caracterizaciÓn de los efectos locales y sistÉmicos de …
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UNIVERSIDAD CHILE FACULTAD CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
Programa Capital Humano Avanzado
Hora:
Firma:
"CARACTERIZACIÓN DE lOS EFECTOS LOCALES Y SISTÉMICOS DE lA SUPLEMENTACIÓN CON
ÁCIDOS GRASOS OMEGA-3 Y VITAMINAS ANTIOXIDANTES C Y E EN PACIENTES
SOMETIDOS A CIRUGÍA CARDÍACA CON CIRCULACIÓN EXTRA CORPÓREA".
Tesis entregada en la Universidad de Chile para optar al grado de
DOCTOR EN FARMACOLOGÍA
Por
RODRIGO LUIS CASTillO PEÑALOZA
Director de Tesis
DR. RAMÓN RODRIGO SAUNAS
Santiago, Chile 2011
2 5
UNIVERSIDAD CHILE FACULTAD CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
INFORME DE APROBACIÓN TESIS DOCTORADO
Se informa a la Dirección de Postgrado de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas de la Universidad de Chile que la Tesis de Doctorado presentada por el candidato:
RODRIGO LUIS CASTILLO PEÑALOZA
Ha sido aprobada por la Comisión Informante de Tesis como requisito
para optar al grado de Doctor en Farmacología, en el examen de defensa
de Tesis rendido el día -¿~----------~~--~~--~~------
Director de Tesis:
Dr. Ramón Rodrigo Salinas
Comisión Informante de Tesis:
Guillermo Diaz-Araya (Presidente)
Dr. Juan Carlos Prieto
Dr. Miguel Concha
Dr. Marco Arrese
2
AGRADECIMIENTOS
Al profesor Dr. Ramón Rodrigo Salinas, por ser un gran guía en este camino que comencé desde el pre-grado, quien creo firmemente reforzó mi decisión de dedicarme a la ciencia y a la discusión científica. Siempre valoraré su esfuerzo, apoyo y paciencia. A la profesora Pilar Barja por fomentarme la inquietud por la docencia.
Al personal técnico del Departamento Cardiovascular del Hospital Clínico de la Universidad de Chile y del Hospital San Juan de Dios.
Al técnico de nuestro laboratorio Diego Soto Humeres, gran persona e incansable amigo desde el pre-grado.
A mis compañeros de Laboratorio Rodrigo Carrasco, Felipe Pérez y Roberto Navarrete, por compartir mis inquietudes y locuras científicas.
A Sandra Pino enfermera del Departamento de Cirugía Cardiovascular del Hospital Clínico de la Universidad de Chile, por ayudarme con el reclutamiento de los pacientes. A Helen Venegas, Soledad Fuentes y Karla Ramos, enfermeras del Hospital San Juan de Dios, por ayudarme a que este estudio se pudiera extender a otro centro clínico.
A los Cardiólogos Mauricio Cereceda y Rubén Aguayo por participar en el seguimiento de los pacientes y a los Cirujanos Jaime Zamorano, Rodrigo Castillo-Koch, Juan Espinoza, Juan Sanz, Eli Villalabeitia y Cristián Baeza, por facilitamos las muestras para este estudio.
Dedicada a toda mifamilia por su apoyo incondicional en todos estos aiíos, mi Padre, mi Hermana Camila y mis Tíos y principalmente a mi Madre, por inculcarme la importancia de la Fe en Diós. Al Dr. Ramón Rodrigo, un tutor excepcional y gran const;fero. A Carola, mi amor cito, por su compañía y paciencia.
3
FINANCIAMIENTO
Esta tesis se realizó a través de una alianza estratégica entre el Programa de
Farmacología Molecular & Clínica, ICBM de la Facultad de Medicina de la Universidad
de Chile, el Departamento Cardiovascular del Hospital Clínico de la Universidad de
Chile y la Unidad de Cardiocirugía del Hospital San Juan de Dios.
El desarrollo de esta tesis se financió por los siguientes proyectos:
«~ Proyecto FONDECYT 1070948: "Prevención de la Fibrilación Auricular
Postoperatoria: Caracterización fisiopatológica de una Intervención
Farmacológica basada en un nuevo modelo de pre-acondicionamiento
no hipóxico."
• Beca Apoyo Tesis Doctoral2008, CONICYT no 24080117.
4
Publicaciones (2007- 2010):
Rodrigo R, Castillo R, Cereceda M, Asenjo R, Zamorano J, Araya J. Non
hypoxic preconditioning of myocardium against postoperative atrial fibrillation:
mechanism based on enhancement of the antioxidant defense system. Med
Hypotheses 2007;69:1242-1248.
Rodrigo R, Cereceda M, Castillo R, Asenjo R, Zamorano J, Araya J, Castillo
Koch R, Espinoza J, Larraín E. Prevention of atrial fibrillation following cardiac
surgery: basis for a novel therapeutic strategy based on non-hypoxic
myocardial preconditioning. Pharmacol Ther 2008;118:104-127.
Castillo R, Rodrigo R, Pizarro R, Escobar M, Cereceda M, Asenjo R, Larraín
E, Castillo-Koch R, Espinoza J, Sánchez G, Donoso P, Araya J. Nueva
estrategia de preacondicionamiento no hipóxico que atenúa el efecto de la
isquemia-reperfusión en pacientes sometidos a cirugía cardíaca con
circulación extracorpórea. Rev Chil Cardiol 2009; 28: 31-44.
Rodrigo R, Vínay J, Castillo R, Cereceda M, Asenjo R, Zamorano J, Araya J,
Castillo-Koch R, Espinoza J, Larraín E. Use of vítamins C and E as a
prophylactic therapy to prevent postoperative atrial fibrillation. lnt J Cardiol
2010;138:221-228.
Castillo R, Rodrigo R, Pérez F, Cereceda M, Asenjo R, Zamorano J,
Navarrete R, Villalabeitia E, Sanz J, Baeza C, Aguayo R. Antioxidant therapy
reduces oxidative and inflammatory tissue damage in patients subjected to
cardiac surgery with extracorporeal circulation. Basic Clin Pharmacol 2010.
[DOI 10.1111 /j.17 42-7843.201 0.00651.x]
5
Presentaciones en Congresos (2007- 2010).
Castillo R, Rodrigo R, Cereceda M, Asenjo R, Zamorano J, Araya J. Preacondicionamiento no hipóxico del miocardio contra la fibrilación auricular postoperatoria basado en un reforzamiento del sistema de defensa antioxidante. XXIX Congreso Anual de la Sociedad de Farmacología de Chile. !quique 2007.
Castillo R, Pizarro R, Cereceda M, Rodrigo R, Asenjo R, Zamorano J, Araya J. Expresión de Nox-2/Nox-4 en tejido auricular de pacientes sometidos a cirugía cardíaca con circulación extracorpórea. XXX Congreso de fa Sociedad de Farmacología de Chile. Chile. Coquimbo. 2008.
Castillo R, Rodrigo R, Pizarro R, Cereceda M, Asenjo R, Zamorano J, Rodrigo CastilloKoch, Juan Espinoza, Julia Araya. Non hypoxic preconditioning in patients subjected to cardiac surgery with extracorporeal circulation. XVII Meeting ISHR Latín American Section to be hefd with the XXVII National Congress of Cardiology (FAC) May 23-25, 2009 Buenos Aires, Argentina.
Castillo R, Rodrigo R, Pizarro R, Cereceda M, Asenjo M, Zamorano J, Araya J, Castillo-Koch R, Espinoza J, Lagazzi L. The development of postoperative atrial fibriflation in patients undergoing on-pump cardiac surgery is associated with atrial oxidative injury. Free Radicals and Antioxidants in Chile. VI Meeting of SFRBM South American Group Santiago, Septiembre, 2009.
Castillo, R, Rodrigo, R, Pizarro, R, Cereceda, M, Asenjo, R, Zamorano, J, Araya, J, Castillo-Koch, R.2, Espinoza J, L. Lagazzi, Pérez F, Navarrete R, Jimenez C. La suplementación con ácidos grasos omega 3 disminuye la ocurrencia de fibrilación auricular post-operatoria mediante la atenuación del daño oxidativo en tejido auricular de pacientes sometidos a cirugía cardíaca con circulación extracorpórea. XXXI Congreso de la Sociedad de Farmacología de Chile. Concepción, 2009.
Castillo R, Rodrigo R, Pérez F, Cereceda M, Asenjo R, Zamorano J, Castillo-Koch R, Lagazzi L, Espinoza J, Baeza C, Sanz J, Villalabeitia E, Aguayo R. Prevención de la fibrilación auricular postoperatoria basada en la suplementación con ácidos grasos omega 3 y vitaminas antioxidantes: estudio clínico, randomizado, doble ciego y placebo controlado. XL VIl Congreso Chileno de Cardiología y Cirugía Cardiovascular. 5 Diciembre 201 O.
Castillo R, Rodrigo R, Pérez F, Cereceda M, Asenjo R, Zamorano J, Navarrete R, Villalabeitia E, Sanz J, Baeza C, Aguayo R. Terapia antioxidante reduciría el daño oxidativo tisular en pacientes sometidos a cirugía cardíaca. l Simposio Radicales Libres y Antioxidantes. 3 de diciembre de 201 O. Empresa Portuaria Valparaíso
6
ÍNDICE PÁGINA
ÍNDICE DE FIGURAS . . . . . . . . . . . . . . .. . .. . . . . .. . .. . . . ... ............. .. . . . . . . . .. . .. 11
ÍNDICE DE TABLAS............................................................... 12
ÍNDICE DE ANEXOS . . .. . .. . .. . . . . .. . . . . .. ... . . . . .. . .. . .. . .. . . . . . . . .. . .. . .. . .. . ... 13
ABREVIA TU RAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . .. . . . . . . . . . . . 14
RESUMEN .......................................................................... 15
ABSTRACT . . . . . . . . . . . .. .. . . .. . . .. .. . .. . .. .. . . .. . .. . . . . .. . .. . .. .. . .. . . . . . . . . . . . .. . ... 17
FORMULACIÓN GENERAL . . . . .... . . . .. . . . . ... .. .... ... .. . .. ... . .. . .. ... . ... 19
1. Introducción....................................................................... 19
1.1 Definición y conceptos generales . . .. .. . . .. .. .. .. 19
1.2 Fibrilación auricular postoperatoria (FAPO).... 19
1.2.1 Factores de riesgo .. . . .. .. .. .. . .. .. .. .. .. .. . . . .. .. .. .... 20
1.2.1.1 Preoperatorios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.2.1.2 lntraoperatorios .. .. . .. . ... ... . .. .. .. .. . . .. .. ... 20
1.2.1.3 Postoperatorios .. .. .. .. .. .. . . . .. .. .. .. .. .. . . ... 21
1 Mecanismos de producción de fibrilación auricular
postoperatoria (FAPO)................................................. 21
1.2.2.1 Reentrada . . . . . . . . . .. . . .. . . . . . . . . .. .. . . . . .. . .. . . .. 21
1.2.2.2 Microentrada .. . . . . .. .. .. .. . . .. . .. . . .. .. .. . .. . . . . 21
1.2.2.3 Remodelación eléctrica .. .. .... .. .. .. .. .. .. . 21
1.2.2.4 Remodelación estructural ................ ..
Estrategias preventivas ................................................. .
2.1 Estimulación por marca paso epicárdico .......... ..
2.2 Fármacos ..................................................... ..
2.2.1 Antagonistas p adrenérgicos ............... ..
2.2.2 Amiodarona ....................................... ..
23
23
23
23
2.3 Nuevas terapias para la prevención de la FAPO ... 24
2.3.1 lnhibidores de la HMG-CoA reductasa .. .... 24
2.3.2 Agentes antiinflamatorios .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. 25
7
3. Participación del estrés oxidativo en el mecanismo de
producción de la FAPO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . .. . . . . . . . . . . .. ... . . . 26
3.1 Su peróxido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
3.2 Su peróxido y NADPH oxidasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 28
3.3 Peroxinitrito . ......... ............. ............... ................ 28
3.4 lipoperoxidación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 29
3.4.1 F2-isoprostanos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
3.5 Sistema de defensa antioxidante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 29
3.5.1 Sistema enzimático . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
3.5.2 Sistema no enzimático . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 29
4. Contribución del proceso inflamatorio en la FAPO ................ 30
4.1 Proteína e-reactiva (PCR) . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . .. . .. . . . . .. . . . . . 31
4.2 Recuento de leucocitos....................................... 31
4.3 Fibrinógeno ........................................................ 31
4.4 Relación del proceso inflamatorio con el estrés oxidativo 32
5. Daño estructural del parénquima miocárdico asociado a la FA 33
5.1 Modificaciones covalentes de proteínas miocárdicas 33
5.2 Upoperoxidación de los fosfolípidos de membrana 34
5.3 Remodeiación del tejido auricular por especies reactivas
del oxígeno (ERO) . . .. . . . . .. . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . .. . . . . . . . . . . .. 34
5.3.1 Factores promotores de la FA........................ 35
5.3.2 Factores promotores de FA y EO ....... ......... 35
6. Vías de señalización celular inducidas por las ERO
en la patogenia de la FAPO .............................................. 36
6.1 Papel de los factores transcrípcionales en la FAPO 37
6.1.1 Factor nuclear kappaS . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . .. . . . . . . . .. 38
Nuevos conceptos sobre el preacondicionamiento miocárdico 40
7.1 Preacondicionamiento inducido por isquemia-reperfusión 40
7.2 Nueva estrategia de preacondicionamiento ............ 41
8
7.2.1 Papel protector de los antioxidantes
no enzimáticos ........................................ 41
Papel de los ácidos grasos omega 3 ........ .
7.2.2.1 Recientes hallazgos epidemiológicos 44
8. Hipótesis del trabajo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . .. . .. . ... 46
9. Objetivo general . . . . . .. . . . .. . . .. .. . . . . . . . .. . . .. . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . .. . . . . .. . . . . .. 46
10. Diseño del estudio .................... .......................................... 47
11. Metodología . . .. . .. . . . . .. . . . . .. . . . . . . . .. .. . .. . . . . . . . . .. . . . . .. . .. . . . . . . . . . . . . . . . . ... 48
11.1 Obtención de las muestras .. . .. .. . . .. .. . .. . . . . .. . . .. . .. . .. .. . . 48
11 Variables de observación (end points) .... ................. 48
11.2.1 Primarias: detección de la FAPO ................. 48
11.2.2 Variables de observación secundarias . .. . .. . . . 50
11.2.2.1 Parámetros de estrés oxidativo . . . . . .. .. . . . . . ... 50
11.2.2.2 Parámetros de inflamación . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . ... 50
Activación del NF-KB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . ... 51
11.2.2.3 Detección de las subunidades de la NADPH
oxidasa y residuos de nitrotirosina en tejido
auricular . .. . . . . . .. . .. . . .. .. . . .. . . . . . .. . . .. . . . . .. . . . . . . . . 51
11.2.2.4 lnmunolocalización de las subunidades
de la NADPH oxidasa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . 52
11.3 Análsis estadístico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . .. . . . . . . . . . . . . .. 52
11.3. 1 Cálculo del tamaño muestra! . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 53
12. Resultados del estudio . . . . . . . . .. . . . . .. . . . . .. . .. . . . . .. . .. . .. . . . . . . . .. . . . . . . . . . . .. . .. 54
12.1 Carácterísticas clínicas de los pacientes . . . . . . . . .. . . . . . .. . .. .. 54
12.2 Variable de observación primaria . . . . . .. . .. . . . .. . .. . . ... .. . .. . .. . . 54
12.3 Variables de observación secundaria . . . .. . . . . .. . . . . . . . . ... . .. . .. 59
12.3.1 Parámetros relacionados con la ocurrencia de
en los pacientes sometidos a cirugía cardiaca . . . 59
12.3.2 Parámetros relacionados con la ocurrencia de
inflamación . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . .. . . 64
9
12.3.3 Detección de las subunidades de la NADPH
en el tejido auricular 68
12.3.4 Nitrotirosina en el tejido auricular . . . . . . . . . . . .. 71
12.3.5 Activación del NF-KB en el tejido auricular .. 73
12.3.6 Eventos adversos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
13. Discusión de los resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . ... 76
14. Conclusiones .................................................................. 84
15. Referencias . . . . . . . . . . . . . . . . . .. . .. . .. .. . . .. . .. . .. . .. . . . . .. . .. . . . . . . . .. . .. .. . . .. . .. 85
10
Figura 1 Figura 2 Figura 3 Figura 4 Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 10 Figura 11 Figura 12 Figura 13 Figura 14 Figura 15 Figura 16 Figura 17 Figura 18
ÍNDICE DE FIGURAS PÁGINA
30 39 49 55 56 59 60 61 62 63 64 69 70
72 73 74 83
11
Tabla 1 Tabla 2 Tabla 3 Tabla 4 Tabla 5 Tabla 6
ÍNDICE DE TABLAS PÁGINA
57 57 58 58 66 67
12
ANEXO 1
ANEXO 2
ÍNDICE DE ANEXOS
.......................................................
" " " ,. ., " " " ~ a " " " m a • a " " n " " a a " 11 " • " " "
PÁGINA
102
110
13
ADN: CAT: e NOS: ERO: FA: FAPO: FN-KB: FRAP: GSH: GSSG: GSH-Px: H202: !k: IR: MDA: NADPH: Noo-: NOX-2: NOX-4: ON: o2·-= OH·-: PCR: p47: p50: p65: PKC: SOD: TNF-a:
ABREVIATURAS
Ácido desoxirribonucleico Cata lasa oxido nítrico sintasa endotelial Especies reactivas del oxígeno Fibrilación auricular Fibrilación auricular postoperatoria Factor nuclear kappaB Ferric reducing ability of plasma Glutatión reducido Glutatión oxidado (disulfuro) Glutatión peroxidasa Peróxido de hidrógeno Corriente de potasio lsquemia-reperfusión Malondialdehído Nicotinamida-adenina-dinucleótido-fosfato oxidasa Peroxinitrito Subunidad catalítica de membrana de la NADPH gp91 Subunidad catalítica de membrana de la NADPH tipo 4 Óxido nítrico Radical superóxido Radical hidroxilo Proteína C reactiva Subunidad citosólica de la NADPH oxidasa Subunidad p50 Rel del FN-kappaB Subunidad p65 Rel del FN-kappaB Proteína quinasa C Superóxido dismutasa Factor de necrosis tumoral-a
14
RESUMEN
Antecedentes.- La fibrilación auricular (FA) es la complicación y el trastorno arrítmico
más frecuente que ocurre posterior a la cirugía cardíaca, con una incidencia descrita en
series contemporáneas entre 27 y 40%, dependiendo de la etiología quirúrgica. Este
acontecimiento clínico se ha asociado con la ocurrencia de estrés oxidativo e
inflamación inducida por la isquemia reperfusión (IR) posterior a la circulación
extracorpórea. Algunos estudios han cuestionado la idea de que la FA postoperatoria
podría incrementar el riesgo de muerte operatoria, a pesar de esto su ocurrencia se
asocia con otras patologías postoperatorias, con una consecuente prolongación de la
estadía hospitalaria y costos médicos. Los fármacos antiarrítmicos actualmente
disponibles para la prevención de la FA poseen una eficacia limitada, además de un
potencial efecto proarrítmico. Por lo tanto, es razonable plantear que la suplementación
con antioxidantes podría atenuar el daño sistémico y cardíaco provocado durante la
circulación extracorpórea.
