedo.El calorestival afectanegativamentea estecultivo. Es
una plantaexigenteen agua. Existen variedadesque puedensoportarheladasligeras.
En cuantoal suelo, estecultivo prefiereterrenosde textura inedia con una buenaretención
del agua,siempreque esténbien drenados.Su pH óptimo está entre6,5 y 7.
La recolecciónpuederealizarsede forma manual o mecánica,dependiendode la extensión
de cultivo necesariapararentabilizar la mecanización.
2.3.4. Operaciones¡)ostcosecha
Los naboscosechadosson transportadosa las centraleshortofrutícolasen donde se realizarán
14
las funciones de recepción,clasificación y embalajes.
No existe una normativa que clasifique las distintas partidas de nabos en lotes homogéneos,
según factores de aspectoy presentación,por lo que estasoperacionesseacogerána los
criterios del Decreto 2257/1972, de aplicación a todos los productos agrícolas con el fin de
prepararlosadecuadamenteparasu expedicióna los centrosconsumidores.
Una vez realizadala recolección las raícesse deshojan,se lacan, se trían y se calibran,
pudiéndosecomercializaren manojos,cajaso sacos.
El almacenamientofrigorífico a 0&)C y una humedadrelativadel 90-95%puedepermitir una
conservaciónadecuadadurantecuatro-cincomeses.
2.3.5. Producción y consumo
La producciónde estahortalizaseha multiplicado en los últimos añospor3,5. La producción
nacional es de 20.272 Tm. Por comunidadesautónomasla más elevadacorrespondea
Andalucía(8.016Tm), en la quedestacaMálaga(3.380Tm). Otrosproductoresimportantes
son la ComunidadValenciana(1.557 Tm) y Cataluña(2.951 Tm) cuyaprincipal provincia
productoraes Barcelona(1.097Tm) (Anuario de estadísticaagraria, 1990).
2.4. ASPECTOSHISTOLOGICOS DE LA RAIZ
Las hortalizaspodrían clasificarsesegún la partedel vegetal que se destineal consumo
humanofundamentalmenteen: hojas, tallos, raícesy frutos. Dadoquelos materialesvegetales
objeto de este estudio son raíces, a continuación se repasanlas característicasgeneralesde
estos órganos comestibles.
La raíz es la partesubterráneade la planta. Su función es, por una parte,la absorciónde
aguay salesminerales,y, porotra, la fijación de la plantaal suelo. La mayoríade las raíces
15
también representan una importante zona de reserva nutritiva para la planta (Cortés, 1990).
Desdeel punto de vista histológico, el tallo y la raíz de las plantaspuedentener tejidos
primariosy/o secundarios.Los tejidosprimarios son aquellosque seformana partir de los
meristemosprimarios (sus célulasderivandirectamentede las embrionarias),mientrasque
los tejidos secundariosderivan de los meristemossecundarios;estos últimos son tejidos
jóvenes presentes en cl vegetal adulto que recuperan su capacidad de crecimiento cuando la
planta, por causasfisiológicaso patológicas,lo necesita.
Todos los vegetalespresentancrecimientoprimario pero no obligatoriamentecrecimiento
secundario.
2.4.1. Estructura primaria
En las raícesdecrecimientoprimario, y en las zonasde las raícesrelativamentepróximasa
las células meristemáticas radicales, se pueden distinguir las siguientes regiones: la cofia, la
epidermis, el córtex ó corteza y el cilindro vascular ó central (Esau, 1977; Rayen y col.
1992) (Esau, 1977; Rayeny col., 1991) (Figurasn0 1 y 2).
- Cofia o calintra
Está constituida por células parenquimáticas. Su función es proteger al meristemo radical y
también facilitar la penetraciónde la raíz en el suelodurantesu crecimiento.
- Epidermis
Estáconstituidaporcélulasde paredesdelgadasy formaalargada,dispuestasde maneramuy
compacta.
Generalmentees monoestratificada.Lo máscaracterísticode la epidermisde la raíz es la
16
GRTEZA
Figura n01,- Seccióntransversalde una raíz primaria (Rayeny col., 1991)
CILINDROVASCULAR
(b)
Epidmís
Figura n”2.- Seccióntransversalde una raíz primaria (Esau. 1977).
formación de pelos radicales.Se suelensituar próximos al ápice, y su función fundamental
es incrementarla superficiede absorciónde la raíz.
Generalmenteno existecutícularecubriendoadichaepidermis,aunque,a veces,las paredes
más externas, incluyendo las de los pelos radicales,experimentancutinización.
A veces,en las zonasexpuestasal aire o en aquellaszonasen las que la epidermispersiste
largo tiempo, las paredes más externas se engruesan y pueden presentar lignina o sustancias
de color oscuro que, todavía, no se han identificado totalmente.
- Córtex ó corteza
El córtex es la zonaque seencuentradebajode la epidermis;sueleser la principal zonade
reservade la planta.
En general, en la mayoría de las gimnospermas y dicotiledóneas, dicho córtex está formado
principalmentepor célulasparenquimáticas,generalmentede reserva.Se puedendistinguir
dentro del córtex las siguienteszonas:
+&oder,’nis: En muchasplantaslas paredesde las células másexternasdel córtex,
situadasen la zonasubepidérmica,se suberizany constituyenla exodermís.
Porsuscaracterísticasestructuralesy citoquimicasla exodermissepuedeconsiderarun tejido
protector. Las paredesde las célulasde la exodermispuedenpresentarlignina y/o suberina,
perosusprotoplastossonviables.La exodermispuedeestarconstituidaporunao variascapas
de células.
+ Endodermis:Lacapamásinterna del córtex es la endodermis. Es unacapaquese
presentaen todas las plantasvasculares;sueleseruniseriada(constituidaporuna únicacapa
decélulas).
En las célulasde las capasendodérmicasjóvenesse observasobrelas paredesanticlinalesla
18
banda de Caspary.Dicha bandaes un engrosamientode la pared celular constituido por
suberinay, segúnalgunosautores,también por lignina (Fahn, 1985).
En la región de paredcorrespondientea la bandadeCasparyno seobservanplasmodesmos,
en contraposicióncon lo que ocurreen el restode la paredde estascélulas dondesuelenser
abundantes.El plasmalemade la célulaendodérmicaestáíntimamenteunido a dichabanda
ya que no se separade ella cuando la célula es sometidaa algún tipo de tratamiento
(Peterson,1927).
Generalmentelas paredesde las células con banda de Caspary van sufriendo depósitos
sucesivosde celulosay suberinae incluso, en algunoscasos, tambiénpuedenlignificarse.
Estas modificacionesno se realizan simultáneamenteen todaslas célulasendodérmicas.En
las primerasfasesdediferenciacióncelular, la formaciónde las bandasdeCasparyseinicia
en las zonas próximasal floema y se va extendiendohastalas cercaníasdel xilema. Las
células endodérmicaspróximas al xilema pueden tener sólo banda de Caspary, y se
denominancélulasde pasoporquepermitenel pasode sustanciasentreel cilindro vascular
y el córtex (Fahn, 1985).
- Cilindro vascular
.
Ocupala zonacentral de la raíz. A veces se le denominamédula. El cilindro vascularestá
constituidopor: el periciclo, los tejidos vascularesy el parénquima.
+ Periciclo: Estáconstituidopor una ó variascapasde células parenquimáticasque
sesitúanentrela endodermisy los tejidosvasculares.Conservala capacidadde crecimiento
meristemáticoy origina los primordios de las raíces lateralesy partedel cambium y del
felógenoen las raícescon crecimientosecundario.
+ Tejidos vasculares: En el cuerpoprimario de la raíz, la cara internadel periciclo
bordealos cordonesde floemay xilema.
El tejido vascularprimarioesel primeroque aparece.Empiezaa funcionarcuandola planta
19
esjoven y luego crecey se desarrollahastaalcanzarun estadodefinitivo cuandola plantaes
adulta.
El floemaestáen forma aisladaen la periferiadel cilindro vascular.Sedisponeen formade
haceso cordonespordentrodel periciclo.
El xilema puedeformar un cuerpocentral, que presentaen muchasplantasuna apariencia
estrelladaen cortestransversaleso bien disponerseen forma de cordonesque alternancon
haces floemáticos, observándoseen algunos casos una médula parenquimática o
esclerenquimáticaespecialmenteen muchasmonocotiledóneas(Fahn, 1985).
La raíz presentageneralmenteun xilema y floema exarco, es decir, que sus primeros
elementosmaduranen la parteexternadel cilindro vascular.El protoxilemaen la raíz está,
porello, localizadoperiféricamenteen el cilindro vascular,mientrasque el metaxilema,con
sus elementosconductoresde mayor calibre, se encuentraen el interior. En el floema la
diferenciacióntambiénescentrípeta.
Según el númerode cordonesxilemáticosque aparecendispuestosradialmentesedice que
la raíz esdiarca(ej. génerosNicoúana,Daucus,Beta, ...), triarca (Pisum,Ervum), tetrarca
(Vicia, Phaseolus..) poliarca( monocotiledóneas)(Esau, 1977) (Figura n<’ 3).
Los elementostraquealesdel sistema se hallan normalmentecomunicadosentre sí por
anastomosislaterales. En las raícesque presentanmédula es posible encontrar también
conexioneslateralesentregruposde floema (Cortés, 1990).
En las raícesde la mayoríade las plantas,el floema no tiene fibras (célulasmuy lignificadas
que forman partedel tejido de sostén:esclerénquima).
20
Figura n03.-Disposición de los cordonesde xiilema (Esau, 1977).
D~asca Tnrwr. Polínnz
+ parénquima En cuantoal parénquima,sus célulasse encuentranasociadasa los
elementosconductorestanto del xilemacomo del floema. En muchasraícesmaduras,que no
experimentancrecimientosecundario,tiene lugar una esclerificaciónde dicho parénquima
asociadoa los tejidos vascularesprimarios.Suelerecibir el nombrede parénquimamedular
por estarsituadoen la médula de la raíz.
2.4.2. Estructurasecundaria
Duranteel crecimientosecundariose desarrollaun cambiumvascular (que da origena los
tejidos conductoressecundariosde la raíz) y un cambiumsuberosoo felógeno(que origina
la peridermiso tejido protectorcorrespondiente>.
No todaslas plantaspresentanestetipo de crecimiento,asílas criptógamasvascularesy la
mayoríade las monocotiledóneasno lo tienen.
En la raíz, el cambiumvascularse origina normalmentea partir de célulasdel procambium
quepermanecenindiferenciadasentreel tloemay el xilemaprimarios.Seguidamentetambién
dan lugara cambiumlas célulasdel pericicloadyacentea los polos (partemásperiféricadel
protoxilema).
Estecambiumse añadea las bandasya existentesy seforma así un tejido continuo.En este
estado,el cambiumno escilíndrico sino lobulado,siguiendoel contornodel xilemaprimario.
El cambium vascularque tuvo su origen a partir de células del procambiumque habían
permanecidoindiferenciadasen el limite internodel floema, comienzaprimerosu actividad,
formándosexilema secundariohacia el interior, hasta que el cambium apareceen forma
circularen seccióntrasversal(es desplazadohaciaafueraporel xilemasecundarioformado).
Continúa entoncesel cambiumdividiéndose y producefloema secundariohaciael exterior
de la raíz y más xilema secundario hacia el interior de la misma. Comoresultado los tejidos
conductoressecundariosde la raíz sedisponenformandocilindros concéntricos(Figuran”4).
22
Pelo radicular
XIlema primario
Figura n04.- Sucesivasetapasdel engrosamientosecundario(Fahn,1985).
La producción deperidermistiene lugardespuésde habercomenzadola producciónde los
tejidosvascularessecundarios.Son lascélulasdel periciclo, también,las que medianteactivas
divisionespericlinales,producenel felógenoo cambiumsuberosode la raíz.
Consisteel mismo en un cilindro de tejido, que funcionandode manerasimilar al cambium
vascular,origina súberhaciael exteriorde la raíz y, felodermiso córtexsecundariohaciael
interior de la misma, para originar un conjunto de tejidos que constituyen la peridermis;
asimismolos tejidos que seencuentranexteriormenteal súber(endodermis,restodel córtex
y epidermis)terminandesprendiéndose.
- Crecimientosecundarioanómalo
En algunoscasosel crecimientosecundariono ocurre como se ha descrito. A veces la
diferenciaconsistesimplementeen queen el xilemay el floema sepresentaunagrancantidad
de parénquima,como ocurre en algunasraícesde reserva(géneroDaucus, por ejemplo),
siendopor lo demásel crecimientosecundarionormal.
En otros casosse forman varios cambiumsadicionalesdispuestosconcéntricamentepor fuera
del cilindro vascular,a partir del periciclo y el floema(géneroBeta,porejemplo).Cadauno
de los meristemosproduceuna cierta cantidadde floema haciael exterior y xilema haciael
interior de la raíz. También se presentaen estos casosgran cantidadde parénquimade
reserva.
2.4.3. Estructurade las raícesde almacenamiento
Las raícesobjeto de esteestudio son todas raícesde almacenamiento.Es decir, raícesque
ademásde la función normalde reservaradical, sedesarrollanformandoórganosgruesosy
carnososque funcionanprincipalmentecomoórganosde almacenamiento.El origen de estas
estructurasde almacenamientopuedeserdiferente.
24
2.4.3.1.Zanahoria
El hipocotiloy la raízaxonomorfaseengruesan,y al desarrollarsela peridermissedesprende
el córtex. Como consecuenciadel desarrolloexcesivodel parénquimael órgano se hace
carnoso.
La zanahoriaesuna raíz diarca. En un cortetransversalde unaraízjoven filiforme sepuede
observarla estructuratípicacon los hacesalternantesde xilema y floema.El cilindro central
está limitado por el periciclo que se encuentra rodeado por una endodermis sin
engrosamientoslignificados visibles. Esta raízjoven tambiénpresentaparénquimacortical y
epidermispilífera. A medidaque la raíz crece seactiva el cambiumque generalos tejidos
conductoressecundarios;estos xilema y floema secundariosse intercalan entre los haces
vascularesprimarios.El periciclo aumentasu grosor y comienzaa formarsela peridermis.
El origen de estenuevo tejido conlíevala exfoliación de los tejidos externos,es decir, la
endodermis,el parénquimacortical y la epidermisinicial. Las característicasanatómicas
generalesde la raíz de zanahoriaya desarrolladase pueden observaren la figura n0 5
(Géneves,1962). Las paredesde las células superficiales están ligeramentesuberificadas
(capasuperficialperidérmica).A continuaciónse encuentrael parénquimadecélulasgrandes,
a menudo alargadastangencialmente.El parénquimay la capaexternason de naturaleza
pericíclica.
El floema está repartido en haces separadosentre sí por anchos radios de células
parenquimáticas.Todasestascélulasestánalineadaspróximasal cambiumy de forma menos
nítida cuanto mas se aleja del meristemo; estascélulas constituyen un tejido de naturaleza
secundaria.El cambiumcomprendenumerosascapasde célulasdispuestasregularmenteen
filas radiales.No tieneel mismo espesoren las diferentesfilas. Sobrela carainternaproduce
tejidos de xilema relativamentepoco lignificados y parénquimaque se disponea modo de
radios a continuaciónde los radios parenquimáticosdel floema.
Portanto, los vasos,de pequeñodiámetro,estándispuestosen filas radialesmásó menoslar-
gas.Estánincluidoscii un parénquimasecundariomuy abundante,con paredescelularesfinas
celulósicas.Los tejidos lignificadosson, pues,relativamentereducidosen la zanahoriajoven.
25
ZANAHORIA
Parénquima (zona del periciclo)
Xilema secundario
Vasos del xilema
Amiloplastos
Figuran05.- Estructurade la raízde la zanahoria(Géneves,1962)
Las células parenquimáticas(Figura n0 5) tienen paredesfinas celulósicas. Contienen
amiloplastos, inclusiones lipídicas y cromoplastos donde se sitúanlos carotenosresponsables
del color naranjatípico de la raíz de zanahoria.
2.4.3.2.Remolacha
En la remolachael hipocotiloy la raíz se hacencarnososcomoresultadode un crecimiento
secundarioen grosor anómalo, típico de Chenopodiceae.Al activarse diferentestejidos
cambiales, se van formando capas de tejido secundarioy parénquimadonde se van
repartiendolos tejidosconductores.El azúcar,en estaremolacha,essustanciade reservaen
las célulasdel parénquimasecundario.
En un cortetransversalde una raíz de remolachajoven todavía poco tuberizadasepueden
observarlos siguientestejidos:
En el cilindro central se sitúandos pequeñoshacesvascularesprimarios con diferenciación
centrípeta, rodeados completamentepor células de parénquimacelulósicas e incluso
lignificadas.El cambiumresponsablede la formaciónde los tejidos conductoressecundarios
se sitúaalrededorde estoshacesvascularesprimarios, como en el resto de las raícesde
plantasdicotiledóneas.
A continuaciónse puedeobservar una corona de xilema secundariocon vasos de gran
diámetro, asociadosa células parenquimáticasdispuestasen forma radial. El cambium
muestraalgunascapas de células dispuestasen filas radiales. A continuación,hacia el
exterior, se ha formadoel floema secundarioigualmentedispuestoen círculo concéntrico.
Cuando la raíz es joven no posee otros tejidos conductoresa esenivel; una zonapericíclica
la rodea.Al desarrollarse,el crecimientosecundarioanómalodeterminala formaciónde un
nuevo cambium,mientrasque el primerofuncionabatodavía.
Este nuevo cambium forma nuevos haces vascularesde xilema y floema también en
27
disposiciónconcéntrica,peroque, a diferenciade los precedentes,seencuentranaisladoslos
unos de los otros (Esau, 1982) (Figura n” 6). Estecambium también ha producidoradios
parenquimáticosinterfasciculares.Cadauno de los nuevoshacescomprendeun hazdexilema
centrífugo, sobrela carainternay un haz de floema sobrela zonacambial. Es importante
señalarel pequeñonúmerode vasoscon paredlignificada y la granabundanciadeparénquima
celulósicoque formael haz vascular.
El cambium nuevo, constituido en la región media del periciclo, ha dejadoen el interior
algunas capas de células pericíclicas. Estas hanproliferadoal mismotiempo que funcionaba
el nuevo cambium, y han originadounascapasdeparénquimaque separanlos nuevoshaces
vasculares de los precedentes. La parte periférica del periciclo se ha dividido igualmentey
se ha hecho más gruesa. De esta forma se han originadocírculos concéntricossobrelos
cuales se disponen haces conductores, derivados del funcionamiento del cambium
supernumerario.Las zonasmeristemáticascambialesson tanto másnumerosascuantomás
tuberizadaestála raíz.
Por otra parte, duranteeste crecimientosecundariode la raíz de remolacha,en la zona
externade los hacesvascularesperiféricos (en la cortezade la raíz) seactiva el cambium
suberosoo felógeno. Al dividirse las células de este meristemo originan la peridermis,
constituidapor la felodermisque separaal felógenodel parénquimapericíclico,y porvarias
capasde células suberificadasen tilas radiales que forman el corchoo súberel cual liniita
exteriormenteel órgano.
A veces,a partir de las células felodérmicas,sepuederecuperarla actividadmeristemática;
el comportamientoes similar al de los cambiunissupernumerariosprecedentesy sepueden
formarnuevoshacesvascularesque quedaríanseparadospor radiosparenquimáticos.
En consecuencia,la raíz de remolachaposeeparénquimasabundantesricos en resevas
glucídicas, representadasesencialmentepor sacarosaen solución en el jugo vacuolar. Las
vacuolasde la remolacharoja contienenademáspigmentosantociánicos.
28
PARENQUIMA DEALMACENAMIENTO
UNA CAPA DECRECIMIENTO
>CILEMASECUNDARIO
F LO E Nl A
SEC UN DA R O
CAMBIUMVASCULAR
st,10 mm
Figura n~~6.- Estructura de la raíz de remolacha(Esau, 1982).
2.4.3.3. Nabo
Al igual que la zanahoriay la remolachatambiénes una raíz en la que la partecarnosaestá
especializadacomoórganode almacenamiento.
En la familia Brassicaceae,el crecimientosecundarioanómaloquedeterminael carácterde
almacenamientode la raíz consisteen la aparición de un cambiumanómalo:en el cilindro
central el parénquima medular situado entre los vasos de xilema se incrementa.
Posteriormente,en el crecimientosecundario,ademásde los meristemosnormales,en este
parénquimatambién apareceotro cambium que origina tejido vasculary nuevascélulas
parenquimáticas(Figura n” 7).
Un carácter
parénquima
conductores
crecimiento
común a las tres raícesobjeto de estudioes la presenciade gran cantidadde
de reserva intercalado con tejidos vasculares. Esta asociación entre los tejidos
y (le almacenamientoderivade las distintas formas de desarrolloanómalodel
secundario(Esau, 1982).
30
FLOEMA
CAMBIUM
XI LEMA
CELULAS DE
XILEMA
CAMBIUM
ANOMALO
xl
Figura n07.- Estructura de la raíz de Brassicaceae(Esau, 1982).
3. ESTUNO DE LA PARED CELULAR VEGETAL
La química fundamentalde la fibra alimentariaresideen la estructurade la paredcelular
(Carpita, 1990). Esta pared es una capagruesay consistenteque rodea a la membrana
plasmáticade las célulasvegetales.Fuela primeraestructuracelulardetectadasegúnCarpita
(1990)y, a pesardel tiempotranscurrido,aún hoy día no se conocecon exactitud.
Laparedcelularestáconstituidamayoritariamenteporpolisacáridosy proteínas,íntimamente
asociadosy entrelazadosformando un complejo entramadoreticular responsablede las
propiedadesmorfológicasy mecánicasde la célula vegetal.
3.1. CARACTERISTICAS GENERALES
La paredcelularesuna de las particularidadesque diferenciaa los organismosvegetalesde
los animales.Suscaracterísticasgeneralessepuedenresumirde la siguienteforma:
-Presenta una estructura muy organizada que confiere rigidez y fuerza, considerándose
como el exoesqueletoque proporcionael sosténmecánicoque el vegetalnecesita.
-Ejerce una función protectora frente al medio ambiente (desecación,agentes
extraños...),actuandocomo una barrera.
-Aísla y al mismo tiempo comunica unas células con otras mediante los plasmodesmos
que permiten el paso de determinadas sustancias sin ejercer un control activo sobre este
transporte.
-El desarrollo de la pared está íntima y recíprocamente relacionado con el de la célula
vegetal.Suscomponentessesintetizanen el interiorcelular y la paredse va secretandodesde
el hialoplasma hacia el exterior. Los procesos de crecimiento y diferenciación celulares son,
en elevadaproporción, consecuenciade la síntesisy organizaciónde la paredcelular.
32
Hoy día se pueden distinguir en la pared tres partes, desde el exterior hacia el interior:
- Lámina inedia.
- Paredprimaria.
- Paredsecundaria.
En la figuras n0 8 y 9 se reproducen diferentes representaciones de la disposición de las
distintas partes de la pared celular.
3.2. ONTOGENIA.
La pared celular se forma en la etapa final del procesode división celular,durantela división
del citoplasma.Los trabajosllevadosa cabo por microscopiaelectrónicaindican que las
vesículasdel aparatode Golgi, formadaspor los dictiosoinasy dirigidaspor los microtúbulos,
se fundenen la zonaecuatorialde la célulaen división constituyendola placacelular, quees
el primer tabic1uede separaciónque se forma entre las dos células hijas. Estaplacano es
continua, está atravesadapor canales de retículo endoplásmicoque en la pared celular
desarrolladaconstituiránlos plasmodesmos,estructurasquepermiten la comunicaciónentre
las célulasadyacentes.El contenido de las vesículasde Golgi, principalmentepectinas,
origina la lámina media y sus membranas constituyen la nueva membranacelular o
plasmalema.El procesocontinúahastaque la lámina media nuevaseintroduceen las paredes
celulares existentes en la célula madre y llega a establecer contacto con la lámina media que
ya existíaalrededorde la célula madre. Entre la lámina mediay el plasmalemacadacélula
forma de inmediato su pared primaria. El esquema de las diferentes fases de este proceso de
formaciónde la paredcelular serepresentaen la figura n~’ 10.
Una vez formada la lámina media empiezana depositarsea ambos lados de la misma
hemicelulosasy tambiénalgode celulosa,segregadaspor las doscélulashijascontigúasque
estánseparadaspor aquella,formándosela paredcelularprimaria. Estaparedesextensible
y puedeadaptarseal aumentode tamañode la célula en crecimiento.Cuandola célula ha
dejadode crecer puedenempezara depositarsesobrela paredprimaria,haciael interior de
33
Pared secundaziacara interna (Se>
Pared Secundariacapaexterm (Si)
Sustancia intercelular
Pared secundartacapa Intermedía (&)
Pared primaria
Figura n08.-Estructurade la paredcelular (Barcelóy col., 1992).
E
Pared secundana de tres capas
4
Figura n09.- Esquemade la pared de la célulavegetal <Esau. 1972V
Figuran010.- Formaciónde la paredcelular (Berkaloff y col., 1982).
la célula, fibras de celulosaque van cambiandosu orientaciónhastaconstituir un verdadero
entramado que forma la pared secundaria, responsable directa de la rigidez de la pared
celular.
3.3. COMPOSICIONQULMICA DE LA PARED CELULAR
Los componentesde la paredcelularsepuedenclasificaren tres grupos:
Polisacáridosestructurales:
- celulosa
- hemicelulosas
- sustanciaspécticas
Glicoproteinas:
- estructurales
- enziniáticas
Otros componentes:
- lignina
- cutina
- suberina
- ceras
— taninos
- salesminerales
3.3.1. Polisacáridosestructurales
3.3.1.1.Celulosa
Es el polisacáridoestructural más abundantede los vegetales, localizándoseen la pared
primaria y sobre todo en la secundaria. Está formada por cadenas lineales de D-glucosa
unidas por enlaces 13-1,4. El grado de polimerizaciónde la celulosaoscila entre 8.000 y
36
14.000 unidades (Barceló y col., 1992), lo que supone una longitud de cadena de 40.000 A
a 60.000 A y un peso molecular superior a 1.000.000. La variación en el grado de
polimerización, así como en la complejidad y estabilidad de la estructura, dependen de la fase
de desarrollode las paredesprimaria y secundaria.
Los gruposhidroxilo de las unidadesde glucosafavorecenla formacióndenumerosospuentes
de hidrógeno, intra e intermoleculares,que estabilizan la estructura.Así, las cadenasde
celulosasedisponende forma paralela,asociándoseintermolecularnientemediantepuentes
de hidrógeno,establecidosentreel hidrógenodel grupo-OH del C3 y los puentesde oxígeno
de las moléculasde glucosaadyacentes,y entre los grupos -OH del C6 y los oxígenos
glicosídicosde las cadenasadyacentes(Figura n0 11). Las cadenasde celulosa,debidoa su
configuraciónmolecular,tienden a agregarse,y, en función del númerode cadenasque se
asocien,sedenominande la siguientemanera:
- Fibrilla elementalo micela: formadapor treinta y dos cadenas de celulosa. Mide
entre 3,5 y 7,5 nm de espesor y tiene una longitud de varios ¡.tm. No puede ser observada
al microscopioóptico. En las fibrillas elementaleslas moléculasde celulosaestánorientadas
longitudinalmente,formandoun agregadocristalino fuertementeordenado,en el que todas
las moléculaspresentanla misma polaridad, esto es, tienen su extremoreductororientado
haciael mismo extremo (le la microfibrilla.
- Microfibrilla: está formada por veinte fibrillas elementales.Es discernible al
microscopioelectrónico. En esteestadoseencuentrala celulosaen la paredprimaría.
- Macrofibrilla o fibrilla: formadapordoscientascincuentamicrofibrillas y visible al
microscopioóptico.
— Fibra: formada por, aproximádamente,mil quinientas fibrillas. Constituye la
estructuramacromolecularde la paredcelular.
La disposición de estoscomponentespuedeapreciarseen la figura n0 12. La celulosase
presenta en la pared celular vegetal en forma de agregadosfibrilares cristalinosqueconfieren
a la paredla mayorpartede su resistencia,si bien a lo largode su estructuraexistentambién
37
II(1
II — 4 ~ll (Ib ~ II —9 oíl, O\ - Q~
(II o -‘——7~ A• ii—o Oil CII, --
o 1-U. o.JI O H
Oil ~U II110 O-Il~
o ~ ~o’
(9 O—Fi CH,6~II, II
Figura n0] 1.- Estructurade la celulosa(Barceló, 1992).
Figura n012.- Estructura detallada de las paredes celulares(Esau, 1976)(a) Cordón de fibras(h) Corre transversal de capas
(e) Fragmento de la capa media de la pared secundaria mostrando las inacrofibrillas (bianco)y los espacios interfibrilares (en negro)
(d) Fragmento de una macrofibrilla mostrando las ,n¡crofibrillas (en blane~,)
(e) Micelas(1-) Fragmento de una ín¡cela
(g) Fragmen«> de una molécula de celulosa
<•11
II 1> <>11
regionesno cristalinas. La susceptibilidadde la celulosaa la hidrólisis, tanto ácida como
enzimática,pareceestarrelacionadacon la extensiónde regionesno cristalinascon bajogrado
deordenamiento( Southgate,1969; Cummings, 1981).
3.3.1.2.Hemicelulosas
Se agrupan bajo esta denominaciónpolisacáridos de estructura compleja y diferente
composiciónquímica, que por hidrólisis generanpentosas,hexosasy ácidosurónicos.
Aunque su clasificación es difícil, el criterio más generalizado se basa en el residuo
monomérico predominante. De esta manera se hablaría de xilanos, arabinoxilanos
,
alucoarabinoxilanos,glucuronoxílanos,2alactomananos,alucomananos,galactoglucomananos
,
xíloglticanos .. (Theander, 1981). Si se atiende a las propiedadesquímicas,entonces,se
tendrían:hemiceltílosasA que precipitancon ácidoacéticoy hemicelulosasB queprecipitan
con etanol (Southgate,1969). En generalsepuededecir queson solublesen álcali pero no
en agua.
Todas las hemicelulosas poseen dos características estructt¡rales comunes:
-Son polímerosque presentantina cadenaprincipal plana de azúcares,unidos casi
siempremedianteenlaces8-1,4 de la que puedensalir un númerovariablede ramificaciones
lateralescortas(Sotíthgate,1969; Barcelóy col., 1992); respectoal gradoderamificaciónhay
diferenciassegúnlos distintosautores(Theander,1981; Barceló y col., 1992).
-Poseenalgunacaracterísticaque les impide formaragregadoscristalinosy, por tanto,
su estrtícturaes menosrígida que la de la celulosa. Puedencristalizar con las cadenasde
celulosaformandopuentesde hidrógenoentrelos grupos-CH2OH de las cadenasdecelulosa
y los oxígenosglicosídicosde las hemicelulosas.
Entre la diversidad(le polímeroshemicelulósicosexistentes,sel)uedenconsiderarcomo más
abundantesxiloglucanosy xilano:
39
- Xiloalucanos:poseenunacadenaprincipal de residuosde glucosaunidosporenlace
13-1,4, a la que se unen por cadenaslateralescortascadenasde residuosde xilosa (a-D-
xilopiranosa) unidos por el carbono 6 de glucosade la cadena principal; estascadenas
lateralespueden agrandarsecon restos de B-D-galactopiranosa,L-arabinofuranosaó B-L-
fucopiranosil-(1 ,2)-J3-D-galactopiranosa(Figura n0 13).
- Xilano: la cadenaprincipal estáconstituidapor unidadesde xilosaunidas mediante
enlaces13-1,4, y puedenpresentarcadenaslateralesde residuosde arabinosaunidasal C3 de
algunasunidadesde xilosa; asícomo tambiéndeácidogalacturónicoy 4-0-metil-glucurónico
unidos al C, de xilosa (Figura n0 14).
La distribución de las hemicelulosasestárelacionadacon la taxonomía,pero ningún grupo
pareceexclusivode un determinadotipo de plantas. Los xiloglucanos,que constituyen un
componentemayoritariode la pared primaria de las dicotiledóneas(hastael 20% del peso
seco total), representanhastael 5% en la paredprimaria de las gramíneas;en éstashastael
20% de los carbohidratosde la paredson xilanos siendoun componentemásescaso(no más
del 5%) en la pared de las dicotiledóneas.Se ha observadola presenciade 13-glucanosno
celulósicosen paredescelularesde monocotiledóneastalescomoavena,maíz, trigo y cebada
con enlacesdel tipo 3-l-.4 y 13-l-.3. (Fry, 1989; Hayashi, 1989)
3.3.1.3.Sustanciaspécticas
Son el componentemayoritariode la lámina mediadondeactúancomo elementode unión
entrelas célulasy tambiénsepresentanen la paredprimaria. Sonpolisacáridosricos en ácido
galacturónicoy, segúnCarpita, (1990) sepuedendistinguir las siguientesestructuras:
- Homogalacturonano.
- Ramnogalacturonano1.
- RamnogalacturonanoII.
El homoqalacturonanoes una estructurano ramificada, que estáformado por unidadesde
ácidogalacturónicocon enlacesa-1,4.
40
iK~i$=2O ~‘IosaOH O
— ~ CH, HO
OCH, CH,nul
HO OH0 HO
YE>, O talos.
HO—CH, ~O-..
OHCH
HO o
oXILOGIIJCANO
XILOGIUCANO
L-utab..na <3 —.2)R galanas $41 —.2>
1-tucos. 2<1 —. 2> O-gslacao.. $43 —. 2>
Figura n013.- Estructurade xiloglucano(Guardiolay García, 1990).
HO—CH, OH
o.l..arabinosa
HO O
MO
O—CO
HO
O
XlLAPiO
,-Lnñínou
XILAPIOCadanas lamaln unidas a las molÉculas da ArabinosaO galactosa $43 —. SI0-sílosa $43 — 2>
O
O
Figura n014.- Estructura de xilano (Guardiola y García, 1990).
Los ranlnoaa]acturonanostipo 1 sonpolímerosconstituidospor unionesa-] ,4 entreresiduos
de ácido galacturónico, intercaladoscon residuosde ramnosaunidos por enlaces a-l,2
(Figura n”15). Aproximádamentela mitad de las moléculasde ramnosaestán unidas a
cadenas laterales formadas por: arabinosa (arabinanos), galactosa (galactanos) y
arabinogalactosa(arabinogalactanos).Los arabinanosestánmás o menosramificadossegún
la fuentevegetalde laqueprocedan,y los galactanosson relativamentepoco frecuentes.Las
cadenasde arabinogalactanopueden ser de dos tipos en función de la mayor o menor
ramificación y se denominanarabinogalactanotipo 1 y arabinogalactanotipo II (Barceló,
1985; Camita, 1990) (Figura n16). Existen estudios que demuestranque los polímeros
aislados(galactanos,arabinanos)son productosde degradaciónde polisacáridospécticosmás
complejos.
En cuantoal ramnocalacturonanotipo II pareceque es un polímeromáscomplejoque el de
tipo 1, cuya estructura no ha sido claramentedelimitaday cuyo papel fisiológico no seconoce
bien todavía(Camita, 1990). Los trabajosencaminadosa su caracterizaciónhan identificado
una amplia variedadde residuosterminalescomo ácidogalacturónico,galactosa,arabinosa,
azúcaresmetilados,y ramnosa,así como tambiéndiversossustituyentesde la cadena,tales
comoácidoglucurónico,apiosa, ramnosa,galactosay fucosa.La gran cantidadde residuos
glicosídicos encontrados sugiere una molécula altamente ramificada.
Otros autores(I3arceló y col., 1992; Melford y Prakash,1986)considerana los galactanos,
arabinogalactanosy arabinanoscomopolisacáridospécticosy no comoproductosprocedentes
de la hidrólisis de polisacáridosmáscomplejos.
Los gruposcarboxilosde los ácidosurónicosptíedenestarparcial o totalmenteesterificados
por gruposmetilos. Según el gradode metilación seestablecela siguienteclasificación:
- pectinas:sustanciaspécticasaltamentemetiladas
- ácidospectínicos:sustanciaspécticasparcialmentemedIadas
- ácidospécticos: sustanciaspécticasexentasde grupos metílicos
Los ácidospectínicosy pécticos,dadosucáracterde ácidodébil, tienen posibilidadde formar
salescon iones como calcio y magnesioque se denominarán:
42
Figuran015.-Estructurade ramnogalacuronano(Barcelóy col., 1985)
U: ácido galacturónícaR: ramnasa
A: arabínosaGAL: galactosaR: ramnosa
Figuran016.-Estructurade arabinogalactanos(Barceló y col., 1985)
- pectinatos: salesácidaso neutrasde los ácidospectínicos
- pectatos:salesácidaso neutrasde ácidospécticosque constituiránel componente
predominanteen la lámina mediao sustanciacementante.
Estoscompuestospuedenunirsea travésde las moléculasde azúcaresa otrosconstituyentes
talescomocelulosa,heniicelulosasy proteínas,formandola protopectina insoluble (Theander,
1981).
Las sustanciaspécticaspuedenserextraídasde las paredescelulares,sólo parcialmente,con
aguacaliente,ácidosmineralesdiluidos y calienteso solucionesde agentesquelantes(EDTA,
oxalato amónico,hexafosfatosódico) en caliente. La acción disolventedel agentequelante
dependerá,en parte,de su capacidadparaconiplejarel calcio unido a las sustanciaspécticas
de la pared.
Mediantediferentesprocesosbioquímicos,condicionadospor la fisiología de la planta, los
monómerosde la celulosasetransformanen ácidosurónicosoriginandocompuestospécticos.
La paredasí constituidatiene mayorcantidadde pectinasqtíe en condicionesnormales;como
consecuenciaestaparedpierderigidez y se licúa o gelifica.
El procesode gelificación o liquefaciónde la paredcelularpuedeoriginar la formación de:
gomas y mucflagos.
Comas.Seforman comoconsecuenciade procesosfisiológicoso patológicosvegetales
quedesencadenanla gelificación de las paredescelulares.Seextraena partirde los exudados
de las plantasque procedende las incisionespracticadasen las mismas,y ademáspresentan
una localización interna en el vegetal como compuestosde reserva destinadosa ser
consumidospor la planta.
Son polisacáridosque se pueden clasificar según la unidad monoméricamás frecuente:
galactano,glucuronomanano,galactomanano,xilano, xiloglucano(Southgate,1969).
Presentanla pro1)iedadcomún de ser sustanciascon carácterhidrofílico, que dan soluciones
44
víscosas cuando se tratan con aguacalienteó fría.
Mucílagos.Son polisacáridosformadosen el metabolismonormalde la planta.Entre
los másconocidosestánlos de semillas y los de las célulasexternasde vegetalesacuáticos.
Lascadenasestánformadasporgalactomananos,glucomananos,arabinoxilanos,xiloarabinano
y galacturonoramnanos.Son solublesen agua(Southgate,1969).
Polisacáridosalgínicos. Son polisacáridosobtenidosa partir de algas marinasque
formanpartede la estructurarígida de sus paredes.
3.3.2. Glicouroteínas
Una proporciónvariabledel pesode la pared,de hastamásdel 10% del total, es debidaa
proteínas. Casi invariablemente las proteínas se encuentran unidas covalentementea
carbohidratos,bien a moléculasde monosacáridos(arabinosay galactosafrecuentemente)o
de oligosacáridosy aún de polisacáridos, por lo que se denominan apropiadamente
glicoproteinas(le la pared (Figura u” 17). Se puedendividir en estructuralesy enzimáticas.
3.3.2.1.Glicoproteinas estrLIctlIrales
Algunasde las glicoproteinasde la paredno tienen asociadaactividadenzimática,por lo que
seclasifican como proteínasestructurales.La mayorparte de estasproteínasestructurales
caracterizadaspresentantin elevadocontenidode uno o dosaminoácidos,que representanmás
del 40% del total de aminoácidosde la moléctíla; se conocenproteínasde estetipo ricas en
hidroxiprolina,prolina, treonina, histidina, triptófano y glicina, entreotros.
De estasproteínas,las más estudiadasy mejor caracterizadasson las proteínasricas en
hidroxiprolina,denominadasextensinas,llamadasde estemodopor creersemnícíalmenteque
estabanimplicadasdirectamenteen el procesode alargamientocelular.Son abundantesen las
paredesprimarias de las dicotiledóneasdondellegan a representarhastael 10% de su peso
45
O CAOFNA PEPTIDICÁ
u
OH
OH
CAOENA PEPTIOICA ~ O
O
CAOENA PEPIIOICÁ~)oH
~y
O—CH,
O’
~n,San
un124
JH,O
OH
r
O CADENA PIPTIDICA
C O
— -rpw..M.sa
Hq
214,0
Figura n017. A) Dimerización de los grupos fenólicos del aminoácidotirosina, con laformación de un puentede isoditirosinaentredoscadenaspeptídicas.B) Enlaceentreun grupotirosinade unacadenaproteica, y el ácido felúricounido a un carbohidrato(Guardiolay García, 1990)
OH
o
‘1 POLISACARmO
seco, no tanto en las paredesde las monocotiledóneas,y secreeque estánausentesen la
mayorpartede las paredessecundarias.Unidasa los grupos -OH de sermae hidroxiprolina
seencuentrannumerosascadenaslateralesde hastacuatromonosacáridosde arabinosay, en
menor cantidad, moléculas de galactosa.
De este modo las moléculasde extensinaforman un entramadotridimensional intercalado
entrelos polisacáridosde la pared y unido covalentementea algunosde ellos.
3.3.2.2.Glicoproteinasenziniáticas
En las paredescelularesse han detectadotambiénglicoproteinasenzimáticas,en su mayor
partehidrolasas(glucanasas,galactosidasas,etc.) y peroxidasascapacesde actuarsobrelos
componentesde la pared (Guardiolay García, 1990).
3.3.3. Otroscomí>oneiítesasociados
3.3.3.1.Lignina
La lignina sólo sedepositaen determinadostipos de células,en las cualesconstituye,junto
con las proteínas,la fracción mayoritariade los componentesno polisacáridosde la pared
celular. Su formación sólo se inicia una vez finalizada la paredsecundaria,comienzaen la
lámina media y se infiltra en la matriz provocandosu expansiónpor todas las capasde la
pared (Lewis y Yamamoto, 1990).
La lignina se puede definir como polímero de alto peso molecular, que se forma por
deshidrogenaciónenzimática y posterior polimerización de los alcoholes aromáticos,
principalmente,coniferol, cumarol y sinapinol. Es un compuestoque carecede estructura
únicaya que su síntesisse llevaa cabosin control enzimáticode la polimerizaciónquetiene
lugar al deshidrogenarselos alcoholesfenólicos (Lewis y Yamamoto, 1990) (Figura n0 18).
47
El procesode lignificación tienedos funciones:comentay sujetalas microfibrillasde celulosa
y otros polisacáridosde la matriz y, debidoa que los complejoslignina-polisacáridosson
fuertes, el conjuntoofrece una gran resistencia,durezae impermeabilidad(eshidrófoba),
previniendola degradaciónbioquímicay los dañosfísicos.
Debido al elevadotamañomolecularde la lignina, la gran estabilidadde su estructuray su
unión covalentecon los polisacáridos(hemicelulosasy celulosa),la ligninaconfierea lapared
una gran rigidez, queimpide el crecimientocelular. Además,la lignina, al ocuparel espacio
entrelos poiisacáridosque anteseraagua,disminuyela hidrataciónde la paredasícomosu
permeabilidadal agua y los solutos. Por esta razón, una célula con elevado grado de
lignificación será un célula muertaya que se encontraráprácticamenteaislada.
3.3.3.2.Cutina. Suberina. Ceras
Los tres son compuestosde naturalezalipídica, que cuandose presentanen la célulaoriginan
modificacionesde la paredcelular: cutinizacióny suberificación,fundamentalmente.
Cutina. Las paredescutinizadasse suelenpresentaren las células externasde los
órganosaéreosvegetales.La cutinaestáconstituidaporpolímerosdehidroxiácidosde 16-18
átomosde carbono (Figura n” 19). Tiene carácterbipolar, que le permitedisponerseentre
la estructurapolisacáridatípica de la pared. El depósitose inicia en la lámina media.
Suberina.La suberinasesuelepresentaren tejidoso célulasespecializadascomo el
súber,las cubiertasseminalesy la bandade Casparyde la endodermisde la raíz (Guardiola
y García, 1990). Su composiciónquímica es similar a la de la cutina, pero la suberina
contienemayornúmerode ácidosdicarboxílicosy de fenoles(Figura n” 19). Se depositaen
el lado interno de la pared celular hacia la pared primaria, pudiendo llegar incluso a
enmascarara la celulosa.
Ceras. Son mezclasde alcoholes,ácidosgrasosy ésteresde ácidosgrasos.Se suelen
presentarjunto a cutina y suberinaen las paredescutinizadas y suberificadas.
48
Figuran018.- Posibleestructurade la lignina (Barcelóy col., 1992).
COMPONENTES MONOMERICOS
CH,iCH,,.eOON
CH,ICH,l..CH.OH
H,ÉCfr4,ISOoMOH
HOOCICH,LCOOH
SusIancuas i.nóIucas4m1830 n~i4?Ol
CUTINA
0. 16 C
CH9C”,I.COO”
~.srCM,l,.COO&~
o. u c
CH .IC$,¾CH.CH¡CX,i,C004
,¡,COCH
CH,ICH,¡.CN¡CH,I.COOH CH,¡CH,I,CH—CH¡CI,kCOOM
O” OH ¿5 0
¡rl 1t~ ,, 4. .r’YCH,¡CI¾¡,CH-CHICIS¡,WC”
OX OHON
Figuran”19.- Estructurade las moléculasde suberinay decutina(Guardiolay García. 1990).
“.COM
IICOX CX
—CM
Co ¡ 4-OCX,
H.CO
SUBERINACH.
O—e
CH ~
-4-o
C.O.CH,CCH,lrCHLCN,lrC¡ ~$,I. 0 4
1“—0” ¿.0 ~H¿¡g 0 ¡
¡ ¿¡,¡, 4..,. uH—0—C—iCH,I,.Cs.
CH—OH ¡5H.¡.
CM, CH,l, (.0
¡ ¿“¡—0—5,— ¡CÑ,s”,—¿
‘YC4CH0.p1 4C~ l.CM,O—C—ICH¡¡.jHCH¡¡.CHr-O
U ~.O ~ Y —¼
oo”
COMPONtNTES MONOMERICOS
3.3.3.3.Taninos
Son componentes minoritarios de la pared pero que influyen en sus propiedadesy
funcionalidad.
En algunasocasionessehan determinadojunto con la lignina obteniéndosevaloresanómalos
de la misma. Puedenser hidrolizables,liberando corno productosde hidrólisis glucosay
ácidos fenólicos, como el ácido gálico, y no hidrolizables, formados por flavanos
(Theander, 1981). Se puedenextraer del vegetalmediantesolucionesalcalinasy soluciones
detergentes.
3.3.3.4. Salesminerales
Del resto de los compuestosasociadosa las paredescelulareses importantecitar la sílice y
otras sales mineralescomo carbonato cálcico, carbonatode magnesioy oxalato cálcico.
Cuandose presentande formaanómalaen la paredcelular, producensu mineralización.
3.4. BIOSINTESIS DE LOS PRINCIPALES COMPONENTES
Las paredescelularescarecende capacidadbiosintéticay los elementosmonoméricosde sus
componentesse sintetizanen el citoplasma.La polimerizaciónde estos monómerospuede
realizarsetanto en el citoplasmacomo en la misma pared, segúnel componentede que se
trate (Anderseny Beardalí, 1991).
La síntesis de polisacáridos y proteínas de la pared así como de sus monómeros
(monosacáridosy aminoácidos) son procesoscitoplasmáticosasociadosa los sistemas
membranososde la célula: membranade retículo endoplasmáticoy/o aparatode Golgi para
todos los componentes,excepto para celulosa y calosacuya síntesis está asociadaa la
membranaplasmática.
50
La formación de lignina tiene Jugaren la paredpor Ja polimerizaciónin si/u deprecursores
secretadosasimismoen vesículasderivadasdel aparatode Golgi. Tambiénla cutina y la
suberinase polimerizan iii situ en la pared, y la síntesis de sus componentes monoméricos
tiene lugar en el interior celular.
En esteapanadoseexponenlos aspectosmásimportantesde la síntesisde los polisacáridos,
proteínasy lignina de la paredcelular (Gahan, 1984; Brett y HilIznan, 1985).
3.4.1. Biosíntesisde los polisacáridosde la paredcelular
3.4.1.1.Síntesisde precursores. Polimerización
Los azúcares-nucleótidosson los donadoresde los carbohidratosen la formación de
polisacáridosde la paredcelular.
Se puededividir el procesode formaciónde un azúcar-nucleótidoen dos etapas:la primera
consisteen la obtencióndelpolisacáridofosforilado(ej. glucosa-1-fosfato).Puedesintetizarse
mediantela fosforilación del monosacáridocon la intervenciónde ATP, una quinasay una
mutasa(Figuran0 20) y tambiéna partir del almidón por una reaccióncatalizadapor una
fosforilasa.
Las reaccionesde la segundaetapa,catalizadaspor diferentespirofosforilasas,permiten la
adición del azúcaral nucleótidoparaobtenerun monosacáridocon enlacesde alta energía,
que permitirán la incorporación posterior de otros monosacáridosen el correspondiente
procesode polimerización.
El uridin difosfato de glucosaesel donadorde azúcaren la mayoríade las reaccionesde
transglicosilación,en la biosíntesisde los componentesde la paredcelular (Figura n0 21).
51
O-glucosa + ATP — D-glucosa-6-P+ ADPkinasa
O-glucosa.6-P — D-glucosa-1-P
mutasa
Figuran020.- Fosforilacióndel monosacárido(Barceló y col., 1992).
Glua,sa-4Pglicosiltransterasa
manaDogalactano
celulosacalosa
pectinas
~ xilano
arabinano
Figura n”21.— [nterconversiónde nucleósidosdifosfato-asasapartir de UDP-glucosa(Robert
UTP
uy Roland. 1992).
Otros nucleótidosde azúcartienen una estructurasimilar, sustituyendola basenitrogenada
por una de las basespúricaso pirimídicas (adenina,guanina,citosina, etc.), o la molécula
deazúcarpor el monosacáridocorrespondiente(Guardiolay García, 1990).
Entretodos los nucleótidosde azúcarposibles,solamentelos derivadosdel uracilo y de la
guaninason donadoresde azúcaren la síntesisdepolisacáridosestructurales.En el cuadro
n0 1 seobservanlos principalesdonadoresen el caso de las hemicelulosas.
Tambiénsonposibleslas interconversionesde unosazúcares-nucleótidosen otros, lo queserá
de gran importanciaparala biosíntesisde los polímerosno celulósicosde la paredceJular.
Las enzimas catalizadoresde estos procesosson: deshidrogenasas,decarboxilasasy
epimerasas.
La polimerizaciónde estoscompuestosen los polisacáridosestructuralesde la paredtiene
lugar por la acción de sintetasas,enzimas asociadasa las membranasdel retículo
endoplásmico,del aparato de Golgi y en algunos casosdel propio plasmalema. Los
polisacáridosasí sintetizados se acumulan en el interior de sáculos o vesículasy son
secretadosal exterior medianteun procesode exocitosis.
Duranteel transporte,los polisacáridospuedenser modificadospor la acción de enzimas
específicas. Estas modificaciones de las moléculas incluyen procesos como son la
esterificación,la formación de ésteresmetiicos y etílicos, la eterificación, la adición de
compuestosfenólicos,etc.
La secreciónfinal a la paredimplica la fusión de las vesículasde Golgi con el plasmalema
y medianteexocitosisse vierte el contenidohacialaparedcelular. A continuaciónseproduce
la ordenaciónde las moléculasen la estructurade la pared, procesopoco conocidoen sus
detalles.Despuésde la secreción, los polisacáridosson modificadospor las enzimasde la
pared,lo que involucraprobablementela unión covalentede algunasmoléculas.En la figura
n0 22 se muestraun resumensimplificado de los procesosde síntesis y secreciónde los
polisacáridosestructurales.
