Presentacin de PowerPoint

CITOGENETICA MOLECULARINTEGRANTES:Licet Liliana VASQUEZ ROMANNoel Alexander MAMANI QUISPE

HIBRIDACION IN SITU

INTRODUCCION

HIBRIDACIONLahibridacinen Biologia Molecular es el enlace de dos moleculas de acido nucleico de caxdena simple, complementarias de acuerdo con las reglas de emparejamiento de bases.

En genetica de celulas somaticas, fusion de dos celulas somaticas a menudo de organismos diferentes para formar una clula hibrida que contiene la informacion genetica de ambos tipos de celulas.

A TRAVES DE LA HISTORIA1969 Por Gall y Pardue, jhon et al se desarrollo esta tecnica.Se empleo ovocitos de Xenopus Laevis, hibridando rRNA con rDNA extracromosomal.

HIBRIDOEs un organismo vivo animal o vegetal procedente del cruce de dos organismos de razas, especies o subespecies distintas, o de alguna o ms cualidades diferentes.

METODOS DE HIBRIDACIONLos ensayos de Hibridacin se pueden clasificar en tres grupos:

HIBRIDACION IN SITULa localizacion de un gen o de un segemento de DNA en un extendido cromosomico o en un nucleo de celulas, sobre un portaobjetos, con huso de una secuencia marcada de DNA que se debe localizar. Generalmente, conlleva el uso de sondas fluorescentes en el caso se denomina hibridacion in situ fluorescente.Es un tipo especializado de hibridacin en soporte solido en la que la sonda se aplica sobre muestras en su ubicacin natural, generalmente preparadas para microscopia.

Supone, por tanto , el empleo de hibridacin bajo un abordaje citolgico e histolgico y metodolgicamente es anloga a las tcnicas inmunocitoquimicas e inmunohistoquimicas. De forma muy global cabe distinguir entre sus aplicaciones tisular y cromosmica.

HIBRIDACION IN SITU TISULARSe realiza sobre cortes de tejido, clulas intactas, ncleos aislados en muchos casos, se lleva a cabo directamente sobre tejidos fijados con formalina, incluidos en parafina, congelados, etc.

HIBRIDACION IN SITU TISULAREs una modalidad de hibridacin particularmente para detectar virus patgenos para diagnosticas clulas cancerosas como consecuencias de cambios genticos o para estudiar cambios en la expresin gnica, detectando secuencias en el RNA celular.

HIBRIDACION IN SITU TISULAREn este caso, tras una fijacin suave se aaden sondas de DNA complementario (cDNA), de hebra sencilla. La deteccin se realiza por autorradiografa y por examen de la pelcula fotogrfica bajo el microscopio o por microscopia de fluorescencia, si se empleo este marcaje para la sonda.

HIBRIDACION IN SITU CROMOSOMICASe realiza sobre preparaciones en porta de cromosomas metafasicos y prometafasico, tratadas con fijadores para preservar las caractersticas morfolgicas del cromosoma, Para hacer accesible la secuencia de DNA, se trata la muestra con enzimas proteolticas y se desnaturaliza en DNA por calor, lcalis o formamida para permitir su hibridacin con la sonda.

HIBRIDACION IN SITU CROMOSOMICAInicialmente se empelaron sondas radioactivas, pero problemas tcnicos en la deteccin de la seal limitan su utilidad.Se a conseguido aumentar la sensibilidad y resolucin con el empleo de sondas marcadas con fluorescencia.En esta tcnicas llamando hibridacin in situ por fluorescencia o FISH, la deteccin se hace bajo microscopia de fluorescencia, bien de forma directa o por mtodo indirecto. PASOS Y CONSIDERACIONES PARA LA HIBRIDACION IN SITU