Métodos y Resultados.- Este fue un ensayo clínico aleatorizado, doble ciego, controlado
por placebo que incluyó a 160 pacientes de ambos sexos, asignados a recibir
suplementación con ácidos grasos omega 3 (2g/día) , o placebo desde 7 días antes de
la cirugía cardíaca. Las vitaminas antioxidantes e (1g/ día) y E (400 Ul/día) o placebo se
agregaron desde 2 días antes de la cirugía hasta e alta. Muestras de sangre se
obtuvieron a lo largo del protocolo y de tejido auricular durante la cirugía. El estatus
antioxidante fue determinado a través de la capacidad plasmática de reducción del
hierro (FRAP), la relación glutatión reducido (GSH)/oxidado (GSSG) en eritrocito y tejido
auricular, y la actividad de las enzimas antioxidantes. La ocurrencia de estrés oxidativo
fue determinada a través de la medición de los niveles de malondialdehído (MOA),
proteínas carboniladas y residuos de nitrotirosina en tejido auricular. El recuento de
leucocitos, fibrinógeno, proteína e reactiva ultrasensible (PeR us) y la activación del
factor nuclear (FN)-kappaB en tejido auricular fueron determinados a través del
protocolo como biomarcadores de inflamación. La FA postoperatoria ocurrió en 23
(30.6%) de 75 pacientes placebo vs 7 (8.9%) de los 78 pacientes sometidos a
suplementación (RR 0.29, Cl 0.13-0.64, P=0.0018). El tratamiento con omega 3 reduce
la relación GSH/GSSG y el FRAP en 36.6 (P<0.04) y 21.5 % (P<0.004),
respectivamente. En el tejido auricular, la suplementación aumentó la actividad de las
15
enzimas antioxidantes y redujo los niveles de MOA y carbonílos en 30.2 y 29.8%,
respectivamente (P<0.01 ). En el postoperatorio precoz, los pacientes suplementados
muestran un 41% menores niveles de MOA (P<0.001) y 27.9% mayores de FRAP
(P<O.OS) vs los pacientes placebos; mientras estos últimos muestran un incremento de
1.28 veces en el recuento de leucocitos (P<0.001) y de 17.5 veces en los valores
sérícos de PCR us (P<0.001) vs los valores basales. La activación del FN-kappaB en el
tejido auricular de los pacientes suplementados fue 22.5% menor que en los placebos
(P<0.05).
Conclusiones.- El esquema de reforzamiento antioxidante aquí propuesto reduce el
riesgo de ocurrencia de la FA postoperatoria y disminuye los niveles de los
biomarcadores de estrés oxidativo e inflamación, en pacientes sometidos a cirugía
cardíaca con circulación extracorpórea. Este tratamiento, seguro y de bajo costo podría
contribuir a prevenir el daño por isquemia-reperfusión en ésta y otras situaciones
clínicas donde éste evento es inevitable.
16
ABSTRACT
Background.-Atrial fibrillation (AF) is the most common complication and rhythm
disturbance occurring after cardiac surgery, with its incidence in contemporary series
ranging between 27% and 40%, respect to surgical etiology. This clinical event has been
associated with the occurrence of oxidative stress and inflammation induced by
ischemia-reperfusion following the extracorporeal circulation. Studies have questioned
the idea that postoperative AF may increase the risk of operative death, but it has been
associated with other postoperative morbidity, with consequent prolonged hospitalization
and increased medica! costs Postoperative AF may increase the risk of operative death,
with consequent prolonged hospitalization and increased social costs. Antiarrhythmic
drugs currently available for the prevention AF suffer from limited efficacy and potential
for life-threatening ventricular proarrhythmia. Therefore, is reasonable to propase that
antioxidant supplementation could attenuate the systemic and cardiac injury induced
during extracorporeal circulation. The aim of this study was tested whether antioxidant
reinforcement reduces postoperative AF in this clinical setting.
Methods and Results.- This randomized, double-blind, placebo-controlled clinical tria!
assigned 160 either-sex patients to supplementation with omega 3 polyunsaturated fatty
acids (n-3 PUFAs)(2g/d), or matching placebo groups seven days befare on-pump
cardiac surgery. Antioxidant vitamins e (1 g/d) and E (400 IU/d) or placebo were added
from 2 days befare surgery until discharge. Blood was sampled throughout the protocol
and atrial tissue obtained during surgery. Antioxidant status was determined using
plasma ferric ion reduction (FRAP), erythrocyte and atrial tissue reduced/oxidized
glutathione (GSH/GSSG) ratio and antioxidant enzyme activity. Oxidative stress
occurrence in atrial tissue was assessed through malondialdehyde, protein carbonylation
and nitrotyrosine residues measurements. The leukocyte count, fibrinogen and high
sensitivity e-reactive protein (hs-eRP) and atrial tissue activation of nuclear factor (NF)
KappaB as inflammation-related parameters, were determined throughout the protocol.
Postoperative AF occurred in 23 (30.6%) of 75 placebo patients vs. 7 (8.9%) of 75
supplemented patients (RR 0.29, el 0.13-0.64, P=0.0018). Treatment with n-3 PUFAs
reduced erythrocyte GSH/GSSG ratio and FRAP in 36.6 (P<0.04) and 21.5% (P<0.004),
respectively. In atrial tissue, supplementation enhanced antioxidant enzymes activity, but
reduced protein carbonylation and lipid peroxidation in 30.2 and 29.8%, respectively
17
(P<0.01 ). Early after surgery, plasma of supplemented patients showed, 41.9% lower
malondialdehyde concentration (P<0.001) and 27.9% higher FRAP levels (P<0.05) vs.
placebo patients; while the latter showed an increase of 1.28-fold in leukocyte count
(P=0.005) and of 17.5-fold in serum hs-CRP levels (P=0.0001) vs. basal values. Atrial
tissue NF-KB DNA activation in supplemented patients was 22.5% lower than that in
placebo patients (P < 0.05)
Conclusions.- The antioxidant reinforcement schema proposed here, reduced the risk
of postoperative AF and ameliorated oxidative stress and inflammation biomarkers, in
patients undergoing on-pump cardiac surgery. This safe, low cost, intervention could
contribute to prevent the ischemia-reperfusion injury in this and other clinical settings
where this event is unavoidable.
18
FORMULACIÓN GENERAL DEL PROYECTO
1. Introducción
1.1 Definición y conceptos generales
La fibrilación auricular (FA) representa la arritmia más común en la población
adulta, fácilmente reconocible para el clínico, sin embargo difícil de tratar. Afecta
aproximadamente a 2.5 millones de Norteamericanos, esperándose que su incidencia
aumente al doble en los próximos 20 años (Van Wagoner, 2007). Su curso clínico
frecuentemente progresa desde una actividad ectópica esporádica a otra transitoria
terminando en un episodio de FA propiamente tal (paroxística). Si esto se mantiene, los
episodios se incrementan en duración, llegando a ser persistentes (no convirtiendo a
ritmo sinusal sin intervención o cardioversión) o permanentes (manteniéndose aún
posterior a la cardioversión) (Budeus et al., 2007).
Fisiopatológicamente, la progresión de FA paroxística a persistente, y de
persistente a permanente involucra complejos cambios a nivel eléctrico, funcional y
estructural (remodelación) tanto en los cardiomiocitos auriculares (miólisis, hipertrofia,
cambios en la densidad o distribución) como también en la estructura de la cámara
auricular (dilatación, incremento de la fibrosis, infiltración grasa). El proceso de
remodelación eléctrica ocurre rápidamente y es al inicio reversible; por el contrario, las
modificaciones estructurales ocurren más lentamente y pueden ser más permanentes,
aún irreversibles con tratamiento farmacológico adecuado. (Thijssen et al, 2001 ).
1.2.- Fibrilación auricular postoperatoria
La FA postoperatoria (FAPO) ocurre frecuentemente como complicación de la
cirugía cardíaca con circulación extracorpórea, asociándose con aumento en la estadía
hospitalaria, costos médicos y mortalidad global. Esta arritmia presenta una alta
incidencia, entre 27 y 40%, a pesar de la optimización en las técnicas anestésicas,
quirúrgicas, tratamiento médico y a la amplia utilización de antiarrítmicos como
betabloqueadores y amiodarona (Wang et al., 2003).
19
1. 2. 1 Factores de riesgo:
1.2.1.1 Preoperatorios
Algunos factores predisponentes para el desarrollo de FA están más claramente
establecidos que otros. La edad tiene una muy buena correlación con el desarrollo de
FAPO y ha sido establecida como un factor de riesgo predictor independiente de otras
variables clínicas (Mathew et al., 1996, Zaman et al., 2000). En efecto, la incidencia
aumenta un 50% con cada década de vida, con lo cual aproximadamente un tercio de
los pacientes sobre los 70 años desarrolla FAPO (Aimassi et al., 1997). El antecedente
de FA previa y la presencia de enfermedad valvular también predisponen a este tipo de
arritmias ya que el sustrato que contribuye a la génesis y perpetuación del trastorno ya
está presente (Vaporciyan et al., 2004). Estudios también demuestran que el desarrollo
de FAPO es mayor en aquellos pacientes que la onda P es más larga. El valor
predictivo positivo de la dispersión de la onda P y su concordancia con parámetros de
función ventricular ha sido recientemente demostrado en pacientes sometidos a cirugía
de bypass coronario (Dogan et al., 2007).
Recientemente, se desarrolló un modelo de regresión logística con 14
indicadores. Aquellos que mostraron mayor fuerza de predicción fueron la edad del
paciente, la necesidad de ventilación mecánica prolongada (24 h o más), realización de
bypass cardiopulomonar, y presencia de arritmias preoperatorias, todos estos
permitirían sustentar un manejo profiláctico más agresivo (Magee et al., 2007).
1.2.1.21ntraoperatorios
La FAPO se puede iniciar y perpetuar a partir de descargas focales del tejido
auricular localizado en la cercanía del ostium de las venas pulmonares (Van Wagoner,
2007). La inclusión de las venas pulmonares en la atriotomía, parece incrementar el
riesgo de FA, esto debido a que el estímulo gatillado desde esta zona condiciona una
reentrada más prolongada. En este contexto, los estímulos provenientes de esta zona
pueden propagarse y sumarse a otros frentes de la activación normal en aurículas
susceptibles, inciando así la actividad asincrónica (Melnyk et al., 2005). Otros hallazgos
relacionarían más el tiempo de la duración del bypass y el tipo de cardioplejia con el
desarrollo de FA (Hakala et al., 2004).
20
1.2.1.3 Postoperatorios
La FAPO se acompaña de 2 tipos de complicaciones: dependencia de
marcapaso auricular y complicaciones respiratorias. La necesidad de marcapaso puede
llevar a FA ya que esto podría representar la preexistencia de una disfunción del nodo
sinusal, que predispone en un alto porcentaje a FAPO. Por otra parte, es difícil distinguir
la causa-efecto de algunas complicaciones respiratorias con FAPO. La neumonía, la
ventilación mecánica prolongada (Manganas et al., 2007) y la descompensación de la
enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) (Mathew et al., 2004), se han
asociado a una alta incidencia de FAPO.
Recientemente, estudios clínicos están en concordancia con la utilización de
estrategias de postcondicionamiento, definido como cortos ciclos de isquemia
intermitente alternados con fases de reperfusión aplicados posterior al evento isquémico
mayor. La aplicación de este diseño reduciría el tamaño del infarto e injuría miocárdica,
aún en presencia de múltiples comorbilidades (Vinten-Johansen et al., 2007).
1.2.2 Mecanismos de producción de fibrilación auricular postoperatoria
Existen diversos mecanismos involucrados en el desarrollo de la FAPO. El
aumento del tono simpático del período postquirúrgico, la inflamación pericárdica, la
presencia previa de fibrosis y dilatación auricular (Amar et at., 2003, Olshansky, 2005)
son algunos de los factores más involucrados que caen en la categoría de no
modificables. Sin embargo, existen entidades fisiopatológicas claves en la cadena de
eventos que llevan al desarrollo de una FAPO, entre ellas:
1.2.2.1 Reentrada. En condiciones de fibrosis existen alteraciones en la
conducción intra e interauricular, lo que favorece la génesis de arritmias. En este
escenario, se pueden producir múltiples focos de reentrada dentro de la aurícula, los
que al descargar caóticamente hacen fibrilar el tejido auricular (Waldo, 2003).
1.2.2.2 Microentrada. En el caso de existir bradicardia, estos focos pueden
generar extrasístoles, los que son seguidos de pausas, las cuales producen aún más
dispersión de la refractariedad, y así más probabilidad de generar microentradas, con la
consecuente probabilidad de fibrilación del tejido auricular (Jensen et al., 2004).
1.2.2.3 Remodelación eléctrica. La FAPO una vez iniciada, resulta en cambios
electrofisiológicos (por ej., acortamiento del período refractario) que predisponen a
mantener el trastorno o a reiniciar una actividad eléctrica anormal después de terminado
el episodio. Además, se ha descrito que el desarrollo de FA persistente cambiaría la
21
función y expresión de canales iónicos presentes en las uniones intercelulares de los
cardiomiocitos (por ej conexinas), alterando la conducción eléctrica en el tejido auricular
(Polontchouk et al., 2001 ). Otro hallazgo común en el estudio de la remodelación
eléctrica lo constituye la evidencia de regulación negativa del canal de calcio tipo-L.
Esta corriente es un elemento principal en el acoplamiento excitación-contracción en el
miocardio y una importante determinante tanto de la duración del período refractario
efectivo como de la contactilidad auricular. El mecanismo por el cual se produce la
regulación negativa de este tipo de intensidad de corriente podría ser resultado de una
modulación transcripcional, sin embargo este efecto no está completamente
caracterizado (Lenaerts et al., 2009).
1.2.2.4 Remodelación estructural. Es el factor dominante que facilita la
mantención y persistencia de la FA (Everett et al., 2007) Las modificaciones
ultraestructurales resultan en una conducción auricular heterogénea y el
desacoplamiento en la conducción eléctrica vectorial, fenómenos progresivos que se
relacionan con las comorbilidades previas del paciente y otros factores que sustentan
cambios mayores en la arquitectuta miocárdica como la dilatación auricular (Sitges et
al., 2007). En este punto, la reducción del diámetro de la cámara auricular mejora la
respuesta en la conversión a ritmo sinusal después de una ablación por radiofrecuencia
en pacientes sometidos a cirugía cardíaca (Scherer et al., 2007).
La dilatación de la aurícula izquierda durante la ocurrencia de la FAPO puede
contribuir a perpetuar la arritmia. Sin embargo esto sería evitable hasta cierto punto con
la mantención de un ritmo sinusal. Se sabe por ejemplo, que los pacientes sometidos a
cirugía cardíaca por etiología valvular tienen basalmente más dilatada su aurícula
izquierda (Chen et al., 2005). Además, la ocurrencia de FA paroxística en pacientes con
elevados valores de PCR, está asociada con dilatación de la aurícula izquierda y
disminución de su función contráctil, independiente de la hipertorfia y función ventricular
(Dernellis & Panaretou, 2006).
22
2. Estrategias preventivas
Diversas intervenciones preventivas han sido evaluadas sin resultados
uniformes.
2.1 Estimulación por marcapasos epicárdico auricular. Esta intervención es
considerada antiarrítmica ya que logra un control de la frecuencia cardiaca previniendo
las consecuencias arritmogénicas de la bradicardia e irregularidad del intervalo
electrocardiográfico RR (Daubert & Mabo, 2000). Es conocido también que al no
producirse FA no hay remodelación patológica que la autoperpetúe (Shiroshita
Takeshita et al., 2005).
2.2 Fármacos
2.2.1 Antagonistas B adrenérgicos
Los fármacos p bloqueantes (propanolol, atenolol, metoprolol) ejercen su efecto
bloqueando la acción cronotrópica e inotrópica positiva de las catecolaminas sobre los
receptores f31, resultando en una disminución de la contractilidad y frecuencia,
respectivamente. Dado el incremento del tono simpático que se aprecia en los pacientes
sometidos a cirugía cardiotorácica, es posible plantear que el tratamiento con p
bloqueadores podría ser efectivo en disminuir la FAPO (Workman et al., 2006).
El carvedilol, un beta bloqueador no selectivo de los receptores (3 1 y a1 , ha
mostrado prolongar la sobrevida en pacientes con insuficiencia cardíaca congestiva y
post-infarto al miocardio (Remme et al., 2007). Datos recientes indican que el carvedilol
tendría un perfil farmacológico distinto al de otros betabloqueadores, lo que podría
hacer más eficaz su utilización en prevenir la FAPO en variadas condiciones clínicas
(Celik et al., 2009). De esta forma su cardioprotección se basaría no sólo en su efecto
betabloqueante sino a sus propiedades antioxidantes y antiinflamatorias (Acikel et al.,
2008). La administración de este fármaco incrementa significativamente los niveles de
las enzimas antioxidantes superóxido dismutasa y glutatión peroxidasa, a diferencia de
otros betabloqueadores beta-1 selectivos como el metoprolol (Arumanayagam et al.,
2001 ). En un reciente estudio prospectivo, el tratamiento preoperatorio con carvedilol fue
más efectivo que el metoprolol en reducir la FAPO (Haghjoo et al., 2007). Estos
hallazgos sumados a otros tipos de evidencia clínica, sugieren que el uso preoperatorio
de betabloquedores es más efectivo que el postoperatorio en la profilaxis de ésta
arritmia.
23
2.2.2 Amiodarona
Es un antiarrítmico clase 111 que combina efectos sobre el canal de potasio,
sodio, calcio, además de propiedades antiadrenérgicas (Singh, 2008). La efectividad
de la amiodarona se debe a que al bloquear el componente tardío del canal
rectificador de potasio (IKr) en cardiomiocitos prolonga la duración del período
refractario efectivo tanto en tejido auricular como ventricular. Múltiples metanálisis han
examinado el efecto de la amiodarona en la FAPO. Uno de ellos combinó datos de 10
estudios y reportó una significativa disminución en la incidencia de esta arritmia (riesgo
relativo de 0.64 a 0.55, con IC de 0.75) comparando grupo con amiodarona versus
placebo (Aasbo et aL, 2005). A pesar de que el uso a corto plazo es seguro y efectivo,
existen ciertos aspectos que es necesario puntualizar. Primero, existen varios estudios
que avalan el uso y superioridad de la amiodarona para prevenir la FAPO (Solomon et
al., 2001 ), sin existir un efecto claro en la duración de la estadía hospitalaria. Segundo,
se pueden producir serios eventos adversos secundarios a su administración,
incluyendo algunos efectos tiroídeos y toxicidad pulmonar, evidentes clínicamente si
se opta por esta estrategia (Punnam et al., 201 0). Finalmente, la ocurrencia de
bradicardia y otros eventos adversos podría ser más evidente con el uso de
amiodarona en pacientes que estén con dosis máximas de betabloqueadores. Por lo
tanto, no existe suficiente evidencia actualmente para recomendar la amiodarona por
sobre los betabloqueadores para la profilaxis de la FAPO.
2.3 Nuevas terapias para la prevención de la FAPO
2.3.1 lnhibidores de la HMG-CoA reductasa
Debido al papel que involucraría a la inflamación en el desarrollo de la FAPO, el
tratamiento preventivo con estatinas sería una opción valida. Estudios han mostrado el
efecto preventivo de las estatinas tanto sobre la recurrencia de FA posterior a una
cardioversión eléctrica (Tveit et al., 2004; Ozaydin et aL, 2006), como después de una
cirugía torácica. Sin embargo, Amar y colaboradores (2005) mostraron que la reducción
de la fibrilación auricular posterior a una cirugía torácica por causa no cardiovascular
sería independiente de la reducción de algunos marcadores inflamatorios como la PCR
e IL-6. Los mecanismos exactos de este efecto antiinflamatorio no son bien
comprendidos actualmente. En parte, se sabe que estos compuestos estabilizan a las
células endoteliales reduciendo la expresión de mediadores inflamatorios como
citoquinas y moléculas de adhesión celular (lssac et al., 2007), lo que atenuaría la
24
injuria endotelial inplicada en el daño en el tejido miocárdico, factor contribuyente al
desarrollo de FAPO y al proceso de remodelación implicado en su perpetuación.