53
¡ CITOSOI.
APARATO D~ GOLflI
Metálación <Sadenosil metiomna)Acetilación (Acetil CoA){ ierulilación <Ferul¡l-CoA>
PLASM ALE MA
Figuran->22.- Esquemade la localización de los procesosde síntesis ysecreciónde los polisacáridoshemicelósicosy pécticos.
Nucleátidos dearcar Qirof oit orílasas
Sintetasasde polisacáridos
Secreción<esocitosis)
regulada por Cati tos óIic o
VESíCULAS DE GOLOl
Mod,f¡cac¡onespoitpoli.nsri»ción
Modificaciones PARED CELULARpostdeposición
Cuadro n0 1. Resumende la biosíntesisde liemicelulosas.
Nucleotido donador de azucar Producto formado
UDP ó TDP-ácidogalacturónico Acido poligalacturónico
[5-Adenosilmetionina]
UDP-arabinosa,UDP-xilosa
[Esteresmetílicos de poliurónidos]
Arabano, xilano
UDP-xilosa,UDP-ácidoglucurónico
UDP-galactosa
Glucuronoxilano
Galactano
GDP-manosa Manano
UDP-xilosa,UDP-glucosa Xíloglucano
GDP-manosa,GDP-glucosa Glucomanano
UDP-apiosa,UDP-ácidogalacturónico Apiogalacturonano
UDP-glucosa Glucanocon enlacemixto
Glucano/3-1,3
El control del procesoestáejercidopor la secreciónde macromoléculasdesdeel interior al
exteriorde la célula (Barceló y col., 1992).Esteprocesoestácondicionadopor la síntesisde
las macromoléculasque puedeestarcontroladapor:
-La sintetasacorrespondiente(cantidady actividadde la misma).
-Transporte de precursores hacia el sistema endomembranoso, proceso que debe
implicar la presenciade transportadoresespecíficos, ya que aunque Jas sintetasasse
encuentrendentro del lúmendel sistemamembranosono son funcionaleshastaque seponen
en contactocon sus sustratosespecíficos.
-La incorporaciónde estospolisacáridosa la paredcelulardependede su transporte
empaquetadosen vesículasy de la fusión de estasvesículascon el plasmalema.
-La tasade fusión pareceserotro factorreguladordela formaciónde la paredcelular,
ya que el númerode vesículasaptasparala fusión excedeal númerode las que realmentese
fusionan.
3.4.1.2. Biosíntesisde celulosa
Se asociaal plasmalemaen lugar dea las membranasdel aparatode Golgi.
Aún no seconocecon exactitudcómo se sintetiza.La mayor dificultadpara ello resideen la
incapacidad para obtener un sistema in vitre a partir del cual se produzcacelulosa
identificable y en cantidadapreciable. Actúa como precursor UDP-Glucosa y hay un
requerimientoabsolutode Ca2~ y Mg2~, y celobiosaque, probablemente,actúacomoaceptor
de restosdeglucosa, iniciándoseasí la formaciónde la cadenade celulosa.
La enzimasintetasade celulosa,que no ha sidoaisladatodavía,polimerizaUDPGcitosólico,
secretandodirectamentela moléculaformadaal exterior de la célulaen la superficieinterna
de la pared. Se ha observadola existenciade agregadosmacromolecularesasociadosa un
56
extremode las microfibriulas, que seinterpretancomocomplejosenzimáticosintegradosen
la membrana.Cadauno de estoscomplejossintetizasimultáneamentetodas las cadenasde
celulosaqueforman la microfibrilla, teniendolugar la ordenacióncristalinade las moléculas
despuésde la síntesis,probablementea cortadistanciadel complejoenzimático.
La ordenaciónparalelade las fibrillas de celulosaestárelacionadacon la orientaciónde los
microtúbulosen el citosol (Figura n0 23). Aunquesehan propuestoalgunosesquemaspara
explicarestarelación,el mecanismoqueregulala orientaciónde las microfibrillasde celulosa
no se conoce con precisión (Emons y col., 1992).
3.4.1.3. Biosíntesis de hemicelulosas
Como ya se vió anteriormenteen su estructurase incluyen xilosa, arabinosa,galactosa,
manosa,glucosay ácidoglucurónico.
Unavez formadoslos precursoresy, teniendoen cuentala posibilidadde las interconexiones
de unosazúcares-nucleótidoscon otros, éstospuedencederel azúcara un aceptor,de igual
forma que sucedeen la síntesisde celulosa. Así, se han estudiadosistemascelularesde
vegetalessuperiorescapacesde transferir xilosa desde UDP-D-xilosa a un xilano 13-1,4, o
manosadesde UDP-D-manosaa un manano13-1,4 etc. Un sistemaenzimáticoes capaz
tambiénde transferirel grupo metilo a partir de 5-adenosilmetioninaa las subunidadesde
ácidoglucurónicoque forman partede hemicelulosas.
3.4.1.4.Biosíntesis de pectinas
A partir de Phaseolusaureusseha obtenidoun sistemacapazde formar cadenasde a-l,4-
ácidogalacturónicoutilizando como donadorUDP-D-ácidogalacturónico.
En un sistemaobtenidoa partirde tomate,la incorporaciónde ácidogalacturónicotienelugar
a partir de TDP-D-ácidogalacturónico.
57
Figuran023.-Modeloespeculativoparala síntesisde celulosaen la membranaplasmáticade los vegetales(Emonsy col., 1992).
En remolachase ha visto que estaplantacontieneincluso un sistemaenzimáticocapazde
convertir TDP-glucosaen TDP-D-ácidogalacturónico.
La metilaciónde los gruposcarboxilotienelugardespuésde que se haformadola cadenade
ácidopoligalacturónico;pareceserque el donadorde los gruposmetilo es el compuesto
S-adenosil-L-metionina.
3.4.2. Biosíntesisde 2IicoDroteínas
Las proteínasde la paredsesintetizanen el retículoendoplásmicorugoso,siendosecretadas
al exterior por el mismo procedimientoque los carbohidratos,en vesículasdel aparatode
Golgi. Previamentea su secreciónlas moléculasdeproteínaseacumulanen las vesículas.
Sufrenvarias modificacionesdespuésde la síntesisde las cadenaspeptídicasy antesde su
secrecióna la pared. Entre estas transformacioneshay que destacarla formación de
hidroxiprolina en las cadenasde extensina.En el código genéticoexiste un codón para la
prolina pero no para la hidroxiprolina que se tiene que formar por reaccionesde post-
traducción.
La unión delas cadenaslateralesde mono- y oligosacáridosa las moléculasdeproteínatiene
lugar también antesde su secrecióna la pared. El mecanismono es bien conocidopero
involucra probablementela transferenciadesde nucleótidosde azúcar por la acción de
transferasasespecíficas.La glicoproteinaen formasolubleessecretadaen vesículashacia la
paredcelular. Su insolubilizacióny unión fuertea la paredpareceserdebidaa la formación
de enlaceso puentesde isoditirosina,procesocatalizadoporuna peroxidasa.El esquemade
la biosíntesisde extensinapuedeobservarseen la figura n0 24.
59
3.4.3. Biosíntesis de 112n¡na
El primerpasopareceser la formaciónde los aminoácidosaromáticosfenilalaninay tirosina,
que puedenconvertirseen diversosderivadosdel ácidocinámico; estospor reducción dan
lugar a los alcoholescumariico,coniferílico y sinapílico a partir de los cualesse forma
lignina. Las ligninas se forman ya en la paredpor reaccionesde polimerizaciónespontánea
(no catalizadasenzimáticamente)de los alcoholescinámicos (Figura n0 25). Este carácter
espontáneodeterminaque la lignina no seaun compuestoúnicoy homogéneosino un grupo
de sustanciasde ciertaspropiedadescomunes.
Parala lignina, la síntesisde los precursoresque tiene lugar en asociacióncon membranas
del retículo endoplasmáticopareceestarreguladapor los niveles de algunasenzimascomo
fenilalanina-amonio-liasa(PAL). La polimerizaciónocurreen la paredcelulary pareceestar
reguladapor las enzimasimplicadas,unaperoxidasay/o ascorbatoliasa(Lewis y Yamamoto
1990; Barcelóy col., 1992).
3.5. ESTRUCTURA DE LA PARED CELULAR
La forma en que seunen los diferentescomponentesde la pared celulares, en gran parte,
desconocida.Esto es debido principalmentea la poca información que existe sobre sus
estructuras.
A continuaciónsedescribirála organizaciónde la paredprimaria y de la paredsecundaria.
3.5.1. Paredprimaria
En la pared celular primaria las hemicelulosasy las sustanciaspécticas presentanuna
disposiciónamorfamientras que los hacesque constituyen la celulosason los que actúan
comoverdaderocomponenteestructural,
60
SE-
~eGolv
Vesículas seCreto-ras, aparato deGolgi
S¡ntcs¡sdcl ~ol¡pcpt¡dOneo en proltra
Hidroxilacion ~ pepudil-prOliflahidrOxtiaSa
Polípeps¡dorico enhídrox,pFOIiTia
UDP~arabifOSaGI¡cos¡Lac¡on ~— UDP-galactosa
Cl,coprOletflaSec¡tcwn
PARED CELULAR
Fraccion Enlacesoluble Isodtt~rossna
5.Fraccion unidacOs4alefltCmCfltC
Figura n024.- Esquemade biosíntesisde extensina(Guardiolay García, 1990).
~1Gumarinas
Rttuwtn
Alcoholescinamícos
~na
Gon~ugados de lasácidos cinamicos
Degradaciónoa,csal
~xí.ou2~oicos
C~n¡ugatwn tMaknt~ CtA
~noides
Figuran (>5,~ Esquemade la biosíntesisde sustanciasfenólicas (Guardiolay García,1990).
Los polímerosestructuralesde Ja paredestán interconectadosentresí mediantediferentes
tipos de enlacesque pueden ser covalenteso no covalentes.Entre los enlaces de tipo
covalentese encuentrael enlaceglicosídico (ej. xiloglucano-pectina)y como enlacesno
covalentesaparecenel enlaceporpuentede hidrógeno(ej. xilolucano-celulosa)y los enlaces
iónicos (ej. enlacesentrepolisacáridospécticos) (Melford y Prakash,1986).
Sobre la base de estas observaciones se han expuesto varios modelos estructurales de pared
celular que serán diferentessegúnprocedande plantasdicotiledóneaso monocotiledóneas.
Cualquiermodelodeparedcelularprimariadebepermitir explicarlas siguientespropiedades:
- gran resistenciaparasoportarfuerteoposición
- facilidad para crecersin resistencia
- comportamientoen el tratamientoquímico ó enzimático
3.5.1.1. Pared primaria de plantas dicotiledóneas
Aunqueningunode los modelosestructuralespropuestoshastala fechajustifican plenamente
la disposición estructural de los distintos componentesde la pared celular de las
dicotiledóneas,sedescribiránaquellosqueestánbasadosen un mayornúmerode evidencias
experimentalesy gozandela mayoraceptaciónentrelos científicos,si bien hay que teneren
cuentaquelos modelospropuestossebasanen el estudiode un númerolimitado de tejidos
vegetalesy sedebenconsiderarsólo modelosteóricos.
* Modelo de Albersheim y colaboradores
Fue propuesto por el equipo de Albersheim (Keegstra y col., 1973; Albersheim, 1975;
Albersheim, 1978).
Se basa en la idea de que todos los componentes de la pared celular pueden interaccionar
entresí pormedio de enlacescovalentesy su unión a travésdel xiloglucanomediantepuentes
de hidrógeno con las fibrillas de celulosa. Para explicar este modelo se han propuesto los
62
esquemasde las figuras n0 26 y 27.
En ellos puedeapreciarseque las fibrillas de celulosa, agregadaslateralmentemediante
puentesde hidrógeno,estáncubiertascompletamentepor una capade xiloglucanode tina
molécula de espesor.La unión entre ambos polisacáridosse hace mediantepuentesde
hidrógeno.En el extremoopuestoestasmoléculasde xiloglucanoseunenaarabinogalactanos.
Los extremos reductores de arabinogalactanos seunen a las cadenasde ramnogalacturonanos
por enlaceglicosídico.
Los residuosde proteínade estapared enlazancon los polisacáridosmedianterestosde
hidroxiprolina, seunenglicosídicamentea tetraarabinósidosy dan lugar a los protoglicanos
y glicoproteinas.
Por último, unidas covalentementeal ramnogalacturonano,se encuentranlas cadenasde
arabinogalactanosconectadasa restosde sermade la proteínade la pared.
Aunque hay evidencia del enlace de hidrógenoentre los xiloglucanos y las fibrillas de
celulosa,hay pocoapoyoexperimentalquejustifique los enlacescovalentesentrexiloglucano
y cadenaslateralesneutrasde pectina. Sin embargo,la observaciónde que la extracción
catalizada con poligalacturonasa facilita la separación de una pequeña cantidad de xiloglucano
de las paredescelulares, sugiere que hay algún grado de interacción (probablementeno
covalente)entrela fracción pécticay el xiloglucano.
La glicoproteina,ricaen hidroxiprolina,esun componentede las paredescelularesprimarias
pero, a pesar de ello, Albersheim (1978) ha propuestoun modelo reformadoen el que
excluyendichaproteína sobrela basede que no se ha demostradoexperimentalmenteque
estuvieraunidade forma covalentea los polisacáridosde la pared celular. Desdeentonces
otras fuentes han subrayado, igualmente, la ausencia de enlace covaJenteentre los
polisacáridosy la proteínade la pared.
63
Glicoproteina
Microfibrilla
Pectinaneutra
Hemicelulosa
Figura no 27 .- Modeloestructuralde paredprimariasegún Albersheim (Cortés. 1990)
¡II II
%RAMN&GAI.ACTURONANOkJ.,.~i. ¿~A RABINO-
GALAaANO II
~,i,,,,iIt
Figura n0 26.- Modelo estructural de pared primaria
segúnAlbersheim (Barceló y col., 1992).
Pectinaácida
* Modelo de Lamport
Estemodelo sebasaen la existenciaen la paredde una estructuraentramadaque constade
dospolímeros: microfibrillas de celulosapenetrandoen la malla de una red de extensina,
“suspendidas”en un gel hidrofflico de pectina-hemicelulosa.Los esqueletosde celulosay
extensina, aún sin estas covalentemente unidos, están entrelazados por la formación de lazos
cerradosde extensinaalrededorde las microfibrillas. Esta hipótesispermite que la pared
celular searígida y al mismo tiempo capazde extendersede maneracontrolada,implicando
al xiloglucano en el control de este crecimiento. El xiloglucano unido por puentesde
hidrógenoa la celulosaactuaríacomo un cerrojoquese abredurantesu giro, permitiendoque
las microfibrillas decelulosase deslicena travésde la malla de extensinahaciendoposible
el crecimientoen extensión(Melford y Prakash,1986) (Figuran0 28).
* Otros modelos
-Modelo de Monro.
Estemodelo se basaen los estudioshechossobreparedescelularesde lupino. Coincide con
el modelodeAlbersheimen la consideraciónde microfibrillas de celulosainterconectadaspor
una matriz de polisacáridos.
Este modelo dibujado por Monro en 1976 está recogidopor Melford y Prakashen 1986
(Figuran0 29). El esquemase explicade la siguienteforma: la mitad de la figura representa
el entramadoextensina-hemicelulosay la otramitad representapor separadoel entramadode
sustanciaspécticasque se creeno incluye la glicoproteinade la pared, la extensina. Así, las
microfibrillas decelulosaestánenlazadasentre si por dos retículosde polimeros separados.
El primero está compuestopor glico-proteina de la pared y polisacárido(probablemente
hemicelulosas), y el segundo está compuesto por los polimeros pécticos.
-Modelo de Melford y Prakash.
Todos los esquemaspropuestostratande explicarla unión de unospolisacáridosaotrospero
faltaría explicar con claridad si todas esasuniones dan lugar a varias capasy cómo se
disponenéstas.
65
Celulosa
Extensínalisa
4 Puentedeísodiúrosina
Figuran0 28.-
2<
celulosa
Xilogiucano
Pectina
Modelo estructuraldeparedprimariasegúnLamporty Epstem(Barceló y col., 1992).
Extensina
HéliCe deextens,na
Cuadro n0 II. Contenido relativo de los distintos tipos de polímeros presentesen
paredescelulares de monocotiledoneasy dicotiledoneas.
Componentes Monocotiledoneas
% pared celular
Dicotiledoneas
% pared celular
Hemicelulosa
Xiloglucano
Glucuronoarabinoxilano
f3-D-glucano mixto
65
+
+ + +
+ +
24
+
Celulosa 15 23
Pectina
Acido (l—4) cx-D-Galacturónico
Ramnogalacturonano1
RamnogalacturonanoII
Arabinano,galactano,AGP
10
+
+
2
+
34
+ + +
+ +
+
+ +
Proteína
Extensina
AGP
10
+
++
19
++
++
Dadas las limitaciones que presentanlos modelosanteriores,Melford y Prakash(1986)
proponenotra forma de representartridimensionalmentela disposiciónde los polisacáridos
de la paredcuyo esquemaserecogeen la figura n’> 30.
En estemodelo, en la partemás externade la paredcelular se depositanvarias capasde
pectinaque forman un entramadoreticular externoque constituye la lámina media. Las
cadenaspécticasque forman dichas capasestán interconectadaspor enlacescovalentesy
puentesdecalcio, y presentanalgunasmoléculasde glucosay xilosa unidascovalentemente.
No seproponenunionescovalentesentre las sustanciaspécticasy ningún otro componente
de la paredcelular, si bien algunasregionesde estos polímerosestán fuertementeunidasa
xiloglucanospor enlacesde hidrógeno.Bajo las capasde la lámina media se sitúan varias
capasde fibras de celulosaunidas al xiloglucano medianteenlace no covalente.La unión
entre xiloglucanos asociadosa la celulosa está facilitada por la glicoproteina rica en
hidroxiprolina, a travésde unionesno covalentesque incluye puentesde isoditirosina.
3.5.1.2.Paredprimaria de plantasmonocotiledóneas
Las paredescelularesprimariasde monocotiledóneas,del tipo de las gramíneas,presentan
una naturalezadiferentea las paredesde dicotiledóneas,por lo que ningunode los modelos
estructuralesanteriormentemencionadosesválido paraestetipo de plantas.
En el cuadron0 II secomparael contenidorelativo de los diversospolímerospresentesen
dichasparedesprimarias (Carpita, 1990).
En monocotiledóneas,el tipo de polisacáridomásabundanteson las hemicelulosas,con una
proporciónentreel 50 y el 70%, siendoel glucuronoxilanoel polímeromayoritario,mientras
que Ja proporciónde hemicelulosasen dicotiledóneases inferior y la fracción predominante
esel xiloglucano. Al contrarioqueen las dicotiledóneas,la celulosaesmenosabundanteen
los tejidos de monocotiledóneas;asimismo las sustanciaspécticasse encuentranen menor
proporción en las monocotiledóneas,aproximádamenteun 10% frente a un 34% en las
dicotiledóneas.Por Ultimo, la proteínaes másabundanteen dicotiledóneas(Carpita, 1990).
68
Figura29.- Modeloestructuralde paredprimariasegúnMonro (Meliord y Prakash,1986)A: entramadode extensina-hemicelulosa.B: entramadode sustanciaspécticas.M: microfibrillas.
t ‘
A
a
c
Dirección de elongación
Ramnogalacturonano
Cadenalateralde azúcaresneutros
~a~rabiyo.galactano/arabinano/galactano
Regiónesterificadade pectina
Distribuciónde glicoproteinaenhidroxiprolinaenlazadaporpuentesde isodifirosina
Fibrillasde celulosa
A EntramadodesustanciaspécticasE Capadecelulosadistribuidaal azarC Capadecelulosaordenada
Figura«‘30.-Modeloestructuralde paredprimariasegúnMelford y Pr.akash(1986)
3.5.2. Pared secundaria
El material fibrilar de la pared secundariaestáorientadode forma más regularque en la
paredprimaria y el ángulode orientaciónde este material cambiadurantela formación, lo
que permitedistinguir, segúnalgunosautores(Barcelóy col., 1992) variascapas:
-CapaS~: es lacapaexternao máspróximaa laparedprimaria,en dondelas espirales
de celulosaforman un ánguloamplio con el ejecelular.
-CapaS2: es la capaintermediay la de mayor tamañode la paredsecundaria.
-Capa53: es la capainterna,que estáen contactocon el protoplasto.En estacapala
inclinación de las microfibrillas esmenor.
Apartede la celulosahay otros polisacáridoscomo hemicelulosasaunqueson relativamente
menosabundantesqueen laparedcelularprimaria. Otrassustancias,principalmentelignina,
puedendepositarseen estaparedsecundaria.
La formaciónde la paredsecundariaestáacompañadaa menudopor una modificaciónen la
composición de la pared primaria y la lámina inedia (modificacionessecundariasen la
composición). Normalmentela modificación es debida a la impregnacióncon suberina
(suberificación)o con lignina (lignificación).De formacaracterísticala lignificación se inicia
en la láminamediaprogresandogradualmentehacia la paredprimaria y, finalmentehacia la
secundaria.
Las paredesexteriores, así como las células que bordean los espaciosintercelularesen
algunosórganos(ej. la cavidadsubestomáticade las hojas),acumulancutina. Estasustancia
puedeimpregnarlas paredes(cutinización)y aún depositarseen superficie(cuticularización).
La cuticularizaciónno impide el crecimientode la pared.
70
4. EVOLUCION DEL CONCEPTO DE FIBRA ALIMENTARIA
El término “fibra alimentaria” correspondea un grupode compuestosdediferenteestructura
químicay no siemprebienidentificados.En el momentoactual todavíano hayacuerdosobre
cuálesson estoscompuestosy, menosaún, sobresu actividadfisiológica.
Hellendoorn (1981) se refirió a la fibra alimentariacomo “una abstracción”.Quizá fue
demasiadolejos pero realmentepensaren la fibra alimentariacomo un conceptoes más
adecuadoqueconsiderarlauna sustancia.De hechoabarcauna seriede conceptoscadauno
de los cualestienesu propia validez y sus propiaslimitaciones.El término fibra alimentaria
es simplementeuna expresiónabreviadaque cubreuna amplia variedadde conceptos.
El desarrollodeestetérminopasaporvariasetapasque, siguiendoun ordencronológico, se
pueden clasificarde la siguienteforma:
- Investigacionespreliminares.
- Estudiosepidemiológicosy primerasdefiniciones.
- Nuevasdefinicionesy discusiónsobrelos componentes.
4.1. INVESTIGACIONES PRELIMINARES
La primera referenciabibliográfica que se tiene de la fibra datade 1805 en la cual se
denomina“fibra bruta” al residuo que se obtiene por tratamientoquímico de la muestra
(Heredia, 1980; Asp y Johansson,1984).
Como puedededucirsede la definición, el conceptode fibra brutaestotalmenteanalíticoy
no lleva implícita ningunaconsideraciónrespectoa los componentesque en ella figuran ni
en cuantoa la trascendenciafisiológica de los mismos.
La inquietudporestafracción del alimentoha sido constante,a lo largodel siglo XX, en los
71
investigadoresdedicadosal campode la alimentación.Ya en 1929 MacCancey Lawrence
clasificaronlos carbohidratosen disponiblesy no disponibles(Southgate,1969).Es laprimera
vez que se hace referenciaa la no biodisponibilidad fisiológica de un componentedel
alimento, sin precisarcualesson las característicasestructuralesque lo hacenindigestible.
Durantelos años30, algunosinvestigadorescomo Williams y Olmsted (Asp y Johansson,
1984) aislan analíticamente,mediantetratamientosenzimáticos,un residuo insoluble que
representauna confirmaciónexperimental“in idtro” de la no disponibilidadfisiológica de
ciertoscomponentesde los alimentos.
Todo estetrabajo, bibliográficamenteescaso,lleva a acuñarel término “fibra alimentaria”
dado como tal porHipsley en 1953 (Asp y Johansson,1984). A partir de estemomentodos
conceptosmarcharánunidos: fibra alimentariay no disponibilidadfisiológica.
En la décadade los 60 el máximoexponentede la tendenciaa relacionarla fibra alimentaria
con su no digestibilidad fisiológica fue Van Soest. En 1966 la define como el “material
orgánicoinsolublee indigestiblepor las enzimasde los animales”.La dualidadconceptual
anteriormentemencionadase ve reflejadaen un método que no reproduceningún tipo de
condiciónfisiológicaperoa partir del cual Van Soestidentifica unoscomponentesconcretos
porprimeravez: celulosa,hemicelulosasy lignina. La definición semodifica quedandocomo
sigue: “la fibra es el material insoluble vegetal que no es digestible por las enzimas
proteolíticas y diastásicas, y que no puede ser utilizada excepto por la fermentación
microbianaen el tracto digestivo de los animales”. En estadefinición se introducen dos
nuevasideas:la procedenciade la fibra de las células de origen vegetaly el hechode una
posibleutilización fisiológicade la misma.
Gran parte de los estudiosanalíticoscorrespondientesa estaépoca,sobre los que se han
desarrol]adoestasideas, han sido realizadossobrematerialesdestinadosa la alimentación
animal.
72
4.2. ESTUDIOSEPIDEMIOLOGICOS Y PRIMERAS DEFINICIONES
El conceptoy término fibra alimentadase confirmantotalmenteen relacióncon su actividad
fisiológica en el organismohumanoen el año 1972, a partir de los estudiosepidemiológicos
realizadosporBurkitt y Trowell, segúnlos cualesexisteunarelaciónentrecarenciade fibra
en la dietay aparicióndeunaseriede enfermedadesdigestivasy metabólicas(Burkitt y col.,
1972).Estehechosignifica introducir un nuevomatiz: la repercusiónfisiológicamásamplia
paraun componentequeera ya admitidocomo no disponible.
La primera definición de fibra alimentariadadapor Trowell datade 1974 y consisteen lo
siguiente: “residuode las paredescelularesvegetalesque no eshidrolizado por las enzimas
digestivasdel hombre”. Se estableceasí un marco de referenciapara la libra alimentaria
dentrode la célula vegetalpero es imprecisapor doshechos:
-Se refiere a un residuoen el que no se sabeexactamentequé componenteshay.
-Al incluir “las paredescelulares”excluyealgunoscompuestosno estructuralesque,
al serindigestibles,puedenserconsideradoscomo fibra alimentaria.
Por estasrazonesla definición anterior se modificó para quedarcomo a continuaciónse
expresa: “polisacáridosy lignina de las plantasque son resistentesa la hidrólisis por las
enzimasdigestivasdel hombre” (Trowell y col, 1976).
Parece,pues,que quedaunánimementeadmitido que la característicafisiológica común a
polisacáridosy lignina es la de ser indigestiblespor las enzimasdel tracto gastrointestinal
humano.
Despuésde los estudiosde Burkitt y Trowell (1973) se desarrollaráuna línea de trabajo
totalmentecentradaen la alimentaciónhumanaque va encaminadaa:
-Localizar la fibra alimentariadentrode la estructuracelular correspondiente.
-Definir cuálesson los componentesque forman en realidadla fibra alimentaria.
-Establecerla actividad fisiológica exactade dichoscomponentes.
73
Cadauno deestospuntosestásiendoampliamentedebatidoen la actualidad.Sehan sucedido
encadenadamenteuna serie de definicionescadauna de las cualesamplíaa la anterior en
cuantoa la incorporaciónde nuevosconceptosse refiere. Algunasde éstasinciden en lo que
ya habíaseñaladoVan Soest,peroen todoslos casosestasdefinicionesadolecende alguna
imprecisión.
4.3. NUEVAS DEFINICIONES Y DISCUSIONSOBRELOS COMPONENTES
Southgatey col. (1978) opinan que la segundadefinición dada por Trowell tiene el
inconvenientede no considerarcomo fibra alimentariaa todos aquelloscompuestosque,
aunqueno son de origen vegetal, tienen propiedadessemejantesa los componentesde la
misma. Porestarazónproponenla siguientedefinición: “sumade lignina y depolisacáridos
que no son digeridospor las secrecionesendógenasdel tracto digestivo humano” que es
compatiblecon la hipótesisde Burkitt y Trowell (1975).
Schweizery Wúrsch en 1979 y Selvendrany col., tambiénen 1979, aceptanla definición
anterior, señalandoque, entre los compuestosque quedaríanexcluidosen la definición de
Trowell (Trowell y col., 1976) seencuentranlas celulosasmodificadas.
De la definición de Southgatesededuceque la fibra alimentariaestáformadaporuna mezcla
de materialesde la pared celular, de polisacáridosno estructuralesy de polisacáridos
utilizados como aditivos alimentarios.
En estemomentosedisponede dos ideasunánimementeaceptadas:
-El mascodeorigen del material que forma la fibra alimentaria.
-La actividad fisiológicaque todasellascomparten.
Sin embargoestasituación no durarámucho tiempo puestoque al intentar concretarqué
compuestosforman la fibra alimentariasurgela controversia.
El mismo Southgate,años más tardeproponeotra manerade definir la fibra, aunqueel
74
conceptode la misma semantienerespectoal que sugirió anteriormente:“suma de lignina
y de polisacáridosde unadieta que no son a-glucanos,o de una forma simplificada “suma
de lignina y de polisacáridosno almidón”. Este investigadorañadeque se trata de una
definición de trabajo, es decir, una aproximacióncon fines analíticos.De aquíque no se
contemplenaquelloscomponentesde la paredcelularque, aunqueseencuentranen pequeñas
cantidades,podríanmodificar la conductafisiológica de los polisacáridos.
Englyst y col. (1982)proponenuna definiciónque seaproximaal punto de vista mantenido
por Southgate, ya que considerala fibra alimentaria como polisacáridos no almidón,
exclusivamente,eliminandola lignina.
Por lo dicho hastael momento, se puedeapreciar una tendenciaa considerarcomo fibra
alimentariaúnicamentea carbohidratosy lignina, sin embargohay autoresquetambiéntienen
en cuenta otra serie de compuestos.Así, a principios de los 80 han sido propuestos
(Iheander,1983)como componentesde fibra los siguientes:
a) Proteína,taninosy cutina que estánfrecuentementeasociadoscon los principales
componentesde la paredcelular. Pareceque todos ellos se comportancomo la lignina,
presentandoresistenciaa las enzimasdigestivasy a la microflora intestinal.
b) Tambiénseindica que habríaque considerara aquellospolímerosy productosde
degradaciónde los constituyentesde los alimentosqueson resultadode los procesostérmicos
a los que son sometidos.A estacategoríapertenecenlos complejos tanino-proteína,los
polímeros resultantesde la caramelizacióny las reaccionesde Maillard y el almidón
modificado.
Entre estasdos tendenciasha habido ambigúedaden algunosautorescomo es el caso de
Cummings, 1981. Por una parte intenta delimitar el concepto desdeun punto de vista
químico.Consideraque la fibra debeserdefinidapor los componentesquímicosmásqueen
virtud de su actividad fisiológicacomo propugnabaTrowell. Señalaque la fibra alimentaria
estáformadafundamentalmentepor polisacáridosno almidón y los clasificaen celulósicos
y no celulósicos,admitiendo la presencia,dentro de los no celulósicos,de hemicelulosas,
75
sustanciaspécticas,polisacáridosde almacenamientocomo inulina y gomaguar y las gomas
y mucilagosvegetales.Sin embargono desestimala lignina, apoyándoseen la importancia
que estecomponenteha demostradoteneren alimentaciónanimal y dadoque no se conoce
con exactitud lo que sucedea nivel humano.Por otro lado se cuestionala trascendencia
fisiológicaquepuedatenerla íntimaasociaciónestructuralentrealmidóny fibra en alimentos
como los cereales.
El debatesobrela definición de fibra enfrentaahoraa dos grupos:
-El deEnglyst y col. (1982)parael cual la fibra alimentariaestáformadaunícamente
por polisacáridosno almidón, excluyendoclaramentela lignina y el restode las sustancias.
Con el tiempo Cummingsha adoptadotambiénestaposición, (Cumming y col., 1985).
-El de otros autores(Asp y col., 1983 y Iheander,1983) que secuestionancomo
fibra alimentaria los componentesque se citan posteriormente,en virtud de dos hechos
principalmente: su interrelación estructural y la no digestibilidad en el tracto gastrointestinal
humano.
Se discuteel papel de numerosassustanciasdentro de la fibra alimentaria: lignina y otros
polifenoles, proteína indigestible y almidón resistente.Lignina y almidón resistenteson
ampliamentedebatidosmientrasque en proteínaresistentey taninos trabajan un número
limitado de grupos investigadores. En general, la proteína resistente no es tenidaen cuenta;
sin embargoalgunosautores(Trowell, 1988; Saura-Calixtoy col., 1991), reivindican que
debería ser consideradacomo componentede la fibra. Respectoa los taninos, se han
encontradoen elevadacantidaden los residuosde fibra insoluble (Saura-Calixtoy col.,
1991).
Mientrasque la definición másaceptadaconsiderapolisacáridosno almidón y lignina (Asp,
1987), en el Reino Unido se utiliza la de polisacáridosno almidón. En realidadesto es
volver, en líneasgenerales,a la definicióndeTrowell, perohabiendodefinido,desdeel punto
de vista químico, las diferentes sustancias y habiendo empezado el desarrollo de estudios que
permitencomprobarciertosaspectosde la actividadfisiológicade estassustancias(Van Soest
76
1973; Rérat (1978); Fetzery col., 1979; Kies y col., 1984; Van Soest 1984; Englyst y
Cummings,1985; Englysty Cummings,1986; Englyst y Cummings,1987).
En 1990 el informe de la British Nutrition Foundation(Heaton, 1990) no adoptaninguna
postura oficial, dejando el término fibra alimentaria sujeto al discurso científico, pero
aconsejaa la comunidadcientíficaqueserefieraen términosprecisosal materialen cuestión,
ej: salvadode trigo, pectinadecitrus, carboximetilcelulosa,etc.Estanuevaformade trabajo
facilita la planificacióny descripiciónde los experimentospero conlíevauna interpretación
de los resultadosmuy restringida(en términosde hipótesisquerelacionanenfermedadescon
hábitosalimentarios).
Esta nueva manera de hacer referencia al material de trabajo parece más científica, ya que
a la hora de planificar un experimentoes necesario normalmenteenfocar hacia una
manifestaciónmuy restringidade la fibra, peroparainterpretarlos resultadosesimportante
dirigirse a la fibra de forma lo más amplia posible, sin perder de vista todos los posibles
aspectosinvolucrados.
En el senode la ComunidadEconómicaEuropeasehanorganizadogruposde trabajocuyos
planteamientosobedecena esteenfoque.Así el BCR (BureauCommunitairede Référence:
metrologíaaplicaday análisis químicos) está llevandoa caboestudiosinterlaboratorioque
permitan la certificacióndel contenidode fibra en ciertas muestraspor diferentesmétodos
independientemente de la discusión sobre la definición o de la comparación de resultados
entredichosmétodos.
Recientemente(Abril, 1993) tuvo lugar la 6U reunión del Comité de Gestión COST-92
(DietaryFibre). En ella, Cummingsinformó sobrelas reunionesdel comité científico (Food
Subcommitteeon Dietary Fibre, CEC, DG III) parallegara una definiciónoficial de fibra.
Tras diversasreunionessiguesin alcanzarseun acuerdoradicandoel principal problemaen
la inclusión o no del almidón.
77
5. EFECTOS FISIOLOGICOS DE LA FIBRA ALIMENTARIA:
INVESTIGACIONES ACTUALES
5.1. ASPECTOS GENERALES
Durante mucho tiempo la fibra alimentaria ha sido el componente olvidado de los alimentos
debido,probablemente,a su valornutritivo relativamenteintrascendente.En los últimos años
e] interés de los científicos ha ido creciendoprogresivamentea partir de los estudiosde
Burkitt y Trowell (1975). El efecto preventivo de la fibra está en función de sus efectos
fisiológicos y éstos, a su vez, de las propiedades fisicoquímicas de la misma.
Cleave fue uno de los primeros en referirse al salvado de trigo como laxante y abogó por
dejar de eliminar el salvado y otros elementos, y no por añadir fibra a la dieta. Indicó que
los alimentostransformadosporel hombre,como azúcarrefinaday harinablanca,podrían
originar enfermedades(Heaton, 1990).
En aquel momentola epidemiologíade las enfermedadescrónicasestabainiciándosey la
nutricionalno existíacomotal. Ambasrecibieronun gran estímulode las hipótesisde Burkitt
y Trowell (Heaton, 1990).
Burkitt extendió y popularizó las ideas de Cleave, pero enfatizó el valor protector de la fibra
en oposición al efecto dañino de los alimentos en los que se había eliminado la misma. Esta
teoría tuvo un gran atractivo para el público y dió a los científicos una hipótesis,
aparentementesencilla,para trabajar.
Desdeque secomenzóadestacarla importanciafisiológicadeestafracción del alimento, su
consumose haasociadoal efectopreventivode una seriede enfermedadescomocáncerde
colon, diverticulosis,estreñimiento,diabetes,etc. (Burkitt y col., 1972; Hellendorn, 1973;
Burkitt y col., 1974; Colmey, 1978; Heredia, 1980; Martínez Para y Torija Isasa, 1980;
Trowell y col., 1985) (Figuran031).
78
EnfermedadCoronaria(Descensodelcolesterolplasmático)
DiabetesMellitus(Descensoen lade glucosa)
Estreñimiento(Hecesmás voluminosasy más blandasAumento del tránsito intestinal)
Figuran031.-
Henjiade Hiato(Descensode la presiónintraabdominal)
Obesidad(Aumentodela sensaciónde saciedad)
Diverticulosis(Hecesmásvoluminosasy másblandas)
Cancerde Colon(Dilución de compuestoscancerígenos)
Hemorroides(Hecesmásvoluminosasy másblandas)
Efectosfisiológicosde la fibraalimentariay prevencióndeenfennedades.
La acciónbeneficiosade la fibra decaraa la prevenciónde diversaspatologías,como se ha
indicadoantes,ha sido señaladaen la bibliografíade formareiterada:
-Diverticulosis:Cummingsy col., 1978; Olds, 1978;Geary col., 1979; Fishery col.,
1985.
-Estreñimiento:Harvey y col., 1973; Henningy col., 1986.
-Cáncerde colon: Burkitt, 1978; Mclennan, 1978; Cummings,1981; Sjóding y col.,
1985; O’Neill y col., 1990a;O’Neill y col., 1990b;Szendey col., 1990; Benito y col., 1991.
-Arterosclerosis y cardiopatías: Lebeille y Sauberlich, 1966; Sundaravalli y col., 1971;
Heatony Pomare,1974; Kies y Fox, 1977.
-Diabetes:Jenkingsy col., 1977; Olds, 1978; Worthington-Roberts,1981; Zavoral
y col., 1983; Bantle, 1988; Scott y col., 1988; Akanji y col., 1989; Hollandery Szekely,
1989; Malmlofy col., 1989; Carray col., 1990; Kirsten y col., 1991; Librenti y col., 1992.
-Obesidad:Worthinton-Roberts,1981; Rigaudy col., 1987; Solumy col., 1987.
-Hipercolesterolemia:Juddy Truswell, 1981; Andersony Gustafson,1988;Hoagland,
1989; Mongeauy col., 1990; Klopfenstein, 1990; Andersony col., 1990; Cobiac y col.,
1990; Riccardi y Rivellese, 1991; Bridges y col., 1992.
En algunoscasossehablade componentesen particulary en otros seconsiderala fibra como
un todo. No se indican en profundidad los mecanismosque dan lugar a los efectos
beneficiosos que se citan, aunque todos los autores coinciden en señalar la relación existente
entre las propiedades fisicoquímicas de la fibra alimentaria y sus efectos fisiológicos.
Algunos investigadores(Eastwood, 1992; Eastwoody Morris, 1992)estánllevandoa cabo
estudios muy rigurosos, centrándose en los polisacáridos como principales constituyentes de
la fibra alimentaria y en el hecho de que estos compuestos tienen un amplio espectro de
propiedadesfisicoquímicasen función de su estructura.
La determinacióncuantitativade la fibra alimentariano permitepredecirsu acciónbiológica,
ya quelos efectosfisiológicosdependenfundamentalmentede las propiedadesfisicoquímicas,
que no están relacionadas directamente con la composición química (Schneeman, 1986;
Erosio, 1992).
80
La fibra alimentaria, como se ha visto, no es un único compuestosino una mezcla de
componentesquepuedenpresentarsede una formaaisladao integradosen tina estructuratan
complejacomo esla paredcelular de los vegetales.
Se puedehablar,por un lado, de las cadenasde polimeros que se agrupanen conjuntos
ordenados, como es el caso de las fibrillas de celulosa, que son casi resistentes a la
hidratacióny al ataqueenzimático,porotro lado,de las cadenasdepolisacáridosquepueden
existir en solución como “hélices desordenadas”, presentando entre ellas interacciones físicas,
que son fácilmenteaccesiblesa la acciónde las enzimas,talescomo las sustanciaspécticas.
Por último, habríaque hablarde los entramadosreticulareshidratadostípicos de las paredes
celularesde los tejidos vegetales.
En cada caso en particular, los enlaces se estabilizan o se rompen en determinadas
circunstancias.Así, por ejemplo, las uniones ordenadasse estabilizan con enlaces no
covalentes muy débiles y es necesario un cierto número de ellos para conferir fortaleza, lo
que implica unadeterminadalongitud de la cadena.Sonmuy susceptiblesapequeñoscambios
de temperaturay de concentraciónde sólidos disueltos. Las propiedadesreticulares de
polisacáridos específicos dependen en gran parte del espaciado entre irregularidades
estructurales minoritarias a lo largo de la cadena, en lugar de depender de la composición
general como la determinada en su análisis, que informa de la proporción de azúcares
constituyentes
En las estructuras de la pared celular las propiedades fisicoquímicas y la actividad fisiológica
son función de la integridad de la propia pared. Dicha integridad depende de la alteración del
tejido, del grado de maduración y de los tratamientos a los que se someta.
La fibra alimentariapuedeactuaren el tracto digestivo de tres formasprincipalmente:
-comoconjuntosmacromoleculares,
-comocadenasde polímerossolubles,
-comoconjuntosreticulares,hinchadose hidratados.
Aunquealgunosde los componentesde la fibra son intrínsecamenteinsolubles(celulosa),
81
otros puedencambiarsu forma física con el tiempo por la agitación mecánicadebidaa los
movimientosperistálticosy/o por la alteraciónde sus condicionesfísicasa lo largodel tracto
gastrointestinal (sustanciaspécticas y hemicelulosas).En general, tales cambios irán
destinadosa aumentar la solubilidad e hidratación de la fibra; sin embargo, ciertos
componentes,particularmentelos polisacáridoscargados,talescomolas sustanciaspécticas,
pueden encontrar en el lúmen condiciones que impidan o reviertan el proceso de hidratación
(cambios en el pH, asociacionesintercadenapromovidas por contraiones específicos,
reducción de la calidad del solvente por pequeños solutos o por coacervación con proteínas).
Para explicar las propiedades fisiológicas, la fibra alimentaria se compara a un sistema
fisicoquímico de las siguientes características (Eastwood y Brydon, 1985):
Los componentes de la fibra soluble se pueden considerar como integrantes de una fase de
sol continua en la que los constituyentes insolubles e hidratados se dispersan como una fase
de partículasdiscontinuas.Las partículasde diferentecomposiciónquímicay/o forma física
pueden ser consideradas como constituyentes de fases discontinuas separadas. De forma
semejante, otros componentes de la dieta que no forman parte de la fase continua homogénea
(por ejemplo, grasaque no estáen micelas)puedenser tratadoscomo fasesseparadas.En
tales sistemasde dos faseso de multifases ciertas propiedadesfisicoquímicas,como la
densidad, obedecen a una simple regla de mezclado; sin embargo, otras como la viscosidad
son mucho más complejas y puede ser muy difícil o imposible predecir el comportamiento
a partir de las fases individuales aisladas (Eastwood y Morris, 1992).
En el cuadron0 III sepuedenobservarlas propiedadesfisicoquímicasmásimportantesde la
fibra alimentariay su relación con los efectosfisiológicos
A continuaciónsehará unabrevedescripciónde los efectosmásestudiadosquese resumían
en la figura n0 31, y seexponenen relacióncon las propiedadesfisicoquímicasen cuadron”
III.
82
Cuadro n0 III. Relación entre las propiedades fisicoquímicas de la fibra
alimentaria y sus efectos fisiológicos.
PROPIEDAD FISICOQUIMICA EFECTO FISIOLOGICO
Viscosidad Retardodel vaciamientogástrico.
Disminución de la absorciónde nutrientes
Descensodel colesterolplasmático
Capacidad de retención de compuestos
orgánicos
Descenso de la absorción de nutrientes
Descenso del colesterol plasmático
Susceptibilidad a la fermentación
bacteriana
Descenso del colesterol plasmático
Aumento del tránsito intestinal
Aumento del peso de las heces
Capacidadde retenciónde agua Aumentodel pesode las heces
Capacidadde intercambioiónico Descensode la absorciónde cationes
83
5.2. EFECTOS FISIOLOGICOS MAS IMPORTANTES
5.2.1. Retardo del vaciamiento Lastrico
La presenciade polisacáridossolubles hace que la velocidad de vaciamiento gástrico
disminuya y el tiempo aumente. Estos polisacáridos, polímeros hidrofílicos, tienen la
propiedadde formar en medio acuoso solucionesviscosas,esta propiedadhace que el
contenidoestomacalsehagatambiénviscosoy el vaciamientogástricomás lento.
El efectoque se derivadeestalentitud en el pasodel contenidoestomacalal intestinoes un
aumentode la sensaciónde saciedaddespuésde las comidas.Esteefectose ha asociadocon
la prevenciónde la obesidad.
Algunos investigadoresopinan que no hay correlación entre el aumento del tiempo de
vaciamientogástricoy la absorciónintestinal de nutrientes (Edwards, 1990), otros asocian
este efecto a un descenso en la absorción (Schneeman, 1986).
5.2.2. Descensode la absorción de nutrientes
Diversosestudioshan demostradoquela ingestade fibra da lugara un menorincrementode
la glucosaplasmáticadespuésde las comidas,aun descensode la absorciónde carbohidratos,
lípidos y otros nutrientes(Edwards, 1990; Eastwood, 1992; Eastwood y Morris, 1992).
La absorción de nutrientes en el intestino delgado se debe a dos mecanismos:
1) Las contracciones intestinales crean una turbulencia que mezcla el contenido luminal
y aproxima los nutrientesal epitelio.
2) Los nutrientesdifunden a través de la capa de fluido adyacentea la mucosa
intestinal.
Los polisacáridos solubles, debido a la viscosidad que originan, disminuyen la turbulencia,
84
el mezcladodel contenidoluminal, la interaccióncon enzimasy la disgregacióndepartículas
sólidas,y aumentanel grosorde la capaadyacenteal epitelio disminuyendola difusión.
Se ha habladotambién de que los polisacáridossolublessecuestran,en el gel que forman,
nutrientes, enzimas digestivasy ácidosbiliares, e incluso de una acción directa sobre el
epitelio intestinal (Schneeman,1987).
Los polisacáridosinsolublestienenpocoefectoen la fisiologíadel intestinodelgadoaunque
tambiéndescienden,en menormedida,laglucemiapostprandial(Edwards,1990). Esteefecto
seasociacon la presenciade almidónresistente.Se ha postuladoqueel mecanismoque tiene
lugar es el secuestropor adsorción de carbohidratosen la matriz que forman y que es
resistenteal ataquede enzimaspancreáticas.
Este efecto en la absorción, sobre todo de glucosa, ácidos biliares y colesterol, tiene
importanciarespectoa la prevenciónde la obesidad,de la diabetes,de la hipercolesterolemia
y de las cardiopatíasque de ella se derivan.
5.2.3. Descensodel colesterolplasmático
Los polisacáridossolublesfijan ácidosbiliaresy colesterolen el intestinodelgadoy reducen
su reabsorciónen el ileon terminal.Por consiguiente,esmayor la cantidaddeácidosbiliares
que llega al colon para su excreción con las hecesy menor la que regresaal hígado por
medio de la circulación enterohepática.Esto seinterpretacomo una señalpara aumentarla
síntesisde estosácidosen el hígado.Comolos hepatocitoscatabolizancolesterolparaformar
ácidosbiliares, su concentracióndisminuyeen el interior de la célulay estoproduceel paso
de colesteroldesdeel plasmadisminuyendoallí su concentración(Kohn y Ribeiro, 1991).
En e] coJon,la celuJosay Jalignina prácticamenteno son fermentables;las sustanciaspécticas
silo son y las hemicelulosasparcialmente(Eastwood,1986; Schneeman,1986).
La fermentaciónbacterianade la fibra soluble da lugar a la produccióndeácidosgrasosde
cadenacorta, metano, anhídrido carbónico, hidrógeno y agua. Una gran cantidadde los
85
ácidosgrasosproducidos(acético,butírico y propiónico)esabsorbidaporla mucosadel colon
y llegaa la venaporta. Se ha demostradoqueel ácidopropiónicoinhibe tanto la biosíntesis
hepáticade colesterolcomo la periférica y aumentasu aclaramiento plasmático(Kohn y
Ribeiro, 1991).
El descensodel colesterolplasmático,promovidoporla ingestade fibra, sepuedeconsiderar
como una prevenciónde la arterosclerosisy arteriopatíacoronaria.
5.2.4. Aumento del yesode las heces
En algunos estudiosse ha observadoque de los constituyentesde la dieta, sólo la fibra
alimentariainfluye en el pesode las heces(Eastwoody col., 1984).
Los diferentestipos de fibra difieren en su capacidadparaalterar estepeso(Audiotomre y
col, 1990). El salvadode trigo (fibra insoluble, principalmente)tiene una acción eficaz y
predecible,mientrasque en el casode frutas y verduras(sobretodo fibra soluble) el efecto
es impredecible.
El pesode la hecesse ve aumentadopor la propiapresenciafísicade la fibra queha resistido
la degradaciónbacteriana(fibra insoluble) y por la retención de agua que origina (fibra
soluble).
Los polisacáridossolublestienen unagran capacidadhidrofílicapor la presenciade restosde
azúcares con grupos polares libres. La celulosa, con enlaces intermoleculares, tiene poca
capacidadde retenciónde agua.
En contrade lo que se podríaesperar,los polisacáridossolublestienenmuy pocainfluencia
en el pesode las hecesdebido a que fermentancon mucha facilidad en el colon. Esta
fermentaciónproduceun aumentoen el crecimientomicrobianoqueno dalugara un aumento
en el peso de la heces pero hay un efecto osmótico añadidode los productosde la
fermentación bacteriana en la masa fecal. Los ácidos grasos producidos pueden tener un papel
importanteen el pesofecal y en el tiempo del tránsito.
86
Sehavisto queun aumentode ácidosgrasosde cadenacortaen hecesda lugar a un aumento
en la eliminaciónde aguafecal (Eastwood,1992).
La degradaciónbacterianaseasociacon un descensodel tiempo del tránsito intestinal y con
el aumento de la frecuencia de las deposiciones. La fermentación acelera el tránsito por
mecanismospoco claros. Seproducencompuestosgaseosos(metano,anhídridocarbónicoe
hidrógeno)y ácidosgrasosdecadenacorta(acético,butírico y propiónico).Los compuestos
gaseosospueden distendir el intestino y facilitar la evacuación.El ácido butírico y el
propiónicoestimulanlas contraccionesdel colon medio y distal. Tambiéntiene lugar por la
fermentación bacteriana la liberación de ácidos biliares y de ácidos grasos que estaban
adsorbidosen la fibra en el intestinodelgado.Estos compuestospor la acciónbacterianase
transformanen sustanciascon propiedadeslaxantes(Edwards,1990).
El metabolismo bacteriano produce cambios en los contenidos colónicos que alteran la
osmolalidad y la absorción. Las observaciones realizadas se pueden aplicar a otras sustancias
poliméricasde la dieta: proteínas,grasay almidón. El tiempo de mantenimientode una
estructura física particular varía a lo largo de tracto gastrointestinal. En el caso de la proteína
y el almidón gelatinizado la capacidad de inmovilización de agua es transitoria porque se
digieren rápidamente. El almidón original y retrogradado inmovilizan el agua de una forma
muchomáspersistente(Eastwood,1992).