DETECCION DE SONDA MARCADA

SondasSecuencia de nucletidos complementaria de la secuencia diana a estudioMSondasSondas antisentido y sentidoSONDA ANTISENTIDO (Antisense): Secuencia de nucletidos complementaria de la secuencia dianaSONDA SENTIDO (Sense, control negativo): Secuencia de nucletidos idntica a la secuencia diana, por lo que no puede hibridarse con ellaSecuencia dianaSonda antisentidoTAAggTCCA35ATTCCAggT53ACgCATgAT53ATTCCAggT53Sonda sentidoSondasTipos de SondasSondas bicatenarias (ADN)Sondas monocatenariasNmero de hebrasSondas de ARN (Ribosondas)Sondas de ADNNaturaleza ARN Oligonucletidos

SondasTipos de SondasSondas BicatenariasMMPermiten la deteccin de ambas hebras del ADNSondasTipos de SondasSondas MonocatenariasEn ADN, permiten la deteccin de una de las hebrasMEn ARN, es complementaria a su secuenciaSondasMarcadoresSon molculas que se incorporan a un nucletido para permitir la deteccin de la sonda.MSondasMarcadoresTipos de marcadoresAntignicosFluorescentesInmunohistoqumicaVisualizacin directa (FISH)SondasMarcadoresMarcadores antignicosIncorporan molculas antignicas acopladas a la base nitrogenadaLos ms usadas son: Biotina, Digoxigenina y Fluorescena (FITC)CH2OOHOHPOOOHOHPOOHOHPOOHOHMSondasMarcadoresMarcadores fluorescentesIncorporan fluorocromos acoplados a la base nitrogenadaLos ms usadas son: Fluorescena, Rodamina, Texas redCH2OOHOHPOOOHOHPOOHOHPOOHOHMHibridacin in situProcesamiento de las muestrasFijacinPermite preservar los cidos nucleicos y la morfologa tisular DNasas RNasas! Degradacin de cidos nucleicos diana

FIJACINHibridacin in situProcesamiento de las muestrasFijadorFORMOL TAMPONADO 10%, pH 7.4, durante 24 horasProcesado rutinario de inclusin en parafinaEvitar mezclas fijadoras que contengan Hg o cidosBouinZenkerB5!33Sales de Hg: hacen inaccesibles los cidos nucleicos. cido pcrico reacciona con histonas fomando picratos que hacen inaccesibles los cidos nucleicos.Hibridacin in situProcesamiento de las muestrasSeccionesSecciones de 5 m en portaobjetos tratadosLimpieza con alcohol (microtomo, bao, ...)Esterilizacin en autoclave (pinzas, ...) Precauciones con las RNasas exgenas (condiciones de esterilidad):Uso de agua destilada en el bao para recoger las seccionesPortaobjetos de caja recin abierta!Hibridacin in situProcesamiento de las muestrasSecado de las secciones durante1 Noche a 50-55 CAlmacenamiento de las secciones desecadas a 20CSi no se realiza la HIS en los das siguientesPrecauciones con las RNasas!Hibridacin in situEtapasPretratamientoDesparafinado e hidratacinDeshidratacinDesnaturalizacinHibridacinHibridacin in situDesparafinado e HidratacinSe realizar de igual manera que la IHQLlevar la hidratacin hasta Agua Destilada EstrilPrecauciones con las RNasas!Hibridacin in situPretratamientosCalorPrecauciones con las RNasas!10 min, 95-99CBao MaraMicroondasHibridacin in situPretratamientosMedios EnzimticosPrecauciones con las RNasas!Enzimas proteolticasPEPSINA (10 min TA / 5 min 37C )PROTEINASA K (1 min TA)Hibridacin in situDeshidratacin y secadoPrecauciones con las RNasas!Evita la dilucin de la sondaLa deshidratacin se realiza con alcoholes de graduacin crecienteOH 70 OH 96 OH 100El secado lo podemos realizarAl aire / campanaEn placa trmica a 45-50CHibridacin in situDesnaturalizacinPermite la separacin de las dos hebras de ADN para que pueda ser detectada la secuencia a estudioSlo es necesaria cuando se pretenda detectar ADN y/o cuando la sonda sea bicatenariaHibridacin in situDesnaturalizacin95C durante 5Hibridacin in situHibridacinLa sonda se unir a la secuencia diana bajo unas condiciones determinadasMHibridacin in situHibridacinCondiciones de hibridacin[Na+]TemperaturaMMMHibridacin in situHibridacinTemperatura de hibridacin37C / 45C nocheTemperatura a la cual la sonda se hibridar con su dianaHibridacin in situLavados de rigor (astringency)Permiten aumentar la especificidad de la reaccin eliminando las uniones inespecficas de la sonda con secuencias parcialmente homlogasSSC 2XSSC 1XSSC 0,5XSSC: Tampn citrato salino Se realizan los lavados a 72C, 65C, 42C, 37CSistemas de DeteccinBiotinaEstreptavidinaFluorocromosAc. anti-fluorocromoFluorescencia (FISH)DigoxigeninaAc. anti-digoxigeninaSistemas de DeteccinSondas biotinadasBDeteccin mediante Estreptavidina unida a la enzima (Fosfatasa alcalina o Peroxidasa)EZEZEDianaRevelado con el cromgeno de la enzima (NBT/BCIP o DAB)Sistemas de DeteccinSondas biotinadas