2.3.2 Agentes antiinflamatorios
El papel de agentes con potencial antiinflamatorio ha sido propuesto. Cheruku y
colaboradores (2004) puso a prueba esta hipótesis para lo cual randomizó a 100
pacientes sometidos a cirugía de by pass coronario quienes recibieron ketorolaco
seguido de ibuprofeno o control. La combinación de ambos antiinflamatorios no
esteroidales redujo significativamente tanto la incidencia de FAPO como la estadía
hospitalaria con respecto a los individuos controles. Sin embargo existen también
evidencias de que el uso de ciertos inhibidores de la ciclooxigenasa 2 (COX-2)
incrementarían significativamente el riesgo de eventos cardiovasculares (incluyendo
infarto al miocardio, infarto cerebral y tromboembolismo pulmonar) (Nussmeier et al,
2005). Por lo tanto la evidencia actual es contradictoria.
Por otra parte, el uso de corticosteroides parece reducir la ocurrencia de FAPO a
dosis intermedias (Prasongsukarn et al., 2005). Sin embargo, la ausencia de datos que
den cuenta del uso agregado de corticosteroides a otras terapias ya probadas, tales
como amiodarona y betabloqueadores, apoyan un uso restringido de estos agentes y
estudios randomizados a largo plazo.
La evidencia actual disponible para la profilaxis farmacológica de la FAPO es
inconsistente, con tasas variables de recurrencia y eventos proarrítmicos. El uso de 13
bloqueadores perioperatorios y la adición de amiodarona reduciría la incidencia de esta
arritmia aproximadamente en un 50% (Baker et al., 2007). La suplementación con
magnesio o fármacos antiinflamatorios (estatinas o corticosteroides) podrían también
reducir eventos proarrítmicos en el postoperatorio inmediato. Sin embargo, el impacto
combinado de estas terapias sobre indicadores de mortalidad y estadía hospitalaria no
ha sido evaluado. Datos sobre otras aproximaciones farmacológicas preventivas están
disponibles, tales como el uso de ácidos grasos poliinsaturados omega 3. Estudios
clínicos han mostrado que un incremento en el consumo de aceite de pescado
(Mozaffarian et al., 2005) o suplementos orales de estos PUFA reducirían la incidencia
de FA tanto como arritmias ventriculares en pacientes con infarto al miocardio (Marchioli
et al., 2002) y algunos usuarios de defibriladores implantables, aunque en esta última
condición no existe evidencia sólida (Leaf et al., 2003; Brouwer et al., 2009).
25
3. Participación del estrés oxidativo en el mecanismo de producción de la
FAPO
El procedimiento técnico aplicado en las cirugías cardíacas implica una injuria
contra el tejido miocárdíco, fundamentalmente derivada de los cambios de perfusión, y
por ende, de oxigenación, dando lugar por esta vía a la formación de especies reactivas
del oxígeno (ERO). Estas especies radicalarias se pueden generar por varios
mecanismos tales como la respiración mitocondrial, activación de neutrófilos y algunas
de ellas por la actividad de algunas enzimas productoras de ERO (Dhalla et al., 2000).
La producción de radicales libres en la fase temprana de la reperfusión, en combinación
con la disminución de la actividad antioxidante inducida por isquemia reperfusión (IR),
hacen al tejido miocárdico extremadamente vulnerable. Dentro de estos, el anión
superóxido (021 el radical hidroxilo (OH-) y el peroxinitrito (Noo-) han demostrado
participación en el mecanismo de daño tanto en distintos modelos experimentales,
como en individuos sometidos a trombolisis post infarto (Muzáková et al., 2000), a
angioplastía percutánea (Himmetoglu et al., 2009) o a cirugía cardiotorácica (Ramlawi et
al., 2007).
Las membranas están compuestas mayoritariamente por fosfolípidos y
proteínas. Alteraciones en las proteínas de membrana por estas ERO son factores
importantes en la evolución del daño del tejido auricular por IR. En el caso de los lípidos
la lipoperoxidación y la pérdida de la integridad de membrana desencadenan una serie
de procesos que llevan a muerte celular (Nakamura et al., 2009).
Además las ERO actúan en forma de mediadores o mensajeros, gatillando
señales intracelulares. Así, se pueden activar factores transcripcionales sensibles al
estado redox celular, tales como NF-KB, lo cual a su vez activa la expresión de genes
proinflamatorios (Xiao, 2004). Una vez iniciado el proceso inflamatorio se produce la
transmigración y activación de los leucocitos, lo que contribuye a potenciar el estrés
oxidativo a nivel local, junto con la liberación de mediadores como citoquinas,
quimioquinas y moléculas de adhesión, todo lo cual va a exacerbar el daño tisular,
pudiendo incluso generarse zonas de necrosis de la fibra miocárdica. El paso siguiente,
la reparación involucra el riesgo del depósito de colágeno en la matriz extracelular,
proceso de fibrosis intersticial que afectaría las propiedades funcionales, tanto eléctricas
como mecánicas del miocardio. Así, estudios in vítro han demostrado que la función
contráctil de los cardiomiocitos puede ser afectada por las ERO al alterarse el ciclo del
26
calcio y como consecuencia, la sensibilidad de los miofilamentos a esta aumento de
concentración (Talukder et al., 2007).
3.1 Superóxido.
La principal fuente de 0 2- del sistema cardiovascular es la enzima Nicotinamida
Adenina-Dinucleótido-Fosfato (NADPH) oxidasa, con 5 subunidades, presentes en la
membrana celular y citoplasma, cuyo ensamblaje forma un complejo activo para
producir 0 2- a partir de la molécula de oxígeno (Selemidis et al., 2008). Existe evidencia
que muestra que la producción de superóxido, vía NADPH oxidasa, en homogeneizados
de cardiomiocitos auriculares de pacientes que desarrollan FAPO se encuentra
significativamente aumentada, así como también a través la vía de la xantino oxidasa
(Dudley et al., 2005). Además de la producción de 0 2 - a través de la NADPH oxidasa
de las células residentes en el miocardio, se debe tener en cuenta que este efecto
puede ser exacerbado por la enzima homóloga presente en los leucocitos activados, los
cuales durante el proceso inflamatorio son reclutados por el tejido (Griendling et al.,
2000). Otra fuente de 0 2 - en cardiomiocitos es la enzima óxido nítrico sintasa
desacoplada (eNOS), la que sería un factor importante en la producción de ERO a nivel
mitocondrial (Wolin & Gupte, 2005). En este punto, es importante mencionar que uno de
los cofactores esenciales para la mantención de la capacidad funcional de la eNOS es
la tetrahidrobiopterina (BH4) ya que mantiene a la enzima en su forma dimérica. Sin
embargo, la BH4 a su vez, es altamente vulnerable a los procesos oxidativos y al
oxidarse se produce un desacoplamiento de la eNOS, la cual comienza a producir 0 2 -
en lugar de óxido nítrico (NO). El ácido ascórbico contribuye a evitar este desajuste
metabólico, preservando la formación hacia NO (Heller et al., 2001; Werner et al., 2003).
Además, el efecto negativo de las ERO en el metabolismo energético se evidenciaría en
varios estudios que muestran descargas rápidas y heterogéneas del potencial de la
membrana mitocondrial en respuesta a la ocurrencia de estrés oxidativo (Bukowska et
al., 2008). Estas transiciones en la bioenergética mitocondrial activarían corrientes de
potasio (IK) causando oscilaciones en la duración del potencial de acción, lo que
contribuiría a la génesis de arritmias durante la IR temprana, como la que ocurre en la
FAPO (Aon et al., 2003).
27
3.2 Superóxido y NADPH oxidasa.
Se ha establecido que la producción de aniones superóxido por parte de la
NADPH oxidasa jugaría un papel crítico en la fisiopatología de las alteraciones
cardiovasculares, incluyendo la FA (Heymes et al., 2007). El aumento de la producción
de ERO por esta vía puede tener importantes consecuencias en la generación y
mantención de la fibrilación auricular (Goette et al., 2004). Así, la eNOS desacoplada
llevaría a un aumento en el consumo de oxígeno (Adler et al., 2003) y a una
exacerbación de la respuesta [3-adrenérgica (Sears et al., 2004), alteraciones que
contribuirían a la persistencia de la FA. Se ha determinado que las subunidades Nox-
2/gp91 phox y Nox-4 de la NADPH oxidasa son las más características y abundantes en
cardiomiocitos (Cave, 2009). La expresión de la subunidad Nox-2 aumentaría en casos
de infarto (Krijnen et al., 2003) y jugaría un importante papel en la FA. Por otra parte, la
expresión de la subunidad Nox-4 ha sido implicada en la formación de ERO por parte
del endotelio (Hu et al., 2005) pero no en tejido cardíaco. Actualmente se desconoce su
relación con la aparición de FAPO.
3.3 Peroxinitrito.
Se forma de la reacción del 0 2- con NO, de elevada constante de velocidad,
cuyo valor sobrepasa al de la reacción del primero con la superóxido dismutasa. El
producto de la reacción, peroxinitrito (Noo-), es una molécula altamente peroxidante, es
decir, eleva la lipoperoxidación debido a que forma radical libre hidroxilo por su
descomposición. También, el Noo- interviene en reacciones de nitracíón de residuos de
tirosina de las proteínas (Mihm et al., 2001 ), además de nitrosilación (oxidación de
grupos sulfhidrilo) (Ascenzi et al., 2007), modificaciones de tipo covalente que alteran
las propiedades estructurales y funcionales, pudiendo favorecer el desarrollo de FA.
Además el Noo- puede oxidar las proteínas y DNA celulares, promoviendo la muerte
celular del cardiomiocito via necrosis y/o apoptosis (Han et al., 2008). En el caso de
ciertos estados proinflamatorios como condicionantes de FAPO (EIIinor et al., 2006),
últimamente, se ha descrito un nuevo mecanismo en que ciertas modificaciones post
traduccionales como la nitración por NOo- de la subunidad p65 de NF-KB induce su
disociación del complejo y unión a su inhibidor (lkappaB) con la consecuente
disminución de este factor a sus elementos de respuesta en el ADN (Park et al., 2005).
28
3.4 Lipoperoxidación.
Se ha demostrado que los pacientes sometidos a cirugía no congénita, muestran
una correlación negativa entre los productos de lipoperoxidación y la fracción de
eyección ventricular izquierda (De Vecchi et al., 1998; Milei et al., 2007) lo cual indica
efectos funcionales del estrés oxidativo que serían compatibles con la depresión de la
función miocárdica del 50% de los pacientes, en el período postoperatorio temprano (6-
8 h). Además, los niveles de malondialdehido, producto de lipoperoxidación, se
incrementarían secundarios al proceso de IR en la etapa precoz, aumentando el riesgo
de desarrollo de FA (Hicks et al., 2007).
3.4.1 F2 isoprostanos.
La peroxidación no enzimática del ácido araquidónico resulta en la formación de
F2 isoprostanos, otro producto de lipoperoxidación (Balboa & Balsinde et al., 2006; Voss
et al., 2006). Estos productos han sido descritos como potenciales factores de riesgo
cardiovascular in vivo (Shishehbor et al., 2006), incluso los niveles de 8-isoprostanos
podrían ser utilizados como factores pronósticos de severidad, por ejemplo en
insuficiencia cardiaca y mortalidad cardiovascular (Polidori et al., 2004; LeLeiko et al.,
2009). Últimamente, su medición ha sido valorada para evaluar el estrés oxidativo en
pacientes sometidos a cirugía valvular (Cavalca et al., 2006), uno de los factores de
riesgo preoperatorios que más contribuirían al desarrollo de FAPO.
3.5 Sistema de defensas antioxidantes.
3.5.1 Sistema enzimático.
Las enzimas antioxidantes catalasa (CAT), superóxido dismutasa (SOD) y
glutatión peroxidasa (GSH-Px) constituyen la primera línea de defensa. Es así como la
actividad de estas enzimas en el miocardio condiciona la susceptibilidad de este tejido
frente al efecto deletéreo de las ERO (Akila et al., 2007), sobretodo en el caso de ciertos
modelos de IR (Ruixing et al., 2006; Sharma et al., 2006), como también en el aumento
de la respuesta de ciertos antioxidantes endógenos por administración de agentes
quimioterapéuticos (Cao et al., 2006).
3.5.2 Sistema no enzimático.
Los pacientes que han sido sometidos a una cirugía cardíaca no solamente
tienen una elevación de los productos de lipoperoxidación en el plasma (Zhao et al.
2003); sino que además presentan disminución de los niveles de glutatión cardíaco y
ubiquinol, reflejo del aumento de ERO, cambios que persisten al menos durante las
29
primeras horas postoperatorio
disminución estatus en este tipo
correlacionaria con el incremento del m<:~lolnmalclen
(Corcoran al., 2006).
et la
cirugías calrOI<:'ltorac:lcc!S se
primeras
figura 1 representa las fuentes enzimáticas y no enzimáticas en
miocardio y sus potenciales las biomoéculas. Cabe destacar también que
estas especies pueden como segundos mensajeros en procesos fisiológicos.
Figura 1. Metabolismo de las especies reactivas de oxígeno {ROS) en el miocardio y sus efectos sobre las biomoléculas. Ü2·-, aníon superóxido; H202. peróxido de hidrógeno; ·OH, radical hidroxilo. (Modificado, Becker, 2004)
4. Contribución del proceso inflamatorio en la FAPO
inflamación un ímportante no sólo en mecanismo patogénico de
la sino que también en su mantención (Hatzinikolaou-Kotsakou et al., 2006),
participando en la remodelación estructural del tejido cardiovascular, lo cual influye
directamente sobre el sistema excito-conductor y sobre sus principales efectores,
canales iónicos (Korantzopoulos al., 2005a; Nattel et Los siguientes
indicadores contribuyen a sustentar la participación la inflamación en la fisiopatología
de la
30
4.1 Proteína e-reactiva {PCR).
Es una proteína de fase aguda presente en gran parte de los procesos
inflamatorios que muestran correlación positiva con la presencia de FA (Chung et al.,
2001; Malouf et al., 2005) y probablemente es un factor de riesgo para el futuro
desarrollo de eventos arrítmicos (De Sutter et al., 2006; Liu et al., 2007). Además, los
niveles de PCR se encuentran elevados incluso 24 horas después del comienzo de la
FA surgiendo para la PCR un papel como promotor de persistencia (Acevedo et al.,
2006). Actualmente, la PCR ultrasensible (hsPCR) se considera un mejor indicador de
riesgo de FA que su predecesora. Pacientes con niveles elevados de hsPCR poseen un
importante riesgo de desarrollar patologías cardiovasculares, pese a que puedan
mostrar normalidad en los niveles de PCR (Ben-Yehuda, 2007; Ridker, 2007). Sin
embargo, la correlación de hsPCR con la incidencia de FAPO aún no ha sido
documentada en forma consistente.
4.2 Recuento de leucocitos.
Diversos procesos inflamatorios, incluyendo el que se produce como un evento
posterior a la cirugía cardiaca, conllevan elevación del recuento de leucocitos,
habiéndose señalado que si este es de gran cuantía, predeciría la aparición de FAPO
(Amar et al., 2005; Lamm et al., 2006). Algunos monocitos como el tipo CD11 b
aumentan significativamente en en perioperatorio en los pacientes que desarrollan
FAPO (Fontes et al., 2005), sugiriendo que la inducción de inflamación celular durante
la cirugía cardíaca puede contribuir en la patogenia de ésta arritmia.
4.3 Fibrinógeno.
Durante una respuesta inflamatoria se genera un estado procoagulante, con la
participación de citoquinas inflamatorias (IL-6, IL-1, etc.), fibrinógeno, factor tisular, entre
otros (Kerr et al., 2001). Niveles elevados de 1 L -6 y fibrinógeno fueron observados en
pacientes sometidos a cirugía de bypass coronario que posteriormente desarrollaron
FAPO (Gaudino et al., 2003; lshida et al., 2006). La persistencia de este estado
protrombótico llevaría a alteraciones estructurales que favorecerían el desarrollo y la
mantención del fenómeno arrítmico (Conway et al., 2004).
31
En los últimos años se ha observado que pacientes con arritmias crónicas
poseen un daño oxídativo importante mediado principalmente por ERO (Cha et al.,
2003; Murray et al., 2007). Las ERO pueden activar factores de transcripción como el
FN-KB, AP-1, AP-2 y p21 ras, los cuales juegan un papel crucial en la proliferación,
diferenciación y morfogénesis celular (Wu et al., 2005; Qi et al., 2008). El factor de de
transcripción FN- KB tendría un papel crucial en la regulación de la respuesta
inflamatoria y si bien se ha demostrado que su bloqueo disminuye la remodelación
ventricular y la falla cardíaca postinfarto (Kawano et al., 2006), su papel en FA no ha
sido bien caracterizado. Sin embargo, resulta razonable suponer su participación,
debido a que se conoce la importancia de su efecto en la activación de genes
proinflamatorios. Como consecuencia, se produciría aumento de citoquinas como la IL-
6, proteínas de fase aguda (PCR) y elementos procoagulantes (fibrinógeno), además de
elevar el reclutamiento de leucocitos, lo cual llevaría a exacerbar el estado inflamatorio
sistémico, hecho que permitiría la génesis y mantención de la FA.
4.4.- Relación del proceso inflamatorio con el estrés oxidativo
La cirugía cardíaca puede inducir un estado inflamatorio sistémico (síndrome de
respuesta inflamatoria sistémica, SRIS), cuyos mecanismos celulares de generación
incluyen la participación de ERO, y la mediación de factores de transcripción
citoplasmáticos como el FN-KB, el cual es clave en la regulación de la respuesta
inflamatoria, inmune, proliferativa y apoptótica de las células (Yamamoto and Gaynor,
2001; Yeh et al., 2007). En el caso del FN-KB, las ERO, especialmente H20 2 , actuarían
al menos a dos niveles: 1) oxidación de kinasas claves en la activación de IKB Kinasa la
cual activa al FN-KB (Mabb et al., 2006) y, 2) Modulación del transporte de este factor
desde el citoplasma al núcleo (Kabe et al., 2005; de Oliveira-Marques et al., 2007). El
SRIS tiene una modalidad leve, pero con ocasión de cirugías prolongadas o elevación
exagerada de citoquinas séricas, en especial IL-6, puede progresar a un estado
inflamatorio sistémico severo, con consecuencias letales (lshida et al., 2006; Magovern
et al., 2007) y es probable que el estrés oxidativo determine esta diferencia. Por lo tanto
resulta esperable y promisorio poder intervenir para disminuir la incidencia de FAPO,
mediante la reducción del estrés oxidativo y/o respuesta inflamatoria.
32
5. Daño estructural del parénquima miocárdico asociado a la
La FA provoca alteraciones estructurales que favorecen su mantención en el
tiempo (Schotten et al., 2003), las cuales han sido englobadas en el término
remodelación, definido como aquellas alteraciones electrofisiológicas y estructurales
que promueven la mantención y recurrencia de la FA (Khairy & Nattel, 2002; Nattel et
al., 2007). Se ha señalado ampliamente que la fisiopatología de la FA aguda sería
completamente distinta de la crónica; sin embargo, en los últimos años estudios
moleculares han revelado la ocurrencia de eventos similares en ambas patologías,
sugiriendo entonces un origen fisiopatológico común (Leung et al., 2004; Van Wagoner,
2007), pero con temporalidades distintas.