En la actualidadseestállevando a caboun estudiodentro de los proyectospertenencientes
al programa“Food Linked Agro-IndustrialResearch”(FLAIR 1989-1993)(DG XII. CEE),
cuyo objetivo es el conocimientode las implicacionesfisiológicasdel consumode almidón
resistente.
Masasfecalesmásvoluminosasy másblandassuponenun menoresfuerzoparala evacuación,
reduciendode estaforma el riesgo de procesostales como la formación de divertículos,
hernia de hiato y venas varicosas,que tienen todos en común la elevaciónde la presión
intraabdominal.La dieta rica en fibra que producehecesmásblandasy menosesfuerzoses
tambiéneficaz parael tratamientode las hemorroides.
87
La fibra alimentariapuedereducirlaproduccióny excreciónen el organismodecarcinógenos
fecalesy determinadosestudioshan reveladouna relación inversaentre ingestade fibra e
incidenciadecáncerde colon (Kohn y Ribeiro, 1991).Tambiénseha habladode quela fibra
ejerce, al reteneragua, un efecto de dilución de los compuestoscancerígenos.
Porúltimo, respectoa los efectosfisiológicos de la fibra alimentariaen el organismo,hay que
insistir en que el tipo de efecto dependede cada tipo de fibra en particular y que los
mecanismosmásprofundosqueexpliquenlos efectosproducidosestántodavíapordilucidar.
Los últimos congresoscientíficosdedicadosmonográficamentea la fibra alimentaria, así
comoproyectosinternacionalescoordinadosdedicanespecialatenciónal temade los efectos
fisiológicos.
En la conferenciaeuropea“Dietary Fibre: Chemicaland Biological Aspects”, celebradaen
1990 en Norwich (Reino Unido), setrató de los efectosen el intestinodelgado,en el grueso
y de las repercusionesen el metabolismode minerales.En la siguiente,titulada “Topics in
Dietary Fibre Research”(Roma, 1992) seexpusierongran cantidadde accionesde la fibra
alimentaria, destacandola relación con el cáncer en diferentesregionesdel intestino. El
próximocongresobianualsecelebraráen Nantes(Francia)enjunio de 1994y sedenominará
“Dietary Fibre. Mechanismsof Action in Human Physiology and Metabolism” y tendrá
como temasprioritarios, entre otros, la digestión en el tracto gastrointestinalsuperior,
fermentacióny control de la actividadmetabólicade las bacterias,fermentacióny fisiología
gastrointestinaly metabolismode los nutrientes.
88
6. MiETODOS ANALiTICOS PARA LA DEThRMINACION DE
FIBRA ALIMENTARIA
El análisis de la fibra alimentariava encaminadoal conocimientoe identificación de una
forma exactadecadauno de sus componentesy a su cuantificación,teniendoen cuentael
conceptofisiológico de la misma.
La evolución metodológicaabarcadesdetratamientossencillos, de aislamientoy posterior
gravimetría,hastaaquellosque permitenidentificar diferentesfraccionesdentrode la fibra
alimentaria,bien mediantecolorimetríao bien por medio de técnicascromatográficas.
6.1. METODOS PARA LA DETERMINACION DE FIBRA BRUTA
El primer métodoparaevaluarfibra datade los primerosañosdel siglo XIX aunqueno hay
acuerdosobrela fechaexacta(1805, 1809) (Monte y Vaugham,1982); sedenominamétodo
de Weende(Asp y Johansson,1984) y el tratamientode la muestraserealizamedianteun
ataquesecuencialcon ácido(H2504) y álcali (NaOH)al 1,25%y al residuoinsolubleobtenido
por filtración sele denominafibra bruta. Es el primer método que se conoceparael análisis
de fibra. En un primer momentose destinóal análisisde forrajesy posteriormentese aplicó
al análisisde alimentos.En la actualidadseutiliza para el primerode los objetivos.
Williams y Olmsted(Asp y Johansson,1984) indicaron queestemétodono valoraun 40%
de los carbohidratosno disponibles,y Van Soesty McQueenen 1973 precisaronqueun 80%
de las hemicelulosas,un 60% de la lignina y un 50% de celulosano se cuantifican.Otros
autores(Burdaspaly col., 1980)han señaladola gran diferenciacuantitativaque seproduce
al emplearun métodode fibra brutaparaevaluarla fibra alimentaria.Así pueslos valores
realesde lo quehoy día se entiendepor fibra puedenserunascincovecessuperioresa los
valoresde fibra bruta (Dreher, 1987).
89
6.2. METODOSDETERGENTES
En el métodode Weendeel tratamientocon hidróxido sódicose utiliza para la eliminación
deconstituyentesnitrogenados.Sin embargo,seproduceabundantegelatinizacióndealmidón
y pérdidade lignina en el filtrado. Paracorregir estos inconvenientesse propusoutilizar
exclusivamenteuna digestión ácida, denominándoseel residuo obtenidoen estecaso Fibra
NormalAcida (NAF) (Walkery Hepburn,1955). Estemétodono permiteunadisolucióntotal
de la proteínapor lo cual no esconsideradototalmentesatisfactorio.SegúnVan Soest(1963),
la estimacióndel valor real de estafracciónporestemétodoesmenosexactaque la obtenida
por el método de la fibra bruta, a menos que se utilicen tiempos de digestión
excepcionalmentelargos.
Puestoque los detergentesaniónicoshan demostradofacilitar la disolución de proteínasen
un medio ligeramentealcalinoy los compuestosde amoniocuaternarioson eficacesparala
disolución de polisacáridos,proteínasy ácidos nucleicos, se estudia su utilidad en la
preparaciónde residuosde fibra con un contenidobajoen nitrógenoa partir de forrajes.Por
otra parte, la sustitucióndel hidróxido sódicopor un detergenteadecuadopodríaayudara
mantenerla integridadde la fracción de lignina ya que las condicionesserían mássuaves.
Van Soestinicia en 1963 la publicaciónde una seriede trabajosen los que proponeel uso
de solucionesdetergentesa pH ácido y neutro parael análisisde fibra alimentaria.
En el primerartículo (Van Soest, 1963a)presentadatos sobrela capacidadde una seriede
detergentesparaeliminar el nitrógenoen forrajes. Seestudianlos factoresque afectana la
obtencióny composiciónde la fibra, utilizando solucionesdetergentesa distintosvaloresde
pH. Los detergentesutilizadosa pH neutrofueron: lauril sulfato sódico, aril alquil sulfonato
sódico, miristato sódico, cloruro de cetil piridinio, bromurode cetil trimetil amonio, lauril
amina, tween 21 y monolauratode etilen glicol.
En generallos detergentesaniónicosextrajeronmás nitrógenoa pH muy bajo.
Van Soest indicaque, aunqueesdifícil medir de una forma precisala fibra alimentaria,el
90
término debería implicar un residuo que esté estrechamenterelaccionado con la
indigestibilidad.
El método ácido detergente (Van Soest, 1963b) utiliza bromuro de cetil trimetil amonio en
H2504 lN y determina, en principio, celulosa y lignina.
Segúnesteautorel métododa unabuenacorrelaciónentrefibra alimentariay digestibilidad
en 18 forrages(r=-0.79), mientrasqueen el casode la fibra brutaesalgo menor(r=-0.73).
En el residuo de Fibra Acido Detergente(FAD) se estudia,de forma más detallada, el
contenidode lignina y proteínaen alimentosque han sido sometidosa varios procedimientos
de calentamiento y desecación revelándose que el método es sensible frente al daño debido
a las reaccionesde pardeamientono enzimático.
A continuación tiene lugar el desarrollo del método neutro detergente (Van Soest, 1967). Se
utiliza como detergente lauril sulfato sódico y se evalúa igualmente fibra insoluble, pero en
este caso incluye, además de celulosa y lignina, también hemicelulosas.
El reactivo lleva en su composición edetato sódico, agente complejante que permite la
solubilizaciónde sustanciaspécticas(Belo y Lumen, 1981).
Este métodoha sido adaptadoparael análisisde alimentosricos en almidón,para el análisis
deheno(Goldingy col., 1985)y parala determinaciónde sustanciaspécticas(Belo y Lumen,
1981).
Para el primer grupo de alimentos, se propone la introducción de una enzima amilolítica, bien
antesdel tratamientocon el detergente(McQueeny Nicholson, 1979), en mitad de dicho
tratamiento(Robertsony Spiller, 1977; Robertsony van Soest, 1977) o despuésdel mismo
(AACC Committe on Dietary Fiber, 1981; Asp y Johansson, 1984).
Parael análisisde heno, sesugierela eliminaciónde sulfito sódicoen aquellasmuestrasque
91
contienen un 30% o menos de proteína, y la eliminación de decalina ya que produce un
aumento del valor de la Fibra Neutro Detergente (FND). Belo y Lumen (1981) establecen un
método para la determinaciónde sustanciaspécticasdespuésde tratar la muestracon la
solucióndetergente.
Heller (1977) estudiala influenciade factorescomo el pH y el tamañode partículaen la
pérdida de hemicelulosas, comprobando que, en salvado de trigo, pericarpo de maíz
purificado y tegumentode cacahuete,el contenidode hemicelulosasdesciendeal disminuir
el tamañodepartículay al aumentarel pH.
Con el tiempo, el método neutro detergente ha resultado ser el mejor que existe para el
análisis de fibra alimentaria en heces, dada su gran eficacia en la eliminación del nitrógeno
proteico (Síavin y Marlett, 1983).
En el análisis de alimentos los métodos detergentes presentan una serie de inconvenientes que
han sido señalados reiteradamente en la bibliografía.
Dreher (1987) resume algunos inconvenientes del método ácido detergente:
1) Los alimentosricos en almidón,proteínao grasason muy difíciles de filtrar (Van
Soesty McQueen, 1973).
2) La posible precipitación de ácidos orgánicos puede causar valores anómalos
(Robertson y Van Soest, 1981).
3) El residuo puede formar grumos e interferir en la subsiguiente determinación de
lignina (Robertson y Van Soest, 1981).
4) Una muestrade pequeñotamañopuedehacerdifícil la medidade la precisión, y
el aumento de la misma puede producir espuma y otras dificultades en la filtración
(Southgate,1986).
92
Respectoa los inconvenientesdel métodoneutro detergente,Selvendrany Dupont (1984)
indican pérdidasde lignina y componentessolublesen el detergentey la contaminacióndel
residuo con almidón modificado, llevando a una valoración falsa de FND. Wolters y col.
(1992) y Redondo y col. (1990) coinciden en detectar la presencia de una proporción
considerable de ácido urónicos en el residuo neutro detergente.
Aunquela diferenciaFND-FAD puedeserestimadateóricamentecomohemicelulosas,en la
prácticaestaconsideracióneserróneadebidoa:
1. Las sustanciaspécticas,taninosy sílice se disuelvenduranteel tratamientocon
detergenteneutro, pero son partedel residuo FAD. Esto podríaoriginar un descensoen la
estimade hemicelulosas.
2. La proteína de la pared celular se recupera en el residuo FNDy se disuelve en el
FAD. Esto podría originar un aumento en la estimación de hemicelulosas.
Experimentalmente,Schweizery Wúrsch(1979)hancomprobado,en patatay en coliflor, que
los valoresde FND y FAD son muy similaresdadoel bajo contenidode hemicelulosasque
presentan estos vegetales. Este hecho ha sido constatado igualmente en berenjena, calabacín
y pepinoporRedondoy col. (1987).Morrison en 1980 indicaquepuedehaberuna retención
parcial de hemicelulosaspor parte de la lignina y la celulosa.Cummingsen 1981 y Saura-
Calixto y col, en 1983 señalan que se puede producir contaminación del residuo de FADcon
restos de proteína, e incluso una solubilización parcial de lignina en el tratamiento con la
solución detergente ácida. Por último, Marlett y Lee (1980) indican que en el residuo de FAD
puedeir incluida una partede las sustanciaspécticas.Añaden que el tratamientocon el
detergente a pH ácido parece extraer las pectinas de los tejidos no foliares pero no totalmente
de los foliares.
Los métodosdetergentesde Van Soest han sido ampliamenteutilizadosen el análisisde todo
tipo de alimentos, aunque la necesidad de aplicar el concepto de digestibilidad había sido
señaladaya con anterioridadporRemyen 1931,Williams y Olmsteden 1935, Macy en 1942
y Weinstock y Benham en 1951, que proponen el análisis de fibra según métodos enzimático-
93
gravimétricos(Asp y Johansson,1984).
6.3. METODOS ENZIMATICO-GRAVIMETRICOS
El tratamiento en este caso se hace sometiendola muestraa la acción de enzimasque
eliminan fundamentalmente almidón y proteína.
Algunos de estos métodosevalúanla fibra alimentariasin diferenciasentre sus distintas
fracciones: soluble e insoluble. Otros, sin embargo permiten realizar este tipo de
fraccionamiento.
Se han propuestonumerososmétodosenzimáticosque, con el pasodel tiempo, han ido
incluyendo enzimas de mayor eficacia. En el cuadro n” IV figura un resumen de los
principales métodos enzimático-gravimétricos y se detallan los tipos de enzimas utilizados por
cadaautor.
En general se puede decir (Greenwood y Milne, 1968) que dentro de las cx-amilasas el
mecanismo de acción depende de la fuente de la enzima. Hidrolizan enlaces cv-D-l,4. No
hidrolizan maltosa y al actuar sobre las amilosas sustituidas determinados grupos representan
impedimento estérico para la enzima. La cx-amilasa de cereales tiene una afinidad mucho más
baja para azúcares pequeños que para los grandes, mientras que las enzimas de mamíferos
tienen una afinidad similar por ambos tipos de sustratos. Para las cv-amilasas de bacterias y
hongos,en el casode fi. subúhisexiste mayor afinidad por la amilosa que por las dextrinas.
Hidrolizan amilosa a D-glucosa y maltosa.
Remy utiliza enzimasamilolíticas y proteolíticaspara solubilizar el almidón y la proteína.
Williams y Olmstedempleanpancreatinaacompañadade unahidrólisisácida.Macy modifica
el método anteriorparaevaluarhemicelulosas.Weinstocky Behanseencuentranentrelos
primeros en utilizar enzimas de origen microbiano para eliminar almidón y proteína, pero
estas eran de uso industrial y cuando dejaron de utilizarse con este fin dejaron de estar
disponibles en el mercado. Posteriormente en los años setenta Salo y Kotilainen utilizan
94
Cuadro n0 IV. Principales métodos enzimático-gravimétricos y enzimas que
utilizan
AUTOR ENZIMAS
McCancey Lawrence(1929) Takadiastasa
Williams y Olmsted(1935) Pancreatina
Weinstocky Benhan(1951) Enzimasmicrobianas
Salo y Kotilainen (1970) Pepsinao tripsina
Thomas(1975) Pancreatina
Rhozyme
Hellendoorn(1975) Pepsina
Pancreatina
Elchalzy y Thomas(1976) AmiloglucosidasaTripsina
Furda (1977) Amilasa de fi. subtilisProteasa
Schweizery Wiirsh (1979) PepsinaPancreatina
Asp y Johanson (1981) PepsinaPancreatina
Asp y Johanson (1983) TermamylPepsinaPancreatina
Meuser y col. (1983) AmiloglucosidasaPancreatina/Tripsina
Prosky y col. (1984) TermamylProteasa de fi. SubtiiisAmiloglucosidasa
95
pepsina o tripsina (diastasa). Thomas, incluye pancreatina y otra amilasa. Hellendoorn (1975),
pepsina y pancreatina, lo cual constituye un potente tratamiento enzimático, sirviendo este
métodode modelo paraotros. Elchalzyy Thomasempleanel tratamientode la muestraen
autoclave para gelatinizar el almidón y asegurar su hidrólisis óptima con amiloglucosidasa
(Asp y Johansson,1984).
Un avance en el desarrollo de los métodos enzimático-gravimétricoslo constituye el
fraccionamientoen fibra insoluble y fibra soluble. Esto selogra tratandola muestracon
enzimas, que varian según los métodos, y precipitando con etanol el filtrado que se obtiene
al recoger el residuo de fibra insoluble (Furda, 1977; Schweizer y Wúrsch, 1979).
Asp en 1981 propone ciertas modificaciones a los métodos enzimático-gravimétricos, tales
como la corrección debida a proteínas y cenizas que pueden falsear los resultados obtenidos
para fibra alimentaria. Asimismo sugieren el hervido de la muestra antes de la incubación
enzimática, para mejorar la digestión. Posteriormente, en 1983, introduce en el método
anterior una potente a-amilasa termoestable que consigue la eficaz eliminación del almidón.
Existen otros métodos enzimáticos recogidos en la bibliografía tales como el método de Furda
(1981) y Meuser y col. (1983) (Asp y Johansson, 1984).
En 1984 (Prosky y col., 1984) se propone el primero de los métodos de la Association of
Official Analytical Chemists (AOAC). La evolución seguida por el método ha sido semejante
a la de otros. Son métodosque surgenpara respondera una necesidadanalítica y, que
despuésde estudios interlaboratorio, se van modificando en función de las dificultades
encontradasy de las fuentesde error que se aprecien.
En el esqueman0 1 figuran las condicionespara el tratamientoenzimático que se han
propuestopara el método de la AOAC desdeel primer momentohastala actualidad. A
continuaciónse hará una breve descripciónde sus origenesy los cambios que ha ido
sufriendo.
96
~l984 ~j1988~I985 1992
1 g MUESTRAA)
NaO 05
y IDO ~jL icrmamyl
BM, i000C
15 mm. Enfriar
NaCil0,171 N
NaOi-10,08 M
NaOIi0,08 M
y
NaCil(1,275N
NaDilK O ,275N
a
5 mg proteasa600C
30 mm. Enfriar
F Ac fosíbrico
L 0,205 M
y
clii -j0,325 Nl
, 0,3 ml. amiloglucosidasa300 C
30 mm. Enfriar
a
Hm
NaOIIpi-l - 6
-a>’—
NaOII0,285 M
[lefl,slbrico
Esqueman0 1. Principales modificacionesen el método de la AOAC.
En 1981 seconcluyó,en una de las reunionesde la AOAC, que sedeberíandesarrollardos
métodos para el análisis de fibra: un método rápido y otro más completo que pudiera ofrecer
unainformacióndetalladaacercade los componentesde fibra alimentaria.Un grupode inves-
tigadoresorganizadospor Prosky (Prosky y col., 1984) desarrollóun metodo enzimático-
gravimétricopararespondera la necesidadde un métodorápido. Estemétodosebasaen los
de Asp y col. (1983),Schweizery Wúrsh (1979),Furday col. (1979)pretendeoptimizarlos
tipos de enzimas y las concentraciones de las mismas para una serie de muestras, del grupo
de los cereales,algunasde las cualescontienenuna elevadaproporciónde almidón y otras
de proteína. Además, otro de los objetivos perseguidos fue establecer como definición de
fibra alimentaria,con fines nutricionales,aquellafracción de los alimentosque no es
digestiblebajo las condicionesdel métodoquese va a someteral estudio interlaboratorio.
El método (Prosky y col., 1984) utiliza una amilasa termoestable (termamyl),
amiloglucosidasay proteasaen condicionesóptimas,sin embargo,despuésde habersefijado
los objetivos anterioresy de detallar con exactitud algunos de los pasos, como son las
concentracionesexactasde las solucionescon las que se debenajustarlos valoresde pH, el
estudiointerlaboratorioreveló ciertasdificultadesque serelejan en la gran variabilidad en
los resultadosobtenidospor los diferentesparticipantesparauna misma muestra.Esto hace
que alguno de los datos no pudiera ser utilizado para el estudio y que algunos laboratorios
no remitieran los datos correspondientes a algunas de las muestras.
Los principalesproblemasencontradosfueron:
-Dificultad en la filtración, a lo que se atribuyó la falta de reproducibilidadentre
laboratorios.
-La falta de homogeneidad muy exagerada en los resultados obtenidos en muestras con
bajo contenido de fibra, (ej. patata).
-La hidrólisis enziinática del almidón fue conflictiva. En el caso del arroz la
degradaciónincompletase vió que proveníade una incorrectapreparaciónde la muestraque
dificultaba el acceso de los enzimas a los gránulos. También se señala la posibilidad, para el
resto de los alimentos, de una inactivación enzimática parcial o total durante el transporte.
-El análisis de alimentosprocesadospresentódificultadesdebido a la formación de
98
nuevoscompuestoscomo proteínasmodificadasy productosde la reacciónde Maillard.
-Carencia de un patrón de fibra. Se utilizaron como valores de referencia los dados
por las casascomercialesde las que obtuvieronlos productosanalizados.
Los resultados fueron concordantes con los obtenidos por el método de Asp y col., (1983)
y con el de Schweizer y Wiirsch (1979), sin embargo fueron inferiores a los obtenidos por
Englyst y col., 1982. Este método fue aceptadooficialmenteen 1984 (Prosky, 1992).
En 1985 (Prosky y col., 1985) se proponen modificaciones al método, con Jo que se pretende
conseguir los siguientes objetivos:
-Determinar a qué niveles no es reproducible el método.
-Evaluar el alcance de la degradacióndel almidón porquesu eliminaciónincompleta
interferirá en la determinación de fibra alimentaria.
-Evaluar el tamañode poro del crisol adecuadoen la determinaciónde fibra total
(FI).
-Mejorar los valores de los coeficientes de variación para la determinación de FT.
Paraasegurarsede que las enzimasque se iban a utilizar eran adecuadaspara digerir los
almidones que se encuentran de forma natural en los alimentos, se estableció un
procedimiento para valorar la eficacia del tratamiento enzimático. Esta valoración consistió
en analizarvarios almidonesy confirmar la ausenciade un residuo significativo.
Se comprobó que, tanto en la patata como en la harina blanca con contenidos elevados de
almidón, la hidrólisis fue completa.
Los coeficientesde variación se redujeronsustancialmentecon respectoal estudioanterior,
aunque las muestras con contenidos bajos de fibra siguieron presentando valores elevados.
Finalmentefue aceptadooficialmentepor la AOAC (ref. 985.29)(AOAC, 1990).
En 1988 (Prosky y col., 1988) se organiza un nuevoestudiointerlaboratorioque introduce
la determinaciónde fibra insoluble (FI) y fibra soluble (FS) independientemente.En esta
99
ocasión el método incluye un cambio en las concentraciones de las soluciones tampones
necesariasparaacondicionarlas enzimas.Estoscambioshan sido introducidosparaaumentar
la capacidad tamponante sin aumentar la concentración final de fosfato. Además esto evita
reajustes de pH cuando se utilizan productos ácidos. Para ajustar el pH se sustituyó el ácido
fosfórico por ácido clorhídrico para evitar un aumento concomitante de la concentración final
de fosfato que había dado origen a la coprecipitación de la sal.
Se indica la determinación de fibra insoluble (FI) y de fibra soluble (PS) de forma
independiente.
La precisióndel método paralas fraccionesaisladas,fundamentalmentePS, todavía no es
satisfactoria. Se señala asimismo la necesidadde másestudioscon frutas, verdurasy semillas
de leguminosas.
Cuando la FT se determina por análisis independiente y se compara con la suma de FI y PS,
los resultadosson muy semejantes,a excepciónde la soja en la que la FI fue superiora la
FT debido a la coprecipitación de otras sustancias aparte de la fibra. Este método se acepta
oficialmente por la AOACen 1990 (991.42 y 99 1.43) (Prosky, 1992).
En 1992 (Prosky y col., 1992) se lleva a cabo un nuevo estudio para valorar el métodode
1988. Se trata de aplicar el mismo método (Proky y col., 1984) que fue aceptado oficialmente
con las modificacionesen la concentracióndel tampón, de la basey sustitución de ácido
fosfórico por ácido clorhídrico. Se analizanademásde cereales,frutas y verdurascon un
mayor contenidoque aquellosen fibra soluble.
En general, los valores encontrados para PS fueron superiores a los de FI. Una razón
importantepara ésto parecen ser los problemasen la filtración que se pueden resolver
analizandouna menorcantidadde muestra:entre0,50 g y 0,25 g paramaterialescon elevado
contenidode fibra. El métodoparala determinaciónde PS necesitamásestudios.
En estudios anteriores (Prosky y col., 1984; Proky y col., 1985; Prosky y col., 1988) no se
publicaron los valorescorrespondientesa los blancos,a las proteínasy a las cenizas;sin
loo
embargo,en esta publicación (1992) se da cuentade los resultadosobtenidosen estas
determinacionestanto en FI como en FS.
En lo que al residuo FI se refiere, algunos investigadores que participaron en el estudio
obtuvieron valoresnegativospara el blanco,valorespróximos a cero paralas proteínasy
valoresnegativosde cenizas.
Para el residuo PS también se han encontrado valores próximos a cero para proteínas y
valores negativos para cenizas.
Estoshechoshacenpensar,porunaparte,en la necesidadde revisarel métodoKjeldahl para
la determinación de proteína en este caso y, por otro lado, en las pérdidas de celite que tienen
lugar a través del filtro. La calidad tanto de los crisoles como del celite deberían ser revisadas
cuando esas pérdidas exceden de 5 mg.
Se recomienda(Prosky y col., 1992) que el método de fibra insoluble sea adoptado
oficialmente.Estemétodose puedeutilizar paralelamenteal métodode la determinaciónde
fibra total para obtener fibra soluble por diferencia, hasta que se desarrolleun método
adecuado.
Tambiénaconsejanque las ¡nuestrascon elevadocontenidode azúcaresseanextraídascon
3 volúmenesde metanolal 85% paraevitar interferenciasen la determinaciónde fibra.
Se aconseja que se acepte el método de FT y el de FI (Proky y col., 1988) y que se calcule
FS por diferencia.
De todasestaspublicacionessorprendenfundamentalmentedoshechos:
-Por un lado la poca importancia que se da a la determinaciónexactade fibra
alimentariaen los alimentoscon bajo contenidode fibra.
-El hecho de ver publicados los valores correspondientesa los duplicadosy las
diferenciasexistentesentreellos (Prosky y col., 1992).
101
En la actualidad este método ha recibido numerosas críticas atacando fundamentalmente al
criterio de rapidez que motivó su diseño. Además, el valor absoluto de fibra estimado según
el métodode la AOAC puedeno corresponderexactamentecon los valoresde los métodos
cromatográficos a la hora de analizar los polisacáridos no almidón. En este sentido este
método ‘rápido” no tiene hoy día ninguno alternativo que ofrezca mayor información del
contenido de fibra alimentaria, a no ser el propio análisis detallado de los residuos insolubles
obtenidos.
El método ha sido modificado por Lee y col. (1992). Esta modificación consisteen la
introducciónde un tampónMES-TRIS en lugardel tampónfosfato, eliminacióndel ajustede
pH parala proteasa,y reduccióndel volumen total de muestray del volumende filtración.
El método de la AOAC ha sido adaptado por Li y Cardozo (1992) para alimentos con bajo
contenido en almidón y proteína. Suprimen en este método el uso de enzimas, dado que han
observado que la extracción con hexano y alcohol diluido en frutas y hortalizasda pesosde
residuo comparables a los obtenidosdespuésdel tratamientoenzimático.El métodoconsiste
en incubarlas muestrasen aguaa 37<’C, 90 mm. A continuaciónse precipitacon etanol y el
residuo de fibra total (FT) secorrigerestandoproteínasy cenizas.
En realidad, este método propuestopor Li y Cardozoes un pasomás despuésdel que
propusieron en 1988 Li y Andrews, en el que incluían una única enzima, amiloglucosidasa,
para hidrólisis de almidón. En estemétodono se hidroliza la proteínapresenteen la ¡nuestra
aunquesí seprocedea la hidrólisis de la que estápresenteen el residuo. La aplicaciónde
este método a diferentestipos de hortalizasllevó a la conclusiónde que sepodíaevitar el uso
de enzimas en el análisisde fibra en muestrascon bajo contenidode almidón y proteína.
Recientemente se ha llevado a cabo un estudio interlaboratorio en el que se comparan los
resultados obtenidos por este método con los obtenidos por el de la AOACpara Jas mismas
muestras (manzanas, albaricoques, repollo, zanahorias, cebolla y fibra de soja). Los
resultadosdel estudioaún no han sido publicados(Li y Cardozo, 1993).
102
Métodos sin enzimas habíansido ya propuestospor MeCance(1936) que realizaba la
extraccióncon etanol al 80% para dar tina fracción cuyo contenidoen almidón,proteínay
cenizas,se determinabapor separadoy se restabadel peso del residuo. Autores como
Siddiqui (1989) han sugeridoque el contenidototal de fibra alimentariapuedeserevaluado
determinandoel contenidode agua, almidón, proteínay cenizasy restándolosdel residuo
insoluble en alcohol.
La comprensióndel significadode los métodosenzimático-gravimétricoses importantedado
que el tratamientoenzimáticoestápresentetambiénen los métodosque seagrupanbajo la
clasificaciónde cromatográficos.
6.4. METODOS DE FRACCIONAMIENTO
6.4.1. Método de Soutlwate
Este método (Southgate, 1969) permite un fraccionamientode diferentes compuestos
admitidoscomo fibra alimentaria. Estefraccionamientoespecíficono sehabíalogradohasta
ese momento y va a ser la base conceptualde los métodoscronmtográficos.El método
permite el fraccionamientoen: polisacáridossolubles en agua, hemicelulosas,celulosay
lignina. Cada una de estasfracciones se cuantifica mediantecolorimetría. El esquemaes
técnicamentesimple puestoque sólo empleaaparatossencillos. Es un método largo ya que
requiere varios días paracompletarlo. Permite un grado limitado de fraccionamientoque
deberáserseguidopor un análisiscuantitativocon métodosrazonablementeespecíficos.Los
resultadossugierenquelasdiferentescolorimetríasdanun análisisvirtualmentecompletopara
los carbohidratosno disponiblesquetienen algún significadonutricional y en el campode la
químicade los polisacáridos.Estos resultadosestánde acuerdocon estudiosmásdetallados
de paredescelularesde las plantas.
Southgateutiliza takadiastasapara la eliminación de almidón. Estaenzimaes una potente
amilasaquedesapareciódel mercadocuandodejédeutilizarsecon fines industriales.Realiza
la hidrólisis de celulosacon H2804 72% (plv), a O-40C durante24 h, y la hidrólisis de
103
hemicelulosascon H2S04 5% (p/v) a lCOt)C. Las determinacionescolorimétricaspresentan
el problemade las interferencias.Las hexosasinterfieren en el método de pentosasy el
métodode ácidosurónicosespoco específico.
Southgateseñalaademásun hechoque muy pocosautoresindican y es que las pruebasde
recuperacióntal como se entiendenconvencionalmente,no pueden ser aplicadasen la
determinaciónde carbohidratosno disponibles.Es imposible simular las condicionesde la
paredcelularcuando seañadenpolisacáridospurificadosa una muestrabase.
6.4.2. Otros métodosde t’raccionainiento
Se incluyen dentro de esteapartadolos métodosde Anderson y Clydesdale(1980a) y de
Monte y Maga (1980). Cada uno de estos métodos resulta de una combinación yio
modificaciónde métodosanterioresquepermitanobtenervaloresseparadosparabiopolímeros
solubles en agua fría y caliente así corno de sustanciaspécticas totales, hemicelulosas,
celulosay lignina.
Para la hidrólisis de almidón y proteínael primero de estos métodos utiliza pepsinay
pancreatina,mientrasqueel segundoutiliza amiloglucosidasay tripsina. Esteúltimo método
permiteobtenerhastatrecefraccionesdiferentesdentrode la fibra alimentaria.
6.5. METODOS CROMATOGRAFICOS
En primer lugarsedescribiránlas característicasgeneralescomunesa todos ellos y después
se hará una descripciónmásdetalladade métodospropuestospor diferentesinvestigadores
teniendoen cuentalas distintas variantesde cadatino de ellos.
Estosmétodosconstanfundamentalmentede cuatro pasos:
-Tratamientoenzimáticoparala eliminacióndel almidón.
104
-Hidrólisis ácidade polisacáridos.
-Identificación
-Cuantificacióndelos monosacáridos,bien porCromatografíadeGas-Liquido(GLC)
ó bien por CromatografíaLíquida de Alta Eficacia (HPLC).
Las técnicasque se aplican al análisis de fibra permiten la identificación de diferentes
monosacáridosprocedentesde los polisacáridos, componentesmayoritarios de la pared
celular. Asimismo, existela posibilidadde aproximarseal conocimientode la disposiciónde
los enlacesentredichospolisacáridos.Ahora bien, no suministranningunainformaciónmás.
El desarrollode estosmétodosva parejoa dosproblemasque ya surgieroncon anterioridad:
-La utilización de métodoseficacesparala eliminaciónde almidón y la reproducción
de las condicionesfisiológicas.
-El debatesobrela definición de fibra.
Ademásincorporan,lógicamente,nuevasdificultadesanalíticastípicasde la metodología:
-Hidrólisis de polisacáridosa nionosacáridos.
-Formaciónde derivadosvolátilesde dichosmonosacáridosquepuedanseranalizados
por GLC o neutralizacióndel hidrolizado obtenido para su análisis por HPLC si las
característicasde la columnalo exigen.
Todos estosproblemasson abordadospor diferentes investigadoresaunquede una forma
paulatina.Establecerun ordencronológicode autoresy fechases muy difícil dado que las
investigacionessobrelos distintosaspectossedesarrollande formaparalelae independiente
lo cual hacequeciertasmejorasintroducidaspor unostardenun tiempo en ser incorporadas
por otros.
6.5.1. Cromalo2rafín de 2as-lipliido: GLC
En esteapartadode la memoriafiguran aquellosautoresque han dado lugaral desarrollode
105
diferentesmétodos paraGLC, en los cualeshan ido introduciendomodificacionesa lo largo
del tiempo y, que, en algunoscasosson fruto de interesantesestudiosinterlaboratorio.En
estesentidocabedestacarla importanciade los siguientesgruposde investigación:
- Theandery colaboradores.
- Englyst y colaboradores.
- Selvendrany colaboradores.
Entre estosinvestigadores,Theanderha estudiadomás a fondoal problemade la hidrólisis
enzimática del almidón, Englyst se ha dedicado fundamentalmenteal proceso de
derivatizacióny Selvendrandestacaporconsiderarla fibra alimentariadentrodel contextode
la paredcelular y, además,en sus trabajosse incluyen muy frecuentementedetallessobrela
estructura de las paredesrelativos a los tipos de enlacesentre polímeros y disposición
estructuralde los mismos.
Estosautoresno hanincidido particularmentesobreel estudiode las condicionesde hidrólisis
de los polisacáridosno almidón.
-Grupo de Theandery col. (Swedish University of Agricultura! Sciences.Uppsala.
Suecia)
Destacanpor sus estudios acercade la hidrólisis enzimáticade almidón necesariapara la
determinaciónde fibra alimentaria. Este grupo de trabajo considerael almidón resistente
como partede la fibra alimentaria, así como la lignina Klason. Fraccionanla fibra en
insoluble y soluble,haciendoespecialhincapiéen la problemáticadeextracciónde la fracción
soluble.La hidrólisisde almidón la realizansiempreincorporandocomoenzimas a-amilasa
termoestable(termamyl)y amiloglucosidasa.La enzimatermamyl esunaamilasabacteriana
queal actuarsobreel almidónde patataa850Cdurante45 minutoslo degradacompletamente
a sacáridosdializables. No libera cantidadesdetectablesde azúcaresal actuar sobreun fi-
glucanopurificadode semillade cebadao sobreun arabinoxilanode cebadaó sobrecelulosa
de algodón (Theandery Áman, 1979a).
Proponenrealizarla hidrólisisde almidónen diferentesmomentosduranteel análisisde fibra
106
(Theandery Áman, 1979b). Indican dos variantespara un mismo método: A y B. En la
varianteA realizanla hidrólisis de almidón antesdel fraccionamientoen fibra insoluble y
soluble, mientras que en la B se determina un residuo insoluble previamentea la
determinaciónde almidón. Estaserealizaindependientementey serestadel valor del residuo
obtenido. Estamodificaciónpuededar lugara error en muestrascon elevadaproporciónde
almidón y baja proporción de fibra por eso se sustituyó el B por un esquemade
fraccionamientoC en el que el almidón seelimina antesdel aislamientodel residuode fibra.
La fibra solubleseprecipitacon etanoly la fibra queseobtieneesla total (Theander,1983).
Con el tiempo, Iheandery Westerlund (1986) modifican las condicionesde hidrólisis con
termamylpara alimentosprocesados,y trabajana 96% ya que observanque en ¡nuestras
comoharinaprocesadaporextrusiónpuedequedaraproximádamenteun 1% dealmidón. Esta
enzimala utilizó Asp en condicionessemejantes,perode formaindependienteen 1983. Estas
condicionesdieron resultadosde gran precisiónparacerealesen grano. Aunqueesta enzima
fue tambiénutilizadaporNeilson y Marlett en 1983, estosautoresincluían el tratamientocon
ultrasonidos comprobandoque se reduce la eficacia. Se observa que hay una buena
correlaciónentre los métodosA y C, y entre B y C cuandola muestrano tiene mucho
almidón.
En el denominadométodode Uppsala,Theandery col. (1990) incluyen dicha enzimajunto
con amiloglucosidasaaconsejandoestudiarla actividaddegradativade la fibra quepresentan
las enzimasque hidrolizan el almidón. En general,el tratamientoenzimáticoque se propone
en el método de Uppsala consumemás tiempo que el que necesitanlos tratamientos
enzimáticosdel método de la Associationof Official Analytical Chemists(Prosky y col.,
1988) y el de Englyst (1991). Estos dos métodosincorporantambién termamyl, el de la
AOAC desdelos primerosestudiosy el de Englyst por primeravez. Recientementese ha
llevadoacaboun estudiointerlabortorio del métodode Uppsalay los resultadosestánsiendo
evaluadosen el momentopresentepor la AOAC (The Referee,AOAC 1992).
Las muestrasutilizadaspor el equipode Theanderson fundamentalmentecerealesy derivados
y hortalizascon elevadocontenidoen almidón (patatay guisante).
107
Otrosaspectosde la problemáticade la determinaciónde fibra alimentaria,consideradospor
estegrupo, se señalana continuación.
En relación con la fibra soluble seobservaque, el tipo de solución empleadaen la extracción
condiciona el valor obtenido, no sólo cualitativamentesino también cuantitativamente.
Asimismo, en el líquido que quedadespuésde la precipitaciónde la fibra se observaun
porcentajeimportantede la misma sobretodo en alimentosprocesados.La determinaciónde
lignina se realizapor filtración y posteriorgravimetría.
Analizan también ácido acéticoy cinámico señalandoque están formandoésterescon los
componentespoliméricosde la fibra. Seobservanporcentajesimportantesde estosácidosen
algunasde las muestrasestudiadas:maíz y remolachaazucarera.
En lo referente a la comparaciónfresco—procesadosí detectanmodificacionesque son
obviadaspor Englyst (1991)
En cuantoa las condicionesde hidrólisis, estosautoresutilizan H2504 muy diluido (0.4-0.1
M) paralas hidrólisis secundarias,y en cuantoa las condicionesde derivatizaciónsiguen el
métodode Sawardeker(1965)de formaciónde acetatosde alditol y el de Sweely (1963)de
formaciónde derivadosde trimetilsilano. En 1986, incorporanlas modificacionespropuestas
por Englyst y Cuminings(1984) y que se detallarána continuaciónen el apartadodedicado
a esteautor. Como característicapeculiarde Theandery col. se puededestacarel análisisde
ácidosurónicospor descarboxilación.
-Grupode En2lvst y col. (Dunn Clinical Nutrition Centre.Cambridge.Reino Unido).
Estegrupoinvestigador,en el quedestacaH. Englyst, se dedicadesdehaceañosal estudio
de la determinaciónde fibra alimentariapor métodoscromatográficospreviahidrólisis. Sus
estudiossehan centradoprincipalmenteen el pasode la derivatización.
Según el métodopublicadoen 1982 (Englysty col., 1982)digieren el almidóncon a-amilasa
y pululanasa.Se hicieron ensayoscon otras enzimascomprobándoseque su capacidadde
108
hidrólisis no era suficientey que en algunoscasostenían actividadhemicelulásica.
Observanque el procesadode los alimentospuededar lugar a retrogradacióndel almidón
gelatinizadoy estefenómenolo haríaresistentea la hidrólisis con cx-amilasa.Estealmidón
puede ser solubilizado con una solución de hidróxido potásico 2M, hidrolizado con
amiloglucosidasay determinadocomoalmidónresistente.Se intentóla dispersióncon cloruro
de litio queen principio se mostróeficazpero que ha de ser eliminado antesde adicionar
enzimas. Para acelerarel proceso se necesitanelevadastemperaturasy ello da lugar a
pérdidas.
Neutralizancon carbonatode bario, comprobándoseque este paso conlíeva una cierta
dificultad. La reduccióny acetilaciónson procesoslentosy tediosos.La reducciónimplica
el tratamientocon una soluciónde tetraboratosódicoen amoniaco,mezclary dejar2 horas,
añadir metanol al residuo y evaporara sequedad.La acetilación se realiza añadiendo
anhídrido acético y calentandodurantedos horas a 120<’C. Dividen el método en tres
procedimientosque permitenobtenerdiferentestipos de fraccionamiento.
Un nuevodiseñodel métododatade 1984 (Englysty Cu¡nmings,1984).Dispersanel almidón
con dimetilsulfóxido (DMSO) que es un agenteeficazen la roturade enlacesde hidrógeno
intermoleculares.Se facilita la reacción de acetilación añadiendoN-metilimidazol como
catalizadorque acelerala reaccióny utiliza NH4OH paraneutralizar.Modifican el resto del
procedimientoañadiendooctan-2-ol,a continuaciónuna solución de borohidrurosódicoen
amoniaco3M dejandolb a40<’C. Posteriormenteseañadeácidoacéticoglacial y a unaparte
alícuotade la soluciónacidificadase le añadeN-metilimidazol seguidodeanhídridoacético.
A partir de aquí se puedenseguirdos procedimientos:
a) Añadir aguay diclorometano(Englyst y Cummings,1984).
b) Añadir etanol y mezclar, a continuaciónañadir agua,KOH 7,5 M y mezclar,
repetir la adición de KOH 7,5 M y mezclar. Dejar reposarhastaque seseparenlas dosfases
(Englyst y Cummings, 1984; Englyst y Cummings,1987 y Englyst y Cummings,1988).
Despuésde un estudiointerlaboratoriollevado a cabopor Englysty col. en 1987 (Englysty
¡ 09
col., 1987; Englyst y col., 1987) sesuprimedefinitivamentela utilización decarbonatode
bario como agenteneutralizante.
En todos estos métodos se mantienen constanteslas condiciones de hidrólisis. La
solubilizacióne hidrólisisdecelulosaserealizacon ácidosulfúrico 12 M a 35’~C lii seguido
de ácidosulfúrico 1 M 2 h.
Este método permite como alternativa la determinacióncolorimétrica del hidrolizado
utilizando ácidodinitrosalicílico en caliente(Englysty Hudson, 1987).
Existe muy buenacorrelaciónentrelos resultadosobtenidosparael métodoporcromatografía
de gasesy los resultadosobtenidospor colorimetría en un elevadonúmero de alimentos
pertenecientesa diferentesgrupos: cereales,hortalizas, frutas y frutos secos(Englyst y col.
1988).
La evolución de estos métodos ha permitido pues el establecimientode las condiciones
óptimaspara la determinaciónde polisacáridosno almidón (NSP) en alimentosfrescosy
procesados.
En 1992 Englyst y col, proponen una nueva modificación de su método. Se observauna
tendenciaa la disminucióndel tiempoglobal que durael método,medianteuna reducciónen
los tiemposde cadaetapa.Destacaentretodaslas modificacionesla introducciónde termamyl
y pancreatina,enzimas que ya utilizaban Asp y col. en 1983, y la modificación en las
condicionesde hidrólisis. La hidrólisis primaria se realizacon tina mayorcantidad deácido
sulfúrico.
Señala,además,que no hay necesidadde dividir los NSP en fraccionessolublee insoluble,
luego se puedeomitir el pasonecesarioparadichadivisión.
‘lo
-Grupo de Selvendrany colaboradores.(AFRCInstituteof FoodResearch.Norwich.
ReinoUnido).
Los trabajosde Selvendrany col. se caracterizanfundamentalmentepor hacerreferencia,
continuamente,al tipo de tejido en el que se encuentranlocalizadaslas paredescelularesque
constituyen el marco de la fibra alimentaria. Este grupo realiza numerososestudios
monográficosdedicadosa estetema (Selvendran1984; Selvendrany col., 1987; Selvendran
y Verne 1990).Hanpropuestoun métodoen el quepoco a poco van introduciendovariantes
que le permitenadaptarsea todo tipo de alimentosevitandoasí las limitacionestípicasde
otros métodos.
La novedadprincipal introducidapor Selvendrany col. consisteen aislar lo que llaman
“material de la paredcelulart’ antesde procederal análisisde fibra y es lo queotros autores
denominanresiduode fibra alimentaria.Paraello utilizan el siguientetratamiento:el tejido
húmedosesometea la acción de un molino de bolasy despuéssetrata secuencialmentecon
deoxicolatosódicoacuosoal 1% (p/v), fenol/ácidoacético/aguay dimetilsulfóxido (DMSO)
al 90% en agua(y/y). Los efectosdecoprecipitaciónse minimizanaislandoel material de la
pared celular bajo condiciones en las que la tendencia a asociarse con moléculas
citoplasmáticas,especialmenteenlacesde hidrógeno,es mínima (Selvendrany col., 1979b).
Los efectosdisolventesdel deoxicolatosódico se deben a que interaccionacon regiones
hidrofílicas y lipofflicas de proteínas.
El fenol/ácidoacético/aguaextraeproteínasresiduales,el deoxicolatosódico adsorbidoy
lípidos, en virtud de una fuerte acción disociativadel fenol y su capacidadpara formar
enlacesde hidrógeno.
Se estudió el sistema de homogeneización utilizado observando, mediante examen
microscópico,quela utilizacióndel trituradory el modelodetejido húmedofueron necesarios
para desintegrarla estructuracelular. El tejido molido húmedo es homogéneoy tiene la
ventaja de ser fácilmente aislado por centrifugación. Favoreceasimismo la eliminación
absolutade almidón mediantemétodosquímicoso enzimáticos.Paracerealesse obtuvo un
111
tamañode partículaen el material de la paredcelular de 50 a 150 ítm de longitud y de 15 a
25 jxm de anchura.Tamañosmásgrandesse obtuvieronparatejidos lignificados (Selvendran
y Dupont, 1980).
Secomprobóqueno se producíadegradaciónen los polisacáridosen un ensayorealizadoen
muestrasde almidón de patatay lisozima. Los resultadossugierenque los polimerosde la
paredcelularno sedegradanbajo estascondiciones.Sin embargoel molido del material seco
durante48 horasredujo el tamañototal de partículaa 5-15 pm y puedecausar,por tanto,
algo dedegradaciónde los polímerosde la pared celular (Selvendrany Dupont, 1980).
El material así obtenido está virtualmente libre de almidón, proteínasy otros compuestos
interferentes.Paraalimentoscon elevadaproporciónde almidón combina el tratamiento
anterior con un ataque enzimático con cy-amilasa y pululanasa, evitando el uso de
amiloglucosidasapor su actividadhemicelulásica.
Selvendrany col. (1979b)pruebandiferentestipos de hidrólisisy métodosdeacetilaciónpara
el estudiode la composiciónmonoméricadel material de la pared celular, llegandoa la
conclusiónde que la hidrólisis de Saeman(142504 72% p/p 3 h a 200C y H2504 2N 2 h a
l00<’C) es la queda mayor liberaciónde azúcaresfrentea la utilizaciónde H2S04 2N durante
5 horasy ácidotrifluoroacético.
El análisis de composiciónmonoméricaincluye también las sustanciaspécticasque no se
puedenextraertotalmentedel material de la paredcelularcon solventesacuososinorgánicos
y los polímerosaisladosqueno sepuedensolubilizarcon ácidomineral diluido. Parafacilitar
la solubilidad recomiendanun tratamientopreliminar con pectinasa.Compruebanque el
142504 al 72% promueveuna rápida solubilización de los polisacáridosde la paredcelular,
incluidas las sustanciaspécticas.La descarboxilaciónde los residuosde ácidosurónicosde
las sustanciaspécticasque seproduceduranteel tratamientocon ácidosmineralesdiluidos
es mínima.
Dentro de la fasede derivatización,en la acetilaciónutilizan la reduccióncon borohidruro
sódico y como catalizadorpiridina.
112
Tambiénrealizanel análisisde metilación segúnel métodode Hakomori (1964) separando
en fraccionessolublese insolublesen cloroformo/metanol.Esteestudioreveló la naturaleza
de los principalesenlacesglucosídicospresentesen el material de la pared celular. La
hidrólisis ácida gradualde dicho material hizo posibleevaluarla fuerza relativade algunos
enlacesglicosídicos.
El material de la pared celular puedeser utilizado también para realizar una extracción
secuencial,con diferentestratamientos,en función del tipo de tejido que seestéanalizando:
-paratejidos parenquimatosos:
- aguacaliente
- oxalatoacuosoen caliente
-KOH lNy4N
-para tejidos lignificados: realiza un tratamientode deslignificaciónque permite la
obtenciónde la holocelulosaa la cual aplicaextracciónsecuencialcon
- aguacaliente
- DMSO
-KOH lNy4N
En los tejidos parenquimatososse vió que, en el material de la paredcelular, las sustancias
pécticassolubilizadasporaguacalienteeran más esterificadasque los polímerossolublesen
oxalato.Los polímerossolublesen álcali conteníanxiloglucanosy otros polisacáridosy una
pequeñacantidadde sustanciaspécticasy el residuo final (wcelulosa)conteníaademásde
celulosa,algunasglicoproteinasy pequeñascantidadesde sustanciaspécticas.
A partir de estas observacionesdesarrollan estudios detalladosde fraccionamientode
glicoproteinas,encontrandoqueuna gran proporcióndeglicoproteinarica en hidroxiprolina
estabaasociadaa la fracciónde a-celulosay que la mayorparte de ella podíaliberarsepor
tratamientocon cloruro sódico y ácidoacético.
Porsusestudiosindicanque,en tejidosparenquimatosos,sepuedepartir del residuoinsoluble
en alcohol, haciendola determinaciónde proteínas.Para tejidos ricos en almidón es más
113
adecuadoutilizar el material de la paredcelular.
En 1990 Selvendranpublicaciertasconclusionesen relación con el enfoquequeha de darse
a los métodosdefibra alimentaria.Al desarrollarmétodosparael fraccionamientode lapared
celular se ha puesto de manifiesto que el tracto gastrointestinalpuedeestar implicado
activamenteen el fraccionamientode la fibra alimentariaduranteel tránsito intestinal y, por
lo tanto, puedesermásventajosoinvestigarla químicade la fibra alimentariaen línea con
esteaparentefraccionamiento,en lugarde insistir en la correlaciónde los efectosfisiológicos
únicamentecon la ingestacuantitativacomo fibra total ó erróneamentecomo fibra soluble
medianteanálisisquímico.
Esto se puedehacer extensivo para no considerarel que todas las fibras de cereales
constituyenuna fuentede fibra diferentey, de formasemejante,todaslas fibras de las frutas
y verdurasson otra fuentedistintapuestoque dentrode los cerealescomo,dehecho,dentro
de las frutas y hortalizas, existen diferencias estructuralesy composicionales.Estas
diferenciaspuedenser responsablesde los efectos más que las diferenciasgeneralmente
asumidascomo debidasa los individuos.