EA-Peroxidasa DAB

EA-Fosfatasa Alcalina NBT/BCIPVirus JC49Papovavirus que afecta SNC de pacientes inmunodeprimidos. Causa patologa desmielinizante (leucoencefalopata multifocal progresiva).Sistemas de DeteccinAmplificacin con tiramidasBEPPDeteccin de sonda biotinada con Estreptavidina-PeroxidasaSistemas de DeteccinAmplificacin con tiramidasBEPPTBTBTiramida-biotina oxidada por la peroxidasa se une a residuos tirosina de protenas prximasTBTB51La tiramida es oxidada por la peroxidasa al reaccionar con H2O2. La tiramida activada (con radicales libres) se une covalentemente a residuos tirosina de las protenas adyacentes a la peroxidasa. Ya que la vida media de los radicales libres de tiramida es muy corta, el depsito ocurre muy prximo a la enzima y por tanto al AN diana.Sistemas de DeteccinAmplificacin con tiramidasBEPPTBEPPTBEPPTBEPPTBEPPDeteccin de la biotina de las tiramidas con ms Estreptavidina-peroxidasaRevelado con DABSistemas de DeteccinAmplificacin con tiramidasTcnica convencionalAmplificacin con tiramidasHPV

Sistemas de DeteccinAmplificacin con tiramidasCaski (600 copias HPV16)HPV

Sistemas de DeteccinAmplificacin con tiramidasSiHa (1-2 copias HPV16)HPV

Sistemas de DeteccinSondas antignicasAEDeteccin mediante un anticuerpo unido a una enzima (Fosfatasa Alcalina o Peroxidasa)Revelado con el cromgeno (NBT/BCIP o DAB)AntgenoDigoxigeninaFITCDeteccin por InmunohistoqumicaSistemas de DeteccinSondas antignicasEBV - EBER

FITCFA NBT/BCIP57EBER= Epstein Barr earlier RNA

HIBRIDACION IN SITU FLUORESCENTE

Sistemas de Deteccin

Sistemas de DeteccinSondas marcadas con fluorocromosFITCIluminacin con luz dealta frecuencia (Ultravioleta)Emisin de fluorescencia de frecuencia inferiorVisualizacin directa de la fluorescencia (FISH)Sistemas de DeteccinSondas Marcadas con FluorocromosHER-2/neu

CentrmeroGen HER2FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)

Sondas Marcadas con FluorocromosHER-2/neu

CentrmeroGen HER2FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)

Variantes (M-FISH y SKY-FISH)Consisten en marcar el ADN de cada cromosoma con un fluorocromo con espectro de emisin nico y diferenciable de lo demsSe pinta a cada cromosoma de un colorLos cromosomas anmalos aparecern no uniformestil en neos hematolgicasCaracteriza correctamente translocaciones complejas y crpticas

GRACIAS