5.1 Modificaciones covalentes de proteínas miocárdicas
Las proteínas pueden ser blanco de las ERO, lo que conduce a cambios
covalentes de su estructura, básicamente por carbonilación (Esme et al., 2006; Aldini et
al., 2006) (mediada por el radical hidroxilo), nitración (mediada por peroxinitrito) (Mihm
et al., 2001; Carnes et al., 2001; Ascenzi et al., 2007) y nitrosilación (grupos sulfhidrilo)
(Viner et al., 1999; Maejima et al., 2005). Bajo condiciones de estrés oxidativo, el o2-reacciona ávidamente con NO para formar peroxinitrito, altamente peroxidante y que
además de inducir lipoperoxidación, puede causar nitración de residuos aromáticos de
las proteínas como tirosina, que es irreversible y puede impedir las reacciones de
fosforilación o adenilación de proteínas regulatorias, lo que lleva a la pérdida del control
energético de la célula (Mihm et al., 2002). Hay evidencias que los pacientes con FA
tienen un aumento de la nitración y carbonilación de las proteínas miofibrilares; con
mayor prevalencia de nitración en los distintos compartimentos miofibrilares; mientras
que la carbonilación parece predominar en las proteínas de alto peso molecular,
particularmente la proteína C (Mihm et al., 2003). El hecho que la administración de
ascorbato atenúa significativamente estos cambios apoya la tesis que el estrés oxidativo
interviene en el mecanismo de la FAPO. La sensibilidad de los efectos del estrés
oxidativo que ha sido encontrada en elementos claves del acoplamiento excitación
contracción, tales como canales de calcio tipo L, receptores de rianodina liberadores de
calcio del retículo sarcoplasmático y bombas como la Ca2+ -A TPasa (Squier & Bigelow,
2000; Bigelow & Squier, 2005), sugiere que tratamientos con antioxidantes, orientados
principalmente a bloquear la formación de peroxinitrito, pueden proporcionar un
beneficio a los pacientes con riesgo de FAPO.
..,..,
.).)
5.2 Upoperoxidación de los fosfolípidos de membrana
El estrés oxidativo conlleva peroxidación que afecta en forma especial a sus
fosfolípidos de la membrana plasmática, alterando su fluidez, la estructura y función de
los canales, receptores y enzimas inmersas en ella. Esto se ha asociado a numerosas
patologías, entre ellas la cardiopatía coronaria, ya que aquellos pacientes sometidos a
cirugía valvular con circulación extracorpórea presentarían un aumento de productos de
lipoperoxidación en el tejido cardíaco (Akila et al., 2007; Milei et al., 2007), sin embargo
el mecanismo que explica dicha alteración no está bien caracterizado. Se ha planteado,
que esta misma alteración tendría un papel importante en la actividad arritmogénica de
los cardiomiocitos, aumentando la susceptibilidad para el desarrollo de FA (Leifert et al.,
1999; Xiao et al., 2005), probablemente debido a alteraciones en la conducción y
excitabilidad (Leifert et al., 2000; Jahangiri et al., 2006). La remodelación eléctrica juega
un papel importante en la fisiopatología de la FA observándose alteraciones inducidas
por la lipoperoxidación en el manejo de iones como Ca2+ y K+, entre otros
(Schoonderwoerd et al., 2005). Se piensa que la alteración de canales de Na+ ó Ca2+
voltaje-dependiente observada en la fibrilación auricular crónica estaría mediada por el
ataque de las ERO a la membrana plasmática (Cha et al., 2003; Barth et al., 2009). Por
otra parte, las alteraciones del canal de Na+ tendrían efectos proarrítmicos (Fukuda et
al., 2005). La actividad de enzimas de membrana, cómo la (Na + K)-A TP asa también
podría alterarse y favorecer el desarrollo de FAPO. Sin embargo, aún no se ha evaluado
el papel de estos eventos y su participación en la patología.
5.3. Remodelación del tejido auricular por ERO
Variada evidencia sustenta que el desarrollo de FA y su persistencia depende de
sustratos electrofisiológicos y estructurales a nivel de la aurícula (AIIessie et al., 2002;
Nattel et al., 2007). El sustrato estructural se refiere a anormalidades en la arquitectura
auricular tales como dilatación, fibrosis, apoptosis y desdiferenciación celular (Kojodjojo
et al., 2007; Everett & Olgin, 2007). Estas alteraciones morfológicas también pueden
disminuir la funcionalidad miocárdica y son un reflejo de importantes transiciones a nivel
molecular. Uno de los principales efectores de esta respuesta es el cardiomiocito, el
cual puede adaptarse a estas nuevas circunstancias y modificar la expresión y
organización de proteínas involucradas en la activación, conducción y contracción
auricular.
34
5.3.1 Factores promotores de la FA en el periodo postoperatorio
Numerosos estudios se han realizado con el propósito de identificar los factores
de riesgo que gatillan la FA postoperatoria; sin embargo, los mecanismos precisos no
están aún dilucidados. Entre los más estudiados se encuentran la edad (Koutlas et al.,
2000), aparición de complejos auriculares prematuros (Pak et al., 2006), la actividad del
sistema nerviosos autonómico (Chen et al., 2006), la conducción auricular anisotrópica
(Chung et al., 2007), el grado de distensión auricular (Osranek et al., 2006), el tiempo de
clampeo aórtico prolongado (Hkala & Hedman, 2003) y la isquemia e inflamación
auricular producto del procedimiento quirúrgico (Feringa et al., 2007). El análisis de la
variabilidad de la frecuencia cardíaca indica que otros factores gatilladores importantes
involucrarían un aumento del tono simpático y una pérdida excesiva del tono vagal,
horas antes de que se desarrolle la FA postoperatoria (Dimmer et al., 1998; Gemein et
al., 2009). Además, la suspensión del tratamiento con betabloqueadores y/o inhibidores
de la enzima convertidora de angiotensina se asociaría con un incremento de la
incidencia de FAPO (Mathew et al., 2004; Budeus et al., 2007). Además, niveles
plasmáticos elevados del péptido natriurético cerebral se asociarían a la ocurrencia de
FAPO como un factor predictor independiente. Este hallazgo sería importante en el caso
de pacientes con un riesgo elevado de desarrollar esta arritmia y que sean candidatos a
profilaxis con betabloqueadores (Wazni et al., 2004).
5.3.2 Factores promotores de la FA y estrés oxidativo
Las corrientes iónicas de calcio (Ca2+), Na+ y K+ juegan un papel relevante en el
ciclo de excitación-contracción miocárdico, siendo el patrón de expresión de sus
respectivos canales y otras proteínas asociadas extensamente estudiadas en FA. En
este contexto, se ha encontrado la menor expresión del canal de calcio tipo L se
asociaría con un acortamiento del período refractario efectivo, fenómeno que no sería
influenciado por la dilatación auricular (Rao et al., 2009).
El daño oxidativo en las membranas biológicas también constituye un evento
fisiopatológico importante durante la injuria tisular secundaria a la isquemia reperfusión
miocárdica. A nivel molecular, la función de la membrana celular del cardiomiocito
puede ser modificada por el ataque directo de las ERO sobre sus distintos
componentes. La exposición a las ERO altera las propiedades físicas de la membrana e
indirectamente el transporte iónico, debido principalmente a la ocurrencia de
lipoperoxidación y a los cambios consequentes en la función de barrera eléctrica (Killig
& Stark, 2002).
35
Este efecto es debido a un incremento en la polaridad de la membrana interna
por la acumulación de productos de oxidación polares. El cambio concomitante en la
constante dieléctrica, que se puede detectar por el incremento en la capacitancia de la
membrana, disminuye el movimiento de algunos iones a través de la membrana interna
(Stark et al., 2005). Los canales iónicos, al contrario de los transportadores, otorgan una
vía polar para que los iones atraviesen la barrera de membrana hidrofóbica. Para
facilitar este funcionamiento, los compuestos estructurales que forman esta vía deben
ser insertados en la membrana, proceso sustancialmente facilitado por el aumento de la
constante dieléctrica. Además, las proteínas de membrana están inmersas en un
medioambiente lipídico y pueden de esta forma estar expuestas al ataque por especies
radicalarias.
Por otra parte, tanto las ERO como los productos de liperoxidación pueden ser
altamente reactivos y modificar la estructura de las proteínas de membrana, afectando
de este modo su función. Como ejemplo, las modificaciones oxidativas de algunas
enzimas de membrana como la (Na+K)-A TP asa han sido estudiadas con respecto su
implicancia funcional (Shao et al., 1995). De acuerdo con esta idea, recientemente se
ha reportado que la actividad de la (Na+K)-ATP asa en el eritrocito se correlaciona
negativamente con el nivel de 8-isoprotanos en sangre perisférica de pacientes
hipertensos esenciales (Rodrigo et al., 2007a).
6. Vías de señalización celular inducidas por las ERO en la patogenia de la FAPO
Los mecanimos moleculares a través de los cuales los lípidos oxidados y su
descomposición en productos electofílicos determinan la activación vías de transducción
de señales rédox-dependiente, se comprenden parcialmente. Estos pueden involucrar
modificaciones directas de las proteínas que participan en la señalización o la
producción secundaria de ERO y del nitrógeno en la célula (Levonen et al., 2004). Las
consecuencias deletéreas de la exposición a altas concentraciones de ERO, tales como
inflamación, muerte celular (apoptosis/necrosis) o fibrosis, podrían ser atenuadas por
efecto de la exposición previa del cardiomiocito a concentraciones moderadas de estas
especies, efecto denominado preacondicionamiento, que se sugiere facilitaría
respuestas de sobrevida celular. Algunos mecanismos asociados a esta respuesta
serían la inactivación del canal mitocondrial de K+ sensible a A TP además de los
canales de Ca2+ sensibles a K+ ya estudiados (Fruehauf & Meyskens, 2007).
36
La ocupación de receptores de superficie durante el preacondicionamiento
isquémico se sugiere que resulta en la apertura de los canales de Ca2+ sensibles a K+ lo
cual causa la liberación mitocondrial de ERO. Estas especies radicalarias pueden actuar
en esta instancia como segundos mensajeros activando vías de sobrevida como las
asociadas a la activación de ciertas isoformas de la proteína quinasa C (Cohen et al.,
2006).
6.1 Papel de los factores transcripcionales en la FAPO
Dado que la ocurrencia de estrés oxidativo es una causa de FA, existe reciente
evidencia que relaciona los cambios en el patrón de expresión génica con la inducción
de un estado prooxidante en aquellos pacientes que desarrollan FA. Uno de los
primeros estudios al respecto mostró una regulación postiva de genes involucrados en
la generación de estrés oxidativo y una regulación negativa de algunos genes que
protegen contra la injuria oxidativa o que median procesos reparativos (Kim et al.,
2003). Otras investigaciones han confirmado estos hallazgos y reportan también
cambios relacionados con la ocurrencia de inflamación, reacciones de tipo rédox y
respiración celular (Ohki-Kaneda et al., 2004; Ohki et al., 2005).
Durante la fase de reperfusión secundaria a la circulación extracorpórea el
incremento en la generación de ERO puede interferir en algunas vías de señalización
celular asociadas a sobrevida. Desde este punto de vista, la modulación mitocondrial de
la producción de ERO tendría un papel fundamental (Becker, 2004). Se ha determinado,
que el incremento de Ca2+ y de ERO a nivel citosólico que ocurre durante la isquemia
miocárdica y su posterior amplificación durante la reperfusión mediarían el daño por
isquemia reperfusión. En este contexto, la mitocondria estaría involucrada tanto en la
producción de ERO como del blanco de daño en la acción de estas especies (Halestrap,
2006). Un modelo propuesto para la inducción de apoptosis por peróxido de hidrógeno
(H20 2) es la regulación postiva del sistema Fas-Fas ligando, lo que activa la vía de las
caspasas, específicamente la caspasa-8 y su vía de señalización río abajo. Por otra
parte la concentración extracelular de H20 2 se asocia con un incremento en la
producción mitocondrial de 0 2 - debido a un aumento de la entrada de Ca2+ a través de
los canales de tipo-L. Este efecto puede persistir debido a un mecanismo de
retroalimentación positiva sobre la actividad del canal, elevando la concentración
intracelular de Ca2+ y la producción de 0 2 - por la mitocondria (Viola et al., 2007). Por
otra parte, el H20 2 puede causar liberación del citocromo e desde la mitondria al citosol,
el cual unido al factor Apaf-1 es un paso crítico en la formación del apoptosoma,
37
complejo que media la vía intrínseca de la apoptosis. Finalmente, el H20 2 puede mediar
la activación de algunos factores transcripcionales como el FN-KB, AP-1 y P53, los
cuales también participan en la mayor expresión de proteínas de "muerte" o inhibidores
de la sobrevida celular.
6.1.1 Factor nuclear Kappa 8
La regulación transcripcional de los principales mediadores proinflamatorios en
la FAPO ha sido atribuída a la activación de las vías de señalización celular
dependientes del factor transcripcional FN-KB y de las proteínas quinasas activadas por
mitógenos p38 (Valen et al., 2001). Como ejemplo, la fosforilación de la proteína
inhibitoria del FN-KB (lKBa) inducida por la ocurrencia de isquemia reperfusión o por las
propias citoquinas proinflamatorias, promueve la expresión de genes que pueden llevar
a injuria miocárdica tales como el factor de necrosis tumoral (FNT)-a, la interleuquina-1 f3 e interleuquina-6 (Liakopoulos et al., 2007).
Recientes estudios indican que el FN-KB juega un papel importante en el
mecanismo de la hipertrofia cardíaca y la remodelación secundaria a estados
proinflammatorios. También se ha visto que este factor tendría una mayor activación en
la progresión de la insuficiencia cardíaca en humanos (Grabellus et al., 2002), donde la
expresión de citoquinas proinflamatorias está exacerbada (Deardorff R & Spinale, 2009)
y su bloqueo mejoraría la función ventricular y la sobrevida posterior a un infarto agudo
al miocardio (Kawano et al., 2006). En cuanto a su papel en la fisiopatología de la
FAPO, actualmente se sabe que participa tanto como factor proarritmogénico,
facilitando cambios funcionales en el miocardio (expresión de canales iónicos) que
inducen FA (Shang et al., 2008), como también en procesos de remodelación auricular
que determinan su persistencia (Freund et al., 2005). En cuanto a la cirugía cardíaca
con circulación extracorpórea, se sabe que la activación del FN-KB podría exacerbar la
injuria por reperfusión en una etapa incial mediada por algunas citoquinas como el FNT
a, principalmente por la mayor mayor migración leucocitaria y la expresión de moléculas
de adhesión celular (Maekawa et al., 2002).
En la figura 2 se muestra un esquema que resumen los eventos generales
involucrados en la fisiopatología de la FAPO con la contribución del estrés oxidativo y la
inflamación secundarios a la cirugía cardíaca con circulación extracorpórea.
38
j Cirugía con CE
Ciclo Trauma
Isquemia/ Reperfusión
Mecánico
1 IEstrés Oxidativo Inflamación
l l Activación Factores Upoperoxidación Citoguinas
Transcricionales ~arbonilación de proteínas TNF-a/IL-6 NF-KB/AP-1/ Nitración de proteínas TGF-(3
STAT-3
l l Muerte Celular Distribución conexinas
Apoptosis/ Alteraciones de canales Fibrosis Necrosis 1R P
J l Remodelación Remodelación
Patológica Estructural & Electrica
r FIBRILACIÓN AURICULAR
Figura 2. Papel de estrés oxídativo y la inflamación en la fisiopatología de la FAPO en pacientes sometidos a cirugía cardíaca con circulación extracorpórea (CEC). FN-KB, factor nuclear kappaS; AP-1, factor de transcripción AP-1 (Activator Protein 1); STAT-3, transductor de señal y activador de la transcripción 3; TNF-a, factor de necrosis tumoral-a; IL-6, interleuquina-6; TGF-¡3, factor de crecimiento transformante-¡3; PR, período refractario. (Modificado de Rodrigo et., 2008).
39
Nuevos conceptos sobre el preacondicionamiento miocárdico.
Preacondicionaniento inducido por isquemia-reperfusión (IR).
Durante la reperfusión que se realiza a un tejido sometido a isquemia, existe un
estallido oxidativo con la generación de gran cantidad de ERO y que explicaría en cierta
forma el daño producido por la reperfusión hecho que ha sido comunicado en riñón,
corazón, hígado e intestino (Zhang & Chen, 2008). Experimentos posteriores
demostraron que la inducción previa de isquemias cortas y no letales podría aminorar el
daño sufrido por un órgano durante un posterior episodio de isquemia más prolongado
(Murry et al., 1990; Pasupathy and Homer-Vanniasinkam, 2005), hecho denominado
pre-acondicionamiento de tipo isquémico o hipóxico. Se ha observado que el
preacondicionamiento de alguna forma disminuiría la cuantía del estallido oxidativo
producido durante la reperfusión. Varios mecanismos han sido planteados para explicar
este fenómeno. Se apunta a que el la hipoxia produciría un aumento en la generación
de superóxido el que induciría procesos conducentes al pre-acondicionamiento (Becker
et al., 1999; Duda et al., 2006). Sin embargo, ésto plantea el conflicto de que el uso de
antioxidantes como tratamiento podría aumentar más el daño al eliminar la inducción
protectora de las ERO (Becker, 2004; Dhalla et al., 2007). Este hecho fue estudiado en
cardiomiocitos junto con otros fenómenos relacionados como función contráctil y
transporte iónico (Mizukami et al., 2008). Se observó que el uso de antioxidantes tendría
la misma eficacia que el pre-acondicionamiento isquémico, sólo si este es administrado
durante la reperfusión en tanto se observa que su administración durante el pre
acondicionamiento atenúa la inducción producida por las ERO y abole su efecto
protector (Bolea! et al., 2007; Tao et al., 2007; Kwak et al., 2009). Esto confirmaría, que
existe un tiempo finito y preciso para la administración de antioxidantes de manera de
no interferir con los mecanismos de inducción mediados por ERO, sumado al efecto de
algunos compuestos "scavengers" como se ha descrito (Ueno et al., 2007). Otro hecho
de relevancia fue la implicación de la proteína quinasa C (PKC) y canales
mitocondriales de K ATP-dependientes en los mecanismos del preacondicionamiento
(Hausenloy et al., 2007; Matejíková et al., 2009). Pese a que las ERO han sido
involucradas y son consideradas como responsables de la inducción de ciertos
procesos que que determinan una disminución del daño por reperfusión, sus
mecanismos no son del todo comprendidos. Se planteó que el superóxido podría
incrementar una la actividad de la SOD (Mn +2 - SOD) existente en etapas tempranas,
produciendo una expresión de SOD adicional en etapas tardías (24 horas post pre-
40
acondicionamiento) (Hoshida et al., 2002; Yang et al., 2007). Dado que las ERO
asumen en determinadas ocasiones el papel de segundos mensajeros en las vías de
transducción de señales, pueden desencadenar estímulos a otros niveles, como por
ejemplo inducción de factores transcripcionales promoviendo la síntesis de enzimas
antioxidantes (Maulik, 2004; Aggeli et al., 2006), reforzando así el sistema de defensa
contra las ERO. Pero un pre-acondicionamiento hipóxico puede ser dañino e incluso
letal para la célula. Por lo tanto, resulta atrayente la idea de lograr los mismos efectos
de manera inocua.
7.2 Nueva estrategia de preacondícíonamiento
Si bien el pre-acondicionamiento hipóxico, la igual que el mediado por adenosina
o canales de K+ A TP-dependientes, ofrecen una manera de disminuir el daño por
reperfusión, estos procedimientos son poco aplicables en clínica humana debido a
ciertos riesgos de procedimiento. Sin embargo, es interesante rescatar de este modelo
que el aumento de la producción de ERO llevaría a gatillar los mecanismos protectores
del tejido frente a un desafío oxidativo. En esta línea, podría aplicarse en forma no
hipóxica, no invasiva e inocua para lograr el mismo objetivo.
7.2.1 Papel protector de los antioxidantes no enzimáticos.
Los antioxidantes de tipo no enzimático también cobran importancia en
condiciones de estrés oxidativo, ya que pueden atrapar radicales libres interceptando la
cadena que conduce al daño tisular (Valko et al., 2007). En el caso del daño tisular que
producen e las ERO y el fenómeno de remodelación eléctrica asociado, se ha recurrido al
uso de antioxidantes para revertir este efecto. Así, experimentalmente se han utilizado
antioxidantes, quelantes de metales y dadores de grupos tiol, observándose que todos
estos agentes producen una significativa mejoría en la sobrevivencia de los
cardiomiocitos sometidos a condiciones de IR (Shinagawa et al., 2003; Fabio et al., 2007;
Koch et al., 201 0). En un estudio realizado por Carnes y cols. (2001 ), se evidenció que
el uso de ascorbato endovenoso en perros sometidos a estimulación eléctrica rápida
atenuó la nitración de proteínas en cardiomiocitos, junto con evitar el acortamiento del
período refractario efectivo. Existen a la fecha, sólo dos estudios clínicos que sustentan
el uso de ascorbato por vía oral y de manera profiláctica, uno realizado en pacientes
sometidos a cirugía de bypass coronario (Eslami et al., 2007), el cual combinó en una
rama del estudio la administración de betabloqueadores y otro, que reduce la
recurrencia del evento arrítmico posterior a su cardioversión (Korantzopoulos et al.,
41
2005b), Sin embargo ninguno de ellos ha abordado en problema que implica el
desarrollo de FAPO de una manera mecanística.