Existen otros autoresque partendel residuo insoluble en alcohol para el estudiode fibra
alimentaria. Bittner y col. (1982) lo utilizan fundamentalmentepara verduraspobresen
almidón y proteína, maíz, guisantey patata. Realizan la determinaciónde almidón en el
residuo insoluble en alcohol, aunqueno analizanproteínay pretendenresolvercon este
métodolas dificultadesde los métodosgravimétricos.Señalanquelos resultadosobtenidos
parapatatasson comparablescon los obtenidospor otros autores.
Bittner y Street(1983) aplicantambiénestemétodoal estudiode forrajes.
Dentro de los estudiosde análisisde mediacióndestacanlos de Brillouet <1982) y Brillouet
y Carré (1983)en el campode las leguminosas.
114
6.5.2. Cromato2raffa líquida de alta eficac¡a: HPLC
Si en el casode la aplicaciónde la cromatografíade gasesal estudiode fibra alimentariase
han llevado a cabonumerososestudios,la cromatografíalíquidadealta eficacia(HPLC) ha
sido muy poco experimentadaen estecampo.
Aunque el análisisde hidrolizadosde paredpor HPLC aparecerelativamentepronto en la
bibliografía, (Conrad y Palmer, 1976), no se aplicaráa la fibra como tal hastaun tiempo
después.El primer estudioen estesentidosedebea Barton y col, en 1982 y va referidoal
análisisdel residuoneutrodetergentede forrajes.La resoluciónque obtienenparala muestra
de patroneses satisfactoria,sin embargo,en el análisis de las muestras,la proporciónde
azucarespresentessólo permitesepararxilosa, arabinosay glucosa.La galactosano sesepara
de la glucosa,quedandocomoun hombroen la pendientedescendentede éstay la ramnosa
no esdetectada.En alimentosparael serhumanolo aplicanpor primeravezSíavin y Marlett
en 1983. Estosinvestigadoresanalizanel residuoneutrodetergentede unadietabajaen fibra
así como del residuo fecal obtenidodespuésde la ingestade la misma.
Como puedeversepor las fechas, la incorporacióna alimentosdestinadosal serhumanoes
bastantetardíay los trabajosencontradosanalizanun númeroreducidode alimentos.Además
escuriosoque en estos trabajos,escasosen número,aparezcandos: Síavin y Marlett (1983)
y Quigley y Englyst (1992),que en su concepciónobedecena un dobleobjetivo,por un lado
el estudio de las posibilidadesque ofreceesta técnicay, por otro el estudio de materiales
biológicos, como heces. Este último hechoes muy poco frecuenteen investigaciónsobre
metodologíade fibra alimentaria.
Síavin y Marlett (1983) comparanlas posibilidadesqueofrecendos tipos de columnas,una
de sílice (MicrobondapackCarbohydrate,Waters Assoc.) y otra de intercambio iónico
(Aminex HPX-85 Carbohydratecolumn, BioRad).
Cuandolos residuosFND del alimento y de las hecesseanalizaronen la columnade sílice
sedetectaronramnosa,arabinosa,xilosa y glucosa. Dadoque en las muestraspredominala
glucosa,siendoalgo superioral 75% de los azúcarestotalesencontrados,no pudodetectarse
115
ni manosani galactosaque eluyena ambosladosde la glucosarespectivamente.La columna
Microbondapackno detectócelobiosa.En la columnade metal pesado,utilizada por estos
mismos autores,galactosay ramnosacoeluyen. La separaciónde todos los azúcaresse
completó en 25 mm. Fueron analizadoscelobiosa, glucosa,xilosa, arabinosa,manosay
galactosa/ramnosa.
Estosautorescompruebanque no hay variación importanteen la cuantificaciónrealizadaen
los azúcaresal utilizar ambascolumnas,lo queesuna evidenciaindirectade la exactituddel
método.Síavin y Marlett se decantanen estaocasiónporel métodoque lleva la columnade
intercambioiónico debidoa una seriede razones,ademásde su capacidadpara separarmas
azúcares.
Neilson y Marlett (1983) utilizan la columna de intercambioiónico HPX-87P (BioRad).
Señalanlos aspectospositivosde sencillezy rapidezen el análisis, aunquela columnatiene
ciertaslimitaciones:
-No se separaramnosade galactosa.
-La sensibilidaddel detectorde índicede refracciónes menorque la del detectorde
ionización de llama (BID) empleadoen cromatografíagaseosa.
A finalesde los 80 se incorporaa la tecnologíade HPLC un nuevodetector,el de impulso
amperoniétrico(PAD). Estedetectorserá utilizado por Garleb y col. (1989)y por Quigley
y Englyst (1992).
Es de señalarque Garleb y col. aplican estatécnicaal análisis de monosacáridosque se
encuentranen materialesfibrosos pero nunca a residuosde fibra previamenteaislados.
El paso de neutralizaciónse resuelve muy ventajosamentefrente a los procedimentos
utilizadosen trabajosanteriores(Ba(OH)2y CO4Ba). Utiliza unaresmade intercambioiónico
BioRad AG4-X4 que neutralizael hidrolizadoácido.
El métodode Quigley y Englyst (1992) resuelveel problemade la neutralizaciónutilizando
una precolumnaque precede a las columnasanalíticas, lo cual facilita enormementela
116
prácticade laboratorio.Además,el métododescritopor estosautorespermitela separación
de monosacáridosy hexosaminas.
En amboscasosseindica quelos métodosson muy exactos,precisosy con gran resolución
apartede su sencillezy rapidez.
En el momento presente,en el seno de la Comunidad Económica Europea (Bureau
Communitairede Référence:metrologíaaplicaday análisisquímicos)seestánllevandoa cabo
estudiosinterlaboratorioquepermitancertificar el contenidodefibra alimentariaen materiales
de referencia.
Los métodosempleadosson AOAC (Proky y col., 1988), Englyst y col. (1992),Quigley y
Englyst (1992)y Uppsala(Theandery col., 1990). Las muestrasobjeto de estudioson: pan
blanco,pan integral,mezclade panblancoe integral y cerealesparael desayuno.El objetivo
de estostrabajoses llegara conseguirtina buenareproducibilidady repetitividadde resultados
paraun mismo método,sin entraren la discusiónde las diferenciascuantitativasquepuedan
presentarseentreellos ni en la discusióndel conceptode fibra alimentaria.
Estosestudiossecaracterizanporlas numerosasmodificacionesa que estánsiendosometidos
los protocolospropuestosinicialmentehastallegar a unascondicionesanalíticasque permitan
lograr el objetivo propuesto.
117
7. INFLUENCIA DE LOS TRATAMIENTOS TERMICOS SOBRE LA
FIBRA ALIMENTARIA.
Desdeun punto de vista general, el procesadode alimentostiene gran importanciaen la
actualidady ello pordiferentes razones.Varela (1984)destacalas siguientes:
-El cocinadoes una característicatípica del comportamientohumanocon una base
claramenteevolutivaque diferenciaal hombrede otros animales.
-Las técnicasculinariasconstituyenuna herenciasocio-cultural.
-El interés por la gastronomíay el placer de comer han ido creciendode forma
importanteen el mundo desarrolladoen los últimos tiempos.
Existe numerosabibliografíadedicadaal estudiode las modificacionesexperimentadaspor
los componentesde los alimentos(Tressler, 1961; Boltman, 1978; Holdsworth, 1979).
Parael caso de la fibra alimentariael examenbibliográfico revelaque se afrontael tema
desdediferentespuntosde vista. Por un lado se analizanlas modificacionescuantitativas.En
estecaso, cadamétodo de análisis da lugar a unos resultadosdiferentespara una misma
muestray un mismo procesadotiene diferentesefectossobredistintasmuestras.Ahorabien,
aunque la consideraciónmás ampliamentedifundida es sólo cuantitativa,es interesante
conocer lo que sucedeen estafracción y sus potencialescomponentes,dadala posible
trascendenciafisiológicade unavariaciónno sólo cuantitativasinotambiéncualitativa(Pilnik
y Voragen, 1984; Amado, 1992).
Existen, asimismo, importantesestudios dedicadosa la explicación de los mecanismos
mediantelos cualessejustifican los dos tipos de variaciones.
A continuaciónsepasaráa exponerun breveresumende los hallazgosen estosdos campos:
-Modificación cuantitativa.
-Modificación cualitativa y relación entre la textura y las modificaciones
experimentadaspor los componentesfibrosos: explicaciónde mecanismos.
118
Un aspectoimportantea consideraresel hechode queestosestudiosvan a tener,en ciertos
casos,utilidad parala industria (Todd y col., 1989; Artz y col., 1990). Tambiénse pueden
aplicar parael aprovechamientode ciertosresiduosen agricultura(Barí y col., 1986).
7.1. MODIFICACIONES CUANTITATIVAS
Las tablas de composición de alimentos reflejan los componentesde ciertos alimentos
procesados.Así las tablas Souci-Fachmann-Kraut(1986/87) incluyen los datos de fibra
alimentaria para algunos alimentos procesados.El método utilizado es el enzimático-
gravimétrico de Schweizery Wúrsch (1979). En Estados Unidos se han elaboradounas
tablas,con propósitosunicamentede investigación,sobreel contenidode fibra alimentaria
de algunosalimentosprocesadosincluyendoproductosde panadería,pasteleríay cerealesde
desayuno,cerealesy derivados,frutasy verdurasy preparadoscomercialesquelas contienen,
y legumbresy frutos secos(United StatesMinistry Of Agriculture, HNIS/PT 106). En este
caso,utilizan el métodoenzimático-gravimétricode la AOAC. Se consideraen amboscasos
diferentesprocesados,perosólo seaportandatosexpresadoscomog/ 100g de sustanciafresca
y nadasecomentaacercade posiblesvariaciones.
En 1988 Englyst y col. (1988) y Englyst y col. (1989) publican una serie de trabajos
dedicadosal estudio de la influencia de distintos procesadosen diferentes grupos de
alimentos.Utiliza el métododiseñadopor su equipo (Englyst y col., 1988) y concluyeque
no existendiferenciassignificativasen ningunode los casosestudiados.
Estastres fuentesde informaciónproporcionandatos de fibra alimentariapara un producto
frescoy su correspondienteprocesado,sin embargopresentanuna ciertaanarquíaen cuanto
a dos hechos:
-No profundizanen cadatipo de procesado.
-No dan cuentade los cálculos que se han seguidoparadeterminarlos contenidosen
fresco y en el correspondienteprocesado,ni en las condicionesen que ambos datos son
comparados.Esto haceque seamuy difícil hacerun análisisde los resultados.
119
Estosdoshechosseobservanreiteradamentea lo largo de la bibliografía.El primerode ellos
es en cierto modo lógico dado que la investigaciónde cada autor se va a centrar en un
númerolimitado de muestrasy de tratamientos.Sin embargo,el segundoes másdifícil de
entender.Son muy pocoslos autoresque explicanla forma en quesehan hecholos cálculos
quepermitenestableceruna comparaciónlógica (Bomben y Hudson,1977; Carroady col.,
1980; Zyreny col., 1983; Reistad, 1984; Nyman, 1984; Nymany col., 1987;Nyman, 1990).
A continuaciónse expondránbrevementelos resultadosdediferentesinvestigadoresparacada
tipo de procesadoen diferentesmuestras.
A la hora de estableceruna clasificación de los resuitadosobtenidospor diferentesautores
sepuedenseguirvarios criterios:
-Segúnel métodode análisisempleado.
-Segúnel tipo de procesado.
-Segúnel tipo de alimento.
Dadoque en la bibliografíael criterio que predominaa la horade elegir uno u otro método
sebasaen consideracionesparticularesde cadainvestigadory quees muy difícil aunarlosse
optapor elegir una clasificaciónen función del tipo de alimento.
Paracadamuestrase hanestudiadodiferentesprocesados,evaluandosusefectospordistintos
métodossegúnlos autores.
Sehandesarrolladonumerososexperimentosen hortalizas.En la mayoríade ellosseestudian
los tratamientospor cocciónen el senode agua. Destacael númerode alimentosestudiados
por Herranz y col. (1981, 1983) y Vidal-Valverde y col. (1983), entre los cualesse
encuentranalgunoscon mayorcontenidoen proteínay almidón. En estasmuestrasse procede
a la cocción y se determinanFibra Neutro Detergente(FND) y Fibra Acido Detergente
(FAD), celulosa,hemicelulosas,lignina y sustanciaspécticas.Los resultadosexpresados
comog/l00 g de materiasecaindican generalmenteun aumentodeFND y FAD y celulosa
y un descensode sustanciaspécticas.
120
En la patata la cocción da lugar a un aumento de fibra insoluble (Varo y col. 1983), un
descensode FND y un aumentode celulosa.
El tratamientodecoccióna presión(Varo y col. 1984)a distintastemperaturas1000C, 1200C
y 1300C da un aumentosignificativo de celulosa,en los polisacáridosno celulósicossolubles
en agua se produceun aumentode galactosay hay descensoen ácidos urónicos, más
acusadamentea 1300C. Para los polisacáridosno celulósicos insolubles en aguahay un
aumentode glucosay un descensode galactosa.
Varo y col., (1984) observanen el tratamientopormicroondasun aumentoen el contenido
de fibra total de forma menos importanteque en el tratamientopor autoclave. En los
polisacáridosno celulósicos insolubles en agua no hay grandes cambios en glucosa y
galactosa.
Duranteel horneadoseproduceun aumentoen el contenidode fibra total y decelulosa(Varo
y col. 1984)cuandoseaplica el métodode Englyst (1981)modificadopor Varo.
La fritura da un aumentode fibra alimentariay de celulosa,y descensodel valor de la fibra
neutro detergente(Varo y col. 1983).
En tomatesseestudiala coccióna presión en distintas condicionesde temperatura100W,
120W y 130”C (Varo y col, 1984). Los polisacáridosno celulósicossolubles en agua
aumentana lOOt’C y desciendena 120” y 130”. Lignina y celulosadisminuyen a 1300C
siendo los cambiossignificativos. El tratamientoen autoclavecon acidificación del medio
produjo los mismos efectosque en el caso de la patata. El tratamientopor microondas
produceun aumentoen los valoresde polisacáridosno celulósicosinsolublesen agua,no hay
grandescambiosen glucosay galactosaperosien los valoresdepolisacáridosno celulósicos.
El horneadoprodujo un aumentode lignina y celulosade todos los constituyentes.
En iudíasverdesel cocinadoa presión produceun descensoen los valoresde FND, FAD,
celulosay lignina (Vidal-Valverdey Frías, 1991>, y el blanqueadoy el enlatadono tienen
ningún efecto (Nyman y col., 1987). En judías verdes en puré seproduceun descensoen
121
sustanciaspécticasduranteel hervido en los primerosmomentosde la cocciónpara pasar,
a medidaque estaprosigue,a una destrucción total de las mismas(Andersony Clydesdale,
1980).
El escaldadode esoárraaos(96”C 4 mm) se estudiamediantelos valoresde FAD y Fibra
Insoluble(FI), determinadapor el métodode Asp (Herediay col., 1992). En la fracción de
FAD no hay modificacionesaunquese detectaun aumentodecelulosa,posiblementedebido
a productosde condensacióntales como fenoles, proteínasy azúcares,originadoscomo
consecuenciadel tratamientotérmico. Hubo aumentode proteínasy pérdidade una gran
cantidadde hemicelulosasque fueron evaluadascomo la diferenciaentreFI y FAD una vez
corregidapor cenizasy proteínas.
En guisanteshay un descensoen los valores de FND, FAD, celulosay lignina (Vidal-
Valverde y Frías, 1991) duranteel cocinado a presión. El blanqueadoy el enlatadono
producenningún efecto (Nyman y col., 1987).
Reddyy Sistrunk (1980)observanen batatasque al cocinaríasen hornotradicionaly en horno
microondastienenun contenidomáselevadode sólidos totales,quepuedeserresponsablede
partede las diferenciashalladas.
Las batatascocinadasen horno tradicional tienenmayor cantidadde sustanciaspécticasque
las cocinadaspor otros métodos.
Al cocinaren horno microondasobtienen mayor cantidadde hemicelulosasy celulosa.El
hervidoy la cocción al vapor da lugar a una cantidadde celulosasuperior en el caso del
segundotratamiento.
Las batatasprocedentesde distintos cultivaresno reaccionande igual forma a los diferentes
métodosde cocinado: la pectina soluble en agua y la hemicelulosase asociarona estas
diferenciasentrecultivares.
En leaumbresVidal-Valverde y col. (1992) observanque el cocinado de las lentejas
122
previamentehumedecidasredujola cantidadde fibraalimentariadebidoa unapérdidadrástica
de hemicelulosas,aunquecelulosay ligninaaumentaron.
En lentejas,seha estudiado,apartede la variación cuantitativade la fibra alimentariaque se
produceal procesarlos alimentos, también los posibles factoresde la pared celular que
puedeninfluir en la mejor o peor cocciónde diferentestipos de lenteja(Bhatíy, 1990).
El salvadodetrigo duranteel hervidoexperimentaun descensoen la fracciónsolubleen agua
y en la fracción acídicade hemicelulosassiendoesteúltimo muy importante.Asimismo se
señalaun aumentode lignina. El horneadoproduceun aumentoen el contenidode lignina
(Andersony Clydesdale,1980b).
Hastaaquí seha habladode alimentosanalizadosindividualmente.Sin embargo,la mayor
partede los alimentosque consumimoshan sufrido un procesomucho máscomplejo, dado
que previamentese han mezcladocon otros paradar como resultado“alimentoselaborados
o platoscomplejos”.
En estesentidoexisten trabajosdedicadosal pan (Barber y col. 1984) y algunosa platos
elaboradostípicos de la cocina española(Redondoy Villanueva, 1987 ; Díez y Villanueva,
1988).
Barber y col. (1984) analizanlos cambiosproducidosen el contenidode fibra alimentaria
duranteel procesode fermentaciónen la elaboracióndel pan. Determinanfibra bruta, FAD
y FND, lignina y celulosa.
En la fermentaciónde la masabasea pH 6, el contenidode FND aumenta,apenasvaríaen
la de la masa final, y disminuye ligeramenteen la de la masa panaria, aunque esta
disminución esestadísticamenteno significativa.
El contenidode FAD se mantieneprácticamenteconstanteen todas las masasdepH inicial
6. Lo mismo sucedecon la celulosa; la lignina no cambia.
123
En la fermentacióna pH 4,6 el comportamientoes similar exceptoel de la masabasecuyo
contenidode FAD disminuyeun 10%.
En el procesodirecto, el contenidode fibra neutrodetergente(FND) aumentaun 10% en las
dos primeras horas de fermentación,despuésse mantienepracticamenteconstante. El
contenido de fibra ácida detergente(FAD), celulosa y lignina no varía durante todo el
proceso. El incrementode FND durante la primera etapa de la fermentación se debe,
probablemente,a las hemicelulosas,ya que el FAD permanececonstante; la pérdida
simultáneade otros constituyentesde la masa,talescomo CO2 y etanolno llega ajustificar
aquél.
Redondoy Villanueva (1987) aplican el método de fibra bruta y los métodosdetergentes
ácidoy neutroa seisplatosde la cocinaespañola:puréde hortalizas,paellavalenciana,pisto
manchego,judíasverdesrehogadas,revuelto de habasy coliflor al natural. Comparanlos
valoresobtenidosen el plato sin cocinary cocinado. A partir de los resultadosobtenidosse
observaque en la fibra bruta, determinadapor el método de Sharrer-Kruschner,sólo se
apreciandiferenciassignificativasentrefrescoy procesadoen las judíasverdesrehogadasy
en el revueltode habas,que setraducen,atendiendoal tanto por ciento de retención,en un
descensode 27% (R = 73%) y del 12 % (R = 88%).
En la fibra ácidodetergente(FAD) las diferenciassignificativascorresponden,ademásde a
los mismos platosque en el casoanterior con pérdidasde 19% (R = 81%) y 13% (R =
87%) respectivamente,al pisto manchegoquedesciendesu contenidoen un 15% (R 85%).
La fibra neutrodetergentesufrepérdidasestadísticamentesignificativasúnicamenteen paella
valenciana,un 19% (R = 81%) y en el pisto manchego1% (R 99%).
7.2. MODIFICACIONES CUALITATIVAS
El segundopunto a considerares la modificación estructural que experimentala fibra
alimentariaduranteel l)rocesado.
124
Estehechosevieneconstatandodesdehacetiempo(Mattheéy Appeldorf, 1978).Indicanque
las hortalizasprocesadasmuestranunamayordesintegraciónen el estómagoquelashortalizas
frescas.Wymany col. (1976)encuentranqueel salvadococinadotiene menorefectoqueel
fresco en el pesode las heces.McConell y col. (1974) observanque el cocinadono tiene
efecto en la capacidadde retenciónde agua de los vegetales,pero sí en la capacidadde
intercambiocatiónico. Hellendoorny col. (1975), utilizando un métodoenzimáticoparaJa
determinaciónde fibra, asícomo el métodode la AOAC parafibra bruta, no detectanninguna
diferenciaen el contenidode fibra de alimentosparael consumohumanodespuésde cocinar
e indica que la mejoraen la digestibilidades másde naturalezafísica que química.
El procesadopuedealterarlas propiedadesfísico-químicasde la fibra y, por tanto, también
susefectosfisiológicos. Los hallazgosen esteterrenopuedenaportarunavaliosainformación,
hoy día necesaria,paraaclararel significadodel conceptode fibra alimentariay cuálesson
los componentesque la integran.
Dentro de estecampohay relativamentepocostrabajos.Destacanlos de Pilnik y Voragen
(1984) por sus estudios de las modificacionesen las propiedadesfísicas de las sustancias
pécticas,en los queproponenla utilización de técnicasadecuadasquepermitanla evaluación
de las modificaciones sufridas por las sustanciaspécticas en el caso particular de la
elaboraciónde zumos.
Nyman (1992) estudia la influencia de diferentes procesados(congelado, blanqueado,
cocinado y enlatado)en la distribución de pesos molecularesy la viscosidad de la fibra
soluble, ademásestudia la fernientabilidady la capacidadde hinchamientode la fibra
alimentariaen guisantesy zanahorias. Observaque se produceuna despolimerizaciónde la
fibra solubleen zanahoriasy judíasverdesdespuésdel tratamientopor microondas,hervido
o enlatado.Tambiénobservancorrelaciónentreel grado de polimerizacióny la viscosidad.
Esto puedeser importantepara cl metabolismode carbohidratos,donde la viscosidadtiene
gran importancia.
Estudia¡nuestrasde zanahoriaspertenecientesa dos cosechasdiferentes.En una de ellas la
fermentabilidadse vió muy afectadapor el procesado.La fibra en productosque son
125
blanqueadosantesde la congelaciónson másresistentesa la fermentaciónque las que son
congeladascrudas o cocinadas.Estas diferenciasen la fermentabilidadse reflejan en la
capacidadde hinchamientofecal. En la otra cosechade zanahoriasy en los guisantesla
fermentabilidades similar despuésde todos los procesos.
Lintas y col. (1992)estudianlos efectosdel cocinadotradicional y del procesadoindustrial
sobrelos polisacáridosen diferenteslegumbres.La variación más importantese produceen
el almidón. El almidón resistentey las fraccioneslentamentedigestiblespredominanen las
legumbrescrudas. Despuésdel cocinado, la cantidadde almidón resistentees altamente
reduciday es digestibleun porcentajemáselevadode almidón.
Champy col. (1990) investiganla influenciadel cocidoa presiónen las propiedadesfisico-
químicas de la f’ibra de la pulpa de remolachaazucarera,en la que observanque no hay
modificación sobrelas propiedadesfisiológicasde la fibra solubley de la insoluble tras el
tratamientocon autoclave.
Muchosde los cambiosde las característicasde texturade los vegetalesse han relacionado
con cambiosen los constituyentesfibrosos. Así puesesimportanterelacionarestoscambios
de texturacon los que experimentala fibra alimentaria.Brandt y col. (1984),en un estudio
realizadocon judías, coliflor, patatas,guisantesy maíz cocidosen solucionesde diferentes
pH, observanque las hortalizasprocesadasson másfirmes a pH 4 y másblandasa pH 10.
Las hortalizasque estánmás influidas por él son las que tienen más modificacionesen los
componentesde la fibra. Asocian estehecho con los componentessolublesencontradosen
el medio de cocciónque son los que reflejan los cambiosde la textura.
En realidad el fenómeno más estudiadoes el mecanismopor el cual se modifican las
sustanciaspécticasduranteel procesode cocción.
Waldron y Selvendran(1990) realizan un estudio en el que señalanque los cambiosde
textura, anteriormentemencionados,ocurrencomo consecuenciade la extracciónde calcio
de la región de la láminamediaporagentesquelantesadecuadosej. citrato, y tambiéndebido
al procesode 3-eliminación de degradaciónde pectinas.Estos dos procesosfavorecen la
126
separaciónde las células. La degradaciónde pectinade manzanapor 8-eliminación ha sido
estudiadaduranteel calentamientoen tampón fosfato a pH 7, y estas condicionesson
semejantesa las que se dan en las hortalizasduranteel hervido.
Estosresultadosmuestranque hay unadescomposiciónde las pectinasque sepuedeproducir
duranteel hervidode las hortalizas. Parapoder predecir los efectosde la degradaciónB-
eliminativa de los polisacáridos de la fibra alimentaria se compararon los efectos
experimentadospor el material de la pared celular purificado cuandose trata con agua
caliente y con oxalatoen caliente y con ácidodiamino ciclohexanotetraacético(CDTA) a
20W.
Los resultadosmuestranque los polisacáridosliberadoscon CDTA son ricos en ácidos
urónicoscon algo de arabinosay galactosa.Porel contraríolos polisacáridosliberadostanto
poraguacalientecomo por oxalatocaliente contienencantidadesconsiderablesde galactosa.
Se comparantambién los residuosde cx-celulosaque permanecendespuésde la extracción
subsiguienteno degradativacon álcali. Mientras que la a-celulosade las paredescelulares
extraídascon CDTA es ricaen galactosa,estemonosacáridoseencuentraen pocacantidad
en la a-celulosaextraídacon oxalato. Se puedeconcluir, según estosautores(Waldron y
Selvendran,1990),quela liberaciónde galactosapor el calorsedebeaunadepolimerización,
mientrasque en condicionesno degradativaspennaneceen la fracción de a-celulosa.
Otros fenómenosque se han analizadocomo responsablesdel cambio de textura son los
cambiosen la cristalinidad de la celulosa en zanahorias.Holdsworth (1979) recogelos
estudiosrealizadosporSchrumpfy Charleysobrelas modificacionesde texturadezanahorias
cocinadasal microondas.Estosautoresindican una pérdidade pesode un 34,2% utilizando
el microondas,comparándolocon un 15,7%en el métodotradicionalde cocción.El cocinado
al microondastambiéncausaalgo de deshidratacióndel tejido, aumentandola cristalinidad
de los geles de los carbohidratosde la pared celular originándoseun aumento de la
resistencia.En batatasel cocinadoal microondasproduce una texturamás groseraque se
asociaa una unión más fuerteentrelos polisacáridosdespuésde la cocción.
127
II PARTE EXPERIMENTAL
1. DISEÑO EXPERIMENTAL
1.1. PLANTEAMIENTO
El objetivo fundamentalde estetrabajoesel conocimientode las modificacionesque puede
experimentarla fibra alimentariay los azúcaressolublesde algunashortalizasde consumo
frecuenteen Españasometidasa la acciónde un procesotérmico. Se haceespecialhincapié
en la fibra alimentariapor su interésy actualidadcientífica.
Una vezrevisadoslos conocimientosque actualmenteexistenen tornoa la fibra alimentaria
sepuedendeducirlas siguientesconsideraciones:
-No existeuniformidad de criterios en cuantoal conceptode fibra alimentariay su
determinaciónanalítica.
-Los resultadosobtenidos en alimentos sometidosa tratamientos térmicos son
diferentessegúnel método analíticoempleado.
-Entre la gran variedad de métodos existentes, los que proporcionan mayor
información sobre la composiciónmonoméricade los polímeros que constituyen la fibra
alimentariason las técnicascromatográficas.
Teniendoen cuentael estadoactualdel tema, la planificacióndel trabajo seha realizadode
la siguienteforma:
-Elección de tres hortalizasde consumofrecuenteen España:zanahoria,remolacha
y nabo.
-Puestaa puntode la metodologíaapropiadaparael análisisde fibra alimentariay de
la fracción de azúcaressolubles.
128
-Estudiode las variacionesque seproducenen la fibra alimentariay azúcaressolubles
de las muestrasseleccionadasuna vez sometidasa procesode cocción.
-Análisis estadísticode los resultadosy valoraciónde los mismos.
1.2. PREPARACIONDE LAS MUESTRAS
Se han seleccionadolas siguienteshortalizasen función de su consumofrecuentey de su
similitud botánica:
- Zanahoria:(Daucuscarota L. var. sativa)
- Remolacha:(Betavulgaris L. var. cruenta)
- Nabo: (BrassicanapusL. var. sculen¡a).
Las hortalizasobjeto de estudio se han adquirido en mercadosminoristas de Madrid en
cantidadsuficiente para llevar a cabo el esquemaexperimentaldiseñado. Una vez en el
laboratoriose elimina la piel y la partecomestiblese troceaen piezasde pesohomogéneo,
distribuyéndolasdespuésen tres grupos: 1, II y III. Cadagrupo se divide en dos partes
iguales,unade las cualessereservaen frescoy la otra, procedentedecadauno de los grupos
seprocesaen distintosmomentos.Las condicionesdeprocesadoutilizadasson: autoclavea
121W de temperaturay 1 atmósferade presióndurante15 minutos, añadiendo300 mL de
agua(Esqueman0 2). Despuésdel tratamientotérmico seseparala muestracocidadel líquido
de cocción.
Tantolas porcionessin procesar(fresco),como las procesadas,seliofilizan en un liofilizador
Terruzzi-Mevilsa mod. TP-3, con superficie de carga de 0,3 mt dotado de equipo de
registro,dispositivodetermovacioy programador.Las temperaturasalcanzadasen elproceso
de liofilización han osciladoentre-3W en la fasede congelacióny 200C en la fasede
desecación,de tal forma que las modificacionesestructuralesseanmínimas. A continuación
sehomogeneizany se conservanen frascosde vidrio herméticamentecerrados,a una
129
MUESTRA
LOTE DEHOj~~I~¡
FBI AT)()
LIIEXI’I’IRIENCIA. 1
EXPERIENCIAII
EXPERIENCIAIII
-A
N
LOTE 1
LOTE2
LOTE 3
Y ENVASADO)
( ANALISIS )
Esqueman’~ 2. Preparaciónde la muestra.
temperaturade5W y en ausenciade la luz.
Se han estudiadotres lotes diferentesde cadahortalizay, como seha indicado,cadalote se
divide en tres grupos. Los lotesseadquirieronen díasdistintosentre los mesesde abril y
junio.
2. METODOS ANALiTICOS
Las determinacionesanalíticassehan llevado a cabomediantelos métodosquefiguran en el
esqueman0 3 y que se detallana continuación.Los reactivosempleadosen cadacaso se
encuentranen el Apéndicede Reactivos.
2.1. HUMEDAD
Se evalúapor la pérdidade pesoque experimentael material liofilizado respectoal fresco.
Se determinaen partesalícuotascontenidasen vialesque seliofilizan al mismo tiempo que
el total de la muestra.
Los cálculosserealizande la siguienteforma:
loo.xHumedad(gibO g) =
P
donde:
X = diferenciade pesoentre la muestrafrescay la liofilizada.
P = pesode muestracontenidoen el vial.
131
oEnoE
2.2. FIBRA ALIMENTARIA
Entre la gran cantidadde métodosexistentespara el análisis de fibra alimentaria, en el
presentetrabajosehan seleccionadolos que se especificana continuación.
2.2.1. Métodos2ravimétricos
2.2.1.1.Métodosdetergentes
Se fundamentanen el tratamientode la muestracon solucionesdetergentesen calientepara
obtenerla fibra alimentariaexpresadacomo fibra neutro detergente(FND) y fibra ácido
detergente(FAD) (Van Soesty Wine, 1967; Van Soest, 1963b) (Esqueman0 4).
a) Método detergenteácido
Segúnlas indicacionesde Van Soest(1963b)se pesaunacantidadde muestraentre0,5 y 1 ,Og
y se lleva a un matrazde fondo redondode 500 mL de capacidady esmerilado.Se añaden
tres o cuatroperlasde vidrio, pararegularla ebullición, y 100 mL de la solucióndetergente
debromurode cetil trimetil amonio a pH 1,5. A continuaciónel matrazse llevaa una placa
calefactoray se calientaa reflujo; una vez alcanzadoel punto de ebullición se mantiene
durante1 hora. El contenidodel matraz se filtra a travésde un crisol de vidrio de placa
filtrante(n0 2), previamentecalcinadoy tarado,con ayudadevacío. El crisol lleva unacapa
de lanadevidrio parafacilitar la filtración.
El matrazse lavacon aguadestiladacaliente (90-1000C)y los líquidos de loción se filtran
por el crisol. Finalmenteel residuose lava dos vecescon acetona.El crisol junto con el
residuosedesecaen estufa(100W) durantetodala noche.Se enfríaen desecadory sepesa.
Posteriormentese calcina en horno mufla a 5000C (3 horas). Se enfría en desecadory se
pesa.De estadeterminaciónseobtieneel valor de las cenizas.
133
Cálculos:100 (X-X’)
FAD (g/100g) =
Pdonde:
X = Pesodel crisol con
= Pesodel crisol con
P = Pesode la muestra.
el residuoFAD estáconstituido,
residuodesecado.
residuoincinerado.
fundamentalmente,por celulosay lignina.
b) Método detergente neutro
El fundamentoesel mismo que en el caso anterior (Van Soesty Wine, 1967). La solución
empleadatienelauril sulfato sódicocomodetergentey el procedimientoseñalatomarun peso
demuestracomprendidoentre0,5 y 1 g, añadir100 mL de la solucióndetergente,cuyo pH
debeestarcomprendidoentre6,9 y 7,1 y manteneren ebullición regulardurante60 minutos.
Permite la determinaciónde un residuo sólido denominadofibra neutro detergente(FND)
formadopor celulosa,hemicelulosasy lignina.
2.2.1.2. Método enzirnático-gravimétrico: Método de Asp
Se fundamentaen el aislamientodel residuode fibra alimentariamedianteel tratamientode
la muestracon dos enzimas:pepsinay pancreatina.El residuo así obtenido se evalúapor
gravimetría(Asp y col., 1983).Dentrodelos métodosgravimétricos,presentala peculiaridad
de analizartanto fibra insolublecomo soluble (Esqueman ‘~ 5).
Se toman 0,4 g de muestra,seañaden20 mL de aguay se sometea la accióndel calor en
un bañode aguahirvientedurante20 minutosparaprocedera la gelatinizacióndel almidón.
A continuaciónseenfría a temperaturaambientey seajustael pH a 1,5. Se añaden15 mg
de pepsinay selleva a incubacióncon agitacióna40W durante2 horas.
134
Esqueman0 4. Métodos detergentes.
M RA
AD
OELATINIzAcIONI
INCUI3ACJON CON PEPSINA
L~ __
[NCUBACIONcONPANCREAlINA(2 h /400C)
FIL3RACJONA VACIO
FILTRADO - -jIIQULIJOS DE
¡4 Volúmcncs dc
ETANOL.
PRECIPITACION
1 ——
I4I,IRAC ION
IIQIIII)OS DE ¡AVADO 7 RI-ISIDIJO
INC INLRACION
INCINERACION
RESIDIR) - CENIZAS
7[ANALISIS DE PROTEíNAS
sÉRESIDUO- CENIZAS - PROTEINA FIBRA INSOLUBLE1
LiussIDUo~CENIZAS FIBRA SOLIJBLIj
Esqueman0 5. Método de Asp.
Transcurridoesteperíodode tiempo seajustaelpH a 6,8 y seañaden25 mg de pancreatina.
Se incubaen las mismascondicionesqueen el casoanterior y posteriormentese ajustael pH
a 4,5. Paraajustarel pH se utilizan solucionesde ácidoclorhídrico e hidróxido sódico.
Ajustadoel pH a 4,5 se filtra sobreun crisol de vidrio de placa filtrante (n0 2), previamente
incineradoy tarado,con ayudade vacío. Se obtiene así un líquido filtrado y un residuo
sólido.
Al líquido filtrado se leañadencuatrovolúmenesde etanolparaprecipitarla fracción soluble
y sedejaen reposodurante 1 hora. A continuaciónse filtra sobreotro crisol de vidrio de
placafiltrante (n0 2), previamenteincineradoy pesado,y se lavacon etanol dosvecesy con
acetona.Se lleva el crisol aestufa(100W) durantetoda la noche.El crisol con el residtío se
enfríaen desecadory sepesa.A continuaciónse incineraen muflaa 500t’C durante3 horas,
seenfríay sepesa.El residuosecoal que serestael pesode las cenizas,se correspondecon
la fibra soluble(FS), formadafundamentalmentepor sustanciaspécticas.
Cálculos:l00(X-X’)
FS (g/l00 g)=
P
donde:
pesodel crisol con residuodesecado.
pesodel crisol con residuoincinerado.
pesode la muestra.
El crisol con el residuoobtenidotras laprimera filtración se lleva a estufa(100W) durante
toda la noche. Se enfría en desecadory se pesa. A continuación se incinera en mufla
(500”C), y sevuelvea enfriar y pesar.El residuo sólido, libre de cenizasy deproteínas,se
corresponde con la fibra insoluble (FI), formada fundamentalmentepor celulosa,
hemicelulosasy lignina.
137
Cálculos:l0O(Y-Y’>
FI (g/100 g) = _________
Pdonde:
Y = Pesocrisol con residuodesecado.
Y’ = Pesocrisol con residuoincinerado.
P = Pesode muestra.
En los residuosFAD, FND y FI se lleva acabola determinaciónde las proteínasqueno son
solubilizadasy quepermanecenen los residuosdespuésdel correspondientetratamiento.En
el caso de los detergentesesta determinaciónno está indicada en el método pero se ha
realizadopara conocer,al igual que en el método enzimático, la eficacia del tratamiento
respectoa la eliminación de proteínas.La determinaciónen los residuosde fibra, asícomo
en las muestras,se realizasegúnel métodoKjeldahl (AOAC, 1990a).Seobvia la descripción
del métodoporno serobjetodeesteestudiosino meramenteun complementodelos métodos
descritosy estudiados.De la misma forma que en el casode las proteínas,en las muestras
tambiénsedeterminael contenidode cenizas(AOAC, 1990b)parapodercalcularla eficacia
de eliminación de las mismas por parte de los métodos detergentesy del enzimático-
gravimétrico. Por las razonesindicadasanteriormentese omite la descripcióndel método.
2.2.2. Métodoscronatopráficos
Los métodoscromatográficospara el análisis de fibra alimentariase fundamentanen el
análisisde los monosacáridosobtenidostras la hidrólisis de los polisacáridosquela forman.
Los monosacáridosson separados,cuantificadosy a partir de ellos se obtienenlos valores
correspondientesa los polisacáridos.El análisis implica tres etapas
- Aislamientode la fibra alimentaria.
- Hidrólisis de los polisacáridos.
- Separacióny cuantificaciónde monosacáridosutilizando el sistemacromatográfico
adecuado.
138
a) Aislamiento del residuode fibra alimentaria(Englyst y Cummings,1988)
Se introduce, en un tubo de capacidadaproximadade 60 mL, una cantidadde muestra
comprendidaentre100 y 200 mg. Se añaden2 mL de dimetilsulfóxido (DMSO), se cierra
el tubo e inmediatamentese mezclan los contenidosutilizando un agitador vibrador. Es
esencialquetoda la muestrasehumedezcay que el material no se adhieraa las paredesdel
tubo. Seagitaduranteun periododecincominutos.Se colocanlos tubosen un recipientecon
aguahirviente situadosobreun agitadormagnéticodurante 1 hora.
A continuaciónsesacanlos tubos uno a uno, se abrene inmediatamenteseadicionan8 mL
de tampónacetatoajustadoa50W. Seponen los tubosen un bañode aguaa 42<’C durante
dos o tres minutos.Se añaden0,5 mL de soluciónde a-amilasay 0,1 mL de la soluciónde
pululanasay semezclanen un agitador.Se incubadurante16 horascon agitación.
Se sacanlos tubos del baño y seañaden40 mL de etanol absoluto. Se mezclanbien y se
dejandurante1 hora a temperaturaambiente.A continuaciónse centrifugana 3500 r.p.m.
durante10 minutos.
Se elimina el sobrenadantecon una pipeta utilizando vacio y se lava el precipitadode la
siguiente manera: se añademetanol al 85%, se agita para formar una suspensióncon el
residuo,se centrifugay seelimina el sobrenadantelíquido igual queantes. Se ¡ayauna vez
con acetonay se elimina el sobrenadante.
En un baño de agua a 60-65”C el residuo se calienta mientras se agita en un agitador
magnéticoy se aplica una ligera corriente de aire. Este pasoconcluye una vez que está
totalmenteseco(Esqueman0 6).
b) Hidrólisis de los polisacáridosqueconstituyenel residuode fibra alimentaria.
Estafasede la hidrólisis serealiza mediantela acción de ácidosfuertes.En la bibliografía
sedescribendiferentesposibilidades(Sloneker,1971; Selvendrany col, 1979a;Barton y col.,
1982; Reistad, 1983; Peterseny col., 1984; Faulks y Timms, 1985; Englysty Cuínmings,
139
MUESTRALIOFILIZADA
(100-200mg)
— — u
c
CALENTAR(1 h/ 1000C)
.7 __
INCUBAR( IGh/420C)
‘x-AMILASAy PULULANASA
ph = 5,2 )
ETANOl. 96’
ESTABILIZAR
CIiNIRIEU(IAJZlO mm /3500 rpm.
Vs-
CENTRIFUGAR10 mm /3500rpm.
(Y-
j LAVAR CON1 ETANOL 85%
2 veces)
DESECAREJ. RESIDUO(Agitación¡60” C
¡DM50(2n1)
LAVAR CONACETONA
N
,1
Esqueman0 6. Determinación de fibra alimentaria por HPLC. Aislamiento del residuo.
1988; Grabany col., 1988; Marlett y Navis, 1988;Siddiqui, 1989),si bien sepuedenreducir
en dosgrandesbloques:
- Hidrólisis con ácidosulfúrico.
- Hidrólisis con ácidotrifluoroacético.
b.1) Hidrólisis con ácidosulfúrico (Englyst y Cummings,1988)
El tratamientocon esteagentehidrolítico serealizaen dos etapas:
- hidrólisis primaria con ácidoconcentrado,
- hidrólisis secundariacon ácidodiluido.
Se añaden0,3 mL de H2504 12 M al residuode fibra alimentariaaisladoanteriormente.Se
calientaa40W durante2 horascon agitación.Seañaden8,4 mL de aguaparaobtenerH2504
0,4138 M y semantienedurante3 horasa 100W en un bañode aguahirvientemientrasse
agita.
Durantela hidrólisis primaria seforman ésteressulfato con la celulosa,especialmenteen
y se rompen los puentesde hidrógenoentre las mierofibrillas. El paso de la hidrólisis
secundariarompelos ésteresforínadosen la hidrólisis primaria y regenerael monosacárido
libre. El resto de los polisacáridosseven afectadosde igual forína por la acción del ácido
concentrado.
Despuésseenfríaa temperaturaambiente.El hidrolizadosepuedeconservardurante24 horas
a 50C (Esqueman0 7a).
b.2) Hidrólisis con ácido trifluoroacético(Barton y col., 1982)
El residuode fibra alimentariase poneen un tubo de ensayoy se añaden20 mL de ácido
trifluoroacético (ATF). Se calienta durante 1 hora en un bloque calefactor a 121’-’C.
Finalizadoel calentamientose dejaenfriar el tubo a temperaturaambientey seprocedea la
evaporaciónhastasequedaden un rotavapor.
141
RESIDUODEFH3R~j~¿jM~
a) Condicionesde hidrólisis con H2S04.
RESIDUODEF113RA ALIMENTARIA
-- 1.1 —
— TRATAMIENTO CONNII1 h/121”C
EVAPORARA SEQtJEDAD
lA VAR RESIDIJOCONAGIlA
Y POSTERIOREVAPORACION(3 vcccs)
b) Condiciones de hidrólisis con ATF.
I-Ill)ROLISIS PRIMARIA14280412 M, 2 fi /400 C
(Agitación)
HIDROLISIS SECUNDARIA112S040,4138M, 3 fil 100
0C(Agitación)
Esqueman0 7. Determinación de fibra alimentaria por HPLC. Hidrólisis del residuo.
A continuaciónse añaden150 mL de aguay seevaporaa sequedadde nuevo. Este lavado
serepitedosvecesmásparaasegurarunacompletaeliminaciónde ATF. El concentradofinal
seredisuelvecon 5 mL de agua(Esqueman0 7b).
cl Preparación del hidrolizado para el análisis cromatográfico
Se utilizan diferentes tipos de sistemascromatográficos, fundamentalmente:
-CromatografíaLíquida de Alta Eficacia (HPLC) que, como ya se ha indicado, es
utilizada en escasonúmerode trabajos.
-Cromatografíade Gases(GLC), ampliamentedifundida.
c.l) CromatografíaLíquidade Alta Eficacia (HPLC~
c. 1.1) Hidrolizadocon ácidosulfúrico
Antes de realizarel análisis cromatográficoes precisoneutralizarel hidrolizado (apartado
b.l.). Paraello existendiversosprocedimientosdescritosen la bibliografía: neutralización
con hidróxidobárico(Síavin y Marlett, 1983),con carbonatobárico(Neilsony Marlett, 1983)
y utilización de la resmade intercambioiónico BioRad AG 4-X4 (Garleb y col., 1989).
Todos ellos han sido estudiadoscomo sepodrácoínprobaren el apartado titulado “Estudio
de los métodosde análisis” que figura másadelante.
En el caso del tratamientocon Ba(OH)2, se añadeBa(OH)2 2 M hastaque el pH alcanceun
valor de 3,5 aproximádamentey, a continuación,seañadeBa(OH)20,25 M hastaqueel pH
quedecomprendidoentre6 y 7. Se dejaestabilizardurante 1 hora y al cabodeestetiempo
sevuelvea medir el pH, reajustándoloen casode que seanecesario.
Cuandoseutiliza BaCO3,seañaden11 g de dichoproductoa 10 mL delhidrolizado. Semide
el pH, secompruebaque estácomprendidoentre6 y 7, y sedejaestabilizar.
En amboscasos,Ba(OH)2o BaCO3 se formaun precipitadode BaSO4. Se centrifugaa 3500
143
r.p.m. durante10 minutos y seextraeel sobrenadante.Se lava e] precipitado,habiéndose
comprobadoen esteestudioque se necesitan3 lavadoscon 25 mL de aguaparalograr unos
porcentajesde recuperaciónóptimos(Gráfico n01).
Semezclanlos sobrenadantesobtenidosdespuésde las diferentescentrifugacionesy sefiltran
por filtro de 0,45 ~¿ de tamaño de poro y 47 mm de diámetro (HAWPO47000), y a
continuaciónsepasapor la resmade intercambioiónico parala eliminaciónde ionesbario.
Seutiliza la resmaAG 50W-X8(BioRad142-1451)deunacapacidadtotal de 5,1 meq/gseco.
Se ha comprobadoen estetrabajoquees necesariolavar la resmatres vecespara lograr una
recuperaciónóptimade los monosacáridos.
El líquido eluido de la columnade resmaseconcentraen un rotavaporhastasequedad,se
redisuelveen 5 mL de agua,se pasapor filtro de 0,45 ji de tamañode poro y 47 mm de
diámetro(HAWPO47000),y a continuaciónsepasapor un cartuchoSep-PackPlus C18 de
Millipore WatersAssociates.Sedepositaen un vial y seinyectaen el cromatógrafo(Esquema
n0 8).
Por su comodidady rapidezseoptópor el métododeneutralizaciónqueimplica la utilización
de la resmade intercambioaniónicoAG 4-X4 (BioRad 140-4341),de unacapacidadtotal de
2,8 meq/g seco. Paraello se empleauna columnapreparadacon 5,7 g de la mencionada
resma. Se pasan 5 mL del hidrolizado y se lava dicha columna tres veces con agua
desionizada,comprobándoseque así se obtienela máximarecuperación(Gráfico n<’ 2). Se
tomaunapartealícuota,sefiltra por filtro de 0,45 ji de tamañode poro y 47 mm de diámetro
(HAWPO47000Millipore, S.A.). A continuaciónsepasapor un cartuchoSep-packC¡g, se
depositaen un vial y, se inyectaen el equipo cromatográfico(Esqueman0 9).
144
Gráfico n<’ 1. Eficacia de los lavados del precipitado de sulfato de bario.
-ooo,aoo’nl
-~ ¿59 ca
SS’ -~..g ~#
ocao6
a-oo‘oo,o-onl
Ñ60
6 6SSS’ N g~SS’ ‘5’
‘la
Gráfico u’> II. Eficacia de los lavados de la resiíia AG4-X4 (BioRad).
;«IUJOTA DEL I-IIDI&iZADi~3
NEUTRALIZAR CON Ba(Ofl), o CON BaCO3
__________A---_______DEJARESTABILIZAR
CENTRIFUGAR(3500 rpm/lO mio.)
~~~1 -
LAVARRESIDUO— (3
FILTRAR Y PASARFILTRADO PORRESINAI)E INTERCAMBIO IONICO flioRad AG 50 W-XS
_____- (3vcccs)
L__
CONCENtRARA SEQUEDAD
EN R(YFAVAI’OR
—--~~-- _____~~j.7+ ___
REI)ISOLVER CON 5 mL 1)15 AGUA I)ESIONIYADA
___ 1 __ __
FILTRAR PORFILTRO MILLEN 0,45 pm
— FILTRAR POR CARItJCII() SEP-PACKC,
ANALIZAR PORIIPLC
Esqueman0 8. Determinación de fibra alimentaria por HPLC: a) Neutralización y
purificación del hidrolizado.
HIDROI IZADO(SmI)
PASAR PORRESINA I)E INTERCAMBIO IONICO(l3ioRad,A04-X4)
r_______________________________________LAVAR RESINA CON AGUA DESIONIZADA
3 veces)
_________________________________________ Y_______________CONCENTRAR A SI£QUEDAI)
EN ROJAVAPOR
y ---—
RJLDI5OLVER CONAOl/A 1)ESIONIZADA
FILTRAR PORF[I]IRO MILLEX 0,45 ~tm
FííiíRAR PORCARTUCHO SEP-PACK
ANALIZAR PORIIPLCY
Esqueman0 9. Determinación de fibra alimentaria por HPLC: b) Neutralización y
purificación del hidrolizado.
Las condicionescromatográficasson:
-Columna:Aminex HPX-87P,300 x 7,8 mm (BioRad).
-Precolumna:125-029(BioRad).
-Bomba: Mod. 6000 A (Waters).
-Detector: ERC-7522(Erina). Sensibilidad4x.
-Integrador: DataModule Mod. 701 (Waters).
-Termostato:HaakeMod. D8 (Haake).
-Baño de agua: Mod. WH9 (Haake).
-Fasemóvil: aguadesionizadaa 850C.
-Flujo: 0,5 mL/mm.
Cálculos:
El integradorutilizado mide áreasque transformaen concentracionesaplicandoun factorde
respuestacalculadodurantela calibracióndel integrador.
C. Factorde dilución . 100Monosacárido(g/ 100 g) —___________________________
P
C = concentraciónexpresadaen gramos
P = pesode muestra
y1. V3
Factorde dilución = ____________
V2 .V4
= volumen total de hidrolizado(mL)
= volumende hidrolizadotomadopara hacerel análisis (mL)
= volumen final del hidrolizadoanalizado(jil)
= volumende inyección (jil)
c.1.2.)Hidrolizadocon ácidotrifluoroacético(Barton y col., 1982)
El hidrolizado(apartadob.2) unavezpreparado,se pasaporcartuchoSep-PackC1~, sefiltra
por filtro Millex y se inyectaen el cromatógrafo.
148
Las condicionescromatográficasson:
- Columna: Polygosil 60-5NH2.
- Bomba: Mod. 6000 A (Waters).
