Como funciona la hibridación in situ.Como funciona la hibridación in situ.

Agentes desnaturantes:- Temperatura- Moléculas polares (con gruposamino y carbonilo que compitan por laformación de puentes hidrógeno)- Condiciones alcalinas

Desnaturalización y renaturalización del ADN por la temperaturaDesnaturalización y renaturalización del ADN por la temperatura

Alteración de las propiedades físicas del ADN por desnaturalización

Curvas de Desnaturación Curvas de Desnaturación

Las curvas de desnaturación son específicas para cada molécula de ADN y dependen de lacomposición nucleotídica-La curva sigmoidal muestra que las interacciones que mantiene la doble hélice son cooperativas (laseparación en un punto estimula la separación consecutiva de otros puntos en la molécula)-De esta curva se obtiene la Tm (temperatura media de fusión)-La Tm muestra una correlaciónlineal con el contenido de G+C

Aplicación de la hibridación de ácidos Aplicación de la hibridación de ácidos nucleicos en el análisis molecularnucleicos en el análisis molecular

-Formación de híbridos de DNA:DNA o DNA:RNA durante un proceso de renaturación- El apareamiento de los híbridos dependerá de la complementariedad de bases y de las condiciones químicas y térmicas del proceso de renaturación

Astringencia o rigor (Stringency):grado de especificidad en el apareamiento de los híbridos. Experimentalmente se regula cambiando la temperatura, tiempo, longitud y composición de las cadenas a hibridar y ambiente químico (pH, cationes (Na+), moléculas polares(formamida))

Como funciona la hibridación in situ.Como funciona la hibridación in situ.

Como funciona la hibridación in situ.Como funciona la hibridación in situ.

Tipos de hibridación in situTipos de hibridación in situ

*tisular

*cromosomica

*FISH (fluorescente)

*cromosomica con sondas fluorescentes

Hibridaciones in situ FISH (Fluorescent In Situ Hybridization, Hibridaciones in situ con fluorescencia)

1ª Fase.Región cromosómica de interés. Preparación de la sonda.Una sonda es un segmento de ADN marcado con fluorescencia,que es complementario

2ª Fase.Hibridación. Los cromosomas desnaturalizados, fijos enel porta objetos del microscopio, son expuestos a la sondamarcada con fluorescencia. La hibridación (fusión) tiene lugarentre la sonda y el ADN cromosómico complementario(es decir,se acopla).

3ª Fase.Visu alizac ión . Tras la hibridación, se examina elportaobjeto al microscopio con luz fluorescente. Las señalesfluorescentes indican la presencia de ADN cromosómicocomplementario. La ausencia de tales señales implica queno hay ADN cromosómico complementario.

Marcado con una molécula

fluorescenteSonda de ADN

Desnaturalización e hibridación

Glosario:Hibridización: Formación de dúplex a partir

de cualquier combinación de ácidos nucleicos.

Dúplex: Estructura de ácidos nucleicos de doble cadena.

Factores que afectan la Hibridación:• Temperatura.• La concentración de sales.• Bases no complementarias.• Longitud del fragmento. “Es importante tomar en cuente estos

factores ya que las condiciones optimas no son las mismas para cada experimento.”

¿Que es una sonda?Son oligonucleótidos sintéticos, cDNA,

fragmentos de DNA genómico o RNA de cadena sencilla complementarias a la región de DNA o RNA blanco.

Sondas Marcadas Contienen alguna “marca” que

revela su unión (hibridación) a la secuencia elegida, generalmente se trata de P32.

…Entonces…

Marcaje

2 clasificaciones de sistemas para que el marcaje sea incorporado dentro de la sonda Tipos de marcaje Métodos para ser detectar

los marcajes

Autorradiografía

Inmunocitoquimica

(Haptenos)

Características:

-alta sensibilidad (tririo)

-alta resolución

-es posible usar método cuantitativo

Algunos isótopos:

*3-H: señal a nivel subcelular, t=largo

Resolución de un diámetro celular

*35-S: tiempo exposición 1 semana

*32P:resolución menor que el anterior pero menos tiempo

*33P: resolución igual el S en menor tiempo pero de mayor costo

Directo

La molécula detectable (reportera) es enlazada al acido nucleico y este hibrido puede ser visualizado directamente en el microscopio

*el paso limitante de este método es que el hibrido subsiste a las condiciones de lavado