Por otra parte, el efecto protector secundario a la administración de a tocoferol
(vitamina E) se encuentra escasamente determinado para eventos arrítmicos
(Shiroshita-Takeshita et al., 2004). Varios ensayos clínicos llevados a cabo por el grupo
italiano GISSI (Prevenzione lnvestigators) han tratado de demostrar eficacia en
prevención secundaria con la administración crónica de a tocoferol sin éxito (Marchioli
et al., 2005). Sin embargo, aún no se ha recurrido al uso de una asociación de vitamina
e y E para lograr esta protección, a pesar de la potenciación esperada para la acción
antioxidante de estas 2 vitaminas, abarcando el dominio del ambiente hidrofílico
(vitamina e, hidrosoluble) y lipofílico (vitamina E, liposoluble). Más aún, se ha podido
comprobar que, en la interfase, la vitamina e es capaz de convertir a su forma original
de a tocoferol, cuando éste se encuentra como radical libre a-tocoferoxilo después de
haber interceptado a una molécula de ERO (Rubbo et al., 2000). El curso temporal de la
aplicación de estas intervenciones va aplicado en dos etapas: 1) Fase de inducción de
enzimas antioxidantes a través de EPA/DHA (1/2). 2) Fase de reforzamiento de la
capacidad antioxidante no enzimática. Resulta indispensable el orden de aplicación de
estas intervenciones para lograr optimizar el efecto que se vería menoscabado con la
aplicación simultánea de ambas medidas.
7.2.2 Papel de los ácidos grasos omega-3.
Los ácidos grasos poliinsaturados omega 3 son sustancias esenciales para el
desarrollo y el normal funcionamiento del organismo. Ellos no pueden ser sintetizados en
el organismo, debiendo ser adquiridos en la dieta principalmente del pescado como ácido
a linolénico. Las principales formas son el ácido eicosapentaenoico (20:5 n-3, EPA) y el
ácido docosahexaenoico (22:6 n-3, DHA), los cuales han demostrado protección ante
eventos cardiovasculares. Aunque, los mamíferos son capaces de sintetizar EPA y DHA a
partir de ácido linolénico, la ausencia de eficacia cardioprotectora de este precursor ha
sido recientemente revisada (Wang et al., 2006a; Wang et al., 2006b). Por otra parte, en
cuanto al efecto mismo, la administración de éstos compuestos podría generar
concentraciones de ERO moderadas, lo que ha sido previamente documentado en base a
su susceptibilidad a formar lipoperóxidos (van Ginkel & Sevanian, 1994). A pesar de que
estos compuestos aumentan el nivel de las ERO, disminuyendo consecuentemente la
capacidad antioxidante del corazón, la inducción de estrés oxidativo por los ácidos grasos
omega 3 potenciaría de alguna manera la respuesta antioxidante mediante la regulación
42
positiva de las propias enzimas antioxidantes. Esto ha sido demostrado en cardiomiocitos
de rata, donde la administración de omega 3 aumentó la expresión de las enzimas
antioxidantes CAT, SOD y GSH-Px, en un modelo de asincronía inducida por peróxido de
hidrógeno (H202) (Jahangiri et al., 2006). Además, existe evidencia de que la
suplementación con DHA en células gliales y endoteliales aumenta la actividad del
sistema de defensa antioxidante celular y disminuye la formación de productos de
lipoperoxidación a bajas dosis (Leonardi et al., 2007). Resultados de estudios
prospectivos indican que el consumo de pescado o aceite de pescado que contiene estos
ácidos omega-3 se asocia a disminución de la mortalidad por enfermedades
cardiovasculares, principalmente menor tasa de muerte súbita posterior a un infarto.
(Breslow, 2006; von Schacky 2007; von Schacky & Harris 2007; Biscione et al., 2007). De
acuerdo con estos estudios, los mecanismos que subyacen a esta reducción, se atribuyen
a sus efectos de hipolipemiantes (reducción de niveles de VLDL y triglicéridos
plasmáticos), atenuación de la disfución endotelial, estabilización de la membrana celular,
disminución de la agregación plaquetaria y la proliferación de la musculatura lisa vascular,
además de prevenir la sobrecarga de calcio (Boriani et al., 2007; Fahs et al., 2010).
Existen sin embargo estudios epidemiológicos que no reportan beneficios (Frost &
Vestergaard, 2005; Saravanan et al., 2010; Heidarsdottir et al., 2010), los cuales están
basados en el consumo de pescado determinado por cuestionarios alimentarios y en un
consumo diario con suplementos de omega 3 en bajas dosis (<1g/día). Por otra parte, la
suplementación con dosis diarias de omega 3 por sobre los 2g al día, conteniendo
cantidades de EPA/DHA 1 :2, desde 5 días antes hasta 36 horas del postoperatorio, fue
existosa en reducir la ocurrencia de FA cercana al 50% (Caló et al., 2005). Con respecto
a los efectos agudos, estos serían atribuibles a la atenuación de los cambios
electrofisiológicos que condicionan la ocurrencia de la FA como el acortamiento del
período refractario y el aumento de la dispersión (da Cunha et al., 2007; Opthof et al.,
2007). Además se ha asociado el consumo de omega 3 en dosis farmacológicas con
una menor formación de F2-isoprostanos (Nalsén et al., 2006).
43
7.2.2.1 Recientes hallazgos epidemiológicos
Los hallazgos de múltiples estudios epidemiológicos durante los últimos 3 años
han sustentado la relación entre el consumo de aceite de pescado enriquecido con
ácidos grasos omega 3 EPA y DHA, con una menor incidencia de morbimortalidad
cardiovascular y eventos fatales asociados (von Schacky, 2007). En este contexto, está
descrito tanto para el EPA como el DHA efectos sobre la conducción eléctrica tanto a
nivel auricular como ventricular. El consumo de EPA/DHA (1g/día) se asocia a una
reducción significativa de la frecuencia cardíaca y el intervalo QT, lo que prevendría un
una potencial susceptibilidad a desarrollar eventos arrítmicos (Mozaffarian et al., 2006).
Por otra parte, existen en la actualidad algunas formas de cuantificar y asociar el riesgo
de desarrollo de FA al consumo de este tipo de ácidos grasos, como el índice omega 3.
Éste es definido como el porcentaje de EPA y DHA en eritrocitos, y sus valores se
correlacionarían negativamente con el riesgo de mortalidad cardiovascular (Harris & von
Schacky, 2004). Estudios epidemiológicos (Rupp et al., 2004; von Schacky & Harris,
2007; Harris et aL, 2007) indican que un índice omega-3 menor a un 4% se asocia con un
riesgo 10 veces mayor de muerte súbita, comparado a un índice mayor a 8% (lso et aL,
2006). A su vez, otros trabajos en la actualidad validan los bajos valores del índice
omega 3 como factor de riesgo cardiovascular en pacientes con enfermedad coronaria
estable (Block et al., 2008; Farzaneh-Far et al., 2010). En el caso del consumo de
aceites de pescado o suplementos alimenticios como fuente de omega-3, en que las
dosis de EPA y DHA son inciertas, el índice omega-3 puede ser usado para monitorizar la
terapia. Más aún, este indicador sería bastante útil en el caso de excluir a pacientes en
los que altos niveles basales de estos compuestos jugarían en contra de la real magnitud
de la intervención (Jarvinen et aL, 2006).
44
En base a estos antecedentes, se podría postular al estrés oxidativo como un
importante evento en la ocurrencia de la disfunción miocárdica asociada a la injuria por
IR. Las ERO pueden contribuir en la fisiopatología de la FAPO mediando procesos tales
como la inflamación (activación del FN-KB), muerte celular (vía apoptosis o necrosis) o
aún respuestas de sobrevida (vías antipoptóticas), de acuerdo con el tiempo de activación
de tales vías y la concentración de las ERO inducidas. Por lo tanto, resulta razonable
asumir que el reforzamiento del sistema de defensa antioxidante sistémico podría
proteger al miocardio contra el daño oxidativo.
45
HIPÓTESIS DEL TRABAJO
En pacientes sometidos a cirugía de cardiopatía no congénita, la
suplementación con ácidos grasos omega 3 (desde 7 días antes de la intervención y
hasta el alta) y vitaminas antioxidantes C y E (desde 2 días antes de la intervención y
hasta el alta), disminuirá la ocurrencia de fibrilación auricular postoperatoria. Este
efecto se correlacionará positivamente con marcadores que den cuenta de un
aumento de las defensas antioxidantes y negativamente con marcadores de estrés
oxidativo e inflamación.
9. OBJETIVO GENERAL
Caracterizar un esquema de tratamiento profiláctico de la fibrilación auricular,
basado en la inducción de un pre-acondicionamiento no hipóxico y un reforzamiento
del sistema de defensas antioxidantes en pacientes que van a ser sometidos a cirugía
cardíaca no congénita con circulación extracorpórea. Esta caracterización consistirá
en dar a conocer los parámetros relacionados con inflamación y estrés oxidativo tanto
en tejido auricular (locales) como en sangre de los pacientes (sistémicos).
46
10. DISEÑO DEL ESTUDIO
Desde Julio del 2007 hasta Marzo del 201 O, se realizó un ensayo clínico,
randomizado, doble ciego, controlado por placebo, que ha incluyó a 160 pacientes,
admitidos para cirugía cardíaca en el Departamento Cardiovascular del Hospital
Clínico de la Universidad de Chile, el Complejo Hospitalario San José y el
Departamento de Cardiocirugía del Hospital San Juan de Dios. El protocolo fue
aprobado por los Comités de Ética de los respectivos hospitales y el manejo de los
individuos fue acorde a los principios de la declaración de Helsinki (2001 ). Todos los
pacientes ingresaron al estudio previa firma del consentimiento informado.
los criterios de inclusión para ingresar al protocolo fueron:
1.- Mayor de 18 años y menor de 80 años
2.- Cirugía cardíaca no congénita
3.- Ritmo sinusal al momento de la randomización
los criterios de exclusión del ingreso al protocolo fueron:
1.- FA crónica
2.- Reoperación cardíaca
3.- lngesta de vitamina C o E un mes previo al estudio
4.- Insuficiencia renal crónica (cretininemia > 2.0 mg/dl)
5.- Insuficiencia hepática (bilirrubinemia > 3.0 mg/dl o albuminemia < 3.5g/dl o
protrombinemia < 60% en ausencia de terapia anticoagulante oral o signos
ecográficos de daño hepático crónico o presencia de várices esofágicas.
6.- Embarazo
7.- Cardiopatía congénita
8.- Cirugía de urgencia
La variable de observación primaria de este estudio fue la ocurrencia de FA
confirmada por electrocardiograma (EKG) posterior a la cirugía cardíaca y hasta el
alta. Las variables de observación secundarias incluyen la evidencia bioquímica
(biomarcadores) de estrés oxidativo e inflamación en sangre y tejido auricular. Los
participantes potencialmente elegibles fueron randomizados (en forma no estratificada
y centralizada, bloques de 5 pacientes) a recibir ácidos grasos omega 3, en dosis de
2g/día (ácido eicosapentaenoico, EPA; y ácido docosahexaenoico, DHA, en la relación
1:2, respectivamente) (Calo et al., 2005) o placebo, 7 días antes de la cirugía cardíaca.
47
Posteriormente, 2 días antes de la cirugía, se agregaron vitaminas antioxidantes C
(1g/día) (Carnes et al., 2001) y E (400UI/día). Ambos tratamientos continuados hasta
el alta. El grupo placebo recibió igual número de cápsulas de idéntico color y tamaño,
conteniendo triglicérido de ácido caprílico (825 mg por cápsula), gránulos inertes (500
mg) y aceite vegetal (400 mg) reemplazando los omega 3 y las vitaminas C y E,
respectivamente. (Productos provistos por los laboratorios Procaps (Colombia) y
Gynophram CRF (Chile).
11. METODOLOGÍA
11.1 Obtención de muestras
Las muestras de sangre fueron obtenidas al momento de la randomización (día-
7), antes de agregar las vitaminas antioxidantes, dos días antes de la cirugía (día -2), 15
minutos antes del inicio de la circulación extracorpórea (Tiempo 0), 6-8 horas después
de finalizada la cirugía (día +1) y al so día del postoperatorio (Día +5). Los
sobrenadantes de plasma y hemolizado fueron almacenados a -80°C hasta el momento
del ensayo. Las muestras de orejuela derecha (aproximadamente 400 mg) fueron
obtenidas antes del inicio de la circulación extracorpórea, y divididas en 2 partes, una
para estudios de inmunofluorescencia y la otra para estudios de abundancia de
proteínas.
11.2 Variables de observación (endpoints)
11.2.1 Primaria: detección de la FAPO
Se mantuvo monitorización por EKG continua en la Unidad de Cuidados
Intensivos y/o Unidad Coronaria hasta las 48 h de finalizada la cirugía, para todos los
pacientes en protocolo. Posteriormente, se utilizó registro continuo por Holter hasta el4°
día postoperatorio. La incidencia global de FAPO fue de 21.8% en los 3 centros
hospitalarios. Teniendo en cuenta que el 95% de los casos se ubica entre el 2° y 4°día
del postoperatorio (Lamm et al., 2006), este hallazgo se aproxima a la incidencia
reportada por otras series. Finalmente, entre la remoción del Holter y el alta, la pesquisa
de FAPO fue confirmada por EKG de 12 derivaciones en caso de síntomas o sospecha
clínica.
En la figura 3 se detallan los días y momentos de intervención, así como también
la distribución de ambas ramas de estudio.
48
PLACEBO
FAH
3. Protocolo de inteíllención secuencia! para ambas ramas de estudio.
49
11.2.2 Variables de observación secundarias:
11.2.2.1 Parámetros de estrés oxidativo
La capacidad antioxidante del plasma fue determinada mediante la cuantificación
espectrofotométrica de la reducción del ión férrico a ferroso (ferric reducing ability of
plasma, FRAP), con un límite de detección de 1 O ¡Jmoi!L (Benzie & Strain, 1996). El
status rédox intracelular fue determinado por la medición de la relación glutatión
reducido (GSH)/ glutatión oxidado (GSSG) en tejido auricular y eritrocitos (Hissin & Hilf,
1976).
La actividad de cata lasa (CA T) fue determinada por el método descrito por Aebi
(1984), basada en la cinética de descomposición del peróxido de hidrógeno a 240 nm, y
expresada en base a la constante de primer orden (k)/mg proteína. La actividad de
superóxido dismutasa (SOD) está basada en la disminución de la autooxidación de
catecoles a 480 nm. Una unidad de SOD se definió como la actividad que dobla la
autooxidación (Misra & Fridovich, 1972). La actividad de la glutatión peroxidasa (GSH
Px) se midió en fracción citosólica (sobrenadante de 100.000 g) por un método
espectrofotométrico basado en la reducción del glutatión disulfuro acoplado a la
oxidación de NADPH por la glutatión reductasa.25 Una unidad de GSH-Px se definió
como la actividad que oxida 1 ¡Jmol de NADPH por minuto (Fiohé & Günzler, 1984).
La lipoperoxidación fue medida a través de la determinación de malondialdehído
por la técnica de cromatografía líquida de alta precisión (HPLC) con detección
flurométrica, con un límite de detección de 0.48 ¡Jmoi/L (Young & Trimble, 1991). El
conteindo de grupos carbonilos fue determinado en tejido auricular, con un límite de
detección 2.0 nmol/mg de proteína (Reznick & Packer, 1994).
11.2.2.2 Parámetros de inflamación
La determinación de la proteína C reactiva ultrasensible (PCR-us) (Macy et al.,
1997) se realizó por técnica de ELISA (Magiwell CRP kit United Biotech, Mountain
View), además se utilizaron el recuento de leucocitos y niveles de fibrinógeno por
técnicas estándar.
Los biomarcadores de estrés oxidativo e inflamación medidos en sangre en el
postoperatorio precoz (muestra del día +1) fueron corregidos por hemodilución, de
acuerdo a la caída del hematocrito, y la administración de fluidos posterior a la
circulación extracorpórea.
50
Activación del factor nuclear kappaS. El extracto de proteínas nucleares a
partir del tejido auricular fue preparado según lo descrito por Deryckere F & Gannon
(1994). Las muestras fueron sometidas a ensayo de retardo en gel (electrophoretic
mobility shift assay, EMSA) para medir la unión del factor al ADN usando los partidores
5'-GATCTCAGAGGGGACTTTCCGAG-3' (GrupoBios SA, Chile) marcados con a-32P
dCTP y utilizando el fragmento Klenow de la ADN polimerasa 1 (lnvitrogen Corp.,
Carlsbad, CA, USA) como ha sido previamente descrito (Videla et al., 2004). La
especificidad de la reacción fue determinada por un ensayo de competencia usando
ADN no marcado en exceso (1 00 veces molar). Las subunidades de este factor que se
unen al ADN fueron detectadas por el ensayo de "supershif" usando anticuerpos
policlonales lgG de rata y conejo contra las proteínas p50 y p65 Rel (Santa Cruz
Biotecnology, Santa Cruz, CA, USA). Las muestras fueron cargadas en condiciones no
denaturantes en geles de poliacrilamida al 6% y corridas sin que la sonda llegara al final
del gel (entre 6-8 horas). El patrón de bandas para FN-kappaf3 fue detectado por
autorradiografía y cuantificado utilizando el programa lmageJ (NIH, lmage, USA).
11.2.2.3 Detección de la subunidades de la NADPH oxidasa y residuos de
nitrotirosina en el tejido auricular
Los homogenizados de tejido auricular fueron separados en una fracción
soluble (citosólica) y una particulada (asociada a membrana) por ultracentrifugación
descrita previamente por Mohazzab-H et al. (í 999). La fracción de membrana fue
utilizada para la detección de las subunidades de membrana gp91 phox y para la
citosólica p47phox mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 10% utilizando
anticuerpos policlonales contra ambas subunidades (BD Biosciences, San Diego, CA,
USA), (1 :2000), transferidas a membranas de PVDF. La reacción antígeno-anticuerpo
fue detectada por reacción con luminol (ECL, Amersham, Biosciences). Se utilizo a
actina como control interno.
51
11.2.2.4 Detección de residuos de nitrotirosina en el tejido auricular.
Además, los residuos de nitrotirosina, un marcador específico de
modificaciones rédox por especies derivadas del nitrógeno, fue también medida por
western blot (Fu et al., 2001 ). El homogenizado de tejido auricular (60 J..lg) fue
separado en un gel de poliacrilamida al 12% y transferidos a una membrana de
nitrcelulosa (Protran; Schleicher & Schuell, Keene, NH, U.S.A.). Se utilizó un
anticuerpo primario anti-nitrotirosina policlonal de conejo (1 J..lg/ml; Upstate
Biotechnology, Lake Placid, NY, U.S.A.) (dilución 1:1 000), incubándose por 18 hrs.
Posteriormente las membranas fueron incubadas con un anticuerpo secundario anti
conejo lgG (1 :4000) por 3 hrs. Todas las membranas fueron visualizadas usando ECL
y expuestas en films por autorradiografía. Para el análisis densitométrico se utilizó el
programa lmageJ.
