TECNICAS DE ANALISIS DE ACIDOS NUCLEICOS

HIBRIDACIONDE ACIDOS NUCLEICOSDOCENTE: Mara Soledad Depix UST

Desnaturalizacin y Renaturalizacin por efecto de la Temperatura

DESNATURALIZACIN DEL DNA

1. Fuerza inica50%

2. Longitud DNA doble 3. Composicin de bases

Tm oC = 2 x no(A + T) + 4 x n(G + C)

Curva de Desnaturalizacin y Composicin de Bases

CAMBIOS EN LA VISCOSIDAD Y ABSORBANCIA A 260 nm

Qu

es la Tm?

Tm = temperatura de melting o de separacin de las hebras. La Tm es una medida de la estabilidad de los hbridos definida como la temperatura a la cual 50% de los hbridos se encuentran formados y 50% permanecen disociados.

50% 5 - - - - - - - - - - -3 3 - - - - - - - - - - 5

50%

HIBRIDACION

2 elementos bsicos: Secuencia diana y sonda

FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS

Nmero de pares GC v/s pares AT Grado de complementariedad Largo de las hebras Concentracin de sal en la solucin Temperatura Concentracin de formamida

FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS

Nmero de pares GC v/s pares AT

Mayor nmero de enlaces de H entre la hebras mayor estabilidad

de los hbridos. 3 enlaces de H entre G y C 2 enlaces de H entre A y T

FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS

Temperatura

Mayor T aumenta la energa cintica de las hebras

y desestabiliza la estructura de los cidos nucleicos. las hebras se separan.

FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS

Grado de complementariedad

Menor complementariedad de bases, menos enlaces de H formados

menor estabilidad

FACTORES QUE AFECTAN LA ESTABILIDAD DE LA HIBRIDACION ENTRE ACIDOS NUCLEICOS Largo de las hebras

Mayor largo de las hebras (cDNAs) >200pb

ms enlaces de H mayor estabilidad del hbrido. Menor largo de las hebras (oligos)