Indirecto

Requiere una marca que contenga la molécula reportera (inducida química o enzimaticamente ) que pueda ser detectada por afinidad citoquimica. En este método al igual que el anterior , el marcaje no debe interferir co n la hibridación , ya que ola molécula reportera debe estar accesible a los anticuerpos que la detecten

Marcaje: 1er tipo de clasificación

Marcaje: 2do tipo de clasificación

En el mosaico se observaron fragmentos de 7,1 y 6,6 Kpb, correspondientes a 747 y 293 tripletes CGG para la MC y un fragmento de 2,9 Kpb correspondiente a una premutación de 113 repetidos CGG. (figura 1b). En el caso de metilación parcial se observan fragmentos de tamaño entre 6,2 y 7,2 Kpb correspondientes a una amplificación de 363 a 696 repeticiones CGG con metilación del locus y fragmentos entre 2,8 y 5,2 kpb correspondientes a amplificación entre 30 y 830 repetidos CGG, no metilados (figura 1C).

Figura 1. Autorradiografía de Southern blot e hibridación con la sonda StB 12,3 marcada con ?-32P [dCTP]. 1A) Carril 1: Mujer normal. Carriles 2, 3 y 4: Probando hombre con mutación completa. 1B) Carril 1: Mujer normal. Carril 2: Probando con mutación completa y premutación (mosaico). 1C) Carril 1: Probando con mutación completa y metilación parcial. Carril 2: Mujer normal.

Marcaje: IsotópicosEjemplo con 32P para ver tripletes

(lectura)

FIGURA. Autoradiografía de hibridización Southern realizada con ADN de plantas de maíz obtenidas por cultivo de tejidos (Dp 1, Dp 4, Dp 6, Dp 9, Dp 14, Dp 17) líneas A hasta F, respectivamente, y plantas utilizadas como control (LH 51 y B 73) líneas G y H. Las enzimas de restricción empleadas fueron HpaII y MspI sensibles a la metilación. Como sonda se usó el fragmento P8b de maíz. Los números desde 1 hasta 4 representan bandas de peso molecular decreciente.

Marcaje: IsotópicosEjemplo de una autoradiografía de AND

CITOGENÉTICA MOLECULAR - FISHCaracterísticas :° FISH (Hibridación In Situ Fluorescente). Es una metodología que se basa en la propiedad de apareamiento de las bases nitrogenadas adenina-timina (A-T) y guanina-citocina (G-C) de los ácidos nucléicos.

Detección de genes específicos mediante la utilización de sondas marcadas con distintos fluorocromos. Cromosomas humanos MO de fluorescencia.

Marcaje: NO IsotópicosEjemplo con Hibridación In Situ Fluorescente

La técnica dehibridación in situestá basada en la capacidad que poseen los ácidos nucleicos para hibridarse entre sí, es decir, la existencia de determinada secuencia de ADNo ARN, que resulta complementaria con otra secuencia.

Se diseña una sonda (formadapor una secuencia de ADNPreviamente conocida),Y marcada con un fluorocromo o Isótopo radiactivo.

La utilización de esta técnicaproduce: La hibridación (unión),de la sonda marcada, con la secuencia a buscar (si está presente) y posteriormente mediante técnicas específicas de detección (FISH), se obtiene la transformación de la secuencia en algo visible.

…En conclusión …

¿Que es la hibridación en situ a grandes rasgos?

¿Cómo se logra esto?

¿Que logramos con ello? o ¿Qué se produce?

Fijación :Se utiliza para preservar morfológicamente el materialBiológico. Desde el punto de vista químico existenlimitaciones en el tipo de fijación:i) Los grupos funcionales involucrados en el apareamiento de las bases estánprotegidos por la estructura de DNA.ii) El RNA es poco reactivo con agentes entrecruzantesiii) La reacción es reversible con formaldehído

Tejidos embebidos y su seccionamiento:El seccionamiento de los tejidos puede ser realizado en un criostato o embeber la muestra en una matriz para después cortarla con un microtomo. La parafina es el medio más popular para embeberTejidos , posteriormente la parafina puede ser disueltatotalmente del tejido antes de la hibridación.

Preparación del tejido

Tratamiento de la laminilla

Las laminillas se tratan para que tengan la capacidad de adherir las células otejidos y puedan ser retenidos durante los pasos subsecuentes de lahibridación in situ.Alternativamente laslaminillas se venden cargadas positivamente dando una buena adherencia.