11.2.2.5 lnmunolocalización de las subunidades de la NADPH oxidasa
El tejido auricular obtenido fue congelado en isopentano bajo nitrógeno líquido;
se obtuvieron cortes de 6 J..lm en criostato. Después de 15 minutos de permeabilización
(PBS, 0.1% Triton X-1 00), los cortes fueron bloqueados con PBS 1% BSA por 90
minutos y posteriormente incubados con anticuerpos contra gp91 phox (1: 100, BD
Biosciences) y p47phox (1 :200, ABR) a 4°C toda la noche. Posteriormente se incubaron
las muestras con sus respectivos secundarios marcados con fluoróforos que emitían
en el espectro verde (Aiexa Fluor® 488 or 543-Molecular Pro bes, para gp91 phox y
p47phox, respectivamente). Las imágenes fueron registradas por microscopía confocal
(LSM S-Pascal, Axiovert 200, Zeiss).
11.3.3 Análsis estadístico
Los resultados fueron expresados como promedio ± desviación estándar (SO)
para variables continuas. Se utilizó el test de Shapiro-Wilk para determinar la
normalidad en la distribución de las variables. Aquellas distribuidas normalmente fueron
comparadas usando la prueba t de Student. Las variables sin distribución normal fueron
expresadas como mediana y rango intercuartílico, y comparadas mediante el test de
Wilcoxon.
Las diferencias entre los marcadores bioquímicas (variables de observación
secundarios) por grupo de tratamiento se estimaron mediante el test de ANOVA para
medidas repetidas. El análisis primario, basado en los eventos de FAPO confirmados,
52
fue realizado por el principio de intención de tratar. Con respecto a este análisis, los
eventos de FAPO registrados incluyen a todos los acontecidos desde la primera dosis
de suplemento o placebo, independiente de su duración. La frecuencia de FAPO fue
calculada por el método de "límite de producto" o kaplan-Meíer, para estimar la
proporción acumulada de la arritmia. Se utilizó el modelo de regresión de Cox para
determinar el tiempo de supervivencia (libre de FAPO) y calcular la reducción del riesgo
relativo entre ambas curvas. Finalmente se estimó por análisis multivariado el valor
predictivo (odds ratio o razón de proporciones, OR) de la ocurrencia de FAPO de cada
una de las variables bioquímicas.
El análisis de correlación entre variables y grupos de tratamiento fue llevado a
cabo mediante el test de Pearson (r). Por último se utilizó el test exacto de Fisher para
comparar la frecuencia de eventos adversos en ambos grupos.
11.3.1 Cálculo del tamaño de la muestra.
El cálculo del tamaño de la muestra fue desarrollado en base a la ocurrencia de
la FAPO como evento primario. Se asume para este propósito una ocurrencia esperada
de 35% en el grupo placebo y un í 5% en el grupo suplementado, diferencia basada en
un número de similar de pacientes entre ambos grupos, un error alfa de 5% y un poder
estadístico del 80%. El resultado otorga 71 pacientes por rama de tratamiento. (Win
Episcope 2.0). Se consideró significancia estadística con un valor de P<0.05, utilizando
los programas estadísticos Microsoft Excel y Stata 10.00 para Windows.
53
1 RESULTADOS DEL ESTUDIO
12.1 Características clínicas de los pacientes
Ambos grupos de tratamiento muestran similares características demográficas
y clínicas (diámetro AP de la aurícula izquierda y fracción de eyección principalmente).
Tampoco se evidenció diferencias en el tratamiento farmacológico previo de ambos
grupos (influencia del tratamiento con betabloqueadores y estatinas) (Tabla 1 ). La
media de seguimiento por rama fue de 10.5 ± 0.15 días. La conversión espontánea a
ritmo sinusal ocurrió en 3 pacientes suplementados y en 2 placebos (P=0.068). No
hubo diferencias en el uso de amiodarona para ambas ramas de tratamiento (2
suplementados y 9 placebos, P=0.485). Cardioversión eléctrica fue llevada a cabo en
un paciente que recibió suplemento y 2 que recibieron placebo (P=0.560). Ningún
paciente que desarrollo la FA presentó recurrencia después del primer episodio en
período postoperatorio hasta el alta. Las variables relativas etiología quirúrgica y a la
duración de la circulación extracorpórea se muestran en la Tabla 2.
12.2 Variable de observación primaria.
De los 284 individuos elegibles, 124 fueron excluidos por no firmar el
consentimiento informado, no cumplir los criterios de inclusión o perderse antes de la
randomización De los restantes, 75 pacientes fueron randomizados a recibir placebo
y 78 a recibir suplemento. (Ver Figura 4). La ocurrencia de FAPO fue de 30.6% (23
pacientes) en el grupo placebo y de 8.9% (7 pacientes) en el grupo suplementado
(Riesgo Relativo=0.29; IC 0.13 a 0.64; P=0.0018). En la Fig. 5, las curvas de
supervivencia de Kaplan-Meier ilustran para ambos grupos, la proporción de los
pacientes en protocolo libres del evento arrítmico en el período postoperatorio. Del total
de eventos, 23 pacientes (76.6%) desarrollaron FAPO entre el segundo y tercer día
postoperatorio (19 placebos y 4 suplementados; 2. 7 ± 0.2 vs 2.3 ± 0.1 días,
respectivamente; log rank test=0.0004). Los pacientes que reciben el placebo tuvieron
3.7 veces más riesgo de desarrollar FA en cualquier día del postoperatorio (HR=3.71; IC
1.53 to 9.57; P=0.004), con un número necesario a tratar de 4.6 pacientes con el
suplemento para prevenir un evento arrítmico (IC 95% 2.9 a 1 0.5). El resumen de las
variables de eficacia del estudio se muestra en la Tabla 3.
El diagnóstico de FAPO se realizó a través de monitorización por EKG continua
en la Unidad Coronaria o Unidad de Cuidados Intensivos en 4 (57.1%) de los pacientes
suplementados y en 9 (39.1 %) de los pacientes pertenecientes al grupo placebo
54
(P=0.665). El resto de los casos de FAPO se detectó por EKG de 12 derivaciones. El
promedio de duración de la arritmia fue de 13.3 ± 0.3 h en los pacientes asignados a
suplemento y de 14.2 ± 1.3 h en los asignados a placebo (P=0.07). La estadía de los
pacientes en protocolo en la Unidad Coronaria/Unidad Cuidados Intensivos vs la
hospitalaria total fue de 2.90 ± 0.13 vs. 3.13 ± 0.14 (P=0.44) and 8.15 ± 0.16 vs. 9.20 ±
0.18 (P<0.02), para pacientes suplementados y placebos respectivamente. Cuatro
pacientes en el grupo suplementado (insuficiencia renal aguda, n=2; insuficiencia
cardíaca congestiva, n=1; hemorragia que no requiere transfusión) y cinco en el grupo
placebo (insuficiencia renal aguda, n=2; mediastinitis, n=2; y neumotórax, n=1)
presentaron complicaciones en el postoperatorio (Tabla 4).
Grupo placebo__j
Intervención discontinuada (n= 14)
Eventos adversos (n= 12)
Dispepsia (i¡=J) Dianva {n=3) Decisión del paciente (n=2)
Elegibles
Exduídos (n=l24)
')ín f!Ít<?ríos de índu slún (n= 54¡
1 i Grupo suplementado L_
62)
Intervención discontinuada (n= 15)
Eventos adversos (n= 8)
Dispepsia (u=S) Dianva (n=2) Decisión del paciente (n=7)
Figura 4. Flujograma de los pacientes participantes en el protocolo
55
o 0...
il
1.00
<Ll 0.90 "O
(/) 0.80 2 e <Ll
·~ 0.70
<Ll "O e :§ 0.60 '-0 Q_
2 0... 0.50
o 1
Seguimi-ento (días)
Riesgo FAPO+
(n) FAPO-
2 3
o 1 2
o 5 13
153 148 135
Suplemento
Placebo
4 5 6 7 8 9 10
Postoperatorio (días)
3 4 5 6 7 8 TOTAL
10 2 o o o o 30
125 123 123 123 123 123 123
Figura 5. Gráfico de Kaplan-Meier que estima la ocurrencia de la FAPO en el período postoperatorio de los pacientes (placebo y suplemento) sometidos a cirugía cardíaca con circulación extracorpórea (CEC). La tabla inferior muestra el número de casos de FA por día del postoperatorio.
56
Tabla 1. Características clínicas de los pacientes en protocolo
Características Placebo Suplementados Valor P (n= 75) (n= 78)
Demográficas Edad, años 59(10) 59 (12) 0.41 Sexo (relación hombre/mujer) 63/12 63/15 0.30 lndice de masa corporal (kg/m2
) 25.3 (3.4) 25.7 (4.0) 0.18 Frecuencia cardíaca (LaUmin) 71.5 (11) 72.4 (12) 0.23 Fracción de eyección ventricular izq (%) 65.5 (6.9) 66.9 (6.5) 0.24 Dimensión AP de Al, mm 49.4 ± 5.0 48.0 ± 6.7 0.21
Comorbilidades Hipertension, n (%) 25 (33.3) 27 (34.2) 0.45 Diabetes mellitus, n (%) 39 (52.0) 42 (53.2) 0.44 Hipercolesterolemia, n (%) 36 (48.0) 38(48.1) 0.49 Historia tabaquismo, n (%) 28 (37.3) 29 (36.7) 0.47
Tratamiento farmacológico Aspirina, n (%) 48 (64.9) 49 (62.0) 0.35 Atorvastatina, n (%) 31(41.3) 32 (40.5) 0.46 Otras estatinas, n (%) 11 (14.9) 8(10.1) 0.18 lnhibidores de la ECAt, n (%) 41 (54.7) 49 (62.0) 0.18 ARA 11 +, n (%) 17 (22.7) 18 (22.8) 0.49 Diuréticos, n (%) 21 (28.0) 23(29.1) 0.44 13-bloqueadores, n (%) 45 (60.0) 47 (59.5) 0.47 Bloqueadores de los canales de calcio, n (%) /12 (16.0) 13(16.5) 0.47 Nitratos, n (%) 4 (5.3) 7 (8.9) 0.19 Insulina, n (%) 5 (6.7) 6 (7.6) 0.41 Sulfonilureas, n (%) 8(10.7) 11(13.9) 0.27 Biguanidas, n (%) 19(25.3) 20 (25.3) 1.00
Las variables continuas son expresadas como promedio ± OS si presentan distribución normal, o como media (rango intercuartílico) si no la presentan. Las variables categóricas son expresadas en frecuencia (%) AP: anteroposterior; Al: aurícula izquierda; tiECA: inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina; +ARA 11: antagonistas del receptor de angiotensina 11
Tabla 2. Variables perioperatorias
Revascularización, n (%) Reemplazo valvular, n (%) Etiología mixta, n (%) Tiempo de clampeo aórtico, min Tiempo de CEC*, min
CEC: circulación extracorpórea.
Placebo (n= 75)
37 (49.3) 24 (32.0) 14 (18.7) 78 (32) 93(19)
Suplementados (n= 78)
39 (49.4) 27 (34.2) 13(16.4) 87 (31) 95 (14)
Valor P
0.49 0.39 0.35 0.03 0.18
57
Tabla 3. Analisis de eficacia del tratamiento
Incidencia de FAPO en suplementados Incidencia de FAPO en placebo Reducción riesgo absolute IC (95%) Riesgo relativo IC (95%) Reducción riesgo relative IC (95%) NNT IC (95%) Valor p (Test de Fisher)
0.089 0.306 0.217
0.13-0.64 0.287
0.117-0.706 0.685
0.294- 0.883 4.6
1.53 - 9.57
0.004
IC: intervalo de confianza; NNT: número necesario a tratar.
Tabla 4. Principales hallazgos y complicaciones en el postoperatorio
Placebo Suplementados (n= 75) (n= 78)
FA postoperatoria, (%) 23 (30.6) 7 (8.9) Duración de la FA, (h) 14.2 ± 1.3 13.3 ± 0.3 Hospitalización (días) 9.20 ± 0.18 8.15 ± 0.16 Complicaciones
postoperatorias, (%) 5 (6.6) 4 (5.1)
Valor P
<0.01 0.07 0.02
0.74
Las variables continuas son expresadas como promedio ± OS si presentan distribución normal. Las variables categóricasson expresadas en frecuencia(%). FA: fibrilación auricular.
58
1 3
12.3.1 Parámetros relacionados con fa ocurrencia de EO en los
!os
se muestra en la
muestra
7
6
5 * 4
3
2
1
o
B ti
* 4
3
2
1
o Placebo
6. Daño oxidativo en e! auricular determinado por íos niveles de MOA y carbonilos inl,,.m,nt"""'n,::: con omega 3 más vitaminas antioxidantes C y E
auricular fue obtenida al momento de la Diferencias con *P<0.05 vs
59
el caso la en so y niveles y
a sus
y el respectivo no
existe de
el
y al momento el muestra
en 4y1
veces sus basales y las del respectivamente
7A
(1!
E ® (!!
Q. !:....! tl.l<( e: e :2:¡e ~-
't:l o ·- E :.: :::1. f::! (j) Q. o Q.
::::¡
3
2
1
o
<0.001).
Día -7 Tiempo O Día +1 Día+5
-Placebo =suplemento
Figura 7. Los gráficos los niveles de en eritrocito (B) de los pacientes sometidos a o placebo en los distintos ti,:>rnnr\.:::
orcltO(~OI1::>: al momento de la randomización antes de la administración de las vitaminas antioxidantes el día de la (Tiempo 0), a las 6-8 horas de finalizada la +1) y a! alta +5). Diferencias con t vs " vs Pla1ceoo. ANOVA para medidas rep,eti\:las
60
La
este
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6 '
2
de la CEC.
,& Placebo r=0.96
el al
Cabe destacar sólo
;n=47
;n=48
••
3
O,
61
sin embargo, no muestra diferencias significativas después de dos días de tratamiento
con vitaminas antioxidantes. En el grupo placebo, la relación GSH/GSSG no mostró
diferencias significativas entre los grupos durante el protocolo. En el postoperatorio
precoz (día +1 ), el grupo placebo muestra una caída de un 45% en la relación
GSH/GSSG en el eritrocito respecto al valor preoperatorio (P<0.001 ), cambio que fue
atenuado en el grupo suplementario. Al alta, no existen diferencias significativas en
dicha relación en ambos grupos, comparado con su respectivo valor basal (Fig. 10A).
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~ <( <(
0.00 o. Placebo Suplemento Placebo Suplemento
Figura 9. Parámetros relacionados con el status antioxidante intracelular. Se muestran la relación GSH/GSSG (A) y las actividades de las enzimas antioxidantes CAT (B), SOD (C) y GSH-Px (D) en los pacientes suplementados con omega 3 más vitaminas antioxidantes C y E (n=48), o placebo (n=47). Los datos presentados incluyen los valores determinados en el tejido auricular al momento de la cirugía (15 minutos antes de establecer la CEC) (Tiempo 0). Diferencias significativas con *P<0.05 vs placebo (Test de Wilcoxon).
62
A
~ ()
e ..... ·;: e w :Q e () (!,)
.!!!c¡ woo O:::oo
C) --J: (/') C)
B
18
12
6
o
Día -7 Día -2
t t
Tiempo O Día +1 Día +5
l!!lll!l!Piacebo
=Suplemento
Figura 10. Los gráficos representan la relación GSG/GSSG en eritrocito (A) y el FRAP en plasma (8) de pacientes sometidos a suplemento o placebo en los distintos tiempos del protocolo: al momento de la randomización (Día -7), antes de la administración de las vitaminas antioxidantes (día -2), el día de la cirugía (Tiempo 0), a las 6-8 horas de finalizada la cirugía (día +1) y al alta (día +5). Diferencias significativas con *P<0.05, t vs basal, * vs placebo. (Test ANOVA para medidas repetidas).
63
Con respecto a la capacidad antioxidante extracelular, posterior a los 5 días de
tratamiento con omega 3, el FRAP muestra una caída del 22% con respecto al basal
(P<O. 004) (Fig. 1 08), valor que se recupera a los dos días siguientes a la
administración de las vitaminas antioxidantes C y E. Por su parte, el grupo placebo no
muestra diferencias significativas entre el ingreso al protocolo y el día de la cirugía
(Tiempo 0). En el postoperatorio precoz (día +1 ), el placebo evidencia una caída del
FRAP en un 20.9% respecto de la muestra al momento de la cirugía (P<0.05), cambio
que es atenuado en el grupo suplementado. Al alta, la capacidad antioxidante
plasmática en el grupo de pacientes suplementados con omega 3 y vitaminas
antioxidantes fue 23.7% mayor que aquellos que recibieron el placebo y 20.7% respecto
del valor de FRAP al ingreso al protocolo (P<0.05).
12.3.2 Parámetros relacionados con la ocurrencia de inflamación en los pacientes
sometidos a cirugía cardíaca.
Los parámetros relacionados con la ocurrencia de inflamación a lo largo del
protocolo se muestran en la Figura 11. Destaca que en el postoperatorio precoz (día + 1)
el grupo placebo muestra un incremento en el recuento de leucocitos (8A) y en los
niveles de la PCR ultrasensible (11 8), llegando a valores 1.28 (p<O.OOi) y 17.5
(p<0.001) mayores que sus respectivos valores basales. La concentración plasmática
de fibrinógeno no mostró cambios durante el período de tratamiento en ambos grupos.
64
A
B
Día +5
-Placebo
=Suplemento
Figura 11. Los gráficos representan los valores del recuento de leucocitos (A) y los niveles de PCR ultrasensible (us) (B) en las muestras de sangre de los pacientes sometidos a suplemento o placebo en los distintos tiempos del protocolo: al momento de la randomización (Día -7), antes de la administración de las vitaminas antioxidantes (día -2), el día de la cirugía (Tiempo 0), a las 6-8 horas de finalizada la cirugía (día +1) y al alta (día +5). Diferencias significativas con *P<0.05, t vs basal,* vs placebo. (Test ANOVA para medidas repetidas)
65
Con respecto al análisis multivariado la relación GSH/GSSG (OR=1.13; IC 0.98 a
1.18; P<0.001), el nivel de PCR (OR=2.51; IC 1.81 a 3.50; P<0.001) y el recuento de
leucocitos preoperatorios (OR=1.88; IC 0.60 a 7.44; P=0.038) (muestra basal) fueron
predictores de la ocurrencia de FAPO (Tabla 5). Además, los pacientes fueron
comparados respecto a la ocurrencia de FAPO en relación a las características
demográficas y bioquímicas al momento de la cirugía (Tiempo 0). Mientras las
características demográficas no muestran diferencias significativas entre ambos grupos,
los pacientes que presentan FAPO poseen mayores niveles de estrés oxidativo en el
tejido auricular (p<0.01) e inflamación en sangre (PCR y leucocitos) (p<0.01) (Tabla 6).
Tabla 5. Análisis de regresión logística con variables predictoras de F APO
Valor Basal
1.13 0.98- 1.18 < 0.001 Erit GSH/GSSG
2.51 1.18- 3.50 <0.001 PCR-us {mg(dl)
1.88 0.60-7.44 0.038 leucocitos
Representado Razón de riesgo (OR) y acompañado de Intervalos de confianza (IC 95%). P significativo < 5%.
66
Tabla 6. Relación entre la ocurrencia de fibrilación auricular postoperatoria y las características demográficas, parámetros inflamatorios y relacionados con estrés oxidativo, en pacientes sometidos a cirugía cardíaca con circulación extracorpórea.
