HIBRIDACION DE ÁCIDOS NUCLEICOS

ZHARICK OROZCO

CHRISTIAN SÁNCHEZ

HIBRIDACIÓN DE ADN

• Construcción artificial de ácidos nucleicos bicatenarios a partir de dos monocatenarios, usando la complementariedad de bases

Mediante dos procesos desnaturalización y renaturalzacion

- Homoduplex ADN-ADN o ARN-ARN

- Heteroduplex ADN-ARN

PROCEDIMIENTOLa hélice de doble cadena (ADN) se separa mediante un proceso físico (calor) o químico (con una base fuerte, como la sosa cáustica-NAOH). Esto rompe los enlaces por puente de hidrógeno que mantienen unidas las dos hebras del ADN. Las dos hebras complementarias se separan, el ADN se desnaturaliza.Una muestra de cadenas simples (o desnaturalizadas) se mezcla con otra muestra de cadenas simples.

ALGUNOS FACTORES QUE INFLUYEN

• Temperatura

• PH y productos químicos

• Concentración

• Tamaño de la sonda (ADN)

• Tiempo de hibridación

MÉTODOS• FASE LIQUIDA

- DESNATURALIZACION

ADN pierde su estructura tridimensional ya sea por agentes químicos o físicos

Este proceso es útil como base

Para los procesos de hibridación

MÉTODO DE NORTHEM BLOT

• Permite determinar la cantidad y tamaño de ARN específicos presentes en preparaciones de ARN total, mensajero, o ribosómico

- Se ha utilizado para mostrar la sobre expresión de ADN o desregulación de genes

Supresores tumorales en

Células cancerosas cuando

Son comparados con

Tejidos normales

SOUTHERN BLOT

• Esta técnica se ha empleado para el diagnóstico y caracterización de diversas patologías

•  esta técnica se utiliza para analizar secuencias de ADNs foráneos, introducidos en el genoma vegetal

• - El ADN vegetal es extraído de las células y digerido con una ó más enzimas de restricción.

• - Los productos de la digestión del ADN son separados de acuerdo a su tamaño, mediante electroforesis en geles de agarosa.

• - El ADN, que ahora se encuentra en el gel, es desnaturalizado, y transferido a una membrana de nitrocelulosa. Las posiciones relativas de los fragmentos de ADN en el gel se mantienen cuando el ADN es transferido a la membrana.

• - El ADN es fijado a la membrana mediante la exposición a la luz ultravioleta, o por medio de altas temperaturas (80ºC).

• - El ADN ligado a la membrana es hibridado con una sonda de ADN ó ARN, que posee homología con la secuencia de interés. La posición de los fragmentos homólogos a la sonda puede ser detectada mediante autor radiografía o colorimetría, dependiendo del tipo de sonda utilizada.

DOT BLOT Y SLOT BLOT

•  Procederes similares al Northern con la diferencia de que el ARN no es sometido a electroforesis sino que se sitúa directamente sobre la membrana

• Este tipo de prueba es muy útil cuando se quieren estudiar gran número de muestras, pero tienen la limitante de no ofrecer

información sobre el tamaño de las bandas del ARN hibridado. 

HIBRIDACION DE COLONIAS BACTERIANAS

•  Método empleado para identificar colonias bacterianas que contengan determinada secuencia de ácidos nucleicos de interés

• consiste en sembrar los clones sobre placas

de Petri con agar para después de crecidos

transferirlos a membranas de nylon o

nitrocelulosa y luego realizar la hibridación

HIBRIDACIÓN IN SITU

• Se basa en la unión recíproca de una secuencia de oligonucleótidos (la sonda), con una secuencia complementaria de nucleótidos presente en las moléculas de ARN o ADN dentro del tejido

• Esta técnica es muy útil,

por ejemplo, para identificar

la secuencia de 

nucleótidos, en Determinadas

enfermedades de origen

genético

CHIP DE ADN• En el desarrollo de técnicas de hibridación ha llevado a la miniaturización de

los filtros de nitrocelulosa y a la utilización de matrices microscópicas en forma de chip de ADN.

• De esta manera se pueden colocar en una matriz una inmensa cantidad de copias génicas diferentes y mediante un proceso de hibridación detectar todas aquellas que tienen una secuencia parecida. Modificando las características de las moléculas presentes en la matriz así como cambiando las sondas utilizadas, las posibilidades de análisis de expresión que proporcionan los chips de ADN son enormes.

APLICACIONES

• Algunas de sus aplicaciones más frecuentes son:

• Estudio de genes, que se expresan diferencialmente en condiciones diversas (sanos/enfermos, mutantes/salvajes, tratados/no tratados).

• Clasificación molecular en enfermedades complejas. Identificación de genes característicos de una patología

• Predicción de respuesta a un tratamiento

• Detección de mutaciones y polimorfismos de un único gen (SNP)

•GRACIAS !!!