Pretratamiento del tejido Antes del a hibridación, el tejido debe tener un pretratamiento para queincremente la eficiencia de la hibridación y minimice los pegadosinespecíficos:a) Los tejidos o secciones son usualmente tratadas con solventesorgánicos (etanol o metanol) para permeabilizar las células removiendo lasmembranas lipídicas.b) Tratamiento con proteasas para facilitar la accesibilidad al RNA deinterés. la digestión con proteasas es un paso crítico; una digestióninsuficiente o la sobre digestión puede afectar sustancialmente la intensidadde la señal así como la morfología. La digestión es seguida de una refijación,de lo contrario la desintegración del tejido ocurrirá.c) Inactivación endógena enzimática. Cuando hay una enzima es usadacomo marca, la actividad enzimática endógena puede ser inactivada.Ejemplo, para el caso de peroxidasa la muestra es tratada con 1% peróxidode hidrógeno en metanol por 30 minutos.d) Tratamiento con RNAsas. Sirve para remover RNA endógeno y puedemejorar la señal en híbridos DNA-DNA. Este tratamiento puede ser usadocomo control en hibridaciones de mRNA.e) Tratamiento con HCl. la extracción de proteínas y la hidrólisis parcial de las secuencias blanco puede contribuir a un mejoramiento en la señal.f) Tratamiento con detergentes. (si los componentes de la membranalipídica no han sido extraídos por otros procedimientos como fijación,deshidratación, incrustación e inactivación endógena de la enzima.)

Microscopiaa) De campo claro. Las imágenes son obtenidas por transmisión directa deluz a través de la muestra. Es la preferida para muchas aplicaciones rutinarias porque las preparaciones son permanentes. (ejemplo:localización de una copia de un gen, requiere el detección de atogramos deDNA).b) De campo oscuro. La luz dispersa entra a los lentes del microscopio, portanto el material aparece como un objeto iluminado en un fondo negro.Usada para experimentos radioactivos.c) De contraste de fases. Explota los efectos de la interfase producidacuando dos sets de onda se combinan. Éste es el caso cuando la luz pasa através de una parte delgada o densa de la célula (como el núcleo) y es retrasda. En consecuenia su fase es cambiada relativamente a la luz que pasa por una región adyacente (delgada) del citoplasma. Usada para detección enzimática.d) Microscopía de contraste de reflexión. Es similar a la de contraste defases. Esta técnica mide el cambio de la longitud de onda de la luz reflejadade la muestra que de la luz emitida directamente. Se utiliza para detectar una copia simple del gen sin radiactividad.

e) De fluorescencia. Contiene una lámpara para excitar fluoróforo y un filtroespecial, el cual transmite un alto porcentaje de luz emitida por el fluoróforo.es de gran utilidad para la hibridación in situ no radioactiva.f) Imágenes digitales. Puede detectar señales que no pueden ser vistas conmicroscopía covencional. La tecnología de procesamiento de imágenesprovee de un mejoramieto dn la detección de la señal como medida de datoscuantificados. Si se quieren ver imágenes en 3 dimensiones, éste es el instrumento ideal. Para análisis en tres dimensiones la microspia confocal es una alternativa.g) Microscopía electrónica. La resolución de este tipo de microscopíaresalta cuando los electrones en lugar de luz son usados, teniendo cortaslongitudes de onda (0.004 nm). El poder de resolución de los microscopioselectrónicos más modernos es de 0.01 nm. La resolución de la microscopiaelectrónica es de 0.1 nm resuelve las estructuras finas de la célula.h) Flujo citométrico. La velocidad donde la cual la fluorescencia de célulasindividuales puede ser medido con un flujo citométrico lo cual tiene muchasventajas para la cuantificación de la señal en la hibridación in situ.

Legend:

Process of creating a hybrid strand of DNA/RNAThe two strands of a DNA molecule are denatured by heating to about 100°C = 212°F (a to b). At this temperature, the complementary base pairs that hold the double helix strands together are disrupted and the helix rapidly dissociates into two single strands.The DNA denaturation is reversible by keeping the two single stands of  DNA for a prolonged period at 65°C = 149°F (b to a). This process is called DNA renaturation or hybridization.Similar hybridization reactions can occur between any single standed nucleic acid chain: DNA/DNA, RNA/RNA, DNA/RNA. If an RNA transcript is introduced during the renaturation process, the RNA competes with the coding DNA strand and forms double-stranded DNA/RNA hybrid molecule (c to d).These hybridization reactions can be used to detect and characterize nucleotide sequences using a particular nucleotide sequence as a probe.