Características demográficas
FAPO (+) (n= 30)
Edad, años 59.4 (14) Sexo (Hombre/mujer) 25/5 Índice de masa corporal (kg/m2
) 25.4 ± 2.1 Frecuencia cardíaca (Lat/min) 72.2 ± 6.5 Fracción de eyección ventricular izq, % 57.5 (28) Dimensión AP de Al, mm 48.8 (6.1) Días estadía UCI/U.Coronaria,(días) 2.9 ± 0.9 Estadía hospitalaria total (días) 8.6 ± 1.1
Parámetros inflamatorios PCR-us* (mg/dl) 21.4±2.8
FAPO (-) (n= 123)
58.9(12) 101/22
25.6 ± 2.7 71.9±7.4
59 (26) 47.6 (6.4) 3.0 ± 0.87 8.7±1.4
6.9 ± 3.1
Recuento de leucocitos (cel/fJL) 8241.8±1839.9 6803.7±1500
Fibrinógeno (mg/dl) 247.0 ± 56.3
Parámetros relacionados con estrés oxidativo
GSH/GSSG en tejido auricular
GSH/GSSG en eritrocito
Carbonilos en tejido auricular
FRAPt (fJmoi/L)
MOA en plasma:j: (fJmoi/L)
MOA en tejido auricular (¡Jmol/mg proteína)
11.8 ± 3.78
15.8 (0.9)
3.22 ± 0.75
284.8 ± 56.4
0.78 ± 0.18
4.32 ± 0.99
258.7 ± 57.7
14.1±2.5
15.5(1.4)
2.85 ± 0.75
302.1 ± 48.2
0.71±0.16
3.73 ± 0.83
Valor P
0.40 0.44 0.37 0.40 0.76 0.14 0.41 0.43
<0.01
<0.01
0.32
<0.01
0.19
<0.01
0.03
0.01
0.01
Las variables continuas son expresadas como promedio ± DS si presentan distribución normal, o como media (rango intercuartílico) si no la presentan. Las variables categóricas son expresadas en frecuencia(%) AP: antera-posterior; Al: aurícula izquierda ICU: lntensive Care Unit "PCR-us: Proteína C reactiva ultrasensible tFRAP: Ferric reducing ability of plasma tMDA: Malondialdehído GSH: Glutatión reducido GSSG: Glutatión oxidado
67
12.3.3 Detección de las subunidades de la NADPH oxidasa en el tejido auricular
de los pacientes sometidos a cirugía cardíaca.
Con respecto a las fuentes de ERO en el tejido auricular de los pacientes en
protocolo que fueron sometidos a cirugía cardíaca, se determinó el contenido y
localización de la enzima NADPH oxidasa, usando anticuerpos contra las subunidades
gp91 phox (subunidad de membrana) y p47 phox (subunidad citosólica). Se determinó
la abundancia de la subunidad citosólica p47 phox en la fracción de membrana del
tejido auricular como una forma indirecta de la activación de ésta enzima (8abior, 1999),
mediante western blot. La Figura 12 8 muestra en los suplementados un 48.8% menor
contenido relativo de la subunidad p47 phox en la fracción de membrana (P<0.05), sin
diferencias en la abundancia de gp91 phox (Fig. 12 A). Por otra parte, los pacientes que
desarrollaron FAPO presentan un 52.2% mayor contenido de la subunidad p47phox que
aquellos libres del evento arrítmico (Fig. 12 C).
En busca de una asociación entre el grado de activación de la enzima
NADPH oxidasa y los niveles de estrés oxidativo en el tejido auricular, se buscó
correlacionar la abundancia de p47 phox en la fracción de membrana con los distintos
biomarcadores de estrés oxidativo en el tejido auricular. Se encontró una correlación
positiva entre el contenido relativo de p47 phox y los niveles de malondialdehído (Fig.
13A), contenido de carbonilos (Fig. 138) y residuos de nitrotirosina (130) (r=0.731,
p<0.001, n=55; r=0.852, p<0.01, n=55; r=823, p<O.Oi, n=55) en ambos grupos de
tratamiento. Por otra parte, la relación GSH/GSSG en el tejido auricular mostró una
correlación negativa con la cantidad de p47phox (Fig 13C) (r=-0.671, p<0.01, n=55).
68
gp91phox
a;-actina
-¡¡¡- (8) (11
.2: -¡¡¡ i! "Ó
2. o Suplemento Placebo Control
e gp91phox
FAPO {+) FAPOH
Gp91 phox
130 ~ gp91
90
55
43
p47phox
íii (11
> 1.5 :¡::¡ (11
f "Ó 0.5
2. o
D
* (10)
Suplemento
* (14)
•
(10)
Placebo
p47phox
a actina
FAPO(+) FAPOf)
~p47
(8)
Control
Figura 12. Contenido relativo de las subunidades de la NADPH oxidasa gp91phox (A) y p47 phox (B) en el tejido auricular de pacientes sometidos a suplemento (n=10), placebo (n=10) y sin intervención farmacológica (control, n=8). Las muestras fueron obtenidas 15 minutos antes de comenzar la CEC. Las diferencias para ambas subunidades con respecto al desarrollo de la arritmia (15 con FAPO vs 14 en ritmo sinusal) se muestran en la Fig C. Bajo cada banda se muestra la cuantificación densitométrica promedio ± DS y el número de pacientes comparados por grupo. Diferencias con *P < 0.05. (t de Student no pareado). En (D) se muestran los patrones de bandeo para cada subunidad en las condiones suplemento (SUP) y placebo (PL).
69
aactina
A 8 6
• • ' • • ~· • ~
~-· ......
•• (/) e" 4 ~ -• • ..2 Q.¡) . ... IIH,~ 11/i
·¡:; m. •••• o E . • • . •-:.' -E ::::i -~
•• 11/i «! O: 2 .-~
<( o E: o -~ r-0.731; p<0.01 -=.~ r-0.852; p<0.01 :¡:¡:
~~~· 11/i n=55 n=55
3 o 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 0.0 0.5 1.0 1.5
Contenido relativo de p47 Contenido relativo de p47
(u. a) (u.a)
e 12 D 1.50
10 m (.') ¡:; 1.25 • en 8 ~ ... ,.. ·'. ·¡¡¡ • • en o IIH~ • Q • ... 1.00 • 4ltlili 11/i .. :¡::¡ ••• :::r: 6 •• o • ....
~· en • :!:: ni 0.75 • (.') • z :::i • ,. ¡:; 4 (/)
···-· '0 e o 0.50 "o ::S ro 2 "O
-¡¡; p<0.01 ·¡¡¡ 11!!11 IDO r-0.823; p<0.01 0:: (]) 0.25 • • n=55 o 0::
0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 0.00 0.0 0.5 1.0 1.5
Contenido relativo de p47
(u. a) Contenido relativo de p47
(u.a)
Figura 13. Gráfico que representa la correlación entre la subunidad p47 phox y algunos parámetros estrés oxidativo en tejido auricular como el MOA (A), el contenido de carbonilos (B), la relación GSH/GSSG (C) y los residuos de nitrotirosina (O) en pacientes sometidos a cirugía cardíaca con CEC.
70
2.0
2.0
1
Con
grupo
al contenido
n:::lir'!e:>nu::·~ que desarrollaron
con omega 3
en
antioxidantes
menores niveles nitrotirosina que respectivos o1ace1:>os )
A B
Nitrotimsina
o: - actina
FAPO(+) FAPO(-)
Control Placebo Sup)emento
e
Nitrotirosina
a- aclina
Figura 14. Contenido relativo de nitrotirosina en el auricular de pacientes que desarrollaron FAPO (n=1 versus !os que se mantuvieron en ritmo sinusal (n=14) (A) En la B se muestra la cuantificación en pacientes sometidos a suplemento (n=10), placebo (n=10) y sin intervención farmacológica (control, n=8). Las muestras fueron obtenidas 15 minutos antes de comenzar la CEC. Bajo cada banda se muestra la cuantificación densitométrica promedio ± DS y el número de pacientes comparados por grupo. Diferencias con *P < 0.05. (t de Student no pareado}. En (C) se muestra el gel completo con el patrón de nitración en el tejido auricular de pacientes controles, que desarrollaron placebos y suplementados.
71
La Figura 15 muestra la presencia de las subunidades gp91 phox y and
p47 phox (C) en las muestras de orejuela derecha un paciente que recibió desarrolló
la arritmia. imagen de inmunolocalizción en los cortes de tejido auricular muestra un
patrón estriado ambas subunidades. el caso de la subunidad gp91 phox, la
marca se localiza tanto en el sarcolema, como en las invaginaciones (túbulos
transversales) (Figs. 15A y 158), patrón esperable para una proteína de membrana.
A e
gp91
B
Figura 15. lnmunolocalización de las subunidades de la NADPH oxidasa gp91phox(A, 8) y p47phox(C) en cortes de tejido auricular de un paciente con FA La muestra fue obtenida 15 minutos antes de comenzar la CEC (Tiempo 0). La barra de escala representa 5~m.
72
12.3.5 Activación del NF-KB en el tejido auricular
Los pacientes controles analizados mostraron una mayor intensidad en el
bandeo al realizar el ensayo retardo, con un rango 8 y 5 arbitrarias,
dato que concuerda con la mayor activación que presenta este factor en estados
proinflamatorios et al., La magnitud de la unión NF-KB al ADN en el tejido
auricular de pacientes placebo (valor de la densitomatría) fue comparable con la
evidenciada en los controles, mientras los pacientes suplementados mostraron un 30.5
y 22.5% menor magnitud activación que los controles y los placebos (P<0.05),
respectivamente (Fig. 16 a). La supresión de la banda en el control 16 e) en el
ensayo de competencia con ADN no marcado en exceso de 1 00 M confirma la
especificidad de la determinación. Se realizó además análisis de "supershift" para en
muestras pacientes suplementados, confirmando presencia de ambas
subunidades (p50 y p65) (Fig
Control Supl f'!ac
(a)
400
"' 350
~ 300 Ew
""<1! E > 250 g1U ~~ 200 (]) 'O
150 ::;
100
50
o
NF-Jd:3
JL
Compet Control
(e)
Control Suplemento Placebo
(b)
Anti p50 (-) (+} {-) Anti p65 (+) (-) (-)
•Control (8)
O Suplemento (10)
DPiacebo (10)
(el)
Figura 16. Unión del NF-K:B al ADN determinada por la técnica de EMSA en pacientes controles, suplementados y placebos. Autorradiografia que representa los carriles cargados con 8 119 de proteína del extracto nuclear en un paciente control, un suplementado (supl) y un placebo (plac) {a). En (e) se muestra el ensayo de competencia entre una muestra control (positivo) y ADN no marcado en exceso (100 M) (compet) y en (d) el análisis de "supershift" en un paciente suplementado. En (b) se muestran las barras que corresponden a la cuantificación relativa por densitometría de la de la unión del factor al ADN, representando el promedio ± DS para el número de pacientes indicados entre paréntesis. Diferencias significativas (P<0.05): \rs control: 8
VS placebo.
73
Al realizar el mismo ensayo para comparar la activación factor con respecto
a la ocurrencia la arritmia, se evidenció una mayor magnitud de unión NF-KB al
ADN en los pacientes que desarrollaron (Fig. 17 a y b).
NF-ld3 p65 --7
J L p50 --7
p50p65 --7
Control FA(+) FA(-) Control Compet Anti p50 {-) {+) (-)
(a) (e) Anti p65 (+) (-) (-)
(el)
(b)
400 (/) a*
' ro 350 u
~ ~ 300 E > 'ª 'j¡¡ 250 lll1l Control (15) ~ ~ 200 <!> DFA(+) (14) "O
:::¡ 150 llliFA(-) (8) 100
50
o Control FA(+) FA(-)
Figura 17. Unión del NF-tcB al ADN determinada por la técnica de EMSA en pacientes controles, que desarrollaron la arritmia (FA(+)) y los libres de FA(-). Autorradiografía que representa los carriles cargados con 8 !J9 de proteína del extracto nuclear en un paciente control, un paciente FA(+) y otro FA(-) (a). En (e) se muestra el ensayo de competencia entre una muestra control (positivo) y ADN no marcado en exceso (100 M) (compet) y en (d) el análisis de "supershift" en un paciente FA(+). En (b) se muestran las barras que corresponden a la cuantificación relativa por densitometria de la de la unión del factor al ADN, representando el promedio ± DS para el número de pacientes indicados entre paréntesis. Diferencias significativas (P<0.05): ·vs control: "vs FA(-).
74
12.3.6 Eventos adversos
Se registró la ocurrencia de eventos adversos en 8 pacientes suplementados y
12 pacientes sometidos a placebo, sin diferencias significativas (RR= 0.64; 95% IC, 0.27
a 1.48; P=0.342). Los eventos más frecuente fueron la dispepsia (5 vs. 3 eventos)
(RR=1.61; 95% IC, 0.40 a 6.46; P=O. 71) y la diarrea (2 vs. 3 eventos) (RR=0.64; 95%
IC, 0.11 a 3.73; P=0.67). No ocurrieron eventos hemorragíparos o cardiovasculares
mayores (infarto agudo al miocardio durante el postoperatorio.
75
13. Discusión de los resultados
Este es un ensayo clínico doble-ciego, placebo-controlado, que sustenta la
hipótesis que el reforzamiento del sistema de defensa antioxidante sistémico se asocia
a una reducción de la FAPO. Esta estrategia se basa 2 etapas consecutivas: (1) la
producción de estrés oxidativo como consecuencia de la administración de los ácidos
grasos omega 3, los cuales inducirían los sistemas antioxidantes endógenos y (2), el
reforzamiento del sistema de defensa antioxidante no enzimático a través de la
suplementación con vitaminas C y E. La condición pro-oxidante fue confirmada antes de
la administración inicio de las vitaminas antioxidantes (día -2) por una disminución de
los valores de FRAP y relación GSH/GSSG en el eritrocito (Fig. 10), junto con un
incremento de los niveles plasmáticos de MOA en el grupo que recibió suplemento,
comparado con sus respectivos valores basales (Fig 7 A).
Reportes previos muestran el efecto antiarrítmico de los ácidos grasos omega 3
y las vitaminas antioxidantes C y E por separado (Caló et al., 2005; Patti et al., 2006) sin
embargo, este estudio aplica ambas estrategias farmacológicas de manera exitosa,
reduciendo aún más la ocurrencia de FAPO. En cuanto al modelo de estudio, es sabido
que el fenómeno de isquemia-reperfusión que ocurre durante la cirugía cardíaca con
circulación extracorpórea favorece una condición pro-oxidante, proceso que se refleja
en el mayor nivel de estrés oxidativo en la sangre obtenida en la muestra
postoperatoria preces (6-8 horas) (Fig. 7). Un reciente estudio tipo caso-control observó
que los pacientes sometidos a cirugía cardíaca que desarrollan FAPO presentan
mayores niveles de proteínas oxidadas en tejido auricular y una mayor cantidad de
peróxidos totales en el suero a las 6 horas del postoperatorio, con respecto a los que se
mantienen en ritmo sinusal (Ramlawi et al., 2007). Además, se han descrito menores
niveles de glutatión en el tejido auricular de pacientes con insuficiencia cardíaca que
desarrollan este tipo de arritmia, contribuyendo esta depleción al fenómeno de
disfunción contráctil y remodelación que presentan estos pacientes (Van Wagoner,
2008).
El efecto cardioprotector de la suplementación con los ácidos grasos omega 3
parece ser ejercida desde el inicio del protocolo. Estos compuestos altamente
insaturados pueden ser susceptibles de peroxidación (Aiexander-North et al., 1994),
modificación oxidativa que temporalmente podría disminuir la capacidad antioxidante en
sangre (día -2), no así en el miocardio, ya que los valores de la relación GSH/GSSG en
el tejido auricular fueron mayores en los pacientes suplementados. Esto se podría
76
explicar, ya que los omega 3 a su vez, pueden potenciar el sistema de defensa
antioxidante mediante la regulación positiva de algunas enzimas antioxidantes y otras
proteínas. Experimentos en ratas que consumen una dieta enriquecida en omega 3,
muestran el aumento en algunas enzimas antioxidantes como la manganeso superóxido
dismutasa (Mn-SOD) y glutatión peroxidasa (GSH-Px) (Jahangiri et al., 2006).
Adicionalmente estos cambios oxidativos se asociarían a una mejor utilización de la
energía mitocondrial que reduciría la susceptibilidad a desarrollar arritmias secundarias
a un evento de isquemia-reperfusión (Pepe & Mclennan, 2007). Por otra parte, existe
evidencia de que el efecto preacondicionante de los ácidos grasos omega 3 se ejercería
cuando los niveles de ERO son subletales e insuficientes para gatillar la muerte celular,
activando vías antiapoptóticas, y así mejorando la respuesta contráctil del miocardio
(Mukherjee et al., 2007; Leroy et al., 2008). Los datos aquí presentados apoyan esta
idea, debido a que el tejido auricular de los pacientes suplementados muestra mayor
actividad de las enzimas antioxidantes CAT, SOD y GSH-Px (Fig. 9), en comparación
con el grupo placebo.
En cuanto a los efectos clínicos secundarios a la administración de omega 3 que
fundamentarían su papel cardioprotector, éstos incluyen: prevención de arritmias (Pratt et
al., 2009), disminución de triacilglicéridos (Jialal et al., 201 0), reducción de las cifras de
presión arterial (Yang & Keny, 2007), disminución de la agregación plaquetaria (Lev et al.,
2010), mejoramiento de la función endotelial (Margan et al, 2006; Fahs et al., 2010),
disminución de la inflamación (Siddiqui et al, 2007) y estabilización de las placas
ateroscleróticas (Thies et al., 2003; Cawood et al., 201 0). Posterior a su administración,
tanto en períodos cortos como durante un consumo crónico, hay evidencias de una
reducción en la frecuencia cardíaca, además de un rápido retorno a la frecuencia cardiaca
basal después del ejercicio, demostrando entonces un probable efecto antiarrítmico de
estos compuestos en humanos (O'Keefe et al., 2006).
Efectos directos de los omega 3. Estudios experimentales han confirmado la
acción antiarrítmica de los omega 3 en varios modelos de muerte súbita en perros,
mostrando que estos componentes estabilizan eléctricamente las membranas de los
cardiomiocitos a través de la modulación de la corriente rápida dependiente del canal de
sodio y la corriente lenta dependiente del canal de calcio tipo L. Como consecuencia,
los cardiomiocitos se hacen más resistentes a la generación de arritmias (Leaf et al.,
2003). Más aún, los omega 3 pueden actuar como ligandos y ejercer un efecto
reversible en la modulación de la cinética electrofisiológica de varios canales iónicos,
77
sugiriendo su unión a sitios específicos de estas proteínas y también a otros no
específicos, por ejemplo incoporándose en los lípidos de membrana (Xiao et al., 2005).
La suplementación con omega 3 a parte de incrementar las defensas antioxidantes,
cambiaría los patrones de fluidez en la membrana del cardiomiocito y atenuaría el
incremento de calcio citosólico (Leifert et al., 2000). Existen otros mecanismos
específicos responsables de la atenuación de la injuria a nivel celular que estan aún en
discusión.
Efectos mediados por omega-3. Los efectos protectores de los omega 3 sobre
los cardiomiocitos estarían determinados a partir de cambios en la expresión génica.
Varios estudios in vitro muestrán que la suplementación con estos compuestos produce
una regulación negativa de algunos genes relacionados con la ocurrencia de
inflamación, remodelación de la matriz extracelular, distribución del calcio intracelular y
formación de ERO (Bordoni et al., 2007; Di Nunzio et al., 2009). Esta modulación
transcripcional sería ejercida directamente por productos de oxidación no enzimática o a
través de factores de transcripción. Con respecto al mecanismo de inducción de las
enzimas antioxidantes, esta ocurriría a través de la activación de elementos de
respuesta antioxidante en el ADN (ARE=Antioxidant response e/ement) que participan
en las reacciones de detoxificación (fase 11). El factor de transcripción relacionado al
factor nuclear eritroide-2 (Nfr2) se uniría a estos elementos de respuesta determinando
la regulación positiva de algunas de las enzimas de detoxificación celular y dentro de
éstas, los componentes que determinan el potencial antioxidante celular (enzimas
antioxidantes, glutatión, etc) (Lee et al., 2005). El Nfr2 se encuentra secuestrado en el
citoplasma por un inhibidor el Keap1, cuya disociación por señales de activación
(proteínas quinasas y sustancias electrofílícas) permite la traslocación al nucleo del
factor. Los omega 3, al ser más susceptibles a la auto-oxidación que otros ácidos
grasos de membrana, como el araquidónico, reaccionan directamente con este
regulador negativo, favoreciendo los procesos de expresión génica derivados de su
acción (Gao et al., 2007). Utilizando espectrometría de masas en tandem para analizar
los ácidos EPA oxidados se demostró la presencia de nuevas moléculas llamadas J3-
isoprostanos, los cuales tanto in vivo como in vitro estabilizan al Nfr2 e inducen su
expresión génica. Además los niveles de ERO se relacionaron con la dosis de EPA y el
tiempo de suplementación. Por ejemplo, se conoce que a bajas dosis, el DHA potencia
la respuesta del sistema de defensa antioxidante, induciendo la actividad de las
78
enzimas antioxidantes catalasa y glutatión peroxidasa, lo que se asocia con menores
niveles de lipoperoxidación (Leonardi et al., 2007).