- Detector: Milton Roy RefractomonitorIV
- Integrador: Mod. CRiA (Beckman).
- Fasemóvil: acetonitrilo: agua75/25.
- Flujo 0,9 mL/mm.
Cálculos:Hs . C . 100
Monosacárido(gibO g) = _________________
Hp.P
donde:
- Hs: altura del pico de azúcaren la muestraproblema.
- C : concentración de azúcar en la solución patrón.
- P : pesode la muestraexpresadoen g.
- Hp: altura del pico del patrón interno.
c.2.) Cromato2rafíade Gases(GLC) (Método de Englysty Cummings, 1988)
Se toman 3 mL del hidrolizadoobtenidocon ácidosulfúrico (apartadob. 1) y seañaden0,5
mL de solución de mio-inositol utilizado coíno patrón interno, que contienenla cantidad
adecuadadel mismo,y acontinuación0,6 mL de hidróxido amónico 12 M. Se mezclany se
compruebasi la solución esalcalina.
Seguidamenteseañaden0,4 mL de una solución3 M de hidróxido amónicoquecontenga50
mg/mL deborohidrurosódico y aproximádamente5 ji1 de octan-2-ol como surfactante.Se
mezclay sedejaen reposodurante1 hora a 40”C.
Al cabode estetiempo se añaden0,3 mL de ácidoacéticoglacial y se mezcla. Se toman
0,5mLde la soluciónacidificada,seañaden0,5 mL de l-ínetilimidazol y 5 mL deanhídrido
149
acético.Se mezclany se dejaestabilizar 10 minutos.
A continuaciónseañaden0,6mL de etanoly sedejaestabilizardurante5 minutos.Seañaden
5 mL de agua, semezclay sevuelvea dejaren reposo5 minutos.
Se ponenlos tubos en un bañode aguafría y seañaden5 mL dehidróxido potásico7,5 M.
Al cabode unosminutos seadicionan5 mL másdel mismo hidróxido.
Se añaden0,5 mL de acetatode etilo, se tapan los tubos y se mezcla su contenidopor
inversión. Se deja hastaque la separaciónen dos fasesseacoínpleta.La partesuperior se
transfierea un vial parasu almacenamientoa 5W. Estepasose repitedosveceshabiéndose
comprobadoque asíse lograpracticamenteel 100% de recuperación(Croínatograman” 1).
Se inyectaen el cromatógrafode gases.Las condicionescromatográficasutilizadasson:
- Columna: 30 mm x 0,32 ínm de sílice fundida cubiertacon Durabond.
- Temperaturadel inyector: 250<~C.
- Temperaturade la columna: 150W (5) 40/min -> 250W (5).
- Temperaturadel detector:275W.
- Gasportador:Helio 85 Kpa.
Cálculos:
HT. WI. 100. FR. 8Monosacárido(g/l00 g)
HI.WT
donde:
HTyHI =
WTyWI
FR=
alturas de los picos de
respectivamente.
pesode muestraproblemay del patrón internorespectivamente.
factor de respuestaparacadauno de los azúcares,obtenidoa patir de
la calibracióncon unamuestrapatrónde azúcaresanalizadaen paralelo
con la muestra.Se calculade la siguienteforma:
la muestraproblema y del patrón interno
150
Hp. PaFR=
Ha. Pp
donde:
Mp y Ha = altura del pico del patróninterno y del azúcarcorrespondienteen
o
la soluciónpatrón.
Pa y Pp = pesodel azúcarcorrespondientey del patróninternoen la solución
patron.
oootCo
o
o
1
23
4__ A-
fi- L..........— — —
Cromatograman01. Eficacia de las extraccionescon acetato de etilo. Cromatogramaobtenido paralos monosacáridosdespuésde:1. Primeraextracción.2. Segundaextracción.3. Terceraextracción.4. Cuartaextracción.
151
2.2.3. Método esuectrofotométrico:determinaciónde sustanciasnécticas
.
Se ha seguidoel método de Scott (Scott, 1979), adaptadoen este trabajo. El método se
fundamentaen la formaciónde un complejocoloreado al reaccionarel 3,5-dimetilfenolcon
los ácidosurónicosque forman partede la estructurafundamentalde las sustanciaspécticas.
El color desarrolladose mide espectrofotométricamente,a una longitud de ondade 450 nm
cuantificandolos ácidosurónicos y a partir de ellos, las sustanciaspécticas.
Estemétodoconstade dospartesque figuran en los esquemas10 y 11:
-Solubilizacióny extracciónde las sustanciaspécticas.
-Análisis cuantitativoporespectrofotometría.
En el capítulo correspondienteal estudio de los métodos se detallará el estudio de la
especificidaddel reactivodel 3,5-dimetilfenol frentea otro fenol ampliamenteutilizado,
m-fenilfenol.
Sepesan0,100g de muestraque seintroducenen un tubo de centrífugay seañaden40 mL
de metanolal 85%. A continuaciónselleva a un agitadormagnéticocon aplicaciónde calor
(100W), durante20 minutos.Transcurridoestetiempo se centrifugaa 3500 r.p.m. durante
10 minutos. El procesode extracciónserepitedos veces.A partir deesteextractoes donde
se realizaposteriormenteel análisisde azúcaressolubles(DeVries y col., 1979; Wilson y
col., 1981; Salvo y col., 1984) (apartado2.3 de la ParteExperimental).
Al residuo,exentode azúcaressolubles,se le añaden30 mL de unasolucióncalientedeácido
oxálico/oxalatoamónico0,125% (pH=4,0). Se agita en caliente durante 10 minutos y
despuésse centrifugaa 3500 r.p.m. 10 minutos. Se extrae el sobrenadante.Se repite la
operacióntres vecesy se enrasaa 100 mL con la solución extractiva.
El métodocolorimétricoutilizado, como ya seha indicado,esuna modificacióndel descrito
porScott en 1979. Se toman 0,5 mL del extractode sustanciaspécticasde la muestraen un
152
ANAIISIS DE SUSTANCIAS PECTICAS
SCI3RENADANTE ( L)
EVAPORAR EN ROlAVAPOR
ffl__REDISOIVERRESII)UO
ENAOl/A DESTILADA
ANALISIS DE AZUCARES SOLUBLES
( METODO DE FERRICIANIJROMItIOIX) IIPLC Y. POTASICO ¡
Esqueman0 10. Extracción de azúcaressolublesy aislamiento de sustanciaspécticas.
CENTRIFUGAR20 miii. /3500 rpm.
—---
REPEILR ~-. —
(2veces) —
RESIDUO( R)
EXIRACCJONEN CALIENTE CONACIDO OXALICO! OXALATO AMONICO 0,125%
CENTRIFUGACION(ID n,in. /3500 rpm)
EXTRACCION DEI SOBRENADANTE
EREPIPIIR2veces)
•1
45 mlii- en baño dc agua hirvienlc
.-
r50 pL reactivo m-feniífenoí
4MEIO[)C m-FENII,FENOI
0,5 mL solución anterior
23 ~l. 112504 Cl-
14~~.
¡Ominen oscuridad
iiiEspectrofotómetro
(. (X 520nm)
1 METODO 1t5-DIMETILFENOI.
L - 0,5 mL solución anterior
8 mL 1~5O4 e. jII
(
40 miii- en baño de agua a 700 C
147 iii —l0,5 mL reactivo 3,5-dimctilleiioí
J
40 miii- ci, oscuridad
Espectnnfntómetro( k - 450 nm ) ,1
Esqueman0 Li. Extracción y cuantificación de sustanciaspécticas.
tubo de ensayoque se lleva a un baño de hielo y se añaden8 mL de ácido sulfúrico
concentrado,para hidrolizar el polisacárido.Se agita el contenidodel tubo y se lleva a un
bañoa700Cdurante40 minutos.Sesacadel baño,seenfríarápidamentey seañaden0,5 mL
de soluciónde 3,5-dimetilfenol (0,1% en acéticoglacial). Se mantienedurante40 minutos
en oscuridady se lee el color desarrolladoa450 nm en un espectrofotómetromarcaPerkin-
Elmer, mod. Coleman55.
Cálculos:
Se utiliza la siguiente fórmula correspondientea la ecuación deducidade la recta de
calibración:
Y = 0,0139779X - 0,002178
donde:
X = concentraciónexpresadaen ¡ig/ 0,5 mL.
Y = valor de absorbanciaobtenidoen el espectrofotómetro.
C . Factorde dilución . 100ácido galacturónico(g/l0O g) = _____________________________
P
donde:
C = concentraciónexpresadaen g.
looFactorde dilución = ______
0,5
P = pesode la muestra.
155
2.3. AZUCARES SOLUBLES
2.3.1. Cromato2raf’fa Líquida de Alta Eficacia (HPLC)
.
Paraestadeterminaciónanalíticase siguen las indicacionesde Wilson y col. (1981). Los
azúcaressolublesseextraende la muestracon metanolal 85% a unatemperaturade 1000C
y agitandodurante20 minutos. A continuaciónse centrifuga(3500r.p.m./10minutos)y se
separael sobrenadantedel residuo.El residuose empleapara ladeterminaciónde sustancias
pécticas,comose ha indicadoanteriormente(apartado 2.2.3. de la ParteExperimental),y
el sobrenadantequecontienelos azúcaressolubles,seconcentraen rotavapory se redisuelve
con aguadestilada(solución5) (Esqueman010).
Se toma una partealícuotade la solución5 y sefiltra a travésde un cartuchoSep-PackC18.
Se toman 2,5 mL del filtrado anterior y se llevan a 10 mL con acetonitrilo. Se desgasifica
utilizando un sistemade ultrasonidos,se f¡ltra una partealícuotapor filtro de 0,45 y de
tamañodeporoy 47 mm dediámetro(HAWPO4700OMillipore, S.A.) y acontinuaciónse
pasapor un cartuchoSep-packC18 y se cuantifica medianteHPLC (Esqueman0 12).
Las condicionescromatográficasseleccionadasson:
- Columna: ¡iBondapackCarbohydrateAnalysis 300 x 3,9 mm (Waters).
- Bomba: Mod. 6000 A (Waters).
- Detector: RefractiveíndexMod. 401 (Waters). Sensibilidad(4x).
- Integrador:DataModule Mod. 701 (Waters).
- Fasemóvil: acetonitrilo agua75/25.
- Flujo: 0,9 mL/mm.
Cálculos:
C . Factorde dilución . 100
Monosacárido(g/100 g ) =_____________________________
P
156
donde:
C = concentraciónexpresadaen g
P = pesode muestra
v1.v3Factorde dilución =
v2.v4
= volumendeextractototal (mL)
= volumende extractotomado parael análisis (mL)
= volumende mezclatomadoparael análisis(¡il)
= volumende inyección (¡il)
2.3.2. Esuectrofotometríavisible
Estemétodo(Gaines,1973)esunacolorimetríabasadaen la reacciónde oxidación-reducción
entreel ferricianuropotásicoy los azúcaresreductores.La determinaciónde azúcarestotales
sebasaen la hidrólisis de azúcaresno reductoresa azúcaresreductores,mediantehidrólisis
cuantitativa,utilizando ácidoclorhídrico 1 N. Deestaforma el contenidode azúcarestotales
puedeser determinadoporanálisisde azúcaresreductoresdespuésde la hidrólisis.
La extracciónde los azúcaressehacecon metanol.Se trata del primerpasodescritopara la
extracciónde sustanciaspécticas(Esqueman” 10). y dichoextractoesutilizado tambiénpara
el análisis deazúcaressolublespor HPLC.
Parael análisis de azúcarestotales, se toman 10 mL de la solución acuosa(5) (apartado
2.3.1. de la Parte Experimental) preparadaanteriormente, se añaden 15 mL de ácido
clorhídrico iN y 10 mL deaguadestilada.Se hierve la solución durante2 minutos.
Despuésdeenfriar seneutraliza, medianteadición de una soluciónde hidróxido sódico 10%
utilizandocomo indicadorfenolftaleína.La soluciónneutralizadasediluye convenientemente
con aguay seutiliza parael análisisde azúcarestotales.
157
SOLUCION ( 5)
FILTRAR PORFILTRO MILLIPORE 0,45¡un
__ --u -
DILUIR EN ACETONITRILO AGUA ( 75 25
I)ESCJASIFICARPORtJIJIRASONIJ.X)S
L. _________________
I-111RARPORCARJUCII() 51W—PACK C1>
ANALIZAR PORI-IPIC
Esqueman0 12. Determinación de azúcaressolublespor HPLC
Se toman 2 mL de dicha solución diluida, se añaden8 mL del reactivo de ferricianuro
potásicoreciénpreparadoy se lleva a 10 mL con aguadestilada.Se mezclabien la solución
y se hierveen un bañode aguadurante15 minutos exactamente.Seenfríanlos tubos en un
bañode hielo y se mezclade nuevo. Semide inmediatamentela absorbanciade las muestras
a 380 nm (Esqueman0 13) utilizando un blancode agua.
En el momentode analizarla muestraha de realizarseuna rectade calibración con glucosa
patrón. Los valoresde absorbanciaobtenidosparala muestrasegúnla rectarealizadadarán
un valor de concentracióncorrespondientea azúcarestotales (% de glucosa)en la muestra
original. Se utiliza la recta obtenida en cada caso que proporcionala concentraciónde
azúcaresexpresadaen jiglmL.
Cálculos:
Y = -0,00207X + 1,483505
Y = absorbanciaobtenidaexperimentalmente.
X = concentraciónde azúcaressolublesexpresadaen yg/mL.
C . Factorde dilución . 100Azúcares (g/100 g) =_____________________________
expresadosen glucosa P
donde:
C = concentraciónexpresadaen g.
P = pesode la muestra.
vI.v3
Factorde diltíción = ________
y2
= volumen total de extracto(mL).
= volumende extractotomadopara hacerel análisis(mL).
= volumende dilución del extracto(mL).
159
SOLUCION(5) J(10 ml)
15 ml. CIH 1 N+
lO mL AGUA DESFILADA
_____________________ 1 ______________________
NEUTRALIZAR CON NaOlI 10%
DILUIR CONVENIENTEMENTE~
A ADIR
L; TOMAR DISOIUCION
<27
8 mL REACTIVOFERRICIANUROPOIASIC()
1CALENTAR (15 mini 1000C)
Y ENFRIAR
1~
/ESPECTROFOTOMETRO
(X=3SOmn)
Esquema n0 13. Determinación de azúcares solubles por el método del ferricianuro
potásico.
CALENTAR ( 20 mm /1000C)Y ENI-RIAR
2.4. ESTUDIO HISTOLOGICO Y CITOLOGICO POR MICROSCOPIA
Se pretendecon ello comprobarla presenciade los componentescuantificadosy observar
las posiblesdiferencias,desde el punto de vista anatómico,que existenentreel material
frescoy el procesado.
Se procedeal estudio de las muestrasfrescasy procesadassin fijar, tras el tratamiento
correspondiente,paraservistas al microscopioy tambiénserealizael análisismicroscópico
de las muestrasfrescasy procesadasincluidasen parafina.
2.4.1. Preparación de las muestras para su observación directa al microscopio
Se realizan cortesde diferenteszonasde cadauna de las raícesen material fresco y en el
materialprocesadoutilizando un microtomode mesa.
La observaciónmicroscópicase realizaa 100 y 400 aumentosmedianteun microscopio
Reichet-YungMicrostar 110 AmericanOptical con cámarafotográficaincorporada.Se utiliza
el material en fresco tras tratamientocon hipoclorito sódico al 50%, o bien despuésde
realizaralgunatinción específicade las que se detallanen el correspondienteapartado.
2.4.2. Preparaciónde lasmuestrasnarainclusión en parafina
a) Fijación de la muestra.
En esteprocesosetrata de producir la muertede las células sin alterarsus estructuras.El
fijador elegido ha sido la mezclaformol-ácido acético-alcohol(FAA), uno de los fijadores
más utilizadosen microscopiaóptica (Johansen,1940).
Se corta la muestraen trozosde varios milímetros de diámetroo de espesory secolocaen
frascosdecristal quepermitanun cerradohermético,añadiendounacantidadde reactivode
161
fijación que permitacubrir con holguradichamuestra.
Se mantienecomo mínimo durante24 horas. La muestrapuedepermanecerasí duranteun
períodode tiempo indefinido, cerrandoherméticamentelos recipientesy manteniéndolosen
nevera.
b) Deshidratación
Estafaseesnecesariaporquelaparafina,queesel mediode inclusión elegido,no esmiscible
con el agua,y, por tanto, hay que reemplazarel aguapresenteen el material por solventes
orgánicos.
Serealizautilizandodiferentesmezclasdeagua:etanol:alcoholterbutílico(ATB) dediferentes
concentraciones.Las proporciones de cada componentede la mezcla van variando
enriqueciéndosepaulatinamentela proporciónde alcohol terbutílico y disminuyendolas de
aguay etanol (Jensen,1962).
La muestraque habíasido previamentefijada, en frascosde cierre herínético,sesometea
tratamientocon cadaunade las solucionesde agua:etanol:ATB.Cadauna deestassoluciones
sedenomínacon el nombrede “serie del alcohol terbutílico” acompañadade un númeroque
indica la proporcióntotal de alcohol de la solución. Dichasseriesson las siguientes:
Serie
50
70
85
95
100
ATE
H.,O (mU
50
30
15
Etanol 95% (mU
40
50
50
45
25
ATR (mU
lo
20
35
55
75
loo
162
El tejido hade permaneceren cadaunade estassolucionesun mínimo de 2-4 horas,siendo
8 horas aproximádamenteel tiempo más frecuentementeutilizado, exceptoen la serie de
100% de ATB que ha depermanacerdurante24 horas,renovándoseel ATB cada8 horas.
c) Inclusión de la muestra en parafina
El material deshidratadoseinfiltra en parafinafundida, que luego sedeja solidificar y se
utiliza pararealizarcortescon microtomorotatorio tipo Minot.
Se utilizan diferentesmezclasde toluol-parafina.Se empleatoluol porque el ATB no es
misciblecon la parafina,y el toluol esmisciblecon el ATB y con la parafina.Jensen(1962),
no utiliza toluol sino que pasadirectamentedel ATB a la parafina.
Pararealizarla infiltración sepuedeutilizar parafinalíquida o parafinasólida(pf= 50-55’>C).
En caso de utilizar parafina sólida es convenientetrabajar en una cápsulade porcelana
añadiendola mezclacorrespondientedetoluol-parafinaen cantidadsuficienteparaquecubra
la muestra.La cápsulacon el material se lleva a unaestufacuyatemperaturaexcedaen 5”C
de la temperaturade fusión de la parafina utilizada. Para realizar las mezclasde toluol-
parafina, convieneguardarla parafina en estufa a 60’~C aproximádamentepara que esté
líquida.
En estecaso se ha utilizado parafinalíquida. En un frasco de vidrio, o en una cápsulade
porcelana,se pone la solución de toluol:parafina,a continuaciónel material, y suficiente
cantidadde alcohol terbutflico para que lo cubra. Se deja un tiempo entre6 y 24 horas.
Posteriormentese va pasandoel material a las sucesivassolucionesde toluol:parafina,
dejándoloen cadauna un tiempo similar, siemprecomprendidoentre6 y 24 horas.
163
Las mezclasde toluol: parafinason las siguientes:
Mecía
-
Toluol (mU
75
Parafina (mU
25
2 50 50
3 25 75
4 -- loo
A continuaciónseprocedea realizarla verdaderainclusión en parafina, utilizando parafina
sólida licuada.Puederealizarsedirectamenteen las cápsulasanteriores,o bien en moldesde
papelde aluminio previamenteparafinados.En el fondo de la cápsulao molde se poneuna
fina capade vaselinao glicerinaque facilita el posteriordesprendimientode la parafina.
En cadamolde seponen4 ó 5 trozosde cadaunade las muestrasy a continuaciónseañadirá
la cantidadsuficientedeparafinaen estadoliquido. Semantieneen estufaa 60W durante24
horas,despuéssesacade la misma y serepiteel procesocon parafinanueva(Jensen,1962;
Gahan,1984).
El enfriamientode la parafinaha de ser lento paraque no se resquebrajey puedasolidificar
en un bloque.Una vezalcanzadala temperaturaambientese introduceen un bañode hielo.
En éste,la parafinasecontraey sedesprendedel recipiente.
El bloqueobtenidosepuedeguardarduranteaños.Seenvuelveen papelde aluminioy varios
bloquesse puedenguardarjuntos en una bolsade plásticoen la nevera.
2.4.3. Microtomía: realización y reco2ida de los cortes
Se utiliza un microtomorotatorio tipo Minot 1212 Leitz. El bloquede parafinasolidificado
que contieneel material, se divide en tantos trozos como fragmentosde muestraincluye.
164
Cadauno de estosnuevosbloquessepegacon ayudade una pequeñacantidadde parafina,
a unapiezade maderaqueactuaráde soporteen el microtomo.El bloquedeparafinase talla
de maneraque las carasde parafinaseanparalelasa las carasde la muestra.La pieza así
montadasecolocaen el microtomo; el filo de la cuchilla del mismo debeser paraleloa la
superficiedel corte. Los cortessehacende un espesorentre16-20 ji. Paraobtener buenos
corteses necesarioque tanto la cuchilla del microtomocomo el bloque esténlo más fríos
posible.
Una vez realizadoslos cortes se recogen en un portaobjetospreviamentedesengrasado
(mezcla toluol-éter) preparadocon una fina capa de adhesivo de Haupt’s y agua. Los
portaobjetoscon los cortesbien estiradosse dejan48 horasen la estufa a 40~>C y se pueden
guardarde forma indefinida (Jensen,1962; Gahan,1984).
2.4.4. Desnarafinado.hidratacióny montaiede las DreIjaraciones
El procesosiguientea la recogidade los corteses el desparafinadoe hidrataciónde las
muestras.Paraello los portaobjetoscon las muestrassevan introduciendo,de formasucesiva,
en recipientescon las siguientessolucionesy tiempos:
Solución Tiempo (mm.)
Xilol 10
Xilol: etanol 5
Alcohol 95% 5-10
Alcohol 70% 5-10
Alcohol 50% 5-10
Alcohol 30% 5-10
A continuaciónse añadeaguay por último, el reactivo de tinción. Si este último es una
soluciónalcohólica,se puedeponeren contactocon la muestradespuésdel alcohol de50%.
165
2.4.5. Tincionesutilizadas
En el estudiode la paredcelular sehan utilizado los siguientesreactivosde tinción:
-Rojo de rutenioparaidentificar las sustanciaspécticas.
-Cloruro de zinc yodadoen el reconocimientodehemicelulosasy celulosa.
-Floroglucinaclorhídricay Verdeyodo como reactivosespecíficosde la lignina.
166
3. ESTUDIO DE LOS METODOS DE ANÁLISIS
Paraestudiarlos métodosde análisiselegidossehan realizadolos siguientesensayos.
3.1. ESTUDIO DE LOS METODOS DE ANALISIS DE FIBRA ALIMENTARIA
3.1.1. Ensayos de los métodos2ravimétricos
Paralos métodosdetergentessellevan acaboensayosdeprecisiónutilizando salvadoporser
un material formado básicamentepor fibra insolubleque sepuedeutilizar comoreferencia
paraotrostipos de materiales.En el casodel métodoenzimático-gravimétrico,seempleauna
mezclade salvadoy de pectina, el primero como representantede la fibra insoluble y la
segundade la soluble.Los ensayosde exactitudno sepuedenrealizarporno existir un patrón
de fibra alimentaria.
3.1.1.1.Ensayo de precisión
Paraestudiarla precisiónde estosmétodosseprocedea realizarel análisis en igualdadde
condicionesa lo largo dediferentesdías.
a) Métodos detergentes
Se han realizadoensayosde precisióntanto parael métododetergenteneutrocomoparael
detergenteácido.
Se ha utilizado como muestra de referenciasalvado, aplicandoel tratamiento con los
respectivosdetergentesa diez fracciones distintas del mismo material (lg) y en días
diferentes.Los resultadosobtenidosse recogenen la siguientetabla:
167
Tabla 1. Ensayo de precisión para los métodosdetergentes.
FAD (gibO g) FND (gllOO
n 10 10
X 10,94 37,56
SD 0,36 1,83
CV 3,30 4,88
X = valor medio; SD= desviación estándar; cv = coeficiente de vanaclon
Por los coeficientesde variación calculadosseobservaque la precisiónes buenaen
ambosmétodos.
b) Método enzimático-gravimétrico: Método de Asp.
Sepesan0,4 g de salvadoy 0,1 g de pectinay se aplicael métodoenzimáticode Asp y col.
(1983)en igualdadde condicionesdiez vecesen díasdiferentes.
Los resultadosdel ensayode precisiónserecogenen las dos tablassiguientes.En laprimera
deellas figuran los porcentajesde FI y FS calculadosde forma independienteparasalvado
y pectinarespectivamente.En la segundase calculael porcentajede FI, PS y FT respecto
al pesototal de salvadoy pectina.
Tabla II. Ensayo de precisión para el método de Asp: FI y FS.
FI (g/lOO g) FS (gllOO g)
n 10 10
X 42,03 117,10
SD 3,95 11,40
CV 9,40 9,74
X = valor medio; SD= desviación estándar; CV = coeficiente de varlaclon
168
Tabla III. Ensayo de precisión para el método de Asp: FI, ES y FT.
FI <gllOO g) FS (g/100 g) FT (gllOO g)1
n 10 10 10
X 33,62 23,42 57,04
SD 3,16 2,28 5,09
CV 9,40 9,74 8,93
X = valor medio; SD = desviación estándar; CV = coeficiente de varíaclon
Por los resultadosobtenidossededucequela precisiónesaceptable.La mayor variabilidad
que seobservarespectoa los métodosdetergentessepuedejustificar porel uso de enzimas
que aumentala dificultad del análisis.
3.1.2. Ensayosde los métodoscromato2ráficos
3.1.2.1. Análisis de fibra alimentaria por Cromatografía Líquida de Alta Eficacia HPLC
Los ensayosabarcaránlos siguientespuntos:
a) Estudiode la hidrólisis de polisacáridos:celulosay xilano.
b) Separaciónde monosacáridos.
c) Estudiode la recuperaciónde monosacáridos.
a) Estudio de la hidrólisis de polisacáridos:celulosay xilano.
En este ensayo se estudian la hidrólisis de polisacáridoscon dos agenteshidrolíticos
diferentes:
- ácido sulfúrico H2S04,
- ácido trifluoroacético(ATF).
169
a.1) Estudiode ]a recuperacióndepolisacáridosutilizandocomoagentehidrolítico
ácidosulfúrico
El ácidosulfúricoesutilizado porSíaviny Marlett (1983)y porEnglysty Cummings(1988).
Estasdosmetodologíassediferencianen la formade llevar a caboel aislamientodel residuo
de fibrá alimentaria.Mientras que en el primer caso seanalizael residuo obtenido tras el
tratamientode la muestracon solucióndetergenteneutra,en el segundoel residuo seobtiene
despuésde eliminar el almidón con DM50 y aislar la fibra alimentariacon un tratamiento
enzimático.
Respectoa la hidrólisis de polisacáridos descrita en el apartado 2.2.2. de la Parte
Experimental,queposteriormenterequiereun tratamientodeneutralización,sehan realizado
una seriedeensayosmodificandolas condicionesde temperaturay tiempo, concentracióndel
agentehidrolítico y agenteneutralizante.
a. 1.1.) Hidrólisis de celulosa
-Ensayo10: en primerlugarseestudiaron,las condicionesde Síavin y Marlett (1983)
que seespecificana continuación:hidrólisis primaria (H2S04 72% 3 horasy V aínbiente),
hidrólisis secundaria(H2S04 1 M 2 horasebullición a reflujo) y neutralizacióncon Ba(OH)2.
SeempleacelulosaAvicel (50 mg) y los valoresmediosprocedentesde 5 ensayosse recogen
en la siguientetabla:
Tabla IV. Hidrólisis de celulosacon ácido sulfúrico. Ensayo JO•
X ± SD= valor medio + desviación estándar; cv= coeficiente de variación
RECUPERACION (%)
X+SD CV
CelulosaAvicel 38 53 + 4 15 10,77
170
-Ensayo20: al observaren la bibliografíaqueel Ba(OH)2era reemplazadoporBaCO3,
y al comprobarqueexistíancondicionesde hidrólisisdiferentes(Englysty Cummings,1988),
se introdujeron los cambiospertinentesen estosdos aspectos.Por tanto, en esteensayose
realizala hidrólisis primariadurante1 horaa 350C y la secundariadurante2 horasa 100W
(Englyst y Cummings, 1988) y se utiliza como agenteneutralizanteBaCO3 por un lado, y
tambiénBa(OH)2,porotro, paracomprobarla influenciadel cambiode agenteneutralizante.
La celulosautilizadafue la mismaque en el ensayoU’. Los valoresmediosde cincoensayos
figuran en la siguientetabla:
Tabla V. Hidrólisis de celulosacon ácido sulfúrico. Ensayo 20.
RECUPERACION (%)
BaCO3 Ra (OH)2
X+SD CV X±SD CV
CelulosaAvicel 44,89 ±318 7,08 44 92 + 3 68 8,19
X ± SD = valor medio + desviación estándar; CV = coeficiente de variación
-Ensayo30: antela bajarecuperaciónde la celulosautilizadaseprocedea utilizar un
nuevotipo (Sigmacelítype20) y se le aplicanlas mismascondicionesen cincoensayos.Con
estascondicionesseleccionadas(hidrólisis segúnmétodo de Englyst y Cummings(1988)y
neutralizacióncon BaCO3)seobtuvieronlos siguientesresultados:
Tabla VI. Hidrólisis de celulosacon ácidosulfúrico. Ensayo3O~
X ±SD = valor medio ±desviación estándar; CV = coeficiente de variacida
- Ensayo 40: al comprobarque las condicionesde hidrólisis no daban resultados
optimosen las muestrasrespectoa la celulosa,seoptó pormodificarlasde la siguienteforma:
RECUPERACION (%)
X+SD CV
CelulosaSigmacell 92,99 + 2 69 2,89
171
hidrólisis primaria, 2 horasa 40W e hidrólisis secundaria,3 horasa 100W. Debido a las
dificultadesde trabajo que suponeel uso de BaCO3 y a la experienciade Garleb y col.,
(1989), sesustituyó el agenteneutralizantepor una resmade intercambioiónico (AG 4-X4
BioRad) y se comprueba el número de lavados necesaríospara obtener una buena
recuperaciónde los monosacáridos(Gráficon<’2, del Apartado2.2. de laParteExperimental).
Estametodologíaes la que seempleaen las muestrasobjeto deestudio.Los resultadosdel
ensayocon celulosa(Sigmacelítype 20) serecogenen la siguientetabla:
Tabla VII. Hidrólisis de celulosacon ácido sulfúrico. Ensayo 40•
X + SD = valor medio + desviación estándar; CV = coeficiente de variación
a.í.2.)Hidrólisis de xilano.
-Ensayo1<’: Se ha utilizado xilano (50 mg) correspondientea dosínarcascomerciales
diferentes, Fluka Biochemika y Sigma, y se les ha aplicado las mismas condicionesde
hidrólisis que en el ensayo30, la neutralizaciónse realiza con la resmaA64-X4. Los
resultadosobtenidosde cincoensayosfiguran en la Tabla VIII:
Tabla VIII. Hidrólisis de xilano conácido sulfúrico. Ensayo10.
RECUPERACION (%)
X+SD CV
Xilano Fluka 81,09 + 2 38 2,93
Xilano Sigma 61,12 ±083 1,35
X + 50= valor medio + desviación estándar; CV coeticienle de variación
172
RECUPERACION (%)
X±SD CV
CelulosaSigmacelí 91,88 ±250 2,72
- Ensayo 20: se estudia la hidrólisis de xilano en las condiciones hidrolíticas
seleccionadasparalasmuestras:hidrólisisprimaria,2 horasa40W, ehidrólisis secundaria,
3 horasa 1000C, y la neutralizacióncon la resmaA64-X4. Los resultadosobtenidosfiguran
en la siguientetabla:
Tabla IX. Hidrólisis de xilano con ácido sulfúrico. Ensayo 20.
X ±SD= valor medio + desviación estándar; CV= coeficiente de variación
a.2) Estudiode la recuperaciónde polisacáridosutilizando comoaEentehidrolítico
ácidotrifluoroacético
En esteensayolos polisacáridosutilizadoshan sido celulosamicrocristalinautilizada en la
preparacióndedietasen investigaciónanimal (50mg) y xilanode la marcaFluka BiocheíniKa
(50 mg). Se ha llevado acaboen el centroCIVO-TNO de Zeist (Holanda).La hidrólisis se
realizadurante1 horaa 121W en autoclave(Barton y col., 1982). Como puedeobservarse
por los resultados obtenidos, el ácido trifluoroacético hidroliza fundamentalmente
polisacáridosno celulósicos. En la tabla X se indican los resultadosobtenidosde cinco
ensayos:
Tabla X. Hidrólisis de celulosay xilano con ácido trifluoroacético.
RECUPERACION_(%)
X+SD CV
CelulosaAvicel 2,85 + 0 03 0,91
Xilano (Fluka Biochemika) 80 00 + 5 21 6,51
X ±SD= valor medio ±desviación estándar; CV= coeficiente de variación
173
RECUPERACION (%)
X+SD CV
Xilano Fluka 81,25 + 2 20 2,67
Los diferentesensayosrealizadosindican que, de los agenteshidrolíticosquemásse emplean
segúnlos trabajospublicadospara la hidrólisis de los polisacáridosque forman la fibra
alimentaria,el ácidosulfúrico esel que da lugar a mejoresresultados,tanto respectoa los
polisacáridoscelulósicoscomoa los no celulósicos.Se ha comprobadoque con diferentes
tipos de celulosaseobtienenresultadosdistintosy estehechocoincidecon el estudiadopor
otros autores(Garleb y col., 1989). Los estudiosrealizadospor Englyst y col., (1982) y
Marlett y Navis (1988)confirmanlos resultadosaquiexpuestossobreel empleode la celulosa
Sigmacelí type 20 como patrón de hidrólisis. El empleo del ácido trifluoroacéticocomo
agentehidrolítico, según los resultadosobtenidos, sólo se justifica para el estudio de
polisacáridosno celulósicos.
Los ensayosrealizadosrevelan que se debería utilizar como agente neutralizantedel
hidrolizado una resmade intercambio iónico como la AG4-X4 (BioRad), por los buenos
resultadosobtenidosy porsu facilidadde empleofrentea compuestosdebarioquedificultan
muchola prácticade laboratorio.
b) Separaciónde monosacáridos
Unavez establecidaslas condicionesmásadecuadasparala hidrólisis de los polisacáridosse
estudiala separaciónde los mismospor CromatografíaLíquida de Alta Eficacia (HPLC).
Se sabequelos monosacáridospresentesen los polisacáridosqtíe forman la fibra alimentaria
son fundamentalmente:glucosa,xilosa, arabinosa,galactosa,manosay ramnosa.
Así pues,el primer pasonecesarioparallevar a caboel estudiodel comportamientode los
monosacáridoses disponer de una columna que permita la adecuadaseparaciónde los
mismos. Existen diferentesalternativasparala separaciónde estosmonosacáridosen lo que
a columnasse refiere. Se puede trabajaren combinación con un detectorde impulso
amperométrico(Webery Long, 1988; Garleby col., 1989; Quigley y Englyst, 1992),o bien
con detectorde indice de refracción (Mercier, 1984; Vidal-Valverde y col, 1985). Este
trabajo se centra en el análisis cromatográficoutilizando este último tipo de detector
habiéndoseseleccionadotres columnasdiferentes:dos de ellas incluyen sílice-aminocomo
174
relleno y la tercera una resmade intercambio iónico. De las diferentescolumnasque se
empleanpara el análisis de los monosacáridosprocedentesde la fibra alimentaria,se han
seleccionadouna seriede ellascompatiblescon el equipo cromatográficodel se dispone.A
continuaciónseindican las columnasestudiadas,junto con las condicionescromatográficas,
el ordende elución de los azúcaresy las concentracionesde los mismosque permitenuna
resoluciónsatisfactoriasegúnel tipo de columna. Estosdatos,asícomo los cromatogramas
presentados,correspondena solucionespatrónde azúcares.
175
b. 1)
Bomba
Detector:
Integrador:
Fasemóvil:
Flujo
ColumnapBondapackCarbohydrateAnalvsis 300 x 3.9 mm <Waters
)
Mod. 6000 A (Waters).
Refractioníndex mod. 401 (Waters).Sensibilidad4x.
DataModule Mod. 701 (Waters).
Acetonitrilo/agua75/25.
0,9 mL/mm.
Ordende elución de los azúcares:xilosa, arabinosa,manosay glucosa/galactosa.
Para las siguientesconcentraciones,de cada uno de los azúcares,xilosa, 0,43 mg/mL;
arabinosa, 0,74 mg/mL; manosa, 0,39 mg/mL, galactosa0,44 mg/mL se obtuvo el
cromatograman02:
‘o -t‘o
tt-~ oaa
a‘o
Qo
o
Cromatograman02. Separaciónde una mezclade monosacáridospatrón con la columna
CarbohydrateAnalysis (Waters).
o
176
u-,
b.2) Columna: Poly2osil 60-5 NH, 250 x 4.6 mm. El ensayodescrito en este apartado
correspondena un estudioquese realizódurantela estanciaen el centroCIVO-TNO de Zeist
(Holanda).
Bomba: Mod. 6000 A (Waters).
Detector: RefractomonitorIV, rango0.05R x 10 Rl (Milton Roy).
Integrador:Mod. CiRA (Beckman).
Fasemóvil: acetonitrilo/agua75/25.
Flujo: 2 mL/mm.
Ordende elución de los azúcares:ramnosa,xilosa, arabinosa,manosa,glucosay galactosa.
Se empleacomopatrón interno mio-inositol.
Parauna concentraciónde azúcaresde 2,9 mg/mL para cadauno de ellos se obtiene el
cromatograman03.
9—cn
‘o
‘o ‘oo— c
mX .0 0o ‘oz o
m ~ ooa’
o.,
oc
o
‘.0
‘.0
Cromatograman03. Separaciónde una mezclade monosacáridospatrón en la columna
Polygosil 60-5 NH2
177
b.3) Columna:Aminex HPX-87P300 x 7.8 mm (BioRad
)
Bomba: Mod. 6000 A (Waters).
Detector:Refractioníndex mod. 401. Sensibilidad4x. (Waters).
Integrador:Data Module Mod. 701. (Waters).
Termostato:Mod. D8 (Haake).
Bailo deagua: Mod. WH9 (Haake).
Fasemóvil: Agua desionizadaa 850C.
Flujo: 0,5 mL/mm.
Ordende elución de los azúcares:celobiosa,glucosa,xilosa, galactosa,arabinosay manosa.
Se utiliza eritritol comopatrón interno.
Para las siguientesconcentracionesde cadauno de los azúcarescelobiosa,0,04 mg/mL;
glucosa,0,06mg/mL; xilosa,0,02 mg/mL; galactosa,0,02 mg/mL; arabinosa,0,02 mg/ínL
y manosa,0,04 mg/mL seobtuvo el cromatograman04.
o
.5
a -~
-2~
Cromatograman<>4. Separaciónde una mezclade monosacáridospatrón en la columna
HPX-87P(BioRad).
u.,u,
oo1>u
oo.’
oe.0
o
oO
178
Por los ensayos realizados sobre la separación cromatográfica de monosacáridos
característicosde la fibra alimentaria, se deduceque la columna más adecuadaes la de
intercambio iónico HPX-87P (BioRad) por la resolución que se obtiene y por sus
característicasde uso.
c) Estudiode la recuperaciónde monosacáridos
En esteapartadoseestudiala recuperaciónde los monosacáridosdespuésde la acción del
ácido sulfúrico en las condicionesde hidrólisis fijadas en estetrabajo(2 h. a 40W y 3 h. a
100W). El hidrolizado seneutralizapor medio de la resmaAG4-X4. La columnautilizada
esla HPX-87P(BioRad).
Se preparauna mezcla de patronesformadapor 70 mg de cada uno de los siguientes
azúcares:celobiosa,glucosa,xilosa, galactosa,ramnosa,arabinosay manosa.Los resultados
obtenidosdespuésde realizar5 ensayosfiguran en la tabla XI.
Tabla XI. Estudiode la recuperaciónde monosacáridosdespuésde la hidrólisis.
RECUPERACION (%)
X+SD CV
Celobiosa 99,89 + 0 58 0,58
Glucosa - 98,12 + 548 5,59
Xilosa 92,94 + 3 36 3,61
Galactosa/ramnosa 95,24 + 4 50 4,72
Arabinosa 90,51 + 3 55 3,92
Manosa 102 28 + 4 03 3,94
Como
casos,
X + SO= valor medio + desviación estándar; CV coeficiente de variación
puedeobservarsepor los resultadosobtenidosla recuperaciónesóptimaen todos los
no observándosedegradacionesimportantesen los monosacáridos
En el centro CIVO-TNO de Zeist (Holanda)se llevó a cabo este mismo estudio con la
179
columnaPolygosil-Amino.Los resultadosson semejantesa los obtenidoscuandoseemplea
la columnade intercambioiónico (HPX-87P, BioRad) que se acabandecomentar:glucosa,
97,09 ±2,13; xilosa, 84 88 + 2,63; galactosa,97 63 + 1,45; ramnosa,98,79 + 2 43~
arabinosa,87 00 + 2 62 y manosa102,58 + 3 22
3.1.2.2. Análisis de fibra alimentariapor CromatografíadeGases(GLC)
Este estudio se ha realizado durante la estancia en el centro CIVO-TNO de Zeist (Holanda).
Se incluyen en este apartadolos mismospuntosqueen el correspondienteal análisisde fibra
alimentaria por HPLC:
-Estudio de la hidrólisis de polisacáridos (celulosa y xilano).
-Estudio de la separación cromatográfica.
-Estudiode la recuperaciónde monosacáridosdespuésde la hidrólisis.
a) Estudiode la hidrólisis de polisacáridos:celulosay xilano
Se utiliza el método descrito por Englyst y Cummings (1988) sin modificar ninguna de sus
condiciones.
Los patrones analizados son:
- Celulosautilizada paradietasen experimentaciónaniínal (TNO).
- Xilano de la marca comercial Fluka Biochemika.
Tabla XII. Hidrólisis de celulosay xilano <GLC).
RECUPERACION (%)
X±SD CV
Celulosa 85,75 + 1 12 1,31
Xilano 97,15 + 1 94 2,00
X + SD= valor medio + desviación estándar; CV= coeficiente de variación
180
Los resultados obtenidos indican una buena recuperación de los polisacáridos ensayados
celulosa y xilano.
b) Separaciónde monosacáridos
Para el estudio de la resolución de monosacáridos se ha utilizado un único equipo
cromatográfico:CromatógrafoCarlo Erba Mega Seriesequipadocon detectorde ionización
de llama y autoinyector.
Sehaestudiadoel poderresolutivo de doscolumnasdediferentelongitud, paracadauna de
las cualeshan sido utilizadaslas condicionesque seindican a continuación.
181
b. 1) Columna: 25 m x 0.32 mmde sílice fundida cubierta con Durabond
Temperatura del inyector: 250W
Temperatura de la columna: 2000C (10 mm) 40/min -. 250W (10 mm)
Temperatura del detector: 2750C
Gas portador: Helio 85 kPa
El orden de elución de los azúcares es: ramnosa, arabinosa, xilosa, mio-inositol, glucosay
galactosa. Para una concentración de 0.58 mg/mL de cadaazúcar se obtiene el siguiente
cromatograma n0 5.
-~ ¿ O‘e
Cromatograma n05. Separación de una mezcla de monosacáridos patrón por cromatografía
de gases (columna: 25 mx 0,32 mmde sfiice fundido cubierta con durabond).
aa u,o
~ .E a
ccl-..-,-o
ci
182
b.2) Columna: 30 m x 0.32 mmde sílice fundida cubierta con Durabond
.
Temperatura de inyector: 250W
Temperaturade la columna: 150W (5) 40/min -. 250<’C (5)
Temperaturadel detector:275”C
Gas transportador : Helio 85kPa
El orden de elución de los azúcares es el mismo que en la columna anterior: ramnosa,
arabinosa, xilosa, mio-inositol, manosa, glucosa y galactosa.
Para una concentración igual a la utilizada en el caso anterior, 0,58 mg/mL para cada azúcar,
se obtiene el cromatograma n0 6.
Cromatograma n’~ 6. Separación de una mezcla de monosacáridos patrón por cromatografía
de gases (columna: 30 m x 0,32 mmde sílice fundida cubierta con durabond)
183
4a ‘o‘a oo e -~
-‘o
Ea ote~< ><
o‘a -4o ce” ‘ae ‘aootoc ~ a
¿~5 (3a, r—,~— 1-. —
‘~4 e-e ‘—> vn.-, —,. — —,.
c) Estudio de la recuperaciónde monosacáridos
Puesto que la técnica de Cromatografía Líquida de Alta Eficacia aparece escasamenteen la
bibliografía hasta este momento, se ha pretendido comparar los porcentajes de recuperación
obtenidos por dicho métodocon los porcentajesobtenidospor un método másampliamente
utilizado, la Cromatografía de Gases.
Se utiliza el método de Englyst y Cummings (1988) tanto para la hidrólisis de polisacáridos
como para la derivatización de los monosacáridos obtenidos.
Se hace el experimento con tres cantidades diferentesde cada monosacárido(ramnosa,
arabinosa,xilosa, manosa,glucosay galactosa):35, 70 y 140 mgde cada azúcar.
Una vez que los azúcares han sido sometidos a las condiciones de hidrólisis (1 hora a 35W~
2 horas a 1000C), se toma una alícuota de 5 mL y se diluye a 10 mL. De estadilución se
toman 0,3 mL para el análisis por GLCLos resultados obtenidos son los siguientes;
Tabla XIII. Ensayo de recuperación de monosacáridospor Cromatografíade Gases (GLC).
RECUPERACION (%)
35 mg________X±SD ¡ CV
7OmgmgX + SD CV
X±SD CVRamnosa 11076 + 5,86 5,29 110,79±5,86 5,29 110,19 + 339 3,08
Arabinosa 87 46 + 2,01 2,30 88,23 ±4,39 4,97 90,71 + Y 38 2,62
Xilosa 9005 + 2,61 2,90 91 36 + 406 4,44 89,90 + 3 70 4,12
Manosa 90 12 + 6,04 6,70 8949 + 293 3,28 93,19 ±3 49 3,74
Glucosa 108,98 ±2,62 2,40 ¡08,93 ±2,28 2,09 92,30 + 3 Sl 3,04
Galactosa 92 15 + 4,52 4,90 91 36 + ¡ 01 1,11 92,60 ±2,93 3,16
X + 513= valor medio ±desviación estándar; CV= coeficiente de variación
184
Los ensayos de recuperación realizados por el método de Englyst y Cummings (1988)
aplicado a la Cromatografía de Gases indican resultados óptimos independientemente de la
cantidad de mezcla patrón de monosacáridos empleada. Los resultados obtenidos por Englyst
(Englyst y Cummings, 1988) para este método son muy similares a los obtenidosen este
trabajo: ramnosa, 85,60%; arabinosa, 93,30%; xilosa, 87,70%; manosa, 90,70%; glucosa,
92,90% y galactosa, 93,90%.
3.1.2.3. Resumencomparativo de los ensayosrealizadosa los métodos cromatográficos
Los ensayos realizados indican que los resultadosobtenidostantoal emplearla Cromatografía
Líquida de Alta Eficacia (HPLC) como la Cromatografía de Gases (GLC), en cuantoa la
cuantificación de monosacáridos se refiere, son semejantes, y, por tanto, que las dos técnicas
son adecuadas para realizar el estudio de los inonosacáridos de la fibra alimentaria.
La aplicación de la cromatografía de gases incluye, como fase preparatoria, la derivatización
de los azúcares y la cromatografía líquida de alta eficacia, la neutralización del hidrolizado.
El uso de la resma del intercambioiónico (AG4-X4) simplifica muchola neutralizaciónde
forma que resulta más sencilla y rápidaque la derivatizaciónque exige la cromatografíade
gases.
El método de cromatografía líquida estudiado presenta una buena resolución de los
monosacáridos excepto de galactosa y ramnosa que coeluyen, pero no hay que olvidar que
este último azúcar es minoritario en la composiciónde los polisacáridosque constituyenla
fibra alimentaria. Esta técnica permite obtener, a diferencia de la cromatografíagaseosa,
información a cerca de oligosacáridos.
A partir de los estudios realizados en este trabajo, se podría concluir señalando que las dos
técnicas cromatográficas (HPLC, GLC) son apropiadas para el estudio de la composición de
la fibra alimentaria, y que la elección de una u otra puede estar condicionada por los objetivos
concretos que se pretendan y por las características de cada laboratorio.
185
3.1.3. Métodos esuectrofotométricos
La espectrofotometría visible ha sido la técnica seleccionada para la determinaciónde
sustancias pécticas en las muestras estudiadas.
3.1.3.1. Extracción de sustancias pécticas
En el análisis de las muestras se ha llevado a cabo un estudio comparativo de la eficacia de
diferentes tratamientos para la extracciónde sustanciaspécticas:
-Extracción secuencial con un único disolvente: solución de ácido oxálico/oxalato amónico
al 0,125%, en caliente, en tres etapas.
-Extracción secuencia] en tres etapas con agua caliente, ácido oxálico/oxalato amónico al
0,125% caliente e hidróxido sódico 0,05N.
La falta de especificidad de los distintos solventes por las sustancias pécticas en el segundo
caso así como la posible interferencia de ácidos urónicos procedentes de hemicelulosas
extraídos por hidróxido sódico 0,05N fueron las principalescausaspara descartaresta
extracción secuencial.
En su lugar se optó por realizar la extraccióncon una solución de ácido oxálico/oxalato
amónico al 0,125% comprobando que dos extracciones son suficientes.
3.1.3.2. Cuantificación de sustanciaspécticaspor el métododel 3,5-dimetilfenol
Entre los métodos citados en la bibliografía para e] análisis de sustancias pécticas, se ha
elegido el método de Scott (1979) modificado en este trabajo (Esquema n’>l 1). Las
modificacionesrecaensobreel volumen de liquido extractivoutilizado en el desarrollode la
186
reacción colorimétrica, las cantidades de muestra, las cantidades de reactivos y los tiempos
de reacción. Se han realizado diversas pruebas comprobándose que las mayores absorbancias
se obtienen con 40 minutos de calentamiento y 40 minutos de permanencia en la oscuridad.
Se estudia la exactitud, la precisión y la recta de regresión del método del 3,5-dimetilfenol.
En recientes publicaciones se ha comparado este método con otros que utilizan como reactivo
de color m-fenilfenol y carbazol (Villanueva y col., 1990 y Rodríguez y col., 1992).
a) Ensayo de exactitud.
Se ha realizado el ensayoadicionandodistintascantidadesdeácidopécticopatrón(25, 50 y
75 mg) a la ¡nuestra que, tras realizar las diluciones oportunas, dan lugar a diferentes
concentraciones: 10, 20, y 30 ng/mL, a partir de las cualesse realizandiezveceslos métodos
señalados.
Tabla XIV. Ensayo de exactitud del método 3,5-diinetilfenol.
Ensayo de exactitud
Ac. Péctico M. 3,5-dimetilfenol
pg/mL X + SD CV
10 95.23 + 3.17 3.33
20 94.94 + 3.34 3.52
30 94.26 + 3.33 3.53
X ±SD= valor medio ±desviación estándar; CV= coeficiente de variacion
La comparación de estos resultadoscon los publicados por Villanueva y col., 1990 y
Rodríguez y col., 1992 indica que la recuperacióndel método del 3,5-dimetilfenol es
semejante a la del m-fenilfenol, mientras que la del carbazol ha resultado inferior.
b) Ensayo de precisión.
Para comprobar la precisión del método se procedea aplicar diez veces sobrediferentes
187
fracciones del mismo material a lo largo de diez días sucesivos, las tres colorimetrías.
Tabla XV. Ensayo de precisión del método 3,5-dixnetilfenol.
M. 3,5-dimetilfenol
X 0,220
SD 0,007
CV 3,18
X = valor medio; SP = desviación estándar; CV = coeficiente de varlaclon
El coeficiente de variación obtenido está dentro de los límites aceptables. Al
comparación de los datos obtenidospor Villanueva y col., 1990 y Rodríguezy
se observa que es inferior al del carbazol (CV = 4,29) y ligeramentesuperior
fenilfenol (CV = 1,69).
realizar la
Col., 1992
al del m-
c) Recta de regresión y coeficientede correlación
Se ha realizado la recta de regresión necesaria para la cuantificación de sustancias
pécticas, por el método del 3,5-dimetilfenol, comprobando el intervalo de concentraciones
(0-60 40.5 mL), preparadas a partir de ácido galacturónicoen el que secumple la ley de
Beer.
La recta de regresión correspondiente a la concentración de las soluciones patrón de ácido
galacturónico y las absorbancias leídas en el espectrofotómetro quedan reflejadas en el gráfico
n0 III y se define mediante la ecuación que se indica.
188
Absorban cia
0.8
0.6
04
0,2
o
~0~20 60
pg Acido galacturónico/O,5 ml
10 20 50 40 50
Gráfico u0 III. Recta de regresión para el método de 3,5-dimetilfenol.
d) Ensayo de las interferencias originadas por los azúcaresneutros
Se hace un estudio de las interferencias originadas por azúcares neutros en los métodos de
m-fenilfenol (Blumenkrantz y Asboe-Hansen, 1973) y 3,5-dimetilfenol (Scott, 1979). Para ello
se prepara una solución de fucosa, ramnosa, arabinosa, glucosa, galactosa y xilosa al 0,2%
a partir de la ctíal se realizan las dos colorimetrías, repitiendo diez veces cada una de ellas.
El método del 3,5-dimetilfenol no detectó los azúcares en ningún análisis, mientras que el m-
fenilfenol dió ligera coloración.
En la siguiente tabla figura el porcentaje de recuperación obtenido para la mezclade los
azúcares para cada uno de los métodos.
Tabla XVI. Ensayo de las interferencias con azúcaresneutros.
M. m-fenilfenol (%) [_M. 3,5-dituetilfenol (%) J
10 lO
X 4,10 0,72
SD 0,44 0,10
CV 10,73 13,89
X = valor medio; SD = desviación estándar; CV = coeficiente de variación
Los resultados obtenidos indican que el reactivo m-fenilfenol
neutros ensayados y que, por el contrario, el 3,5-diínetilfenol no
que hace que este último reactivo sea mucho más apropiado
sustancias pécticas.
interfiere con los azúcares
presentainterferencias,lo
para la cuantificación de
190
3.2. ESTUDIO DE LOS METODOS DE ANALISIS DE AZUCARES SOLUBLES
3.2.1. CromatoilrafíaLíquida deAlta Eficacia (HPLC
)
Para evaluar el método (Wilson y col., 1981) se ha sometido a ensayos de exactitud y
precisión, así como al estudio de la resolución que se obtiene.
a) Ensayo de exactitud
Para realizarlo se ha establecido el contenido cuali- y cuantitativo de azúcaresen las
hortalizas objeto de estudio. Se ha comprobado la presencia de fructosa, glucosa y sacarosa.
Con arreglo a las proporciones observadas en cada hortalizasehan adicionadoa la muestra
diferentes cantidades de la solución de azúcares patrón. Tras realizar las diluciones adecuadas
se ha realizado diez veces la determinación para cada mezcla de patrones.
- Fructosa:25 mg, Glucosa:25 mg, Sacarosa:50 mg, en 25 mL.
correspondiente a zanahoria y remolacha que representa una relación de F:G:S (0.5:0.5:1)
- Fructosa: 25 mg, Glucosa: 50 mg, Sacarosa: Smg, en 25 mL, correspondiente a nabo que
representa una relación de F:G:S (0.5:1:0.1).
Los resultados obtenidos son:
Tabla XVII. Ensayo de exactitud del método de Cromatografía Líquidade Alta Eficacia (HPLC) para la determinación de azúcaressolubles.
Monosacáridos ¡xg/25 ~~1 X + SD CV (%)
Fructosa 25 103,72 + 3 16 3,05
Glucosa 25 100,25 + 4 04 4,03
Sacarosa 50 102,49 + 0 30 0,29
Fructosa 25 100,20 + 0 28 0,28
Glucosa 50 104,08 + 0 26 0,25
Sacarosa 5 94,00 + 1 00 1,06
X + SO valor medio + desviación estándar; CV (7c) coeficiente de varmaclon
191
Los porcentajes de recuperación son óptimos en todos los casos, aunque se puede indicar qtíe
cuando la sacarosa se encuentra en pequeña proporción dicha recuperación es algo inferior.
b) Ensayo de precisión
Se aplica el método diez veces sobre diferentes fracciones del mismo material. Los resultados
obtenidos son los siguientes:
Tabla XVIII. Ensayo de precisión del método de Cromatografía Líquidade Alta Eficacia (HPLC) para la determinación de azúcares solubles.
X+SD CV(%)
Fructosa 0 575 + 0,028 4,87
Glucosa 0 627 + 0,019 3,03
Sacarosa 1 750 + 0,05 2,86
X + SP = valor medio + desviación estándar; CV (%) = coeficiente de variación
Los coeficientes de variación de los resultados obtenidos en las diferentesdeterminaciones
indican que la precisión del método es adecuada.
c) Resolución de la columna ~BondapackCarbohydrate Analysis
El estudio de la separación de los azúcares se ha llevado a cabo con una mezclade fructosa
glucosa y sacarosa. Se emplea la columna pBondapack Carbohydrate Analysis de Waters
como se indica en el apartado 2.3 de la Parte Experimental.
192
El cromatograma obtenido presenta el siguiente perfil:
Cromatograma n<’7. Separación de fructosa, glucosa y sacarosa en una mezcla de patrones
193
ceU,o
I1~
ce ceu, ‘a00e, •-ce
— o
ir’
3.2.2. Espectrofotometríavisible: métodode ferricianuro potásico
Se han realizado ensayos, al igual que en el caso anterior, de la exactitud y precisión, y el
estudio de la recta de regresión del método de Gaines (1973).
a) Ensayo de exactitud
Se lleva a cabo adicionando al material de partida 0,3, 0,4 y 0,5 g de sacarosa, obteniéndose
así los siguientes resultados:
Tabla XIX. Ensayo de exactitud del método del ferricianuro potásico.
Sacarosa (mg/mL) X+SD CV(%)
0,3 10117+271 2.68
0,4 97,58 + 6 52 6,68
0,5 97,03 + 1 23 1,27
X + SP = valor medio ±desviación estándar; CV (%) = coeficiente (le varjaclon
Las recuperacionesobtenidasen los tres casos
limites aceptables.
revelan que la exactitud se encuentra entre
b) Ensayo de precisión
Para comprobar el grado de concordancia al repetir el método sucesivasvecesselleva acabo
la prueba de precisión aplicando dicho métodoa un mismo material en diez días sucesivos.
Se han obtenido los siguientes resultados:
194
Tabla XX. Ensayo de precisión del método del ferricianuro potásico.
10
X 4,36
5113 0,06
CV 1,35
X ±SP = valor medio + desviación estándar; CV (%) coeficiente de varmaclon
Los resultadosobtenidosen los ensayosindican una pequeñavariaciónde los mismosen las
distintas determinaciones, por lo que se puede señalar una buena precisión del método.
c) Recta de regresión y coeficientede correlación
Se ha comprobado que en el intervalo 0-500 pg glucosa/mL se cumple la ley de Beer
obteniéndose la recta de calibración que figura en el gráfico nt14.
195
Absorban cia
1 ,6
1 .4
1.2
1
0,6
0,6
0,4
02
o0 500
Gráfico n0 IV. Recta de regresión para el método del ferricianuro
1 00 200 300 400
pg Glucosa/ml
potásico.
APENDICE DE REACTIVOS
- a-amilasa (EC 3.2.1.1.) Boehringer Mannheim.
- Acetato sódico. Merck. Solución tampón 0,1 M pH=5.2. Disolver 0,6 g de acetato sódicotrihidrato, y llevar a un litro con agua. Ajustar a pH 5,2 con ácido acético 0, lM. Paraestabilizar y activar los enzimas, añadir 4 mLde una solución 1 M de cloruro cálcicoa 1 litro de solución tampón.
- Acetona. Panreac.
- Acetonitrilo. Carlo Erba.
- Acido acético glacial. Panreac.
- Acido benzoico. AnalaR. Solución saturada al 50 %. Disolver en 1 litro de agua1,45 gde ácido benzoico o 1,70 g de benzoato sódico.
- Acido oxálico/oxalato amónico. Panreac. Solución al 0,125% respecto a cada uno de loscomponentes.
- Anhidrido acético. Merck.
- Azul de Bromofenol. Merck. Soluciónal 0,4 % p/v.
- Borohidruro sódico. Merck. Solución de 50 mg/mLen hidróxido amónico 3 M. Sepreparará inmediatamente antes de su uso.
- Cloruro sódico/ácidobórico. Panreac.Disolver 2 g de cloruro sódico y 3 g de ácidobórico en 100 mLde agua.
— Detergente Acido. Disolver 20 g de Cetil Trimetil Amonio (Merck) en 1 litro de H2504iN.
- Detergente Neutro. Disolver, en 1 litro de agua desti]ada, 30 g de Lauril SulfatoSódico~6,81 g de Bórax ; 4,56 g de Fosfato Disódico; 18,61 g de Edetato Disódico; 10 mL deEtilenglicol. Se comprueba que el pH esté comprendido entre 6,9 y 7,1.
- 3,5-Dimetilfenol. Merck. Solución al 0,1 %. Disolver 0.1 g de 3,5-Dimetilfenol en100 mL de ácidoacéticoglacial.
- Dimetilsulfóxido (DMSO). Merck.
- Etanol absoluto.
- Etanol al 85 % y/y.
197
— m-Fenilfenol. Solución al 0,15 % en NaOHal 0,5 %.
- Ferricianuro Potásico. Merck. Disolver 1,25 g de ferricianuro potásico y 1,00 g decarbonato sódico en 25 mLde agua. Disolver 8,75 g de carbonato sódico en 100 mLde agua. Llevar ambas disoluciones a 1 litro con agua.
- Hidróxido amónico. Merck. Solución 12 M.
- Hidróxido potásico. Merck. Solución 7,5 M.
- 1 -Metilimidazol. Fluka Biochemika.
- Octan-2-ol. Merck.
- Pepsina (EC 3.4.23. 1). Sigma.
- Pancreatina. Sigma.
Reactivosutilizados en el estudiomicroscópico:
- Adhesivo de Haupt’s. Se pesa 1 g de gelatina (Probus) y se lleva a 100 mL de agua a90W, seenfríaa 300C, seañaden15 mL de glicerinay seagita, sefiltra y se guardaen la nevera.
- Agua acética. Se prepara una solución de ácido acéticoal 10%.
- Cloruro de Zinc yodado. Se pesan 50 g de CI2Zn, 16 g de 1K y un excesode 12. Se
disuelve en 17 mL de agua.
- Etanol 95%, 70%, 50% y 30%.
- Floroglucina alcohólica. Se prepara una solución al 8% de floroglucina (Merck) enmetanol.
- Hipoclorito sódico (Fine chemicals) al 50%.
- Lugol. Se pesan 0,2 g, 2 g de 1K (Panreac) y se lleva a 100 mL con agua.
- Reactivo de fijación: Formaldehído: Acido acético: alcohol (FAA). 5 mLde ácido acético
glacial, 5 mL de formaldehido al 40% y 90 mL de etanol al 50%.
- Rojo de Rutenio.
- Verde yodo. Se pesa 1 g de verde yodo y se disuelve en 100 mL de agua.
- Xilol (Panreac). Etanol 960. Se mezclan en proporción 50:50.
198
III RESULTADOS Y DISCUSION
1. RESULTADOS
Los resultados obtenidos en el estudio realizado se exponen en este capítulo agrupados en un
total de 80 tablas y 39 gráficos.
1.1. TABLAS
Las tablas que recogen los resultados obtenidos se han estructurado de la siguiente forma:
-Tabla 1: Valores de humedad en las muestras frescas y procesadas.
-Tablas 2 y 3: Valores medios de fibra obtenidos según los métodos detergentes en
las muestras frescas y procesadas.
-Tablas 4 y 5: Estadísticos generales calculados para los valores obtenidos por métodos
detergentes en las muestras frescas y procesadas.
-Tablas 6 y 7: Eficacia de los métodos detergentes en la eliminación de cenizas y
proteínas en las muestras frescas y procesadas.
-Tablas 8 y 9: Valores medios de fibra obtenidos según el método de Asp en las
muestras frescas y procesadas.
-Tablas 10 y 11: Estadísticos generales calculados para los valores obtenidospor el
método de Asp en las muestras frescas y procesadas.
-Tablas 12 y 13: Eficacia del método de Asp en la eliminación de cenizas y proteínas
en las muestras frescas y procesadas.
-Tablas 14 y 15: Valores medios de monosacáridos neutros productos de fibra
obtenidos por HPLCen las muestras frescas y procesadas.
-Tablas 16 y 17: Valores medios de monosacáridos neutros totales procedentesde fibra
obtenidos por HPLCen las muestras frescas y procesadas.
-Tablas 18 y 19: Estadísticos generales calculados para los valores de monosacáridos
neutros procedentes de fibra obtenidos por HPLCen las muestras frescas y procesadas.
-Tablas 20 y 21: Estadísticos generales calculados para los valores de monosacáridos
neutros procedentes de fibra obtenidos por GLC en las muestras frescas y procesadas.
199
-Tablas 22 y 23: Valores medios de polisacáridos celulósicos, no celulósicosy totales
obtenidos por HPLCen las muestras frescas y procesadas.
-Tablas 24 y 25: Estadísticos generales calculados para los valores de polisacáridos
celulósicos, no celulósicos y totales en las muestras frescas y procesadas.
-Tablas 26 y 27: Valores medios de sustancias pécticas obtenidas según el método del
3,5-dimetilfenol en las muestras frescas y procesadas.
-Tablas 28 y 29: Estadísticos generales calculados para los valores de sustancias
pécticas en las muestras frescas y procesadas.
-Tablas 30 y 31: Valores medios de fibra total según diferentes métodos en las
muestras frescas y procesadas.
-Tablas 32 y 33: Estadísticos generales calculados para los valores de fibra total en
las muestras frescas y procesadas.
-Tablas 34 y 35: Valores medios de azúcares solubles obtenidos por HPLC en las
muestras frescas y procesadas.
-Tablas 36 y 37: Estadísticos generales calculados para los valores de azúcares
solubles obtenidos por HPLCen las muestras frescas y procesadas.
-Tablas 38 y 39: Valores medios de azúcares solubles obtenidos según el métododel
ferricianuro potásico en las muestras frescas y procesadas.
-Tablas 40 y 41: Estadísticos generales calculados para los valores de azúcares
solubles obtenidos por el método del ferricianuro potásico en las muestras frescas y
procesadas.
-Tablas 42, 43 y 44: Contenido de fibra alimentaria obtenido por métodos detergentes
en cada una de las muestras frescas y procesadas respectivamente.
-Tablas 45a y 45b: Valores medios de cenizas y proteínas en los residuos FADy FND
y en los residuos FI y FS en las muestras frescas y procesadas.
-Tablas 46, 47 y 48: Contenido de fibra alimentada obtenido por el método de Asp
en las muestras frescas y procesadas.
-Tabla 49: Porcentaje de fibra insoluble y de fibra soluble en la fibra alimentariatotal
de las muestras frescas y procesadas.
-Tablas 50, 51 y 52: Contenido de monosacáridos neutros en la fibra alimentaria de
las muestras frescas y procesadas.
200
-Tabla 53: Contenido de monosacáridos neutrostotalesen la fibra alimentariade las
muestras frescas y procesadas.
-Tabla 54: Porcentaje de cada uno de los monosacáridos neutros en el valor total de
éstos en las muestras frescas y procesadas.
-Tablas 55, 56 y 57: Contenido de polisacáridos celulósicos y no celulósicosen las
muestras frescas y procesadas.
-Tabla 58: Porcentaje de celobiosa y glucosa en el total de polisacáridos celulósicos
en las muestras frescas y procesadas.
-Tabla 59: Porcentaje de cada uno de los monosacáridos neutros en el total de
polisacáridos no celulósicos en las muestras frescas y procesadas.
-Tablas 60, 61 y 62: Contenido de sustancias pécticas, expresado en ácido
galacturónico, en las muestras frescas y procesadas.
-Tablas 63, 64 y 65: Contenido de polisacáridos no almidón (NSP) en las muestras
frescas y procesadas.
-Tablas 66, 67 y 68: Contenido de fibra alimentaria total calculada por distintos
métodos en las muestras frescas y procesadas.
-Tablas 69, 70 y 71: Contenido de azúcares solubles obtenido por HPLC en las
muestras frescas y procesadas.
-Tablas 72, 73 y 74: Contenido de azúcares solubles obtenido por el método de
ferricianuro potásico y por HPLCen las muestras frescas y procesadas.
-Tabla 75: Retenciones calculadas para los resultados de fibra obtenidos por métodos
gravimétricos y para sustancias pécticas en las tres hortalizas.
-Tabla 76: Retenciones calculadas para monosacáridos correspondientes a fibra
alimentaria en las tres hortalizas.
-Tabla 77: Retenciones calculadas para polisacáridos correspondientesa fibra
alimentaria de las tres muestras.
-Tabla 78: Retenciones calculadas para los valores de fibra total de las tres hortalizas.
-Tabla 79: Retenciones calculadas para azúcares solubles totales de las tres hortalizas.
-Tabla 80: Retenciones calculadas para azúcares solubles en las tres hortalizas.
201
En las tablas de la 1 a la 41 los resultadosestán organizadospara el estudio de la
caracterizaciónde la fibra alimentariay azúcarssolublesde las muestrasfrescasy procesadas.
En las tablasde la 42 a la 74, dedicadasal estudiode la influenciadel tratamientotérmico
sobreel contenidode fibra alimentariay azúcaressolublesen las hortalizasestudiadas,los
resultadosdel procesado,como se indicará en la segundaparte de la discusión, están
multiplicados por los correspondientesfactoresde correcciónparaque la comparaciónsea
correcta.Las últimas tablas(75 a 80) reflejan las retencionescalculadaspara las hortalizas
procesadas;el conceptode la retención se comentaráen el lugar correspondientede la
discusiónde los resultados.
1.2 GRAFICOS
Los resultadosobtenidosy recogidosen las tablas indicadasanteriormenteserepresentanen
treinta y nuevegráficosque sehan clasificadode la siguienteforma:
-Gráficosdel 1 al 6: Comparaciónde los valoresde fibra alimentaria,obtenidospor
distintos métodos,en las tres hortalizas.
-Gráficosdel 7 al 18: Estudiode los polisacáridoscelulósicosy no celulósicosen las
tres hortalizas.
-Gráficos 19 y 20: Comparaciónde los valoresde fibra alimentariatotal en las tres
hortalizas.
-Gráficosdel 21 al 24: Comparaciónde los valoresde azúcaressolubles,obtenidos
por distintos métodos,en las tres hortalizas.
-Gráficos del 25 al 33: Comparaciónde los valores de fibra alimentariaen las
hortalizasfrescasy procesadas.
-Gráficos del 34 al 36: Comparaciónde los valoresde ácido galacturónicoen las
hortalizasfrescasy procesadas.
-Gráficos del 37 al 39: Distribución de los azúcarestotalesen las hortalizasfrescas
y procesadas.
202
1.3. ESTUDIO ESTADISTICO
El estudioestadísticode los resultadosse ha realizadoaplicandoel paquetede programas
estadísticoBMDP (Biomedical Program)para obteneruna valoración más objetiva de los
resultadosexperimentales.
En la primerapartede la Discusiónde los Resultados(apartado2.1) que plantea el estudio
comparativode los métodosanalíticosutilizados, se ha aplicadoel testde la t-Studentpara
establecersi existendiferenciassignificativaso no entre los resultadosobtenidospara una
mismamuestrapordiferentesmétodos.Sepretendecomprobaren aquellasvariablesmedidas
pordos métodosdistintosque no hay diferenciasentreambos;paraello secrea unavariable
queesla diferenciaentrelos valoresde la variableobtenidospor los dos métodosaplicados.
Se realizael contrastede hipótesis,cuyahipótesisnulaes que la mediaseaigual a cero o lo
que es lo mismo que la media de las variables medidasmediantelos dos métodossean
iguales.
La interpretacióndel test se realizade la siguienteforma, sefija un nivel de significación(a
— 0,05)y paracadavariableel testproporcionaun “p-value” (nivel designificacióndel test)
que secomparacon el nivel de significación a para rechazaro no la hipótesisnula. Los
resultadosdel estudioestadísticoserecogenen el Anexo 1.
De forma análoga,en la segundapartede la Discusiónde los Resultados(apartado2.2) que
pretendeevaluar la posible influencia del tratamiento térmico sobre los componentes
estudiadosse ha aplicado el análisis de la varianza(ANOVA) que permite determinarsi
existen diferenciasentre las mediasde los valores obtenidosen las muestrasfrescasy
sometidasa procesode cocción a presión.
El análisis devarianzapara las hortalizasagrupadasen frescasy procesadasconsisteen un
contrastede hipótesisen el que la hipótesisnula (hipótesisa contrastar)es que la mediade
la variableen cuestiónparael grupofrescoes igual a la mediade la mismavariableparael
grupoprocesado.La interpretaciónes igual que en el caso anterior; seestableceel mismo
203
nivel de significacióna= 0,05, de forma que si los valoresde “p-value” son superioresa
0,05 se deduceque las variacionesobtenidasno son estadísticamentesignificativas. Los
resultadosse muestranen el Anexo II.
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Gráfico n0 3. Comparaciónde los valoresobtenidossegúnel métodode Asp en las tres hortalizas frescas.
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Gráfico n0 4. Comparaciónde los valoresobtenidossegúnel método
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Gráfico n<’ 6. Comparaciónde monosacáridosprocedentesde la fibra alimentariaen las tres hortal¡zasprocesadas.
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Gráfico ~O 7. Proporción de polisacáridos no celulósicos y celulósicos en zanahoria fresca.
Co¡uposic’Sión l)oI-ceIltuaIl de p. celulósicos.
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Gráfico u” 8. Propsn-ciói¡ de polisacáridos no celtilosicos y celiil6sicos e” zain:íhioria í>i-~ces:ítl>i.
Composición porcentu:íl de ¡t celulósicos.
Gráfico n” 9. Proporción de polis:i cái-id os no ce!u! ósi cos y celulósicos en remolacha fresca.
Composición porcentual de p. celulósicos.
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Gráfi CO u” 10. Proporci óu de pol isaeáridOS ¡¡o cclnl ós¡eos y cclii 1ósicos en ¡‘Sen!ola elía pro cesadaí.
Composición porcentual de p. celulosicos.
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Gráfico n~ 11. Proporción de polisacáridos no celulósicos y ceinlósicos en nabo fresco.
Coniposición porcentual de p. ceinlosicos.
Gráfico n0 12. Proporción de polisacáridos no celulósicos y celulósicos en nabo procesado.
Composición ¡)orcentual de p. celulosicos.
20 .945%
Ac. poligalacturénico
90.858%
Glucosa
No Celulósicos D~ Celulésicos
Celobiosa
9,142%
Monosacáridos neutros
29, 030%
15, 251%
Ac. potigalacturónico
En. No Celulósicos En Celulásicos
Glucosa
90996%
Celobiosa
9,004%
29,679%
Gráfico u’> 13. Proporción de polísacárl dos cclii lósicos y no celulósicoscii zanahoriafresca.
Composición porcentual de p. no celulósicos.
Manosa4, 928%
Arabinosa44,197%
Gal/ram44,833%
28, 275%Ac. poligalacturónico
Xilosa6.041%
E~ Celulósicas E~ No Celulósicas
Gráfico ~O 14. Proporción de poil sacár¡dos ccl nlós¡cos y no celo Iós¡cos en zanaIi oria
procesal(lal.Coníposiciónporcentual de p. ¡lo celulosicos.
Arabinosa35, 294%
Manosa7,691%
LII P Celulósicas Hp. No Celulósicas
Gal/ram
48,195%
Xilosa8, 82 1%
Gráfico u’> is. Proporción de polisacáridos celulósicos y ¡¡o celulósicos en remolacha fresca.
Composición porcentual dc p. nO cclnlósicos.
o ráfico it’> 16. Proporción de íml¡sacáridos celul~sicos y no celulósicos en remolacha
procesada. Composición porcentual de p. 11<> celulósicos.
Mano sa5,197%
Arabinosa34, 293%
67,134%
22,107% Gal/ram23,034%
Ac. poligalacturónico Xii osa
4.635%
Hp. Celulósicas H~, No Celulósicas
Manosa7,088%
Arabinosa38,343% 65, 593%
16,348% Gal/ram21,907%
Ac. poligalacturónico Xilosa5,412%
Hp. Celulósicas El’. No Celulósicas
Gráfico u’> 17. Proporción de polisacáridos celulósicos y no celulósicos en nabo fresco.
Composición porcentual de p. no celulósicos.
Gráfico u’> 18. Proporción <le polisacáridos celulosicos y 11<) celulosicos en nabo
prot’cs.’ud~. Composición l)orccntllal de n. no celulósicos.
Arabinosa
36,712%
48,665%
Mano sa
13,063%
H~ Celulósicas Er’, No Celulósicos
Gal/ram
31,982%
Xilosa
18,243%
Gráfico n’> 19. Comparación de los valores de Fibra Total obtenidos según
(listilitos métodos en las tres hortalizas frescas.
Gráfico n’> 20. Comparación de los valores de Fibra Total ol)tenidos según
distintos métodosen las tres hortalizas procesadas.
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Gráfico u’> 21. Comparación de los valores de azúcaressolul)les obtenidos por HPLC
en las tres hortalizas frescas.
Gráfico no 22. Comparación de los valores de azucaressolubles ol)tenidos por HPLC
en las tres hortalizas procesadas.
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Zanahoria Remolacha Nabo
Gráfico n’> 23. Comparación de los valores de azúcaressolubles
totales en las tres hortalizas frescas.
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LJH.RL. C.
Gráfico n’> 24. Comparación de los valores de azúcaressolubles
totales en las tres hortalizas procesadas.
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Zanahoria Remolacha Nabo
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ZanahoriaRemolachaNabo
ZanahoriaRemolachaNabo
ZanahoriaRemolachaNabo
FAD-FND <con proteína)
FRESCO PROCESADOp-value p-value
0,0296 0,41370,0397 0,04300,6765 0,3657
FAD-FND (sin proteína)
FRESCO PROCESADOp-value p-value
0,0344 0,39950,0450 0,03780,8257 0,3242
PROTF,~d’,-PROT~D
FRESCO PROCESADOp-valtie p-valtue
0,0560 0,07900,0033 0,08470,0012 0,0500
FI-FND (con proteína)
FRESCOp-value
ZanahoriaRemolachaNabo
0,03300,08040,0123
PROCESADOp—value
0,07580,41160,1421
Anexo 1.
Anexo 1. Continuación
ZanahoriaRemolachaNabo
ZanahoriaRemolachaNabo
ZanahoriaRemolachaNabo
FI-FND (sin proteína)
FRESCO PROCESADOp-value p-va]ue
0,03740 0,07070,0102 0,19760,0134 0,1455
FI-FAD (con proteína)
FRESCO PROCESADOp-value p-value
0,0658 0,36650,0198 0,06060,1024 0,0945
FI-FAD (sin proteína)
FRESCO PROCESADOp-value p-value
0,0658 0,36650,0198 0,06060,1024 0,0945
CENR-CENFs
FRESCOp-value
ZanahoriaRemolachaNabo
0,99600,70530,5087
PROCESADOp-value
0,01220, 15 170,3165
CEN = Cenizas
Anexo 1. Continuación
CENn-CEN~D
ZanahoriaRemolachaNabo
ZanahoriaRemolachaNabo
ZanahoriaRemolachaNabo
FRESCO PROCESADOfr-value p-value
0,0295 0,00600,0321 0,07310,0694 0,1269
PROTH-PROTFAJ,
FRESCO PROCESADOp-value p-value
0,0057 0,00930,0086 0,03630,0614 0,0108
PROTH-PROT~I,
FRESCO PROCESADOp-value p-value
0,0048 0,00480,0093 0,04700,0584 0,0124
FND-PoI. cel. + Pol. no ccl.<con proteína)
ZanahoriaRemolachaNabo
FRESCOp-value
0,00970,00060,0153
PROCESADOp-value
0,01020,07850,1733
Proteínas; Pol.cel. = Polisacáridoscelnlósicos; l>ol. mu, ccl. =GEN Cenizas; PROT —
Polisacáridosno celulósicos
Anexo 1. Continuación
FND- Pol. cel.+ Po). no ccl.(sin proteína)
ZanahoriaRemolachaNabo
ZanahoriaRemolachaNabo
ZanahoriaRemolachaNabo
FRESCO PROCESADOp-value p-value
0,0096 0,01110,0008 0,09730,0161 0,1759
HEMICELULOSASFND-FAD--HPLC
(con proteína)
FRESCO PROCESADOp-value p-value
0,0296 0,22110,0397 0,04300,1949 0,2703
HEMICELULOSASFND-FAD-HPLC
(sin proteína)
FRESCO PROCESADOp-value p-value
0,9007 0,22110,0397 0,04300,1949 0,2703
FI-Pol. ccl. + Po). no ce).
FRESCOp-value
ZanahoriaRemolachaNabo
0,16920,00210,0405
PROCESADOp-value
0,05720, 12930,2918
Polcel. = Polisacáridoscelulósicos; Pol. no ccl. = Polisacáridosno celulósicos
Anexo 1. Continuación
FS-SP
ZanahoriaRemolachaNabo
ZanahoriaRemolachaNabo
ZanahoriaRemolachaNabo
FRESCO PROCESADOp-value p-value
0,3355 0,01000,0163 0,02260,0684 0,0126
FT-FND + SP(conproteína)
FRESCO PROCESADOp-value p-value
0,0126 0,05270,0092 0,04740,0786 0,0821
FT-FND+ SP(sin proteína)
FRESCO PROCESADOp-value p-value
0,0139 0,04800,0040 0,04450,7165 0,0791
FF-FAD <con proteína)
FRESCOp-value
ZanahoriaRemolachaNabo
0,06960,00670,0065
PROCESADOp-value
0,03370,03270,0012
Polcel. = Polisacáridoscelulósicos; Poíno ccl. = Polisacáridosno celulósicos
Anexo 1. Continuación
ZanahoriaRemolachaNabo
ZanahoriaRemolachaNabo
ZanahoriaRemolachaNabo
FT-FAD (sin proteína)
FRESCO PROCESADOp-value p-value
0,0650 0,03360,0068 0,03120,0064 0,0015
FT-FND (con proteína)
FRESCO PROCESADOp-value p-value
0,4822 0,01290,0005 0,03220,0296 0,0249
FT-FND (sin proteína)
FRESCO PROCESADOp-value p-value
0,2618 0,01160,0001 0,03160,0276 0,0243
FT-NSP
FRESCOp-value
ZanahoriaRemolachaNabo
0,02590,00090,0397
PROCESADOp-value
0,00260,05720,0459
Anexo 1. Continuación
FI + SP - NSP
FRESCOp-value
0,16920,00210,0405
PROCESADOp-value
0,05670,12930,2917
FND + SP-NSP
FRESCOp-value
0,00960,00080,0161
PROCESADOp-value
0,01070,09730,1759
— kíZ4er
ZanahoriaRemolachaNabo
FRESCOp-value
0, 80470,27450,5978
PROCESADOp-value
0,79630,92980, 760 1
ZanahoriaRemolachaNabo
ZanahoriaRemolachaNabo
= Azúcaressolublespor método HPLC= Azúcaressolublespor métodoFerricianuropotásico
Anexo II. Estadísticoscorrespondientesa la comparación fresco-procesado(Análisisde varianza) (nivel de significación a = 0,05).
(con proteína)(sin proteína)(con proteína)
HumedadFADPADFNDFND (sin proteína)CENI¡ND
PROTFADPROTFNDFIESFTCEN1;,CEN125PROT1,1CELOBIOSAGLUCOSA<Fibra)XILOSAGAL. ¡RAM.ARABINOSAMANOSAM. NEUTROSP. CELULÓSICOSP. NO CELULOSICOSSPFND + SPFND + SPFI + SPFI + FSNSPAZUCFIR
AZUCHPLCFRUCTOSAGLUCOSASACAROSA
Variable Zanahoria Remolacha Nabo
(con proteína)(sin proteína)
CEN = CenizasPROT = ProteínasGAL/RAM. = Galactosa/RaunnosaM. NEUTROS = MonosacáridosNeutrosE. CELULOSICOS = PolisacáridosCelulósicosE. NO CELULOSICOS = PolisacáridosNo CelulósicosAZUC,~,~5 = Azúcaressolublespor métodoFerricianuroPotásicoAZUCILILÍ-. = Azúcaressolublespor método HPLC
0 03240,28990,35380,01600,0187
0, 18370,028 10,46600, 14730,22200,04450,64350,00960, 84050,49840,61480,50450,30400,16530,91150,54270,49870,02950,00920,01100,08360,22200,55240,00680,00480,01700,01740,0075
0,08730,11410, 12900,32590,34 180,01880,07450,2 1250,36510, 14630,83560,02560,11200,00040,270 10,60440,46550,96650,8876
¡ 0,00840,58880,53450,66450,12760,28020,2893
0,31220,83560,85750,05100,05520,07200,0727
- 0,0585
0,08630,55240,565 10,94050,93540,03580,22270,38790, 69 120,04070,34550,25 160, 83400,28430,37590,30370,200,62~90,35980,79790,57320,31170,66440,00270,66200,65790,378 10,34550,91990,05800,05690,05800,05200,0134
2. DISCUSION DE LOS RESULTADOS
2.1. ESTUDIO COMPARATIVO DE LOS METODOS ANALíTICOS EMPLEADOS
Los resultadosobtenidosse analizanestadísticamentesegúnel testde la t-Student,fijando en
todos los casosun nivel de significación de a = 0,05. Los valoresde p-valueencontrados
en cadacaso figuran en el anexo1.
2.1.1 Estudiode los resultadosobtenidosparala fibra alimentaria
2.1.1.1. Métodosdetergentes
Se han estudiadolos métodosácido y neutro detergente(Van Soest, 1963b; Van Soest y
Wine, 1967). Se han seguidoparaestosmétodoslas indicacionesde Van Soest,corrigiendo
los valoresobtenidostras el tratamientocon el contenidode cenizasdeterminadoen cada
residuo.
Se ha realizado, aunque el método no lo indica, la determinación de proteínas en los residuos
de fibra ácido detergente (FAD) y fibra neutro detergente (FND), lo que permite comprobar
la eficaciade estos tratamientosen la eliminaciónde proteínas.
En las tablas2 y 3 figura el contenidode FAD y FND paralas tres hortalizas,expresadoen
g/100g de materiahúmeda,paralas muestrasfrescasy procesadasrespectivamente.
Paracadahortalizasedan los valorescorrespondientesa cadalote (Lote 1, Lote2, Lote 3)
que procedende la media de seis determinacionesde una misma muestra,realizadaspor
duplicado en tres momentosdiferentes, segúnse explica en el apartado 1.2 de la Parte
Experimental.Estaforma de agruparlos datosen las tablasse mantendráa lo largo de todo
el apanadodestinadoal estudiocomparativode métodos.
320
Los residuosFAO y FND seestudiande forma que seobtienentres tipos de resultados.El
valor de “residuo+cenizas”esel que se obtienetras el tratamientocon el correspondiente
detergente,el datode “residuo”esel obtenidounavezeliminadaslas cenizassegúnespecifica
el métodoy el de “residuo-proteínas”esel valor del residuo una vezeliminadaslas cenizas
y las proteínas.
a) Estudiode los resultadosobtenidosen las muestrasanalizadas
Pararealizarel estudiode las fraccionesde FAO y FND setoman los valoresqueseobtienen
despuésde restar las cenizasresiduales;los residuos+cenizasy los residuos-proteínasse
emplearánparael estudiode la eficaciade eliminaciónde cenizasy proteínaspor partede
las solucionesdetergentes.
Se hacereferenciaa los valoresmediostotales(g/lOOg materiahúmeda)y erroresestándar
obtenidos para cada hortaliza, recogidos en las tablas 4 y 5 junto con otros estadísticos
generales(desviaciónestándary desviaciónestándarrelativa).
El métodoneutro detergentepermitela obtenciónde un residuo teóricamenteformadopor
celulosa, hemicelulosas y lignina, mientras que la aplicación del método ácido detergente
consigue un residuo formado, en teoría también, por lignina y celulosa. Así pues, la
diferencia entre ambos métodos puede ser estimada como hemicelulosas y, por tanto, cabe
esperarque el valor de FND sea superioral de FAO.
En las hortalizasfrescas,el nabopresentalos valoresmáselevadosde FAO (1,739±0187),
la remolachaproporcionael porcentajemásbajo (1 454+0 148>, mientrasque la zanahoria
tiene un contenidointermedio (1,511±0,062>.Las hortalizasprocesadasmantienenesta
misma secuencia cuantitativa en los resultados: nabo (1,630±0,160),zanahoria
(1,559±0,109)y remolacha(1,165±0,077).
Respectoa los datosobtenidosdeFND, en los productosfrescosla remolachaesla queposee
el mayor contenido(2,297±0,223),seguidade la zanahoria(1,974±0,119)y, por último,
el menorporcentajecorrespondeal nabo(1,703±0,147).En los procesadoseste orden se
321
altera ligeramente ya que si la remolacha presenta nuevamenteel máximo valor
(2,004+0257), la zanahoriatiene el contenidomáspequeño(1,687±0,026)y el nabo un
valor intermedio(1,719±0,203),
Las diferenciasobservadasentreFND y FAD puedenser estimadas,teóricamente,como
hemicelulosas.Esta cuantificacióntieneque ser interpretadacon precauciónporque,al ser
una valoraciónindirecta, seestánsumandolos erroresdel método neutro detergentey del
ácidodetergente.Esteaspectosecomentarácon mayordetalleal estudiarlas hemicelulosas.
En el caso de las muestrasestudiadas,la remolachacon el máximo valor de FND y el
mínimodeFAD, presentaríael porcentajemáselevadodehemicelulosas.La superioridadde
FND sobreFAD no siempreescierta, en el nabotanto frescocomoprocesadoambosvalores
son próximos.
Secomparanestadísticamentelos valoresmediosde FND y FAD obtenidosparacadamuestra
(niveldesignificacióna= 0,05). Ene]casode los materialesfrescosse observalo siguiente:
los valoresdeFND en zanahoria(1,974±0,119)y remolacha(2,297±0,223)son superiores
a los de FAD (1,511±0062 y 1,454±0,148),siendo las diferencias estadísticamente
significativas.Sin embargoen el nabono se han encontrado diferencias entre los valores de
FND(1,703±0,147) y FAD (1,739±0,187) para el mismo nivel de significación.
En el caso de los materialesprocesados,los resultadosdeFND son próximosen la zanahoria
(1,687±0,026)y en el nabo (1 719+0203) a los de FAD (1,559±0,109y 1,630+0 160)
y las diferenciasno son significativas. Mientrasqueen la remolachaFND (2,004±0,257)y
FAD (1,165±0,077)son estadísticamentedistintos.
La eliminación de proteínaresidualno es unapremisade estosmétodos,cuyo fundamento
suponeuna total eliminación de la misma. Por tanto, si se comparanestadisticamentelos
valoresdeFAD y FND obtenidosdespuésde procederanalíticamentea su eliminaciónen los
residuos,seobservaque todoslos comentariosrealizadosanteriormenteson aplicablesa los
nuevosdatos,si bien estosson, lógicamente,algo inferiores.
322
b) Estudiode las cenizasresidualesen FAD y FND
En las tablas6 y 7 se refleja la eficacia de la eliminación de cenizaspor las soluciones
detergentesen las muestrasfrescas y procesadasrespectivamente.Dicha eficacia se ha
calculadoteniendoen cuentalos valoresde cenizaspresentestantoen las muestras(g/100 g
materiahúmeda)comoen los residuosdetergentes(gibO g de residuo)..
En los residuosFAD, tanto en las muestrasfrescascomo procesadas,se observaque la
eliminaciónde cenizasestotal; sin embargo,en los residuosFND, tanto de frescocomo de
procesado,dichascenizasestánpresentesen todos los casosexceptoen la zanahoria.
La capacidadderetenciónde elementosmineralesestárelacionadacon lapresenciade grupos
carboxilo libres correspondientesa las moléculas de azúcaresde los polisacáridosno
celulósicosy tambiénde la lignina (McConnell y col., 1974; Olds, 1978).La FND presenta
ambos tipos de componentesmientras que en la FAD no cabe esperarla presenciade
hemicelulosas.Podría sucederque la naturalezade la FND como tal, presentemayor
capacidadde retenciónque FAD, o bien que la solución ácido detergentesolubilice más
elementosmineralesque la neutrodetergente.
Entrelos residuosde FND el quepresentamayorproporciónde elementosmineraleses la
remolacha(fresca: 1,457% y procesada:0,925%), a continuaciónnabo (fresco: 0,562%y
procesado:0,432%)y en el caso de la zanahoriano se han encontradocenizas.
Paraver la eficaciaen la eliminaciónde elementosmineralespor partede la solución neutro
detergenteseha determinadola concentracióninicial de cenizasen las tres hortalizas.Los
valoresmediosde cenizasen los materialesfrescososcilanentre0,626%pararemolachay
0,808%paranabo, presentandola zanahoriaun valor intermediode 0,734%. Los valores
obtenidosen el procesado,son 0,466%para naboy 0,559%parazanahoriapresentandola
remolachaun valor intermediode 0,547%.
El porcentajede eliminación calculadoha sido del 100% para la zanahoria(fresca y
procesada),considerablementeelevadoparael nabo(fresco=98,87%;procesado’98,41%)
323
y ligeramenteinferior parala remolacha(fresca=94,57%;procesada=96,57%)(Tablas6
y 7).
Sededucequeel porcentajedeeliminaciónde cenizasessiempreinferior en el casode FND
comparadocon FAD, puestoque en estecaso estotal.
c) Estudiode las proteínasresidualesen FAD y FND
En las tablas6 y 7 se refleja la eficacia de la eliminación de proteínasen los métodos
detergentes,en las muestrasfrescasy procesadasrespectivamente.Dicha eficaciase calcula
teniendoen cuentalos valoresde proteínaspresentestanto en las muestras(gI 100 g materia
húmeda)como en los residuosdetergentes(gibO g de residuo)
Algunosautores(Cummings,1981 y Saura-Calixtoy col. 1983) señalancomo inconveniente
de estosmétodosla retenciónparcial de proteínas.Paracomprobarlo que sucedeen el caso
particular de las muestrasaquíestudiadasse determinala presenciade proteínasen los
residuosFAD y FND.
Las tres hortalizasse comportande formadiferenterespectoa la cantidadde proteínasque
no es solubilizadapor los detergentes.La remolachaes la muestraque presentamayor
proporciónen el residuo de FAD (fresca:5,722% y procesada:4,428%), sin embargoen
zanahoria(fresca: 1,185% y procesada:0,943%) y nabo (fresco: 1,321% y procesado:
1.073%)seobtienencontenidosmuy similares.Los porcentajesde proteínasresidualesen la
FND de la remolacha(fresca:6,619%y procesada:5,839%)son,denuevo,superioresa los
de las otras dos hortalizas; dichos niveles de proteínasen zanahoria(fresca: 1,985% y
procesada:1,456%) son a su vez diferentesa los de nabo (fresco: 0,279% y procesado:
0,345%).
Las diferenciasencontradasentrelas proteínasresidualesde ambosmétodosdetergentesson
significativas(a= 0,05) en gran partede los casos.
Para poder calcular la eficacia en cuanto a la eliminación proteica de las soluciones
324
detergentesserequiereconocerlos valoresde proteínastotalesen las muestrasfrescas,que
oscilanentre1,343%en remolachay 2,530%en zanahoria,y en las procesadasentre0.940%
en remolachay 1,427% en zanahoria.El nabo presentavalores intermediosen fresco
(1,500%)y en procesado(1,333%).
Destacael menorporcentajede eliminación de proteínasen la remolacha,tanto en FAD
(fresca= 93,75%y procesada= 93,54%)comoen FND (fresca~ 88,38%y procesada=
84,22%)respectoa las demáshortalizasque superanel 98% de eliminación para ambos
métodosdetergentes..Portanto, sepuedeindicar que la eficaciade eliminacióneselevada,
y ligeramentesuperioren el métodoácidodetergenterespectoal neutro detergente,excepto
en el casodel nabo. Dicha eficaciadependeno sólo del método empleadosino también de
la muestrade quese trateen cadacaso.
Con frecuenciano sele da importanciaa la presenciadeproteínasen los residuosdetergentes
debido a su bajaproporción(Marlett y Lee, 1980).Es escasoel númerode trabajosen los
quese determinael contenidodeproteínasen los residuosdetergentesprocedentesdel análisis
de alimentos.
La presenciade proteínas,sepuedeatribuir a razonesde disposiciónestructural(Selvendran
y Robertson, 1990), o a que el tratamientodetergentela modifique impidiendo su total
solubilización.
Los valores de FAD y FND, así como los correspondientesa cenizas y proteínas,se
encuentranrepresentadosen el gráfico 1 paralas hortalizasfrescasy en el gráfico2 paralas
procesadas.
2.1.1.2.Método enzhnático-gravimétrico de Mp
Recordandolo expuestoen la ParteGeneral,este método datade 1983 y fue diseñadopor
Asp y col, que considerancomo fibra alimentariatodos aquelloscompuestosqueresistenel
325
tratamientoenzimáticocon
compuestosen dosgrandes
- Insolublesen agua
- Solublesen agua
de maneraquela suma de
En la tabla 8 figuran los
hortalizas frescas, y en la
húmeda.En las tablas10 y
pepsinay pancreatina.Esta metodologíapermite separarestos
grupos:
= Fibra Insoluble(FI)
= Fibra Soluble(PS)
FI y PS dael valor de Fibra Total (FT).
valores obtenidos para fibra insoluble, soluble y total en las
tabla 9 en las procesadas,expresadosen g/l 00 g de materia
11 figuran los estadísticosgeneralesparadichasmuestras.
Los valoresde FI seobtienenrestando,al valor del residuode fibra, la cantidadde cenizas
y proteínasquepermanecendespuésdel tratamiento.El residuosolublesecorrigesustrayendo
el valor de cenizasresiduales.
Los análisissehacenporcuadruplicado,destinandodosresiduosde FI al análisisde proteínas
y dos al análisis de cenizas. En los cuatro residuos de ES obtenidos se realiza la
determinaciónde cenizas.
Estemétodopermiteunaprimeraaproximaciónal estudiocualitativode los componentesde
la fibraalimentaria:FI es la sumade celulosa,hemicelulosasy lignina, y FS estáconstituido,
principalmente,por los polisacáridospécticos.
Durante un tiempo se pensóque los valores de FI y PS permitían predecir, con cierta
aproximación,cualibaa serel efectofisiológico predominanteoriginadoporlos componentes
presentesen el residuode la fibra alimentaria.Sin embargo,en la actualidad,aunqueesta
idea se mantieneen líneasgenerales,se insiste en la necesidadde comprobarcon mayor
exactitudla repercusiónfisiológica de cadauno de los componentesde la fibra alimentaria
(Eastwood,1992).
a) Estudiode los resultadosde fibra insoluble(FI) en las muestrasanalizadas
Al comparar los valores mediosobtenidospara FI (gibO g materiahúmeda)en las tres
326
hortalizasfrescasy procesadas(Tablas10 y 11) se observaquelos valoresmáselevadosde
FI los presentala remolachatanto fresca,2 413+0204, comoprocesada,2,104±0,330.Los
valoresmásbajosdeFI sonlosquecorrespondena zanahoria,1 253+0,026y 1,346+0085.
El nabopresentaun valor intermediopróximo a zanahoria 1 445+0,118 en el fresco y
1,407+0093 en el procesado.
Es interesantecompararlos resultadosde fibra insoluble obtenidosal emplearel método
enzimático y los métodosdetergentes,por esta razón en primer lugar se comentarálo
referente al estudio FI-FND y posteriormenteFI-FAD (Tablas 4, 5, 10 y 11). La
significaciónde las diferenciasseestableceparaa= 0,05.
En el casode los materialesfrescos,si secomparanlos datosobtenidosporambosmétodos,
las diferencias encontradas son estadísticamentesignificativas en zanahoria (FI =
1,253+0026, FND = 1 974+0,119)y nabo(FI = 1 445+0,118,FND = 1,703+0 147),
destacandoademásel hecho de quelos valoresdeFND son superioresa los de FI en ambos
casos. En remolachaambos valores son semejantes(FI = 2,413+0204 y FND =
2,297+0223).
Para los materiales procesadosno existen diferencias significativas, entre los valores
alcanzadospor ambos procedimientos,en ninguno de los casos: zanahoria (FI =
1,346+0085 y FND = 1,687+0026), remolacha (FI = 2,104+0330 y FND =
2,004±0257) y, finalmente,nabo (FI = 1 407+0,093y FND = 1,719+0 203).
Si parala comparaciónseutilizan los valoresde FND sin proteínas(Tablas2 y 3) se observa
que existen diferencias significativas en los tres materiales frescos y no se dan tales
diferenciasen ningunode los materialesprocesados.Asípues,la remolachafrescaesel único
material cuya comparaciónentreFND y FI varíaen función de la consideracióno no del
valor deproteínaresidual.
En la bibliografíaestudiadapocasvecesserealizala comparaciónentreestostérminos, pues
lo que seha venido realizandohastael momentoes la comparaciónde FND con FT, que se
327
expondrámásadelante.En el caso del espárragolos valoresde FI son inferioresa los de
FND en la parteapical y en la partemediadel turión, mientrasque en la zonabasales más
elevadaFI queFND (Redondoy col. 1990).
La aplicaciónde una metodologíau otra origina diferenciassignificativasen los resultados
y la bibliografíaseñalala presenciade otros componentesque puedeninterferir. En el caso
de los residuosdeFND seindica la posiblepresenciade almidón(Morrison, 1980)y en los
de FI la interferenciade taninos(Saura-Calixto1987 y 1988)y seproponela correcciónde
taninoscuandose aplicael método de la AOAC a muestrasespecialmentericas en este
componente,ej. vainasde algarroboy esparceta.
En el caso de los materialesprocesadoslas enzimasutilizadasen el método FI serían tan
eficacescomo la solución neutrodetergenteparaeliminar los compuestosque interfierenen
zanahoriay nabo. En los materialesfrescos,ni las enzimasdel métodode Asp ni la solución
detergentepueden eliminar esos compuestos,de ahí las diferencias encontradas. En
remolacha,ambosmétodosFND y FI eliminan esasinterferenciascon la misma facilidad,
tanto en frescocomo en procesado.
En lo que se refiere a la comparaciónentreFI y FAD, se observaen las muestrasfrescas
comozanahoria(FI = 1 253+0,026,FAD = 1,511+0062) y nabo (FI = 1,445±0,118,
FAD = 1,739±0187)queno existendiferenciasestadisticamentesignificativas,mientrasque
en remolachasi seaprecian(FI = 2,413+0204 FAD = 1 454+0 148).
Parael caso de las procesadaslos resultadosde FI y FAD son cuantitativamentesemejantes
en los tres casos,zanahoria(FI = 1,346±0085 FAD = 1,559±0,109),remolacha(FI =
2,104+0330, FAD = 1,165±0,077)y nabo(FI = 1 407+0,093,FAD 1,630±0,160).
Si se utilizan para la comparaciónlos datos de FAD una vez eliminadaslas proteínas
existentesen dichosresiduos,seobservanlos mismoshechosque parael casode FAD con
proteínatanto en los materialesfrescoscomo en los procesadosde las tres hortalizas.
328
Al igual quesucedecon la comparaciónFI-FND, pocasvecesseencuentraen la bibliografía
la comparaciónEL-FAD. En espárragolos valoresde FI son claramentesuperioresa los de
FAD (Redondoy col. 1990).
Comoya seindicabaen la ParteGeneral,los compuestosencontradoscon mayor frecuencia
comocontaminantesdel residuoFAD son restosde polímeroshemicelulósicosy sustancias
pécticas(Marlett y Lee, 1980; Morrison, 1980).
Los métodosdetergentesy el método enzimáticode Asp tienen diferentesfundamentosy
fueron concebidoscon diferentesfines. Los métodosdetergentesparael análisisde alimentos
paraanimales(forrajes)y los enzimático-gravimétricospara el análisisde alimentosparael
hombre.Además, el métodode Asp lleva implícita la consideraciónde la fibra alimentaria
como una entidadcon acciónfisiológicaen el organismohumano.
Por esto es muy útil comprobar si la determinaciónde fibra alimentaria por ambas
metodologíasda resultadospróximos.Del análisisde los resultadosobtenidosen estetrabajo
se compruebaque en el análisiscuantitativode los materialesprocesados,ambosmétodos
aportanresultadossemejantesy, por tanto, cualquierade dichos métodospodría resultar
válido, mientrasque en los frescos,en la mayoríade los casos,los resultadosdifieren en
funciónde la metodologíautilizaday por tanto la especificacióndel métodoseguidoseríaun
factor importantea señalar.
b) Estudio de los resultados de fibra soluble (FS~ en las muestras analizadas
Al compararlos valoresobtenidosparaFS (gibO g materiahúmeda)en las tres hortalizas
(Tablas 8, 9, 10 y 11) se observaque el valor más elevado en las muestras frescas
correspondea remolacha(0,941±0,030),a continuaciónzanahoria(0 774±0194) y, por
último, al nabo (0,578±0,078).En cuantoa las procesadasel ordense modifica, zanahoria
(1,280+0040), remolacha(1,241+0152) y nabo(0,866±0,085).
En principio, el componentemayoritariopresenteen estosresiduossonlas sustanciaspécticas
aunquepuedehaberotros componentes,fundamentalmenteproteínas.
329
Paracompararel valor de fibra solublecon el obtenidoparasustanciaspécticaspormétodos
espectrofotométricosse ha realizado la determinaciónpor medio del método del 3,5-
dimetilfenol (Scott, 1979), que determinaexclusivamenteácidogalacturónicodespuésde la
hidrólisis de los polisacáridospécticosy que seestudiaráposteriormente.
c) Estudiode las cenizasresidualesen FI y PS
Sedeterminael contenidode cenizasen el residuoFI y en el FS, A partir de estosvalores
(g/100 g residuo) se calcula el porcentajede cenizasde la muestraque permaneceen el
residuoy la eficaciadel métodode Asp (Tablas12 y 13).
En los productos frescos el porcentaje de cenizas hallado en FI es inferior al encontrado en
FS en los tres casos: remolacha (FI = 3,705%, PS = 10,308%), zanahoria (FI = 3,447%,
FS = 10,258%) y nabo (FI = 3,193%,PS = 11,424%).. Comopuede apreciarse, el residuo
FI de las tres muestras contiene una proporción similar de cenizas mientras que dentro del
FS el valor más elevado corresponde a nabo, remolacha y zanahoria presentan valores
semejantes y ligeramente más bajos. Por tanto, en dichas muestras FI y FS se comportan de
diferente forma frente a la retención de elementos minerales.
Asimismo,en los procesados el porcentaje de cenizas residuales es más bajo en FI que en FS,
obteniéndosediferenciasimportantesentrela cantidadde cenizaspresenteen dichosresiduos:
zanahoria(FI = 2,154%,PS = 7,052%),remolacha(FI = 1,775%,PS = 5,102%)y nabo
(FI = 2,178%, PS = 7,664%).
Desdeun punto de vista estadístico(a= 0,05), las cenizasresidualespresentesen FI y PS
son diferentesen la mayoríade los casos,si bien los porcentajesde PS son muy superiores
porque la fibra soluble es menor que la insoluble y el tanto por ciento de cenizas es
proporcionalmente mayor.
Si se exponelo anterior en términos de eficaciade eliminación de cenizaspor el método
enzimáticode Asp para las fraccionesFI y PS (Tabla 12) seobservaque en los materiales
frescosesmuy similar paraambas:zanahoria(FI = 89,001%y FS = 89,096%), remolacha
330
(FI = 84,294% y PS = 82,783% ) y nabo (Fi = 91,369% y PS = 90,376% ). En los
procesados(Tabla 13) la eliminaciónesmáselevadaparaFI queparaFS, siendola diferencia
de un 9% para zanahoria,5% pararemolachay 6% paranabo.
La comparaciónde los contenidosde cenizasen FI y en FND podríaindicar si la capacidad
que tienencelulosa,hemicelulosasy lignina pararetenerelementosmineralesdependeo no
del tratamientoquímicoque estánsufriendodichoscomponentes(Tablas6, 7, 12 y 13). De
los resultadosse deduceque la eliminación de cenizaspor partede estos tratamientos,
químico y enzimático, es diferente en el caso de zanahoria(fresca y procesada)y de
remolachafresca mientras que ambos tratamientostienen la misma eficacia remolacha
procesaday en nabo (frescoy procesado).
d) Estudiode las proteínasresidualesen FI
Las proteínasestánpresentesen el residuoFI, y paradar un valor correctode dicho residuo,
el método indica que hay que restaríasdel peso total. Esto implica que el tratamiento
enzimáticono essuficienteparaeliminartodala proteína.La presenciade dichaproteínaen
el residuotiene hoy día un papelcontrovertidoen la definición de fibra alimentaria.
El contenidodeproteínas(g¡100g de residuo)representaun porcentajedel residuode FI muy
variable dependiendode la muestrade que se trate (Tablas 12 y 13). En el caso de las
hortalizasfrescasoscila desdeun 42,142% en zanahoriahastaun 4,614% en remolacha,
pasandopor un valor intermediode 24,460%en nabo. En los procesadoshay un margen
también bastante amplio, desde 32,088% en zanahoriahastaun 6,077%en remolacha,siendo
del 19,797%en nabo.
La eficaciade la digestión proteicapara las diferenteshortalizas,frescasy procesadas,es
muy semejanteen zanahoriay nabo, con unos porcentajesde eliminación de: zanahoria
(fresca= 61,378% y procesada=55,641%) y nabo (fresco= 67,247% y procesado=
73,226%),y bastantesuperioresen remolacha(fresca=90,852%y procesada=84,066%).
Las publicacionesen las quesedetallanlos valoresdeproteínapresentesen los residuosson
331
escasas.En el espárrago,los valoresdeproteínasen la fibra insolubleobtenidaporel método
de Asp son semejantesa los presentesen el residuoFAD, y superioresen amboscasosa los
obtenidospor el métodoFND (Redondoy col. 1990).
Cuando se comparan estadisticamente(a= 0,05) los valores de proteínasresiduales
encontradosen FI con los halladosen FAD y FND, seobservandiferenciassignificativasen
prácticamentetodos los casos.Así pues,en todos los materialesla eficaciade los métodos
detergentesen la eliminación de proteínas es superior a la del método enzimático-
gravimétricode Asp (Tablas6, 7, 12 y 13).
La proteínaes puesuno de los componentesen los que el diferentefundamentode cada
método tiene mayor influencia. El tratamientoquímico elimina gran cantidadde proteínas,
mientrasqueel tratamientoenzimáticodejauna mayorproporción.La presencia de proteínas
en el residuo FI puede ser debida a que no ha sido digerida por las enzimas utilizadas según
las condiciones del método, es decir, es resistente a la hidrólisis, y ese hecho se utiliza para
definirla como proteína resistente.
La interpretación de la presencia de proteína en los residuos de fibra alimentaria es
controvertida. Como ya se explica en el apartadodedicado a la definición de fibra
alimentaria, algunos autores (Asp, 1987) son partidarios de incluirla como componente de la
fibra alimentaria mientras que otros se oponen a esto (Englyst y Cummings, 1988)..
Los valoresde fibra insoluble (FI) y de fibra soluble (FS) obtenidospor el métodode Asp
serepresentanen los gráficos3 y 4 paralas hortalizasfrescasy procesadasrespectivamente.
2.1.1.3.Método cromatográfico (HPLC)
Comoya seindicó en la partegeneral,Englystdefinela fibra alimentariacomopolisacáridos
no almidón (NSP). El métodopor él diseñadoen 1982, y modificadoen los años 1984 y
1988, ha sido utilizado en alimentospara el hombre,aplicándoloal análisis de un gran
332
número de alimentos, dentro de los cuales se incluyen cereales, hortalizas, frutas y frutos
secos.
Estemétodopermiteidentificar y cuantificarporcromatografíalos monosacáridosque forman
los polisacáridosno almidón que constituyenla fibra alimentaria.Se complementacon la
determinaciónde las sustanciaspécticaspor espectrofotometríacomo se detalla en la Parte
Experimental.
Las condicionesanalíticasempleadaspermitenla obtenciónde un cromatogramacuyo perfil
essemejanteen todaslas muestrasde hortalizasfrescasy procesadasobjeto de estetrabajo
(Cromatogramasdel 8 al 13).
La columna utilizada, HPX-87P de BioRad, eluye en primer lugar oligosacáridos,a
continuaciónmonosacáridosy finalmentepolialcoholes.En total sehan detectadodiez picos,
de los cualesen la región correspondientea oligosacáridossepresentantres: 1, 2 y 3, en la
zona de los monosacáridosneutrosse identifican cinco: 4, 5, 6, 7 y 8, y dentro de los
polialcoholesaparecendos: 9 y 10.
Delos trabajosencontradosen labibliografíaqueutilizan un equipodeHPLC con las mismas
condicionesaquíempleadas,Neilson y Marlett (1988)analizanmanzana,salvadode trigo,
guisantey un plato elaborado.El perfil cromatográficoque obtienenestosautorespara sus
muestraspresentatres picos antesde la glucosa,semejantesa los del presenteestudio, que
identifican como: celobiosa, celotriosa y productos de degradación de monosacáridos.
333
Cromatogramas obtenidos para los monosacáridos constituyentesde fibra alimentaria dc zanahoria por HPLC
4
9
lo
Cromatograma n’>8. Zanahoria fresca
4
13
6
9
10
3
Cromatograma n09. Zanahoria procesada
Cromatogramas obtenidos para los monosacáridos constituyentes
de fibra alimentaria de remolacha por HPLC
4
Cromatograma n’>l0. Remolacha fresca
4
1 2—-‘--y
7
9
loa
21
7
3
9
lo
Cromatograma n<’1 1. Remolacha procesada
Cromatogramas obtenidos para los monosacáridos constituyentesde fibra alimentaria de nabo por HPLC
9
Cromatograma n”12. Nabo fresco
4
9
4
1 7
10
1
7
10
Cromatograma n<’13. Nabo procesado
Se ha confirmado la identificación de celobiosa (pico n0 3) y su presencia puede ser debida
auna hidrólisis incompletadecelulosaquepodríaestaroriginadapor la presencia de regiones
más cristalinas en la molécula. El pico n0 2, aunque eluye al mismo tiempo que en el estudio
de Neilson y Marlett, no ha podido ser identificado, dadoque no existepatrón de celotriosa.
Respecto al pico n0 1, estos autores piensan que puede tratarse de productos de degradación
de monosacáridosque coeluyen al principio del cromatograma. En este trabajo se ha
comprobadoque aparecetambiénen los cromatogramascorrespondientesa la hidrólisis de
patrónesde polisacáridos(celulosa y xilano) y en los correspondientes a la mezclade
monosacáridospatrón sometidosa las mismascondicionesde hidrólisisque las muestras.
Sepuedeseñalarquela formaquepresentael pico n0 1 esmuy característica,ya quecarece
de pendiente de descenso, presentándose en su lugar una línea vertical. Este hecho se
mantiene desde el primer momento que se empieza a utilizar la columna hasta que, avanzado
el muestreo, la pérdida de resolución de la misma empieza a ser notoria.
A continuaciónse identifican los monosacáridos:glucosa(pico n0 4), xilosa (pico n0 5),
galactosa/ramnosa(pico n06), arabinosa(pico n0 7) y manosa(pico n0 8).
Despuésde los monosacáridos,en la región correspondientea los polialcoholes,el primer
pico que aparece es el eritritol que ha sido utilizado como patrón interno (pico n0 9). Más
tardese encuentraun pico (n0 10) que no figura en los cromatogramaspresentadospor
Neilsony Marlett (1983).Estáacontinuacióndel eritritol perono hapodidoseridentificado.
La celobiosay la glucosaprocedende los polisacáridoscelulósicos,si bien una pequena
proporciónde glucosapuedecorrespondera polisacáridosno celulósicos. El resto de los
monosacáridosprocedende polisacáridosno celulósicos:hemicelulosasy sustanciaspécticas.
La sumade todoséstosdaun valordepolisacáridosno almidón (NSP),propuestoporEnglyst
comodefinición de fibra alimentaria.
Con el fin de completar la investigación es interesante comentar los estudios correspondientes
a cromatografíade gases(GLC) que se han realizadoen el centro CIVO-TNO de Zeist
337
(Holanda). Se han analizado tanto las muestras frescas como las procesadas y se han obtenido
los cromatogramascorrespondientes(Cromatogramasdel 14 al 19)..
En esta técnicasólo sedetectanlos picos correspondientesa monosacáridos.El orden de
elución, como ya se dijo en la parteexperimental,es: ramnosa,arabinosa,xilosa, mio-
inositol, manosa,glucosay galactosa.
Seobservaquela resoluciónesmuy buena,separándosela ramnosacorrectamente.El tiempo
del cromatogramaeslargo, transcurriendoun periodoimportantedesdequeaparecela xilosa
hastael m-inositol. La fucosa, que apareceen algunos vegetales(Englyst y Cumrnings,
1988), no se detectacon este sistema cromatográficopara las hortalizas objeto de este
estudio. De estos cromatogramas no se puede obtener información adicional sobre celobiosa.
338
Cromatogramas obtenidos para los monosacáridos constituyentesde fibra alimentariade zanahoriapor GLC
6
Cromatograma n014. Zanahoria fresca
6
2
3
4 7
7
4
3
Crornatograma n” 15. Zanahoria procesada
Cromatogramas obtenidos para los monosacáridos constituyentesde fibra alimentariade remolachapor GLC
Cromatograma n’ 16. Remolacha fresca
6
4
7
3
2 6
7
4
3
Cromatograma n<’17. Remolacha procesada
Crornatogramas obtenidos para los monosacáridos constituyentesde fibra alimentaria<‘le nabopor GLC
Cromatograman’>18. Nabofresco
6
2
a
4
7
6
2
3
74
Cromatograma n”19. Nabo procesado
a) Estudiode monosacáridos
Los resultadosobtenidos,expresadosen g/l00 g de materiahúmeda,paracadamonosacárido
figuran en las tablas 14 y 15, y la suma total de los mismos en la tablas 16, 17,
correspondientesa las muestrasfrescasy procesadas.Sehan corregidolas pérdidassufridas
durantela hidrólisis, y paraello, seha multiplicadoel valorobtenidoparacadamonosacárido
por un factor calculadoa partir del tanto por ciento de recuperaciónde cadauno de los
patronesdespuésde la hidrólisis ácida.
En las tablas 16 y 17 se hacereferenciaa los valoresmediosy otros estadísticosgenerales
de la suma total de azúcaresneutros para las tres hortalizas, frescas y procesadas,
respectivamente.En los materialesfrescosla remolachapresentael contenido medio más
elevado,1,422+0226, a continuaciónel nabo, 1,285±0153 y, por último la zanahoriacon
los valores medios más bajos 0,979±0,168.En los productosprocesadosse mantienela
mismasecuencia,obteniéndoselos siguientesvaloresmedios,remolacha1,599±0,166,nabo
1,413+0013 y zanahoria1,149+0081
Si se refieren las concentracionesobtenidasde cada monosacáridoal valor total de los
mismos,la distribución,expresadaen porcentaje,decadamonómerofigura en los siguientes
cuadros.En las hortalizasfrescas:
Cuadro n0 1.. Distribución de monosacáridosen las hortalizasfrescas(%)..
ZANAHORIA REMOLACHA NABO
Celob¡osa 6,231 4,216 5,288
Glucosa 43,104 39,.283 55,832
Xilosa 4,494 2,600 7,154
Gal/Ram 24,208 12,790 12,286
Arabinosa 18,080 38,158 14,386
Manosa 3,882 2,881 4,977
Como puedeapreciarsepor los datos reflejados en estecuadro, la zanahoriatiene como
azúcarmayoritario la glucosa,seguido de galactosa/ramnosay arabinosa,y proporciones
342
inferioresdecelobiosa,xilosay manosa.
En la remolachapredominanglucosay arabinosaque alcanzanporcentajessimilares; en
cantidadesmásbajasseencuentranla galactosa/ramnosay, finalmente,celobiosa,manosay
xilosa con contenidosmáspróximos.
Los resultadosobtenidosen el nabo indican un elevadocontenidode glucosacon respectoa
los demásazúcares;concentracionesmuy similaresy sensiblementeinferiores de arabinosa
y galactosa/ramnosa,y en proporcionesmásescasasaparecenxilosa, celobiosay manosa.
En las hortalizas procesadas los porcentajes son:
Cuadro n0 2. Distribución de monosacáridos en las hortalizas procesadas (%).
ZANAHORIA REMOLACHA NABO
Celobiosa 5,570 5,000 5,635
Glucosa 36,989 40,188 60,057
Xilosa 3,742 3,000 7,418
Gal/Ram 27,241 11,813 10,128
Arabinosa 23,499 36,125 11,912
Manosa 2,959 3,813 4,280
Apareceuna situaciónmuy semejantea la observadaen las muestrasfrescas, si bien las
proporcionessemodifican,semantieneexactamenteel mismo orden de participaciónde los
azúcaresen las tres hortalizas.
Los resultadosobtenidosparacadauno de los monosacáridosse representanen los gráficos
5 y 6 para las hortalizasfrescasy procesadas,respectivamente.
b) Estudiode los uolisacáridos
Paraexpresarlos monosacáridosen forma de polisacáridosse multiplican por un factor que
corrigela pérdidade aguay cuyo valor esde 0,90 parahexosasy 0,88 parapentosas.
343
Losvaloresmediosde polisacáridoscelulósicos,no celulósicosy la sumade ambosobtenidos
en cada hortaliza, tanto frescas como procesadas,figuran en las tablas 22 y 23,
respectivamente,y los estadísticosgeneralesen las tablas24 y 25.
Considerandoel valor total se puede conocer qué tanto por ciento representan los
polisacáridoscelulósicosy los no celulósicos.Para los materialesfrescosse obtienenlos
siguientesporcentajes:
Cuadro n0 3.. Distribución de polisacáridos celulósicosy no celulósicosen las hortalizas frescas (%)
ZANAHORIA REMOLACHA NABO
Polisacáridoscelulósicos
Polisacáridosno celulósicos
49,773
50,227
44,025
55,975
61,558
38,442
Se observa que cada hortaliza presentauna relación diferente entre los polisacáridos
celulósicosy no celulósicos.El nabo, que tiene histológicamenteun crecimientosecundario
normal, presenta una mayor proporción de polisacáridos celulósicos, prácticamente el doble
de los polisacáridos no celulósicos.. A estos resultados contribuye la gran proporción de
glucosa, y la escasa cantidad de arabinosa en relación con la remolacha y de
galactosa/ramnosaen relación con zanahoria.
En zanahoriay remolacha,de crecimientosecundarioanómalo, sepresentauna situación
diferente a la anterior, predominan los polisacáridos no celulósicos frente a los celulósicos;
mientrasqueen la zanahoriano hay gran diferenciaentreambasfracciones,en remolachaes
más importantela proporciónde polisacáridosno celulósicosrespectoa los celulósicos.
En los materialesprocesadoslos porcentajescalculadosson los siguientesfiguran en el
siguientecuadro:
344
Cuadro n0 4. Distribución de polisacáridos celulósicos y no celulósicosen las hortalizas procesadas (%).
ZANAHORIA REMOLACHA NABO
Polisacáridoscelulósicos
Polisacáridosno celulósicos
4 1,380
58,620
45,772
54,228
65,747
34,254
Sededuceque las proporcionesentre estoscomponentessemantienencon respectoal caso
anterior. En el nabo predominael porcentajede polisacáridoscelulósicos sobre los no
celulósicos,y en el casode la remolachay la zanahoriala proporcióndepolisacáridosno
celulósicos es superior a la de celulósicos.
Comoya seseñalabaanteriormente,los polisacáridoscelulósicospuedenserevaluadoscomo
la suma de celobiosay glucosa.Si se admite el total de polisacáridoscelulósicosde esta
forma se puededeterminaren qué tanto por ciento seencuentran la celobiosa y la glucosa
dentrodel total. Paralas hortalizasfrescas:
Cuadron0 5. Distribución de celobiosay glucosaen los polisacáridoscelulósicosde las hortalizas frescas (%).
ZANAHORIA REMOLACHA NABO
Celobiosa
Glucosa
13,242
86,758
10,178
89,822
9,142
90,858
En general,las proporcionessonsimilaresparalas treshortalizas,si bienel mayorporcentaje
de celobiosadentrode los polisacáridoscelulósicoslo presentala zanahoria,a continuación
remolachay, por último, nabo.
Paralas hortalizasprocesadas:
345
Cuadro n0 6: Distribución de celobiosay glucosaen los polisacáridos celulósicosde las hortalizas procesadas(%)..
ZANAHORIA REMOLACHA NABO
Celobiosa
Glucosa
13,740
86,260
11,603
88,397
9,004
90,996
Las proporciones son semejantes a las muestras frescas, oscilando el porcentaje de celobiosa
de entreun 9 y un 14% del total de los polisacáridoscelulósicos.
La distribución de polisacáridos celulósicos y no celulósicos, indicando la composiciónde los
primeros, se representanen los gráficos7 y 8 para la zanahoriafrescay procesada,9 y 10
para la remolachafrescay procesada,y II y 12 para nabo fresco y procesado.En los
gráficos del 13 al ¡8 se refleja la misma distribución pero mostrando,en estecaso, la
composiciónde los polisacáridosno celulósicos.
Dentrode los polisacáridosno celulósicosseconsideranlos siguientesmonosacáridosneutros:
xilosa, galactosa/ramnosa,arabinosay manosa.La proporciónde cadauno de ellos respecto
al total, en las muestrasfrescases:
Cuadro n0 7.. Distribución de monosacáridos en los polisacáridosde las hortalizas frescas (%).
no celulósicos
ZANAHORIA REMOLACHA NABO
Xilosa 8,824 4,635 18,243
Gal/Ram 48,190 23,034 31,982
Arabinosa 35,294 67,135 36,712
Manosa 7,692 5,197 13,063
Los monosacáridosque se encuentranen proporcionesmás elevadasen
materiales son galactosa/ramnosay arabinosa.. En zanahoria el
galactosa/ramnosa es superior al de arabinosa. En remolacha y nabo es
arabinosa, invirtiéndose las proporciones con respecto a la zanahoria, siendo
los diferentes
porcentaje de
mayoritaria la
los porcentajes
346
departicipaciónmásdistantesen el caso de remolacha.
Por la bibliografía se conoce que los monosacáridosramnosa y galactosaproceden
fundamentalmentede sustanciaspécticas,y si se considerael porcentajededichassustancias,
expresadoen ácido galacturónico,que figura en las tablas26, 27, 28 y 29, se observaque
la zanahoriaes la muestraque presentaun valor másalto.
Con respecto a la relación galactosa/ramnosa,si se tienen en cuenta los datos de
cromatografíagaseosa(Tablas20 y 21) la proporciónde galactosarepresentaun 90,064%
dentrode la mezclade galactosa/ramnosay la ramnosaun 9,935%en la zanahoria;en la
remolacha,80,909%y 19,091% yen nabo82,114% y 17,886%.
La xilosa y la manosason azúcares minoritarios, sobre todo en remolacha y en zanahoria,
estandoen el nabola proporciónmásequilibradacon respectoal restodelos monosacáridos.
No obstante,la manosaestá en proporcióninferior a la xilosa en zanahoriay nabo, y en la
remolachaligeramentesuperior.
En lo que a los procesadosserefiere, los porcentajescalculadosson:
Cuadron0 8. Distribución demonosacáridosen los polisacáridosno celulósicosde las hortalizas procesadas (%).
ZANAHORIA REMOLACHA NABO
Xilosa 6,040 5,412 24,654
Gal/Ram 44,831 21,907 28,802
Arabinosa 44,190 65,593 33,871
Manosa 4,930 7,088 12,673
En zanahoria,los porcentajesde galactosa/ramnosay de arabinosason muy semejantesentre
sí y muy elevadosrespectoa xilosa y manosa.En remolachadestacala superioridadde la
arabinosa,en menorproporcióngalactosa/ramnosa,y las diferenciasde contribuciónde la
xilosa y manosarespectoa la arabinosason bastanteimportantes.En nabo, la participación
347
de arabinosa,galactosa/ramnosay xilosa esbastanteparecida,siendola manosala que más
sedistancia,si bien las diferenciasno son tan acusadascomo en las muestrasanteriores.
Según los datos obtenidospor cromatografíade gases(Tablas20 y 21), el porcentajeque
galactosay ramnosarepresentandentrode la mezclade estosdos azúcareses el siguiente:
zanahoria,90,341% y 9,659%; remolacha,83,665% y 16,335%,y nabo, 85,926% y
14,074%.
El valor que Englyst considera de fibra alimentaria es el que corresponde a la suma de
celulosa,hemicelulosasy sustanciaspécticasqueforman los polisacáridosno almidón (NSP)
y que se discutirá en el apanado correspondiente a fibra total.
c) Comparación de los resultados obtenidos de fibra alimentaria por cromatografía y
métodos2ravimétricos
Puesto que el método neutro detergente no indica la determinación de sustancias pécticas,
para comparar los valores obtenidoscon los correspondientesal método de HPLC se
considera en este caso la suma de polisacáridos celulósicos y polisacáridos no celulósicos. El
nivel de significaciónestablecidoparalas diferenciasencontradasesde a= 0,05.
Al compararFND con la sumade polisacáridos,seobservaque en el casode los materiales
frescos,las diferenciasson estadísticamentesignificativas. Sin embargo,en el caso de los
procesados hay diferencias estadisticamente significativas en la zanahoria, pero en la
remolachay el nabono se han encontradodiferenciasentrelos valorescorrespondientesa
cadauna de ellas.
Lasdiferencias,en los casosen quesepresentan,son lógicasdadoque en el FND seincluye,
en principio, lignina. Se podríaindicar una mayorproporciónde lignina en los materiales
frescosqueen los materialesprocesadosasí como la presenciade determinadoscompuestos
retenidospor el residuoFND: sustanciaspécticas(Redondoy col., 1990; Wolters y col.,
1992), almidón (Wolters y col, 1992) y proteína (Redondo y col., 1990). Ademáses
importanteteneren cuentaque HPLC es un métododirecto que permite la cuantificación
348
individual de componentes,mientrasque FND esuna gravimetría.
En los casosen que se presentaigualdadse podría comentarla existenciade una menor
proporción de lignina en el FND y una menor presencia de otros componentes que
contaminanel FND.
Al realizarla comparaciónentrelos valoresdehemicelulosasobtenidoscomodiferenciaentre
FND y FAD y los obtenidospor HPLC seobservaque, en los materialesfrescosno hay
diferenciaestadísticamentesignificativa para zanahoriay remolacha,siendo diferenteslos
valoresdeambasmetodologíasparael nabo.En los procesadosla comparacióndalos mismos
resultados.
Con repecto a la comparación de los resultados obtenidos por HPLC y por el método
enzimáticoparaFI se observaque,apesarde la controversiaexistenteentrelos dos métodos
en cuanto a las sustancias cuantificadas por cada uno de ellos, los resultados obtenidos no dan
diferencias estadísticamente significativas para los materiales de zanahoria fresca y de las tres
hortalizasprocesadas.En remolachay nabo fresco no hay evidenciade que los resultados
obtenidos por ambas metodologías sean iguales. Las diferencias podríanjustifícarseen
función de la presencia de determinados compuestos en el residuo FI.
Ahora bien, no sólo cabe hablar en términos de dificultades para eliminar determinados
compuestos interferentes, también se puede pensar, aunque esto no parece que sea probable,
en una cierta actividad hemicelulásicade las enzimasempleadasen el método de Asp
(Theander,1990),y de unaciertasolubilizacióndecompuestoscomola lignina porpartede
la solución detergenteneutra. Estos fenómenos,sobre todo el último, de magnitud
desconocida en las muestras estudiadas, puede tener alguna importancia a la hora de hacer
la comparacion.
349
2.1.1.4.Método espectrofotométricopara sustanciaspécticas:3,5-dimetilfenol
Como ya se indicó en la parte experimental, se ha realizado una modificación del método
propuestopor Scott en 1979.
En una soluciónácidafuerte los carbohidratossufrenreaccionesde condensacióncon gran
número de sustancias dando productos coloreados que se pueden medir
espectrofotométricamente.El 3,5-dimetilfenol es un reactivo altamenteselectivopara el
compuestoque se forma al tratar el ácido urónico con ácido sulfúrico: 5-formil-2-
furancarboxialdehído(5FF),en presenciade los productosde reaccióndehexosasy pentosas.
Este fenol presenta además de elevada selectividad una buena sensibilidad.
Los valores de ácido galacturónico (g/l0O g materia húmeda) obtenidos para las hortalizas
frescas figuran en las tablas 26 y 28, y los obtenidos para las procesadas figuran en las tablas
27 y 29.
El análisis de las hortalizasfrescasofrece unosvaloresmediosmuy próximos entresí.. La
zanahoriapresentalos másaltos 0 545+0,017,seguidade remolacha,0 400+0049, y nabo,
0,339+0012. En el caso de las hortalizasprocesadaslas cifras mediasobtenidashan sido:
zanahoria,0 470+0042; remolacha,0,312+0 022 y nabo: 0 253 ±0018.
Si se comparanestadisticamenteestos resultadoscon los obtenidosparaFS seobservaque
en zanahoriay nabofrescosambosvaloresson igualesmientrasque, en remolachafresca y
en los tres procesadosdifieren significativamente.
En los casosen que hay diferenciassiemprela fibra soluble (FS) es superior al valor de
sustanciaspécticasdeterminadoespectrofotométricamente(SP). El resultadode SPrepresenta
un porcentajevariabledel valor de FS que figura en el siguientecuadro:
350
Cuadro n0 9. Porcentaje de SP en SF en las hortalizas frescas y procesadas.
FRESCO PROCESADO
Zanahoria
Remolacha
Nabo
70,413
42,614
58,651
36,637
25,041
29,225
La superioridadde ES sobreSP sedebea la presenciade otros compuestosdistintosde las
sustanciaspécticas, como proteinas, que precipitan con etanol y se valoran como fibra
soluble.
2.1.1.5.Estudiode los valoresde fibra total
Los resultados obtenidos para la discusión de este apartado, expresados en g/l00 g de materia
húmeda,paralas muestrasfrescasy procesadas,serecogenen las tablas30, 31, 32 y 33.
a) Estudiode los valoresde FND + SP
Los métodos detergentes no suponen la determinación de fibra total y para suplir este
inconvenientesehan sumadolos valoresde FND y los de sustanciaspécticas(SP).
En las hortalizasfrescas los resultadosson muy próximos entre sí, correspondiendoa la
remolacha los valores más elevados: 2,657+0 264, seguida de zanahoria: 2,465+0 128 y,
por último nabo: 2,008+0 156. En las hortalizas procesadas, nuevamente la remolacha
presentalos resultadosmásaltos’ 2 284+0,274,a contintíaciónel nabo’ 1 947+0,219 y, por
último la zanahoria:2 110+0023.
El porcentaje de sustancias pécticas dentro del valor total de fibra considerado como
FND+SPrepresentaen los materialesfrescosel 20,305% en zanahoria,15,368%en nabo
y 14,388%en remolacha.En el casode los procesadoslos porcentajesson: 20,184%para
zanahoria,16,305%pararemolachay 15,309%para nabo.
351
De las proporcionesanteriormentecomentadasse observaque la mayor contribución de
sustanciaspécticasal valor de fibra total correspondea la muestracuyo valor de SP esmás
elevado y el menor a la muestracuyo valor de SP es el más bajo para el caso de los
materialesfrescos.En el casode los procesadosocurrelo mismo.
b) Estudio de los valores de FT
Los valoresdeFT se obtienenmediantela sumade FI y FS. Por lo dicho hastael momento
se puede deducir que el valor más elevado de FT lo presentaremolacha (fresco =
3,354+0198, procesado = 3 345±0,476), a continuación zanahoria (fresco =
2,027+0 176, procesado = 2,626±0 102) y nabo (fresco = 2 023+0,182, procesado =
2,273±0,177).
c) Comparaciónde los valoresde FI con FND±SP
Cuandose comparanlos valoresde FT con FND+SPpara un nivel de significaciónde a
0,05 seobservaque las diferencias entre dichas metodologías están en función de la muestra
que seanalice.En la zanahoria,los valoresde FND+SPobtenidosen las muestrasfrescas
son significativamente superiores a los FI, mientras que en las procesadas las diferencias no
son significativas; en la remolacha, ocurre lo contrario, ya que los valores de FND+SPson
significativamenteinferioresa los de FT, tanto en las muestrasfrescascomo procesadas.
Finalmente,en el nabose obtieneigualdadde mediasentrelos valorescalculadosporambos
métodos,tanto en el material fresco comoprocesado.
d) Comparaciónde los valoresde FT con FAD
De la valoraciónde los resultadosobtenidosporambosmétodosse observa,comoeslógico,
quehay diferenciasestadísticamentesignificativas(a= 0,05)en todos los casos,exceptoen
la zanahoriafresca.
e) Comparaciónde los valoresde FI con FND
Algunos autores comparan los valores de FT con los valores de FND para evaluar el
comportamientode estasdos metodologías.En el estudiopresentela comparaciónseñala
diferenciassignificativas(a= 0,05)en todaslas muestrasexceptoen la zanahoriafrescaen
352
la que seha encontradoigualdadde medias.
Visser y Gurnsay(1986)analizannumerosashortalizasy frutas porel métodode la AOAC
(TDF) y por el método neutro detergente obteniendo resultados poco concluyentes. Así, en
algunas muestras(melocotón, nectarina,albaricoquey cereza) los valores de TDF son
superioresa FND, mientrasque en otras (manzanasde diferentesvariedades,tamarindo,
feijoa, kiwi, guisante,judía verde, maíz y cebolla)seobservalo contrario.
Redondoy col. (1987)estudianel contenidode fibraalimentariaen berenjenay calabacínpor
el métodode Asp y por el métodoneutrodetergente.En ambasmuestrasel valor de FT es
superioral valor de FND.
O Comparaciónde los valoresde FT y NSP
Parahacerestacomparación,sesumana los valoresde los polisacáridoscelulósicosy no
celulósicos,obtenidosporHPLC, y los de sustanciaspécticasparaobtenerNSP. Los valores
de FT son siempre superioresa los de NSP. Se observan diferenciasestadísticamente
significativas(a= 0,05)paratodos los casos,exceptoen remolachaprocesada.
Las diferencias,aparte de todos los comentariosanteriores,se puedenatribuir a la gran
variaciónque existeen el valor de sustanciaspécticasdeterminadaspor el métodode Asp
(ES) y por el métodoespectrofotométríco(SP).
La comparación de los valores de fibra total, obtenidos por distintos métodos, se representa
en el gráfico 19 para las hortalizasfrescasy en el 20 para las procesadas.
Finalmente,al compararlos estadísticosRSD (Tablas32 y 33), expresadosen coeficientes
devariación(CV), obtenidosen la determinaciónde fibra alimentariatotal por los diferentes
procedimientosanteriormentemencionadosen las distintashortalizas,se compruebaqueen
los materiales frescos la metodología que ha supuestomayor variabilidad ha sido la
cromatografíalíquida dealta eficacia: zanahoria,CV= 21,00%; remolacha,CV= 25,60%;
nabo, CV= 17,10%, frentea los otros dosprocedimientosen donde los valoresoscilanen
353
un intervalode coeficientesdevariacióncomprendidoentre9,00 y 17,20%.Sin embargoen
los procesadosla menordispersiónprocededel mismo métodode análisis: zanahoria,CV =
3,90%; remolacha,CV= 1,78%; nabo, CV 1,40%,frentea las otrasdeterminacionesen
las quelos intervalosde variabilidad alcanzanvaloresdel 24.60%.
2.1.2.. Estudiode los resultadosobtenidospara azúcaressolubles
2.1..2.1.. Método cromatográfico(HPLC)
El método de HPLC, a diferencia del método colorimétrico que se verá a continuación,
permite la separaciónde los azúcaressolublespresentesen las muestras.Las hortalizas
estudiadassecaracterizanporpresentaren todos los casosfructosa,glucosay sacarosa.
Las condicionescromatográficasutilizadaspermitenobtenerun perfil cromatográficopara
cadauna de las muestrasestudiadasque figura en los cromatogramasn020al 25.
En las tablas34 y 35 figuran los valores obtenidospara
húmeda)asícomo el valor total en las hortalizasfrescasy
las tablas36 y 37 se representanlos estadísticosde dichos
estos azúcares(gI 100 g materia
procesadas,respectivamente.En
valores.
Los valorestotalesobtenidosmediantela sumade azúcares,sondiferentesen cadahortaliza.
354
Cromatogramas obtenidos para azúcares solubles de zanahoria por HPLC
3
Cromatograma n~~20. Zanahoria fresca
3
Cromatograrna n”21. Zanahoria procesada
Cromatogramas obtenidos para azucares solubles de remolacha por HPLC
3
2
Cromatograma n<’22. Remolacha fresca
1
3
2
1
Cromatograma n”23. Remolacha procesada
Cromatogramas obtenidos para azúcares solubles de nabo por HPLC
12
Cromatograman<’24. Nabofresco
2
3
1
3
Cromatograman”25. Nabo procesado
En los materialesfrescosel valor máselevado lo presentala remolacha:7,295±1,016,a
continuación la zanahoria: 2,972+0346 y, por último el nabo: 2 720+0280. En los
procesadoslas diferenciasentrelas muestrasson menores,pero cuantitativamentesesigue
el mismo orden, remolacha:4,688±0,106,zanahoria:3,362±0,103y nabo: 1,777+0243.
El estudiode las cantidadesdecadauno de los monosacáridospresentesen el valor total de
azúcaresmanifiestauna distribución característicapara cadahortaliza, En las hortalizas
frescaslos porcentajesde contribución figuran en el siguientecuadro:
Cuadron0 10. Distribución de azúcaressolublesen las hortalizasfrescas (%).
FRUCTOSA GLUCOSA SACAROSA
Zanahoria
Remolacha
Nabo
18,200
l,..867
39,771
24,680
6,597
52,484
57,120
91,537
7,516
Los monosacáridos fructosa y glucosa se encuentran en proporción más próxima en las tres
hortalizasrespectoa la cantidadde sacarosaque siempreestádistanciada.En zanahoria,la
sacarosaes el azúcar predominante, seguido de glucosa y fructosa. En la remolacha la
fracción de monosacáridossolublesestápracticamenterepresentadapor sacarosa,mientras
que la glucosay la fructosase encuentranescasamenterepresentadas.Finalmenteel nabo
ofrece un contenido mayoritario de glucosa y fructosa, frente a la contribución minoritaria
de la sacarosa.
Es de destacarel hecho de que remolachay nabo representansituacionesexactamente
contrapuestas.Pararemolachala sacarosaseencuentraen un 91,536%mientrasque la suma
de fructosay glucosarepresentaun 8,464%.Parael nabo la sacarosarepresentaun 7,516%
y la sumade fructosay glucosaun 92,255%.
La zanahoriatiene una situaciónintermediaentreambosal encontrarsemás equilibradaen
la distribución mencionadade los azúcares(sacarosa,57,120% y la suma de glucosa y
fructosa,42,880%).
358
Con respectoa la relación (r) entre glucosa y fructosa, expresadacomo cocienteentre
glucosa/fructosa,cabeseñalarque la primeraofrecevaloressuperioresa la segunday por
tanto (r) serásuperiora 1. En cadahortalizaseobtieneuna relación distinta, elevadaen la
remolacha(r = 3,54) y muy parecidaen la zanahoriay el nabo (r = 1,35 y r = 1,32).
En las honalizasprocesadasla distribución de los diferentesazúcaresen el contenidototal,
expresadoen tanto porciento, figura en el siguientecuadro:
Cuadro n0 11. Distribución de azúcaressolublesen las hortalizas procesadas(%).
FRUCTOSA GLUCOSA SACAROSA
Zanahoria
Remolacha
Nabo
17,936
1,813
39,111
23,260
5,695
55,768
58,834
92,492
5,121
En este caso, los porcentajes de contribución obtenidos reflejan una situación semejante a la
de los materialesfrescos.La sacarosaalcanzaunarepresentatividadmáximaen la remolacha
y muy escasa en nabo, mientras que fructosa y glucosa contribuyen con proporciones más
elevadas en el nabo e inferiores en la remolacha. Por último, en la zanahoria la distribución
de los azúcaresesmásequitativa.
La comparacióndelos valoresde azúcaressolublesobtenidosporHPLCen las treshortalizas
frescasserepresentanen el gráfico 21 y en las tres hortalizasprocesadasen el 22.
2.1.2.2. Método espectrofotométrico: ferricianuro potásico
Estemétodo (Gaines,1973)permite obtenerun único valor, que correspondea la sumade
los azúcares libres. Los valores obtenidos (gIl 00 g materia húmeda)para zanahoria,
remolachay nabo se reflejan en las tablas 38 y 39, para producto fresco y procesado
respectivamente,y los estadísticosgeneralesen las tablas40 y 41..
359
En los materialesfrescos,la cuantificaciónde azúcarespor estemétododa como resultado
un contenidomáximo en remolacha7,143+1 091 a continuaciónzanahoria4,884+0260 y,
por último, nabo 2,648±0,391.En los procesadosse sigue el mismo orden: remolacha
4,718+0265; zanahoria3,430±0,298y nabo 1,746+0305.
2.1.2.3.Comparaciónde los resultadosobtenidospara azúcaressolublespor el método
de HPLC y por el método del f’erricianuro potásico
Cuandose comparanestosvaloresse observaqueno hay evidenciapararechazarla hipótesis
de igualdad de medias de los resultados obtenidos por los dos métodos en todas las muestras
tanto frescas como procesadas. Es decir, la determinación de azúcares solubles totales por
cualquierade estosmétodosofreceresultadossemejantespara un nivel de significación de
a 0,05.
Las desviaciones estándar relativas, expresadas en tanto por ciento (CV), obtenidas para las
mediasde los tres lotes de cadahortaliza, según los dos métodosempleados(HPLC y m.
ferricianuro potásico) son en los materiales frescos, zanahoria: 12,00% y 9,20%, en
remolacha:24,10%y 26,50%,y en nabo: 17,80% y 25,60%.En los materialesprocesados,
zanahoria:5,30%y 15,00%,remolacha:3,90%y 9,70%,y nabo:23,60%y 30,30%.Como
puedeobservarsela variaciónesmenor, en general,en el casodel método cromatográfico.
Los resultadosde los azúcaressolubles en las tres hortalizas frescas y procesadasse
representanen los gráficos23 y 24.
360
2.2. COMPARACION DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS EN LAS
HORTALIZAS FRESCAS Y EN LAS PROCESADAS
El estudioestadísticode los resultadosobtenidosen las hortalizasfrescasy en las procesadas
se lleva a caboaplicandoel análisis de la varianza(ANOVA), estableciendoun nivel de
significaciónde a= 0,05. Los valoresde p-valueencontradosfiguran en el anexoII, de los
resultados.
2.2.1. Expresiónde los resultados
La comparaciónde los resultadosobtenidospara fresco y procesadose puedehacer
considerandodichos resultadosexpresadosen g/l00 g de materia secao en g/100 g de
materiahúmeda.
En cualquierade los dos casosse ha de tener en cuentaque fresco y procesadoson dos
materialesdiferentesaunqueprocedande la misma muestra.En el procesado,apartede las
modificacionesya señaladasen el capítulocorrespondiente,se observaque tiene lugar una
solubilizaciónde ciertoscomponentesy variacionescuantitativasde la humedadrespectoal
material fresco.
A continuaciónsepuedenobservarlas pérdidasde algunoscomponentesen las hortalizas
procesadasrespectoa las frescas,considerandola mediade los tres lotes:
Cuadro n0 12. Porcentaje de pérdidas de distintos componentesen las muestras procesadas
Cenizas Proteínas Azúc. Solubles S. Pécticas
Zanahoria
Remolacha
Nabo
24%
13%
42%
43%
30%
11%
32%
36%
35%
14%
22%
25%
361
Una mismacantidaddecualquiercomponenteque no ha sufrido pérdidaspor solubilización
aumenta,proporcionalmentea la pérdidatotal de sólidos, en la muestraprocesaday se
originaun incrementode su concentraciónrespectoa la muestrafresca.Si la concentración
de los componentessemodificano sepuedenevaluarlas variacionesde una formacorrecta
si no seconsideranlas pérdidasde sólidos que sufre la muestraprocesada.
Es necesario,por lo tanto, aplicarun factora los resultadosobtenidosen los procesadosque
corrija el incrementoaparentede algunoscompuestosdebidoa la pérdidade sólidosen el
aguade cocción.
2.2.1.1.Cálculo del factor de corrección
Pararealizarla correcciónsemultiplican los datosobtenidosen el procesado(expresadosen
g/100g de materiaseca)porun factorcorrespondientea lapérdidade sólidos solublesy que
secalculacomoseindica a continuación..
Separtedecantidadesigualesde muestraparael frescoy para el procesado.Sin embargo,
despuésdel tratamientose observaque hay una modificación en el peso así como en la
humedaddel procesadocon respectoal fresco.Utilizandolos pesosdel material fresco(PT1Ú
y del material procesado(PT~), asícomo las humedadesde cadauno de ellos (H1 y H1..), se
puedeconocerla cantidadde materiasecaque les corresponde,respectivamente.
Seobservaquela cantidadde sustanciasecapresenteen el pesototal de la muestraprocesada
essiempreinferiora la cantidadexistenteen el fresco,referidosambosal mismopesoinicial.
Esto indica la solubilización de algunos componentesen el aguade cocción duranteel
tratamiento.
Conociendo la materia seca del fresco y del procesado se puede calcular la relación que existe
entre ellos y el factor por el que hay que multiplicar los resultadosobtenidosen el procesado
para que sean comparablescon los del fresco. El factor de corrección (F) se calcula
362
atendiendoa la siguientefórmula:
PT~. (100 - H~)
PTF . (100 - H~)
donde:
PT~ = Pesototal del procesado
PTF = Peso total del fresco
= Humedaddel procesado(g/100 g)
HF = Humedaddel fresco(g/l00 g)
Paracomprobarexperimentalmentelos valoresde los factoresde corrección así calculados
sedeterminael residuosólido presenteen los líquidosde cocción. Estadeterminaciónpermite
obtenerel pesode los sólidos solublescedidospor la muestraprocesadadurantela cocción.
Si estepesose sumaal total del procesadoy serefieren los cálculosa estenuevovalor, los
resultadosobtenidos son iguales a los que se alcanzandespuésde utilizar el factor de
corrección.En el cuadronúmero13 semuestranalgunosejemplosde datosdel procesadoen
relaciónal frescosin corregiry unavezmultiplicadosporel factorde corrección.Los valores
de los factoresde correcciónaplicadososcilanen un intervalode 0,57a 0,73parazanahoria,
0,53 a 0,96 pararemolachay 0,62 a 0,68 paranabo.
Finalmente,para expresarlos resultadossobre materiahúmedase considerala humedad
deteminadaen el producto antesde ser sometido al tramientotérmico. Así se evitan las
diferenciasdebidasa la mayoro menorpresenciade aguaen las muestras.La expresiónde
los resultadosderivadade los cálculos mencionadospermite estableceruna compañaración
real entrelos componentesdel productofresco y los del correspondienteprocesado.
A continuaciónse muestranalgunosejemplosde datosdel procesadoen relaciónal frescosin
corregiry una vez multiplicadospor el factor de corrección:
363
Cuadro n0 13. Porcentaje de FND, FI’ y NSP expresadoen materia seca en lashortalizas frescasy en las procesadasantesy despuésde aplicar el factor de corrección.
Fresco Procesado
No Corregido Corregido
FND g/100 g ni. seca
18,328 20,742 14,036Zanahoria
Remolacha 16,076 19,531 14,024
Nabo 20,060 25,616 20,062
FI’ gibO g ni. seca
19,132 32,743 21,984Zanahoria
Remolacha 24,784 34,433 25,050
Nabo 23,845 37,668 26,632
NSPgIlOO g m. seca
10,587 18,063 12,145Zanahoria
Remolacha 12,159 18,147 12,739
Nabo 15,493 22,186 15,848
FND FibraNeutroDeter~eute;FT = FibraTotal (métodode AsÑ;NSP = PolisacáridosNo Almidón (métodode Englyst)
2.2.2. Comparación de los valores de humedad obtenidos en fresco y en procesado
Los valorescorrespondientesala humedad,expresadosen g/ 100 g, seencuentranen la tabla
1. El análisisde varianzademuestraque no existendiferenciasentrelas muestrasfrescasy
procesadas,para el nivel de significación establecido(a= 0,05), en remolacha(fresca=
86710+1 074, procesada= 90327+1196) y nabo (fresco= 90,487+1 240 procesado=
93 320+0 174). En el caso de la zanahoria (fresca= 89,421±0,760,procesada=
91 969+0233), las diferenciassi son significativas.
El ligero incrementoque se observaen las muestrasprocesadasse debe, lógicamente,al
tratamientotérmico en el senode agua.
364
2.2.3. Comparaciónde los valoresde fibra alimentariaen las muestrasfrescasy en las
orocesadasobtenidospordiferentesmétodos
Paraestudiarlas diferenciasfresco-procesadolos datos se agrupanuna vez másen función
de los métodosanalíticos:
- Métodosdetergentes
- Método enzimático-gravimétricode Asp
- Método cromatográfico(HPLC)
- Método espectrofotométricoparala determinaciónde sustanciaspécticas:
3,5-dimetilfenol.
La división por metodologíasseha preferidoa la clasificaciónpor los componentesquese
determinanen cadacaso porque los resultadosdifieren en función del fundamentode los
distintosmétodosanalíticos.
Para estudiar la influencia del tratamiento, y poder establecer la variabilidad de
comportamientodelas diferentesmuestras,se utiliza el parámetro‘Retención”.La retención
(R), expresadaen tanto por ciento, refleja la pérdidao gananciade cadacomponentedel
material procesadorespectoal fresco,al que se le atribuyeel valor 100%,de tal formaque
un porcentajeinferior a 100 indica pérdidasy un valor superiora dicha cifra incrementos
despuésdel tratamientotérmico.
Esteparámetrosecalculaa través de la siguientefórmula:
% Procesadoloo
% Fresco
g/l00 g m. húmeda
365
2.2.3.1.Métodos detergentes
Los resultadossepuedencompararteniendoen cuentalos residuosFAD y FND obtenidos
al aplicar lascorrespondientesmetodologíaso bien despuésde eliminar la proteínaresidual,
FAD-proteina y FND-proteína.Por afinidad con el apartadoanterior de la discusión se
comparanlos valores correspondientesa los residuoscon la proteínaque quedaen ellos,
segúnindicanlos métodos.Los resultadosse expresanen g/l00g demateriahúmeda(Tablas
42, 43 y 44).
a) Comparaciónde los resultadosparaFAD
En general,los valoresobtenidosparaFAD en las hortalizasprocesadasson inferioresa los
que seobtienenen las frescas,exceptoen el lote 1 de zanahoriay en el lote 2 de nabo, donde
se produceun ligero incremento(Gráficos29,30 y 31).
Secompruebala homogeneidadcon quelos tratamientostérmicos(1, II y III) inciden en cada
uno de los lotesde remolachay naboal calcularsecoeficientesde variacióninferioresal 10%,
si bien, en la zanahoria,la variabilidad de los resultadoses superior a las hortalizas
anteriores:
Cuadrou0 14. Coeficientesde variación(%) obtenidosa partir de los resultadosde los tratamientos1, II y III aplicadosa cada lote.
ZANAHORIA (CV) REMOLACHA (CV) NABO (CV)
Fresca Procesada Fresca Procesada Fresca Procesada
Lote 1
Lote 2
Lote 3
1,867
8,420
13,534
19,289
10,816
13,106
6,298
13,709
5,866
4,826
7,359
1,095
5,856
7,142
6,879
2,378
4,675
3,440
testadfstieo obtenido a partir de los resultados de los tratamientos 1,11 y III de cada lote
Las pérdidas debidas al procesado en la fracción FAD de las distintas hortalizas (Tabla 75),
considerandoel valor medio total, quedanreflejadasen las siguientesretenciones:nabo,
94 293+9488, zanahoria,92,259+8276, y remolacha,79,662±7,351.En la remolachala
366
retención es sensiblemente inferior a la calculada para nabo y zanahoria, lo que indica que
el tratamientotérmico ha sido más agresivoen este caso. Para el nivel de significación
establecido(a= 0,05), lasdiferenciasencontradasno son estadísticamente.significativas.
Una retención inferior a 100% se puede justificar en base a la solubilización, duranteel
procesado, de ciertos componentes que pudieran encontrarse asociados al FAD, como
sustancias pécticas, proteínas y hemicelulosas.Esto permitiría hablarcon mayorpropiedad
de un residuo FAD más estrictamenteformado por celulosay lignina en el caso de los
materiales procesados. Se puede indicar que la remolacha, que es la hortaliza que sufre
mayores pérdidas, es la que presentaun contenidosuperiorde hemicelulosas.
El tratamiento puede afectar a la celulosa de manera que se altere la distribución y proporción
de las regionesamorfasdela moléculay queéstasseansolubilizadasporel ataquedetergente
ácido.
Se compruebaque la variabilidad de comportamientoque experimentala fracción FAD por
la cocción es muy similar en todos los materiales,comose deducede los coeficientesde
variación calculados para las retenciones: zanahoria, CV=15,538%, remolacha,
CV=15,983%,y nabo, CV=17,430%(Tabla 75).
Al estudiar,en los trabajospublicadospordiferentesautores,cómose modificael valor de
FAD por la coccióna presión,seobservaque,porun lado, son muy escasosy, porotro, no
se detalla la forma en que se realizan los cálculos lo que hace aún más difícil la comparación
y el estudiodelos resultados.Esteúltimo hechoserepitea lo largode todaslas metodologías
que van a sercomparadas.Los resultadosobtenidosestánde acuerdocon los de diferentes
autoresparaestasmismashortalizas(Herranzy col., 1981; Herranzy col., 1983).
b) Comparación de los resultadosobtenidosparaFND
Los valores obtenidos en las hortalizas procesadas son más bajos que los de las frescas,
excepto en el lote 1 de la remolacha y en los lotes 1 y 2 del nabo (Gráficos 29,30 y 31).
367
De igual formaque en el casode FAD, destacala homogeneidadcon quelos diferenteslotes
de cadahortalizarespondena la aplicaciónde los distintostratamientostérmicosen función
de los bajoscoeficientesde variación, inferioresal 10%, salvo en el lote 1 de remolachay
de zanahoriaen los que seapreciauna mayordispersión:
Cuadro n0 15. Coeficientesde variación(%) obtenidos a partir de los resultadosde los tratamientos 1, II y III aplicados a cada lote.
ZANAHORIA (CV) REMOLACHA (CV) NABO (CV)
Fresca Procesada Fresca Procesada Fresca Procesada
Lote 1
Lote 2
Lote 3
11,293
1,275
10,245
12,256
3,070
4,431
2,359
3,504
1,233
17,597
1,265
4,507
1,714
4,694
3,805
4,684
7,749
4,293
1estadístico obtenido a partir de los resultados de los trnta¡nientos 1,11 y Hl (le cada lote
Según las retencionescalculadas(Tabla 75), se observan pérdidas de esta fracción en
remolacha(86 769+15,561),y másacusadasen zanahoria(76 380+3,447),mientrasqueel
nabo (101,332+13876) experimentaun ligero incremento.Unicamenteen el caso de la
zanahoriael descensoes significativo (a= 0,05).
De nuevo se pueden justificar las retencionesinferiores al 100% en función de la
solubilización de sustancias pécticas y de otros posiblescompuestosasociadosa la fracción
FND. Las muestras de zanahoriatienencontenidomásalto de sustanciaspécticas,el mayor
porcentaje de proteínas en FNDse observa en remolacha y, por el contrario, las muestras de
nabo presentan los valoresmásbajosde sustanciaspécticasy de proteínasresidualesen FND.
La solubilización o pérdida de estos compuestos podría estar favorecida por el tratamiento
térmico aplicado, lo que explicaría, en parte, los descensosde FND más acusadosen
zanahoriay remolachaque en las muestrasde nabo.
Asimismo, los posiblescambiosexperimentadospor los polisacáridoscelulósicosy los no
celulósicosa lo largodel procesadopodríancontribuirtambiéna las variacionesobservadas.
368
La influenciadel tratamientosobrelas distintashortalizas,en función de la variaciónde las
retenciones,es másdispersaen remolacha(CV=31,064%)y nabo(CV= 23,718%)que en
zanahoria(CV=7,816%).
c) Estudiode las cenizasresidualesen FAD y en FND
El contenidode cenizas,junto con el de proteínas,en los residuosFAD y FND, expresados
en gIlOO g de materia húmeda, para cada hortaliza fresca y procesada figura en la tabla 45.a.
En los residuosFAD no sedetectancenizasen ningunade las muestrasanalizadasni en las
frescas ni en las procesadas.
En cuantoa las cenizasde los residuosFND en remolachay en naboexisten diferencias
significativas (cx= 0,05) entre fresco y procesado.El valor de cenizasque se obtiene es
inferior despuésdel tratamiento.En el caso de la zanahoriano hay cenizasresidualesni en
el fresco ni en el procesado.
En estosresiduosla presenciade cantidadesdiferentesde cenizasen procesadoy eíi fresco
se puede interpretar en base a dos fenómenos:
- posiblesolubilización de elementosmineralesduranteel procesode cocción;
- posible alteración de la estructura de los polisacáridosresponsablesde la retención
de elementos minerales.
d) Estudio de las proteínas residuales en FAD y en FND
Los resultados correspondientes a las proteínas de los residuosdetergentesFAD y FND
figuran en tabla 45a.
En el residuo FAD todos los valores de proteínasson máselevadosen el fresco que en el
procesado, excepto en el lote 1 de zanahoria y en el lote 1 de nabo. El análisis de varianza
(a 0,05) indica que estas diferencias no son significativas.
En el caso del FND, en la zanahoria las proteínasdel fresco son máselevadasque las del
369
procesado.En el naboprácticamenteno hay diferencias,exceptoen el lote 1 en el que los
valores son más elevadosen el procesadoque en el fresco. Los residuosFND de la
remolachafrescaretienenmásproteínasque los del procesado,exceptoen el lote 1. Según
seindicabaanteriormente,las diferenciasson significativas(a= 0,05)solo en el casode la
zanahoria.
Como ya se ha comentadoen el apartadocorrespondientea la comparaciónde métodos
analíticos,laproteínaesun componentecuyapresenciano cabeseresperadaen los residuos.
Valoresmás elevadosen el fresco que en el procesadoindican la solubilizaciónduranteel
tratamientodecocción,hechoquesecompruebaademásal estudiarel contenidode proteínas
en las hortalizas frescas y en las procesadas.
2.2.3.2.Método enzim~itico-gravimétricode Asp
Los valores de fibra insoluble (FI), fibra soluble (FS) y fibra total (FT) para el fresco y el
procesado,expresadosen g/I00 g de materiahúmeda,decadauna de las hortalizasestudiadas
seencuentranen las tablas46, 47 y 48, y las retencionesen la 75.
Los valoresde FI en el material frescoson superioresa los del procesadoen el lote 2 de la
zanahoria,en el 2 y 3 de la remolacha,y en el 1 y 3 del nabo. En el casode los lotes 1 y
3 de la zanahoria,del lote 1 de la remolachay del lote 2 del nabo seproducenincrementos
tras el procesado (Gráficos 32,33 y 34).
Se aprecia que la influencia de los tratamientos térmicos (1,11 y nl) sobre FI aplicados a cada
lote de las hortalizas estudiadas producen efectos similares, salvo en el lote 3 de la remolacha
en el que se observauna mayorheterogeneidadde comportamiento:
370
Cuadro n0 16. Coeficientesde variación (%) obtenidos a partir de los resultadosde los tratamientos 1, 11 y III aplicados a cada lote.
ZANAHORIA (CV) REMOLACHA (CV) NABO (CV)
Fresca Procesada Fresca Procesada Fresca Procesada
Lote 1
Lote 2
Lote 3
10,217
11,751
10,544
8,689
8,025
6,960
4,714
2,048
4,265
5,446
4,944
14,478
0,422
10,149
2,786
5,203
7,899
3,124
1estadfstico obtenido a partir de los resultados de los tratamientos LII y III de cada lote
La incidenciadel tratamientosobrela fibra insoluble (FI) esmásacusadaen remolacha,con
un valor de retenciónde 86,790+17108. En zanahoriay en nabo el procesadono origina
modificacionesimportantes,como se observapor las siguientesretenciones:zanahoria,
95 5 17+7 949, y nabo, 97,293+6 277 El análisis de varianza (a= 0,05) indica que las
diferencias no son significativas en ningún caso.
Delos coeficientesde variaciónde las retencionessededuceque la influenciade la cocción
esmáshomogéneaen nabo(CV=1l,176%)y zanahoria(CV=14,414%)que en remolacha
(CV=34,143%).
En cuantoa la fibra soluble(PS) se observaque en todos los casos,en los tres lotesde las
treshortalizas,el contenidodel materialprocesadosiempreessuperioral del fresco (Gráficos
32, 33 y 34).
El comportamientode los tratamientostérmicossobredichafracción en los tres lotesde cada
muestraesbastantehomogéneocomo se deducede los coeficientesde variación calculados
paralos datosde fresco y procesado:
371
Cuadro n0 17. Coeficientesde variación (%) obtenidos a partir de los resultadosde los tratamientos 1, II y III aplicados a cada lote.
ZANAHORIA (CV) REMOLACHA (CV) NABO (CV)
Fresca Procesada Fresca Procesada Fresca Procesada
Lote 1
Lote 2
Lote 3
7,682
19,072
6,733
7,794
9,049
12,106
6,841
11,147
4,030
8,508
7,646
1,236
6,852
7,133
5,257
13,699
9,573
7,487
1estadístieo obtenido a partir de los resultados de los tratamientos 1,11 y 111 de cada lote
Las retenciones calculadas son superiores al 100%, así: zanahoria, 162 027+28,972, nabo,
151 723+15,237, y remolacha, 129,307+17 724, lo que indica, en líneas generales, la
presencia de otros componentesaparte de los polisacáridos pécticos en el residuo.
Estadísticamentelas diferencias encontradasno son significativas, para el nivel de
significación fijado (a= 0,05), en zanahoriay remolachapero sien el nabo.
La fracción solublede la fibra secomportade forma distintaen cadahortaliza. Se observan
variacionesmayoresde las retencionesen zanahoria (CV =30,972%)que en remolacha (CV =
23,742%)y nabo (CV=17,395%).
Duranteel procesodecocciónciertoscomponentesde la fibra insolublepuedensolubilizarse
y pasara formar partede la soluble. Si se estudiael porcentajede FI y de PS en el valor
total de FI (Tabla 49) se observa claramente que hay una redistribución de componentes
entreFI y PS en todaslas muestras.Así en el frescola proporciónde FI essuperiora la de
FS y en el procesadosucedelo contrario.
a) Estudio de las cenizasresiduales en FI y en PS
El tratamientotérmico en el senode aguada lugar a que las cenizasresidualesen FI sean
inferiores(Tabla45b).Las diferenciasentrefrescoy procesadoson significativas(cx= 0,05)
en zanahoriay remolacha,pero no en el nabo.El descensode las cenizasen los residuosde
los materialesprocesadossepuedejustificarde la mismaformaqueen el casode los métodos
detergentes:solubilizacionesduranteel proceso de cocción y posible alteración de la
372
estructurade los polisacáridos.
Al estudiar los residuos FS, se aprecia que el contenido de cenizas experimenta aumentos en
zanahoriay naboprocesados,y seproducendescensosen remolacha,sin queen ningúncaso
las diferencias sean significativas (cx= 0,05).
b) Estudiode lasuroteinasresidualesen FI
Las proteínasresidualesen FI (Tabla 45b) son menoresen zanahoriay naboprocesados,
mientrasque en la remolachason ligeramentesuperioresal fresco. Se observaque existen
diferencias estadisticamente significativas (a= 0,05) en el contenido de proteínas del residuo
FI en zanahoria y remolacha, sin embargo no las hay en el nabo.
Al comienzo del apartado2.2 de la Discusión de Resultados, al indicar las pérdidas
experimentadaspor las distintashortalizastras el procesode cocción, se podíacomprobar
claramentecómo, precisamente,el nabo es la muestraque sufre menorespérdidasen la
fracción proteica(11%) a diferenciade la zanahoria(43%) y de la remolacha(30%).
2.2.3.3. Método cromatográfico(HPLC)
Seestudiael efectodel tratamientode coccióna presiónsobrelos monosacáridosprocedentes
de la hidrólisis de la fibra alimentaria y los polisacáridos celulósicos y no celulósicos que
constituyen.
Los resultadosreferentesa cadauno de los monosacáridos,expresadosen g/ 100g de materia
húmeda,figuran en las tablas50, 51 y 52, parazanahoria,remolachay naborespectivamente.
En la tabla 53 serefleja el contenidototal de monosacáridospara las tres hortalizas.
Al estudiarla suma total de monosacáridosen cadahortaliza se observan,segúnel lote
ligerosdescensoso incrementosdespuésdel procesadosin queen ningún casolas diferencias
encontradasseansignificativas(a= 0,05).
373
Los coeficientesde variacióncalculadosparalos resultadosdemonosacáridostotales señalan
la homogeneidadde los tratamientosen cadauno de los lotes de remolachay nabo, siendo
mayor la variabilidadde los resultadosen la zanahoria:
Cuadro n0 18. Coeficientesde variación (%) obtenidos a partir de los resultadosde los tratamientos 1, II y III aplicados a cada lote.
ZANAHORIA (CV) REMOLACHA (CV) NABO (CV)
Fresca Procesada Fresca Procesada Fresca Procesada
Lote 1
Lote 2
Lote 3
4,241
2,222
8,965
6,874
17,705
13,331
6,756
8,889
1,271
10,110
0,357
5,216
5,136
1,745
3,590
2,247
3,769
4,119
tmestadístico obtenido a partir de los resultados de los tratamientos 1,11 y III de cada lote
Si seconsiderael porcentajeque cadamonosacáridorepresentadentrodel valor total (Tabla
54), sepuedeseñalarque en el casode la zanahoriaprocesadahay un descensoen glucosa,
xilosa y manosa, sin embargo, celobiosa, galactosa/ramnosa y arabinosa aumentan. En la
remolachalas proporcionesaumentanrespectoa celobiosa, xilosa y manosa y hay un
descensode glucosa,galactosa/ramnosay arabinosa.En el nabo seproducenincrementosen
celobiosa, glucosa y manosa, y descienden los demás.
El cálculodel parámetroretenciónpara estosazúcaresprocedentesde la fibra alimentaria
(Tabla 76) refleja que en la zanahorialas variacionesmás importantesse producenen
arabinosa (140,987+14891), galactosa/ramnosa (119,840±19,423), ínanosa
(81 202+15,453)y xilosa (83,667+20075), y las menores en glucosa (94,983±18,236) y
celobiosa(110 441 +25,623). En la remolachalas mayores modificacionesse refieren a
manosa (140,927±6,589) y celobiosa (131 903+9,616), seguidas de xilosa
(124 957+30,773) y glucosa (121,077±30,658), y de menos importancia en galactosa]
ramnosa(110 380+17,731)y arabinosa(106,232±14,191).En el nabo, celobiosa, glucosa
y xilosa presentan retencionessimilares (115,813+12638, 119,553+11484, 110,997
+ 11,029), superioresal 100%, de la misma forma que en galactosa/ramnosa,arabinosay
manosa(93 033±11476, 90,009+2149, 89,933±19,648)son inferioresa dicho 100%.
374
La redistribución de celobiosay glucosa en la celulosa de zanahoria y remolacha puede ser
debida a que son muestrasen las que no existe una diferencia tan importantecomo la
observadaen el nabo, en lo que se refiere a la proporción en la que estánpresenteslos
polisacáridoscelulósicosy los no celulósicos,por lo que pequeñasmodificacionespueden
tener gran trascendencia. En el nabo predominan los polisacáridos celulósicos, mientras que
en zanahoria y remolacha hay mayor igualdad.
Al estudiarel porcentajede cadamonosacáridoen el total de polisacáridosno celulósicos
(Tabla 59) cabe señalar un descenso de xilosa y de manosa y un aumento de
galactosa/ramnosay arabinosaen la zanahoriaprocesadarespectoa la fresca, y que en la
remolachahay un aumentode xilosa y de manosafrente a descensosde galactosa/ramnosa
y arabinosa. En el nabo solo aumenta la xilosa, los demás monosacáridos disminuyen.
El valor medio de las retencionesde los monosacáridosneutros totales indica valores
superiores al 100% en las tres hortalizas (zanahoria: 107 293+14,834; remolacha:
114 152+18,767; nabo:109,553±7,868).En la zanahoria el aumento es debido,
fundamentalmente,a la contribución de arabinosay degalactosa/ramnosa,en remolachaala
prácticatotalidad de los monosacáridosy en naboa celobiosa,glucosay xilosa.
Las retencionessuperioresal 100% podrían ser indicativas de una mayor eficacia de la
hidrólisis ácidaen los materialesprocesadosque en los frescos.El procesadodaríaorigen a
una disposiciónestructural que permitiría una mayor eficacia del ataqueácido o bien
facilitada la acciónhidrolítica al disolverseciertoscomponentes.
2.2.3.4. Método espectrofotométricoparasustanciaspécticas:3,5-dimetilfenol
Los valores correspondientesa las sustanciaspécticas,expresadosen gramos de ácido
galacturónicopor 100 gramosde materiahúmeda,figuran en las tablas 60, 61 y 62, para
cadaunade las hortalizas.Las retencionesse muestranen la tabla 75.
376
El estudio estadístico revela que esta fracción presenta una mayor modificación que las que
sehan estudiadohastael momento,dado que las diferenciasson significativasen zanahoria
y nabo, aunque no se detectan en el caso de la remolacha para el nivel de significación
establecido(a= 0,05).Los resultadosobtenidosson siempreinferioresen los procesadosque
en los frescos(Gráficos39, 38 y 40).
La zanahoriaes la muestraquepresentamayor regularidaden el descensodel contenidode
sustanciaspécticas, como lo demuestranlos coeficientesde variación de los resultados
siempre inferiores al 10%. En el nabo el procesadodel lote 1 tienen una variación
ligeramentesuperior, así como los lotes2 y 3 de la remolacha.El efecto del tratamientoda
lugar a modificacionesmuy semejantesen las hortalizasestudiadas,destacandoel casode la
zanahoria.
Cuadro n0 19. Coeficientesde variación (%) obtenidos a partir de los resultadosde los tratamientos 1, II y III aplicados a cada lote.
ZANAHORIA (CV) REMOLACHA (CV) NABO <CV)
Fresca Procesada Fresca Procesada Fresca Procesada
Lote 1
Lote2
Lote 3
4,554
7,582
7,815
3,519
3,292
10,201
7,280
0,626
8,133
6,493
11,165
15,219
4,044
3,154
4,912
11,80
5,89
7,32
estadístico ohtenido a partir de los resultados de los tratamientos ¡.11 y Hl de cada lote
El descensoen el contenidoen sustanciaspécticasesmuy similar en todaslas muestras,corno
puedeobservarsepor las retencionescalculadas:zanahoria=76,411+7857~ remolacha=
77 297+7560; nabo= 73,777+3581 Como se ha indicado anteriormentelas diferencias
son significativassolo para zanahoriay nabo. El comportamientode las muestrases muy
uniforme en el nabo (CV= 8,406%)y más dispersoen remolacha(CV= 16,941%)y en
zanahoria (CV= 17,810%).
La cocciónseacompañanormalmente de un ablandamiento de los tejidos y de cambiosen la
textura. Esto sucedecomo consecuenciade la extracción de calcio de la región de la lámina
377
media por medio de agentes quelantes adecuados, ej. citrato, y también debido al proceso
degradativode fi-eliminación de pectinas.Seha comprobadola degradaciónde las pectinas
demanzanapor¡3-eliminaciónduranteel calentamientocon tampónfosfatoapH = 7, y estas
condicionesson semejantesa las que ocurrenen los vegetalesdurantela cocción (Waldron
y Selvendran, 1990).
Paracomprobarla presenciade ácidogalacturónicoen los líquidosde cocciónseha llevado
a cabo el método espectrofotométrico en dichos líquidos, obteniéndose valores se
correspondencon los porcentajesde pérdidasobservadosapartir de las retenciones,portanto
se puede afirmar que el fenómeno que tiene lugar es fundamentalmente una solubilización.
El métodoespectrofotométricodel 3,5-dimetilfenol(Scott,1979)y el enzimático-gravimétrico
de Asp para la fracción soluble de la fibra (Asp y col., 1983), determinan en teoría los
mismoscomponentes:sustanciaspécticas.El primerode elloscuantificaespecíficamenteel
ácidogalacturónicoprocedentede lahidrólisis de las pectinasy el segundodeterminade una
formamuchomásgrosera,pormediodeprecipitacióny gravimetría,los mismoscompuestos.
El comportamiento de la fracción soluble frente al procesadoes muy distinto según la
metodologíaaplicadaparasu determinación.La fibra soluble (PS)experimentaaumentosen
las hortalizasprocesadasmientras que las sustanciaspécticas (SP) sufren pérdidas. La
diferenciade comportamientoobservadase debeal distinto fundamentode los métodos
analíticosempleadose indica la presenciade otros compuestos,ademásde las sustancias
pécticas, en FS.
2.2.3.5.Comparación de los valores de fibra alimentaria total
Se pueden sumar los resultados de sustanciaspécticas(SP) a los de FND, FI y polisacáridos
celulósicos y no celulósicospara obtener valores de fibra total. Del mismo modo el conjunto
de FI y de PS representa también un dato de fibra alimentaria total.
378
a) FND+SP
Los valorescorrespondientesa cadahortaliza,expresadosen g/100 g de materiahúmeda,
figuran en la tablas 66, 67 y 68, y las retenciones en la 78.
Los resultadosobtenidosen las hortalizasprocesadasson inferiores a los de las frescas,
exceptoen el lote 1 de la remolachay en el 2 del nabo.
En el siguientecuadrosepuedenapreciarlos porcentajesque representanFND y SP dentro
del valorde fibra total. Ningunode los doscomponentesmodificasu contribucióna la fibra
debidoal tratamiento.
Cuadron0 20. Porcentajede FND y SPen FND + SP.
FND SP
Fresco Procesado Fresco Procesado
Zanahoria
Remolacha
Nabo
80,081
86,451
84,810
79,682
87,708
88,215
19,919
13,587
15,239
19,974
12,330
11,765
FND = Fibra Neutro Detergente; SP = Sustancias pécticas
Al considerarla fibra de estamanera,se observaque en el procesadoseproducenpérdidas
semejantes a las de FNDporque este valor es el que más contribuye al de fibra total. En la
zanahoriala retenciónesde 76,362+4308, en la remolachade 85,363+14202 y en el nabo
96 907+ 12 031. En las tres hortalizas se aprecia alguna modificación y de forma más
acusada en la zanahoria.
El estudioestadísticoindicaqueremolachay nabono han sufridomodificacionescuantitativas
significativas (a= 0,05), pero sí la zanahoria en la que existen diferencias tanto en FND
como en SP.
b) FI+SP
Según los datos que figuran en las tablas66, 67 y 68 se puedeapreciarque el valor de
379
FI+SPes inferior en las hortalizasprocesadasque en las frescas,exceptoen el lote 1 de la
remolachay en el lote 2 del nabo. No existendiferenciassignificativas(a= 0,05)en ninguno
de los casos.Aunque sí hay diferenciasrespectoa sustanciaspécticas,el valor mucho más
elevadode FI haceque la fibra total no difiera.
Los tantosporciento de FI y de SP en el valor total seresumena continuación:
Cuadron0 21. Porcentajede FI y SP en FI + SP.
FI SP
Fresco Procesado Fresco Procesado
Zanahoria
Remolacha
Nabo
71,846
86,986
82,514
76,229
78,291
85,782
28,154
13,014
17,486
23,955
11,809
13,886
FI = Fibra Insoluble (método de Asp); SP = Sustancias pécticas
La proporción en que se encuentranFI y SP en el resultadototal sólo presentaligeras
variaciones en zanahoria y nabo, donde el material procesado presenta un mayor porcentaje
de FI en la suma total, hecho lógico si se tiene en cuenta el descenso experimentado por las
sustancias pécticas.
En la remolacha el tratamiento da lugar a modificaciones cuantitativas del mismo orden que
en el caso de FND+SPpara cuantificar la fibra total como indica la retención calculada
(84 437+15,668). En el nabo la incidencia es mayor en este caso (93 093+5 473) y en la
zanahoriamenor(89,731+4936) (Tabla 78).
c) FI-4-FS
Estafracción no sufremodificacionescomoconsecuenciadel tratamientocomosededucedel
análisisdevarianzaaplicado(a= 0,05).Los resultadosfiguran en las tablas66,67,68y 78.
A pesarde no existir diferenciassignificativassi seestudiala proporciónde FI y de FS en
el valor FT seobservaclaramenteque hay una redistribución de componentesen todaslas
380
muestras.Así, en el procesadola proporciónde FI disminuyey la de FS aumenta,como se
indica en el siguientecuadro:
Cuadron0 22. Porcentajede FI y FS en FI’.
FI FS
Fresco Procesado Fresco Procesado
Zanahoria
Remolacha
Nabo
61,815
71,944
71,379
50,946
62,679
61,838
38,185
28,056
28,621
48,500
37,067
37,904
Fi = Fibra Insoluble (método de Mp); FS = Fibra Soluble (método de Asp)
Estehechosepuedejustificar, por un lado porel aumentoque experimentaFS y que hace
queFI disminuyaproporcionalmente,y porotro porla posibleredistribuciónde componentes
entreFI y FS.
Al compararel comportamientode las tres hortalizas se apreciaque zanahoriay nabo
experimentanuna gananciaa la que contribuyenfundamentalmentelos valores de FS del
procesado,como se vió en el apartadocorrespondiente.Las retencionescalculadasson para
zanahoria,115 48+7 353, y para el nabo, 112,298±8,181.En el casode la remolachala
fracciónFT esmenossensiblequelas dosanteriores,siendola retenciónde98,617+17 664.
d) NSP
Los resultadoscorrespondientesaestafracción,que seobtienenpor la sumade polisacáridos
celulósicos,polisacáridosno celulósicosy sustanciaspécticas, expresadosen g/100 g de
materiahúmeda,figuran en las tablas63, 64 y 65, y las retencionesen la 78.
La comparaciónentrefrescoy procesadorevelaqueno existendiferenciassignificativas(a=
0,05)entreellos. Sin embargo,cadamuestrapresentaun comportamientopeculiaren relación
a lo observadoen los casosanteriores.En el nabo el comportamientoes semejanteal
observadoparaFI+FS, con una retenciónde 101,823+6467, mientrasqueen la zanahoria
la tendenciaa experimentarpérdidaessimilar a ladeFND+SPy FI+FS, siendola retención
381
de 94 452+9,687.Sin embargo, la remolachaen esta fracción tiene un comportamiento
diferente a los otros tres casos (FND+SP, FI+SP y FI+FS), presentandoretenciones
superioresal 100% (106 743+16,455).
Todos los procedimientosparaevaluarla fibra alimentariatotal reflejan gran homogeneidad
en la respuestaal tratamientotérmico.Tanto paraFND+SP, comoparaFI+SP, FI+FS y
NSP seobservanvaloresde coeficientesde variacióncomprendidosdentrode unos límites
aceptables.Solamenteel procesadodel lote 1 de la remolachapan FND+SP, y en el
procesadodel lote 3 paraFI+SPse observauna mayorheterogeneidad.
Cuadron0 23. Coeficientesde variación (%) obtenidosa partir de los resultadosde los tratamientos1, II y III aplicados a cada lote.
FNJ.~+SP ZANAHORIA (CV) REMOLACHA (CV)
Fresca Procesada Fresca Procesada
NABO (CV)
Fresca Procesada
Lote 1 9,396 10,059 1,933 15,984 1,130 5,091
Lote 2 2,386 1,767 2,984 1,790 3,676 6,999
Lote 3 6,826 4,290 1,304 5,428 3,626 3,457
tmestadístico obtenido a partir de los resultados de los tratamientos 1,11 y 111 de cada lote
Cuadro n0 24. Coeficientes de variación (%) obtenidos a partir de los resultadosde los tratamientos 1,11 y III aplicados a cada lote.
fl+SP ZANAHORIA(CV) REMOLACHA(CV)
Fresca Procesada Fresca Procesada
NABO(CV)
Fresca Procesada
Lote 1 6,440 7,046 5,031 5,484 0,931 4,927
Lote 2 6,856 5,071 1,821 3,283 8,211 7,362
Lote 3 9,549 5,032 3,191 13,825 1,575 1,832
obtenido a partir de los resultados de los tratamientos I,H y 111 de cada lote
382
1estadístico
Cuadro n0 25. Coeficientesde variación (%) obtenidosa partir de los resultadosde los tratamientos 1, II y III aplicados a cada lote.
fl+FS ZANAHORIA (CV) REMOLACHA (CV) NABO <CV)
Fresca Procesada Fresca Procesada Fresca Procesada
Lote 1 7,194 7,591 2,580 4,945 1,957 8,316
Lote 2 4,188 0,903 4,218 5,212 6,197 8,526
Lote 3 4,754 7,898 2,354 9,142 1,133 2,646
1estadístico obtenido a partir de los resultados de los tratamientos 1,11 y III de cada lote
Cuadro n0 26. Coeficientesde variación (%) obtenidos a partir de los resultadosde los tratamientos 1, II y III aplicados a cada lote.
NSP ZANAHORIA (CV) REMOLACHA (CV) NABO (CV)
Fresca Procesada Fresca Procesada Fresca Procesada
Lote 1 3,486 3,094 6,158 8,738 4,279 3,498
Lote 2 2,504 10,636 6,988 2,988 2,021 2,841
Lote 3 6,000 12,102 2,543 2,693 2,525 5,700
estadístico obtenido a partir de los resultados de los tratamientos 1,11 y 111 de cada lote
2.2.4. Estudiodel contenidoen azúcaressolublesen las hortalizasfrescasy procesadas
2.2.4.1. Método cromatográfico (HPLC)
El contenidoen azúcaressolubles(fructosa,glucosay sacarosa)de cadaunadelas hortalizas
figuran en las tablas69, 70 y 71. Al estudiarlos resultadosde las muestrasprocesadasse
observandescensosrespectoa las frescasen todos los casos.El análisis estadísticode los
mismosindicaqueno todos los azúcaresse comportande igual formaduranteel tratamiento
térmico. Seobservanvariacionessignificativas(a= 0,05) en fructosa, glucosa y sacarosa en
la zanahoria,y también en la sacarosaen el casodel nabo.
383
Los coeficientes de variación calculadospara los resultadosde cada lote indican gran
homogeneidaden todos ellos.
Cuadro n0 27. Coeficientesde variación (99 obtenidos a partir de los resultadosde los tratamientos 1, II y III aplicados a cada lote.
ZANAHORIA (CV) REMOLACHA (CV) NABO (CV)
Fresca Procesada Fresca Procesada Fresca Procesada
Lote 1
Lote 2
Lote 3
6,033
4,153
3,094
3,807
7,649
5,813
5,679
5,287
5,442
2,259
2,699
4,464
1,084
0,627
3,756
10,557
3,031
7,664
1estadfstico obtenido a partir de los resultados de los tratamientos 1,11 y III de cada lote
En cuantoa las retenciones(Tabla 80), la fructosapresentaun valor semejanteen las tres
hortalizas:zanahoria,60433+8,117,remolacha,63 663+6 183, y nabo,63,313±6,988.La
glucosa tiene un comportamientosemejanteen zanahoriay remolacha(57,529+5145 y
57 317+11060), mientra que el nabo tiene una retención superior (69,387±7,459).La
sacarosaesel azúcarquetieneun comportamientomáspeculiardentrodecadahortaliza.Así,
el mayor descenso lo experimenta el nabo (46,312+9 134), a continuación la zanahoria
(58 383+3 933) y por último la remolacha (66,247+ 10 S40).
Los coeficientes de variación de las retenciones indican una escasa dispersión de los
resultados en las tres hortalizas,sobretodo en la zanahoria.
En todos los casosseproducensolubilizacionesen el aguade cocción, detectándoseen los
líquidosproporcionesde azúcaressemejantesa las pérdidasque experimentanlas muestras.
El descensode los azúcaressolublesen las hortalizasprocesadases de distinta magnitud
según el azúcar de que se trate y está influido, además de por la cantidad inicial en el
material fresco, por la hortaliza de que se trate. Así, por ejemplo, la sacarosa presenta igual
valor de retenciónen zanahoria,remolachay nabo, aunqueen la remolachase encuentraen
mínimas proporciones.
384
2.2.4.2.Método espectrofotométricodel ferricianuropotásico
Los resultados obtenidos en las hortalizas frescas y procesadas figuran en las tablas 72, 73
y 74 para cada hortaliza. Las retenciones se muestran en la tabla 79.
Los azúcaressolublesson sensiblesal tratamientotérmico en medio acuoso,obteniéndose
diferenciasestadísticamentesignificativas(a= 0,05) entre los contenidosde las muestras
antes y después de procesarías.
Se observatambiénque no hay variabilidadentrelos diferenteslotesde una misma muestra
en ningún caso.
Cuadro n0 28. Coeficientes de variación (%) obtenidos a partir de los resultadosde los tratamientos 1, II y III aplicados a cada lote.
ZANAHORIA(CV) REMOLACHA(CV) NABO(CV)
Fresca Procesada Fresca Procesada Fresca Procesada
Lote 1
Lote 2
Lote 3
2,144
0,675
0,584
3,958
2,188
1,257
3,054
3,367
1,890
6,262
3,550
24,307
2,472
2,663
7,899
11,522
7,965
14,745
La cocción da lugar a pérdidas semejantes en las tres muestras, como se deduce de los
valoresde las retencionescalculadas:zanahoria,62,173+5305, remolacha,68,393+ 13 258,
y nabo, 66,271+4210, La variaciónde las retencionescalculadasesmuy bajaen todaslas
muestras.
Paracomprobarla presenciade monosacáridosen los líquidos de cocción, se realiza la
colorimetríadel ferricianuropotásicoen una partealícuotade dichos líquidosobteniéndose
resultadossemejantesa las pérdidasexperimentadas.La presenciadeazúcaressolublesen los
líquidos indica, igual que en el caso de las sustanciaspécticas,solubilizacionesduranteel
procesado.
385
2.2.4.3.Estudiode la distribucióndeazúcaressolublesy monosac&iridosque formanla
fibra alimentaria.
En los gráficos39, 40 y 41 seapreciala distribución de los monosacáridosque integranla
fibra alimentariay de los azúcaressolublesconsiderandola sumatotal de estosdosgrupos
de azúcares.
Los azúcarescorrespondientesa la fibra alimentariapresentanporcentajessemejantesen
frescoy procesado:zanahoria(fresco= 16,451,procesado= 19,089);remolacha(fresco =
16,236, procesado= 18,636); nabo(fresco = 32,085,procesado= 35,006).
Sin embargoen los azúcaressolublesseapreciaun descensoen el porcentajede participación
en los materialesprocesadosrespectoa los frescos:zanahoria(fresco = 83,548,procesado
— 56,495); remolacha(fresco = 83,764, procesado= 53,829); nabo (fresco = 67,915,
procesado= 44,369).Estedescensosejustifica en virtud de la pérdidade azúcaressolubles
experimentadadurante la cocción que ha sido de 24,416% en zanahoria;27,535% en
remolachay 20,625%en nabo.
386
2.3. DISCUSION DE LOS RESULTADOSOBTENIDOS POR MICROSCOPIA
OPTICA
El procesadotérmicode productosvegetalesorigina,comoefectomás importante,cambios
en la texturade los mismos. Dichasmodificacionesde la texturaestánrelacionadascon la
organizaciónestructuraly composiciónquímicade la paredcelular.
Se ha estudiadopor microscopiaóptica diferenteszonas de las raices antesy despuésdel
procesado para observar el aspecto de la pared celular y detectar posibles cambios
estructurales, así como confirmar la presencia de los constituyentes de la fibra alimentaria.
hortalizas.
2.3.1. Generalidades
Las tres especiesestudiadasson raícesde almacenamiento.Como talesraícespresentanen
su anatomía una fuerte asociación entre las células de reserva (parénquima) y las células de
los tejidos conductores, que es resultado del crecimiento secundario que sufren.
En la zanahoriase produceun excesivodesarrollodel parénquima(Fotografían0 1) que
determinaque el órgano se haga carnoso. En la remolacha,como en el resto de las
Chenopodiaceae,al activarsediferentestejidoscambialesse van formandonumerosascapas
de tejido secundario,los hacesvascularesse disponendispersosen círculos concéntricos
intercalados por una gran cantidad de parénquima (Fotografía n0 2). En el nabo se puede
apreciar el crecimiento que suele ser típico de otras Brassicaceae:el parénquima crece, en
él posteriormenteseactiva el cambiumque a su vez originaránuevoparénquimajunto con
el tejido conductorsecundario(Fotografían0 3).
En el estudioal microscopio óptico, el aspectode las células del material procesadoes
distinto al de las célulasdel material fresco(Fotografíasn0 4, 5, 6, 7, 8 y 9). Estediferente
aspectopodría deberse a un incrementode la humedaden las células de las muestras
387
procesadas,incrementoque ha sido comprobadoen el análisis químico de zanahoria,
remolachay nabo. Perotambiénotrasvariacionesque seproducenen el contenidocelular
puedenestarrelacionadas,por ejemplo:
-La modificación que el almidón sufre durante el procesado, que se puede observar
pordiferenciasobtenidasen el tratamientode las muestrascon la soluciónde lugol, reactivo
de identificacióndel almidón.
-La pérdidade sólidos solublesque,de acuerdocon el análisis químico, se produce
duranteel procesadotambiénpodríaafectara la distintaaparienciapresentadapor las células
al microscopio.
-En la remolacha se produce una salida de antocianos desde las vacuolas (Fotografía
n0 2), que ademásde afectaral color de la preparaciónpuedeinfluir en la aparienciade las
células que se observan.
-En la zanahoria se detectantambién ciertos cambios en la presencia de los
cromoplastosquecontienenlos carotenoidestípicos de estaraíz (Fotografían0 5).
Por último se pueden señalar las alteracionesen la estructuraque según Waldron y
Selvendran(1990) se pmducen en los pectatoscálcicos de la pared celular duranteel
cocinado,que podríancontribuir a la observaciónde una superficiecelular con apariencia
distinta.
2.3.2. Celulosay hemicelulosas
Las celulosasson uno de los principalespolisacáridosde laparedcelularprimaria y también
sepresentanen la paredsecundaria.En éstael componentemayoritarioes la celulosa.
En el reconocimiento de la celulosa y las hemicelulosas se ha utilizado la reacción del cloruro
388
de zinc yodado. Este reactivo identifica a celulosa y hemicelulosas originando un color azul
(Jensen, 1962). En ocasiones este color azul se observa algo diferente en el material fresco
que, en el procesado(másvioleta-rojizo) (Fotografíasn0 10, 11, 12 y 13). La diferenciade
tonalidadpodríadebersea una posiblealteraciónde la estructuramolecular,sobretodo de
las hemicelulosas,comoconsecuenciadel procesotérmico al que sesometeel material, de
forma similar a lo que la bibliografíaindica que ocurreen la reaccióndel almidón con la
solución de yodo-yoduropotásicoque da tono de color diferente segúnla proporción de
dextrinasque se presenten(Jensen1962; Johansen,1940).
2.3.3. Sustanciaspécticas
En la célulavegetal, las sustanciaspécticassuelenencontrarseen forma depectatos,como
componentesmayoritariosde la lámina mediade la paredcelular. Uno de sus reactivosde
identificaciónmásutilizadosen microscopiaóptica esel rojo de rutenio.
El estudio microscópicoutilizando la reacciónde rojo de rutenio, no revela diferencias
significativas en el contenido de pectatos de la lámina media entre el material fresco y el
procesado.Estaobservaciónpuedegeneralizarsepara la totalidadde la estructuraradicular
(cortezay cilindro vascular)en zanahoria(Fotografíasn0 14 y 15), remolacha(Fotografías
n0 16 y 17) y nabo (Fotografían018 y 19).
2.3.4. Li2nina
En la estructurade las raícesestudiadaslas célulaslignificadasse limitan a los vasos del
xilema(Selvendran,1992).En el estadode madurezen quezanahoria,remolachay naboson
aptospara el consumo,el xilema estárelativamentepoco desarrollado,lo que haceque la
contribucióndel contenidode ligninaen el contenidototal de fibra no sea muy significativo
comparado,por ejemplo,con el de pectinaso el de celulosa.
389
El estudiode los tejidos lignificados se ha realizadomediantela reacciónde la floroglucina
clorhídricaquetiñe las células lignificadasde color rojo-rosa(Fotografíasn0 20 y 21) y el
métodode la doble tinción que utiliza el verde yodo comoreactivoespecificode la lignina
(Fotografían0 22). En amboscasosno seobservandiferenciasen la presenciade lignina
entre el material fresco y el procesado lo que induce a pensar que las condiciones de este tipo
de procesadono son suficientesparaalterarla estructurade la lignina situadaen las paredes
de los vasosdel xilema.
390
IV CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
Del estudio realizadoy de los resultadosobtenidosen el mismo, se puedendeducir las
siguientes conclusiones respecto a:
1.- Métodosanalíticosempleados
:
1) Los métodos gravimétricos (químicos y enzimáticos), precisos, sencillos y económicos,
requieren, según su fundamento,correcciones relativas a las cenizas y proteínas que pueden
contaminar el residuo de fibra. Los resultados experimentales confirman la presencia de estos
compuestos mayoritariamente en los residuos procedentes del método enzimático. La mayor
o menor presencia de otros compuestos distintos a los polisacáridos no almidón está
directamente relacionada con el alimento que se analiza.
2) Los métodoscromatográficos,CromatografíaLíquida de Alta Eficacia y Cromatografía
de Gases, proporcionan más información que los métodos gravimétricos acerca de los
monómerosque constituyenla fibra alimentaria,aunquerequieren más tiempo y equipo
instrumental especifico. Se obtiene una buena recuperación y separación de los
monosacáridos, y en el caso de la cromatografía líquida, se propone, por los resultados
obtenidos, el empleo de una resma de intercambio aniónico para la neutralización del
hidrolizado y una columna con un relleno de resma en forma iónica para la separación de los
azucares neutros.
3) De los métodos cromatográficos empleados, la cromatografía líquida de alta eficacia ofrece
mayorinformación quela cromatografíagaseosasobrelos posiblesoligosacáridospresentes
(celobiosa, celotriosa), pero en este último caso la resolución de los monosacáridosesmejor
al conseguir separar galactosa y ramnosa.
4) La determinación de polisacáridos pécticos requiere más estudios para llegar a conseguír
una metodologíamásadecuada.La cuantificaciónporel métodode Asp da lugar a errores
por exceso al incluir en la fracción soluble otros compuestos distintos de las sustancias
402
pécticas y en el caso de los métodos espectrofotométricos, como el de Scott, solo se valora
el ácido galacturónico y no los constituyentes monosacáridos de las mismas. El último
método, utilizado en este trabajo, es el más adecuado dentro de los espectrofotométricos por
no presentar interferencias con hexosas y pentosas.
5) Del estudio realizado sobre distintos métodos para la determinación de fibra alimentaria
se deduce que se deben utilizar en función de los objetivos que se pretendan y del tipo de
alimento que se vaya a analizar. Los métodos gravimétricos son útiles en análisis de rutina
y los cromatográficos para caracterizar los distintos componentes de la fibra.
Independientemente del método elegido, es necesario especificarlo en orden a una utilización
más correcta de los resultados obtenidos y a su posible comparación, si bien es deseable
establecer un método aceptado por todos los investigadores de forma unánime.
6) Respecto a la determinación de la fracción de azúcares solubles se puede indicar que los
métodos cromatográficos proporcionan más información que los espectrofotométricos acerca
de los distintos monómeros; sin embargo, de cara a una cuantificación global, los resultados
que se obtienen son similares en ambos métodos: cromatográfico y espectrofotométrico;
ambos presentan una exactitud y precisión óptimas.
II.- Caracterización de la fibra alimentaria y azúcares solubles de las hortalizas
estudiadas
:
7) De las hortalizas estudiadas,la remolacha presentael máximo contenido de fibra
alimentaria, expresada como FT= 3,35g/100 g m.h. o como NSP= l,63g/l00 g m.h.. De
los resultados obtenidos se puede deducir una presencia importante de hemicelulosas,
calculadas por la diferencia entre FNDy FAD. Este hecho coincide con la mayor presencia
de polisacáridosno celulósicos (0,71g/100g m.h.) respectoa los celulósicos(0,56g/l00
m.h.), determinados por cromatografía líquida de alta eficacia, y el bajo contenido en ácido
galacturónico (O,40g/lOO g m.h.).
403
8) La zanahoria destaca por proporcionar el mínimo aporte de fibra (FT= 2,03g/l00 g m.h.;
NSP= l,37g/100 g m.hj, así como por contener la máxima cantidad de sustancias pécticas
(SP= 0,55g ácido galacturónico¡lO0g m.h.), hechoque coincide con la presenciade una
concentraciónalta de galactosay ramnosa,constituyentesimportantesde las sustancias
pécticas,entre los monosacáridosprocedentesde la fibra. Dentro de los polisacáridosno
almidón destacala semejanzaentre los celulósicos(0,44g/l0Og m.h.) y los no celulósicos
(0,44g1100 g m.h.).
9) El nabo ofrece un contenido de fibra alimentaria (FT= 2,02g/l00 g m.h.; NSP=
1 ,46g/í0O g m.h.) semejante a la zanahoria e inferior a la remolacha. Al analizar cromatogra-
ficamentelos monosacáridosque se obtienenpor hidrólisis de la fibra se observaque la
glucosaesel azúcarmayoritario,con muchadiferenciarespectoa los demás,lo quecoincide
con una mayor presencia de polisacáridos celulósicos (0,71g/100 g m.h.) respecto a los no
celulósicos (0,44g/100 g m.h.).
10) De las hortalizas estudiadas, la remolacha, igual que ocurre con la fibra alimentaria,es
la que presenta un contenido más alto de azúcares solubles(7,30g/lO0g m.h.), a diferencia
de la zanahoria(2,97g/100g m.h.) y del nabo (2,72g/l00g m.hj. En la remolacha,la
sacarosaesel azúcarpredominanteseguidode glucosay de fructosa.En lazanahoriatambién
predomina el disacárido, pero glucosa y fructosa está más equilibradas. Destaca el caso del
nabo por contener una proporción muy elevada de glucosa, a continuación fructosa y la
sacarosa en cantidad muy pequeña. La proporción de cada azúcar, en el total de esta fracción
es, característica de cada tipo de hortaliza.
11) El estudio por microscopia óptica confirma la presencia, en la pared celular de las
hortalizas estudiadas,de los componentesprincipales de la fibra alimentaria: celulosa,
hemicelulosas y sustancias pécticas.
404
III.- Efecto de la cocción en la fibra alimentaria y azúcares solubles de las hortalizas
estudiadas
:
12) A la hora de comparar los resultados obtenidos en las hortalizas frescas y en las
procesadases necesarioteneren cuenta, no sólo la diferenciade humedadentreellas, sino
también, y principalmente, la pérdida de sólidosporsolubilizaciónen el aguade cocciónque
da lugar a aparentes aumentos en los procesados,que sedeben unicamentea incrementos
proporcionales a la pérdida de sólidos. Se propone la aplicación de un factor de corrección
a los resultados procedentes de las muestras procesadas.
13) La fibra ácido detergenteexperimentapérdidasno significativas en el procesado.Se
podría hablar de un residuo más estrictamenteformadopor celulosay lignina despuésdel
tratamientotérmico al solubilizarseen el aguade coccióncompuestos,comohemicelulosas
y proteínas,que contaminanla FAD.
14) El residuo FNDexperimenta, igual que en el caso del FAD, pérdidas tras el tratamiento
de cocción que son significativasúnicamenteen el caso de la zanahoria.Las sustancias
pécticas pueden contaminar el residuo neutrodetergentey, precisamente,en la zanahoriaque
presentaun contenido más alto en esta fracción es donde la diferencia FAD/FND es
significativa.
15) La fibra insoluble determinadapor el método enzimático-gravimétricode Asp sufre
pequeñas oscilaciones en distinto sentido, según el lote de que se trate, que no son
significativos en ningún caso. Las diferencias más acusadas se observan en la remolacha que
es la hortaliza con un contenido más elevado en polisacáridosno celulosicos.
16) La fibra soluble determinada por el método de Asp da resultados más elevados en los
procesadosque en los frescos,siendo las diferenciassignificativasen la zanahoriay en la
remolacha,perono en el nabo.El aumentode la fibra solublesepuedeatribuir a la presencia
de otros compuestos distintos de las sustanciaspécticas.
405
17) Al estudiar comparativamente los resultados de fibra insoluble y de fibra soluble en las
muestras frescas y procesadas se puede indicar que se produce una redistribución de las dos
fraccionesdespuésdel tratamiento.En los procesadosse produceun descensode la fibra
insolubley un incrementode la soluble.
18) Los resultados obtenidos aplicando el método de cromatografía líquida de alta eficacia
indican que no se producen modificaciones significativas de los distintosmonosacáridosque
constituyenla fibra alimentaria.
19) La mayor modificaciónde la fibra alimentariade las hortalizasestudiadasse observaen
las sustancias pécticas,determinadasespectrofotométricamentecomoácidogalacturónico.Se
producen pérdidas por solubilización (zanahoria=24%;remolacha=23%; nabo= 26%).
20) Los azúcares solubles sufren pérdidas importantes por solubilización en el agua de
cocción que dependen del azúcar de que se trate y de la hortalizaestudiada.
21) El estudio microscópico revela que el aspecto de las células del material procesado es
diferentequeel de las célulasdel material fresco, debidoa modificacionesdel contenidoen
humedad, a alteraciones de la estructura de los pectatos cálcicos y hemicelulosas en la pared
celular durante el proceso de cocción.
22) El estudio actual de las investigaciones sobre la fibra alimentaria indica que quedan aún
muchas cuestiones por elucidar y que falta acuerdo entre los científicos. El presentetrabajo
contribuyeal conocimientode diferentesaspectosde la fibra alimentariaporel estudiode los
métodos analíticos más importantes, por la puesta a punto de una técnica de Cromatografía
Líquida de Alta Eficacia y por el estudio realizado sobre materiales frescos y procesados,
principalmente respecto a la forma de realizar la comparación entre ellos y el factor de
corrección que se debe aplicar a los resultados obtenidos en las muestras procesadas.
406
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