Además, los efectos cardioprotectores y antiarrítmicos de la suplementación con
omega 3 pueden ser atribuidos a la acción antiinflamatoria de estos ácidos grasos
poliinsaturados. Tanto el EPA como el DHA pueden inhibir la producción de citoquinas
inflamatorias tales como el TNF-a, IL-1¡3, ll-6 e IL-8 y algunos quimioatrayentes de
neutrófilos, efectos que son eicosanoide-dependientes o independientes. Dentro de las
acciones dependientes están la incorporación entre los fosfolípidos de membrana a
expensas del ácido araquidónico inhibiendo de esta forma las vías proinflamatorias y
procoagulentes asociadas al metabolismo de este sustrato. Las acciones
independientes por su parte están representadas por la modulación a nivel
transcripcional de la producción de citoquinas pro y antiinflamatorias. En este contexto,
una nueva familia de mediadores lipídicos derivados del DHA llamados resolvinas y
protectinas han sido descritos (Calder, 2009). Estas moléculas pueden inhibir
directamente vías proinflamatorias, como las dependientes de la cicloxigensas tipo 2 y
regular la activación de factores proinflamatorios como el NF-KB (Calder, 2005).
En el caso de la administración de las vitaminas antioxidantes C y E, los
resultados son concordantes con los efectos protectores de ambos compuestos frente a
episodios de isquemia-reperfusión descritos en otros órganos (Bilodeau & Hube! 2003;
lchiki et al., 2008). En el caso de la FA, la administración de ascorbato fue reportado en
un estudio no randomizado, en dosis similares a las utilizadas en este estudio (2g el día
anterior a la cirugía seguido de 1 g al día hasta el so día postoperatotio) reduciendo la
ocurrencia de la FAPO de 34 a 16% (Carnes et al., 2001), sin embargo no hay estudios
que vinculen la vitamina E a las dosis que se utilizaron en este estudio con un efecto
cardioprotector. Con respecto a las determinaciones bioquímicas (variables de
observación secundarias), la disminución de la capacidad antioxidante (FRAP) posterior
a los 5 días del tratamiento con omega 3 se recupera al incorporar las vitaminas C y E
(Tiempo 0). En el postoperatorio precoz, ocurre un nuevo desafío pro-oxidante y
proinflamatorio (día +1 ), que se evidencia en las muestras del grupo placebo en un
menor valor del FRAP, y en mayores valores de malondialdehído, PCR y leucocitos
(Figs 7, 1 O y 11 ). Esto último sustentaría un papel relevante tanto del estrés oxidativo
como de la inflamación no sólo como marcadores de FAPO sino más directamente en la
fisiopatología de la arritmia secundaria al evento quirúrgico. En este contexto, al analizar
79
el total de pacientes sometidos a protocolo con respecto a la ocurrencia de la FAPO se
evidencia un mayor nivel de leucocitos y PCR, junto con mayor ocurrencia de estrés
oxidativo en el tejido auricular, siendo estos 2 marcadores inflamatorios más el glutatión,
predictores de FAPO de acuerdo al análisis multivariado.
Con respecto a los mecanismos de acción de ambas vitaminas, no solamente
pueden atribuirse a la propiedad de atrapar ERO, sino también a la reducción en su
formación por parte de algunas fuentes enzimáticas (Rodrigo et al., 2008). Ambas
vitaminas inducen una regulación negativa de la NADPH oxidasa y positiva de la óxido
nítrico sintasa, fuentes importantes de ERO durante la reperfusión del corazón
previamente isquémico (Uiker et al., 2003). La enzima NADPH oxidasa, es una
importante fuente de ERO en el miocardio ventricular y últimos reportes avalan su
participación en la fisiopatología de la FAPO (Murdoch et al., 2006). Estudios recientes
avalan este planteamiento debido a que se ha encontrado en pacientes que desarrollan
FAPO, un aumento de los niveles de la subunidad citosólica p47 phox (Kim et al., 2005),
así como una mayor actividad oxidasa versus aquellos pacientes que se mantienen en
ritmo sinusal (Kim et al., 2008). Esto último estaría en concordancia con los datos
presentados en este trabajo (Figs 9 y 11 ). En la Fig. 15 se esquematiza la contribución
mecanística de !os omega 3 y las vitaminas antioxidantes en el la prevención de la
FAPO
La asociación relativa entre la ocurrencia de inflamación y estrés oxidativo en la
fisiopatología de la FAPO está bajo controversia. Es conocido que un elemento común a
ambos mecanismos es la activación del NF-KB. Este factor existe en estado
heterodimérico siendo sus dos componentes más frecuentes el p50 y el p65. Se conoce
que permanece inactivo en el citosol formando un complejo con su represor, el inhibidor
KappaBa (IKBa) (Hall et al., 2006). La inducción de ERO, citoquinas y el estrés de roce
tangencial sobre el endotelio producidos durante la injuria por reperfusión estimulan la
activación de este factor por fosforilación de su inhibidor (IKKa). Recientes datos
implican también su mayor activación con la de vías proinflamatorias y pro
arritmogénicas que conducen a remodelación miocárdica, tales como el TGF-!3, la
angiotensina 11 y las dependientes de canales iónicos como el de sodio y potasio (Gao
et al., 2009). En el presente estudio la sup!ementación con omega 3 y vitaminas
antioxidantes disminuye la activación de este factor (Fig 16), probablemente debido a la
menor ocurrencia de inflamación e injuria oxidativa al momento de la cirugía (Tiempo 0),
tanto en el tejido (Fig. 3) como a nivel sistémico (Fig. 11 ). Por otra parte, la ocurrencia
80
de FAPO se asocia a mayor activación de NF-KB (Fig. 17b), lo que se explicaría debido
a que los estímulos proinflamatorios (PCR y leucocitos) que se exacerban durante la
reperfusión (circulación extracorpórea), pueden activar más este factor. Al comparar
pacientes que permanecen en ritmo sinusal versus aquellos que desarrollan la arritmia,
se evidencia que estos últimos tienen mayor activación de vías proinflamatorias como
las dependientes de TGF-B y TNF-a, ambos factores profibrogénicos que sustentan el
proceso de remodelación que ocurre en los pacientes con FA (Polyakova et al., 2008).
Además, datos recientes muestran que el NF-KB podría estar involucrado en la
regulación transcripcional de los canales iónicos y de esa forma contribuir al riesgo de
desarrollar arritmias, como por ejemplo alteraciones en la abundacia del canal de sodio
(Leí et al., 2007). Por lo tanto, las vías de señalización asociadas a la activación del NF
KB constituyen un probable blanco farmacológico para el desarrollo de futuros
antiarrítmicos.
Daño miocárdico mediado por peroxinítrito. La formación de NOO- representa el
mecanismo más importante de injuria en varias patologías cardiovasculares tales como
el infarto agudo al miocardio, la insuficiencia cardíaca crónica y la fibrilación auricular
paroxística (Pacher et al., 2005). El daño citotóxico involucra modificaciones oxidativas
en lípidos y AON, la activación de metaloproteinasas (Wang et al., 2002) y la nitración
de proteínas en residuos de tirosina (Borbely et al., 2005). Además, este compuesto
intermediario puede actuar como molécula de señalización intracelular, activando a
miembros de la familia de las MAP kinasas (Pesse et al., 2005) e inhibiendo algunos
factores transcripcionales pro-inflamatorios como el NF-KB (Lance! et al., 2004). A nivel
del AON, favorece la activación de la enzima poli-(AOP ribosa) polimerasa, la cual
consume nicotinamida dinucleótido (NAO) y ATP, llevando a necrosis celular (Jagtap &
Szabo, 2005).
En el caso de la FA, existe asociación entre la ocurrencia del evento arrítmico y
la mayor formación de Noo· durante la reperfusión (Zweier & Talukder, 2006).
Pacientes coronarios que desarrollan FA posterior a una cardioversión eléctrica
presentan mayores niveles de MOA y residuos de nitrotirosina a largo plazo,
comparados con los que permanecen en ritmo sinusal (Leftheriotis et al., 2009).
Complementariamente, estudios mecanísticos, muestran que la injuria oxidativa que
ocurre en los pacientes que desarrollan FA altera el metabolismo energético de las
miofibrillas y causa disfunción contráctil mediante la nitración de proteínas (Míhm et al.,
2001). Además, se sugiere que la FA se relaciona con la inhibición de la corriente de
81
calcio tipo -L dependiente de la activación de la óxido nítrico sintasa endotelial, en
donde la inhibición de ésta enzima por glucocorticoides atenúa la remodelación eléctrica
en el tejido auricular (Shiroshita-Takeshita et al., 2006). Recientemente se han descrito
efectos antiarrítmicos asociados a la administración de nitratos durante la isquemia, que
se relacionan con el aumento de la biodisponibilidad del ON durante la fase de
reperfusión, optimizando la viabilidad del cardiomiocito frente a la injuria oxidativa (Kiss
et al., 201 0). Por lo tanto los resultados mostrados, apuntan a que los pacientes con
FAPO presentan mayor estrés nitrosativo al momento de la cirugía, así como el efecto
atenuante de la injuria de este tipo asociada a la terapia antioxidante aquí propuesta
(Fig. 13).
Con respecto a los eventos adversos, el consumo crónico de omega 3 se ha
asociado a síntomas gastrointestinales menores como dispepsia y dolor abdominal, sin
embargo en menor frecuencia, se han descrito otros más severos como fenómenos
hemorragíparos e hipertrigliceridemia. La mayoría de los eventos graves son dosis
dependientes y más evidentes con dosis sobre los 3 g/ día (Barceló-Coblijn et al., 2008).
En este protocolo, a pesar de utilizar dosis mayores al consumo establecido por la
Asociación Americana de Cardiología (250 -500 mg de EPA y DHA por día), el corto
tiempo de administración podría asociarse a una menor frecuencia de dichos efectos
indeseados.
En resumen, esta tesis plantea una nueva estrategia de preacondicionamiento
no hipóxico para prevenir la FAPO que involucra un reforzamiento del sistema de
defensa antioxidante. La consecuencia es la atenuación del daño oxidativo e
inflamatorio, que se asocia a una reducción del evento arrítmico. Estos datos deberían
ser la base de futuros ensayos clínicos que tuvieran como objetivo reducir la estadía
hospitalaria y el costo que se asocia a las complicaciones postoperatorias, y mejorar el
pronóstico de los pacientes sometidos a este tipo de cirugías u otras que también
pueden presentar riesgo de FAPO.
82
Suplementación Suplementación Omega3
(EPA+ DHA) Vitaminas antioxidantes
(C +E)
l Síntesis Interacción directa EO moderado
.,!..AA- Tx en membrana J3 lsoprostanos
,¡,
Vías sobrevida (Nfr2 +)
,J.-Actividad ,J., Actividad de ! COX-2 canales Na+ IActiv
Enzimas Antioxidantes
! .,!.. IL-1 !3 Hiperpolarización
Reforzamiento del sistema antioxidante .,!.. NF-K¡3 de membrana
! 1 .J., Inflamación ,J., Especies reactivas del oxígeno
!
Disminuye riesgo de FA
Figura 18. Mecanismos asociados al efecto protector de la suplementación con omega 3 y vitaminas
antioxidantes C y E contra la ocurrencia de FAPO. AA, acido araquidónico; Tx, Tromboxanos; COX, ciclo
oxigenasa; IL-1 ~. interleuquina 1-~eta; NF-KB, Factor nuclear kappaB; EO, Estrés oxidativo; Nfr2, actor de
transcripción relacionado al factor nuclear eritroide-2.
83
14. Conclusiones
En pacientes sometidos a cirugía de cardiopatía no congénita, la
suplementación con ácidos grasos omega 3 y vitaminas antioxidantes C y E se asocia
a una menor ocurrencia de fibrilación auricular postoperatoria.
Este efecto se refleja en:
Un aumento del potencial antioxidante en sangre y tejido auricular
Un menor de estrés oxidativo (niveles de lipoperoxidación y carbonilos)
tanto en sangre como en tejido auricular.
Una menor abundancia de la subunidad citosólica de la NADPH oxidasa, y
Una menor activación del NF-KB en tejido auricular.
Cabe destacar que ambos tratamientos fueron seguros durante la intervención
con una tasa baja de eventos adversos.
84
82. Referencias
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101
ANEXO 1
PROYECTO
DOCTORADO FARMACOLOGÍA
CARACTERIZACIÓN DE LOS EFECTOS LOCALES Y SISTÉMICOS DE LA SUPLEMENTACIÓN CON ÁCIDOS GRASOS OMEGA-3 Y VITAMINAS ANTIOXIDANTES C Y
E EN PACIENTES SOMETIDOS A CIRUGÍA CARDÍACA CON CIRCULACIÓN EXTRA CORPÓREA
CDT Cardiología Hospital San Juan de Dios
Centro Cardiovascular Hospital Clínico Universidad de Chile
Laboratorio Fisiopatología Renal
Facultad de Medicina
Universidad de Chile
9786943
lnv. Responsables: Dr Ramón Rodrigo- Dr. Rodrigo Castillo
lnv Principales: Dr. Cristián Baeza (HJD)- Dr Maurido Cereceda (HCUCH)
FORMULARIO DE INGRESO A PROTOCOLO
Nombre Paciente:
Fecha:
102
Fecha:
Formulario de ingreso a protocolo
Consignar fechas como día/mes/año, una vez completado el formulario enviar al laboratorio.
Número de ficha
Apellido Paterno
Apellido Materno
Nombres
---Edad {años)
RUT
Fecha de nacimiento
N2 Randomización
Día, hora, de la cirugía (planificado)
Día muestra -7
-Día muestra -2
Día Muestra Cx {Antes Bomba) hora:
--Hora de muestra 6-8h post op
Día muestra al alta
103
Formulario de datos clínicos de paciente en protocolo.
Número de ficha
Apellido Paterno
Apellido Materno
Nombres
Epi crisis
Síntoma principal, fecha de aparición
Datos de hospitalizaciones anteriores - Diagnósticos
Día de alta
HTA sí/no
DM si/no
Dislipidemia diagnosticada sí/no
Tabaquismo activo si/no
Antecedentes familiares de Cardiopatía
coronaria si/no
Otras comorbilidades
Antecedentes quirúrgicos
Fármacos usados
Drogas
IMC
Circunferencia de cintura
D D
D
D
D
--
104
Coronariografia preoperatoria:
Ecocardiografía preoperatoria:
Fraccción de eyección ventricular: ____________ _
Diámetro aurícula izquierda: ____________ _
105
Formulario de datos de laboratorio hospitalario
IDENTIFICACIÓN
Exámenes de ingreso del paciente, previos a la hospitalización para la cirugía.
Hematocrito (1 ngreso)
Hemoglobina (Ingreso)
Nº leucocitos (Ingreso)
PCR {ingreso)
Colesterol Total {Ingreso)
Triglicéridos (Ingreso) - ---
Colesterol HDL (Ingreso) ---
Colesterol LDL {Ingreso)
Creatinina {Ingreso)
Nitrógeno ureico -- --
Fibrinógeno (Ingreso) ----
PCR ultrasensible (Ingreso)
* medidos en laboratorio
Otros del paciente:
Postoperatorio (sólo si están disoinibles)
Hematocrito (post operatorio)
Hemoglobina (post operatorio)
Recuento leucocitos {post operatorio)
PCR ultrasensible (post operatorio) -·---
Día del Alta hospitalaria
Hematocrito (Alta)
Hemoglobina (Alta)
Recuento leucocitos (Alta)
PCR ultrasensible (Alta)
Colesterol Total (Alta) ---------
Triglicéridos (Alta)
Colesterol HDL (Alta)
Colesterol LDL (Alta)
Creatinina (Alta)
106
Formulario de Electrocardiografía: Consignar los siguientes datos, una vez completo el formulario, enviar al laboratorio. Solicitar evaluación de ECG por algún electrofzsiólogo en el proyecto. Usando letra legible.
IDENTIFICACIÓN
ECG Preoperatorio: Informe electrocardiográfico (pre)
--------Frecuencia cardíaca en ECO (pre)
Duración onda P (pre)
Intervalo PR (pre)
Duración QRS (pre)
Eje QRS (pre)
Intervalo QTc (pre) --'---·
ECG Postoperatorio Informe electrocardiográfico (post)
--·
Frecuencia cardíaca en ECO (post)
Duración onda P (post) -
Intervalo PR (post)
Duración QRS (post) -
Eje QRS (post)
Intervalo QTc (post)
107
Formulario de datos quirúrgicos
IDENTIFICACIÓN
Tipo de cirugía
Clamp
CEC
Reperfusión
Paro hipotérmico
Plejia
Necesidad intraoperatoria de drogas vasoactivas si/no
Necesidad de hemoderivados si/no
Presenta complicaciones en pabellón
si/no
IAM intraoperatorio si/no
Fibrilación Ventricular itraoperatoria
si/no
Taquicardia ventricular sostenida intraoperatoria si/no
FA intraoperatoria si/no
Comentarios respecto a la cirugía
D
D
D
D
D
D
D
108
Formulario Postoperatorio Usando los datos de laficha, una vez completo enviar al laboratorio. IDENTIFICACIÓN
Desarrollo de FA Postoperatoria SÍ/no
Día postoperatorio N°
Hora de aparición
Duración
Sintomática si/no
Presencia de otras arritmias si/no
Especificar
D
D
D
Hemotngia post operatoria si/no O Necesidad de Ventilación mecánica si/no O Tiempo en ventilación mecánica
Días en Unidad coronaria
Días en Intermedio
Días en sala común
Desarrollo de Infecciones si/no O Especificar infecciones postoperatorias
-
109
ANEXO 2
UNIVERSIDAD DE CHilE FA,CLil T,t~,D DE f\JEDICINA
COfvJITÉ DE ÉTICA DE LA INVESTIGACIÓN EN SERES HUfV1ANOS
CONSENTIMIENTO INFORMADO "CARACTERIZACIÓN DE lOS EFECTOS lOCALES Y SISTÉMICOS DE LA
SUPlEMENTACIÓN CON ÁCIDOS GRASOS OMEGA-3 Y VITAMINAS ANTIOXIDANTES C Y E EN PACIENTES SOMETIDOS A CIRUGÍA CARDÍACA CON CIRCULACIÓN
EXTRACORPÓREA"
Nombre del Investigador Responsable: Dr. Rodrigo Castillo Peñaloza Institución: Laboratorio de Fisiopatología Renal, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. Teléfonos: 9786943.
Invitación a participar: Le estamos invitando a participar en un proyecto de investigación para prevenir la fibrilación auricular que puede ocurrir después de una cirugía cardíaca.
Objetivos: Esta investigación tiene por objetivos evaluar el uso de vitamina C, vitamina E y ácidos grasos omega-3 como medida preventiva de la arritmia cardíaca más frecuente del ser humano. El estudio se realizará en el Hospital Clínico de la Universidad de Chile y el Complejo Hospitalario San Juan de Dios con un número total de 300 pacientes.
Procedimientos: Si a Ud. se le debe someter a una cirugía cardíaca y acepta participar en el proyecto, será sometido a los siguientes procedimientos: 7 días antes de la operación se realizará toma de muestra de sangre y asignación al tratamiento. 2 días antes de la operación se vuelve a tomar muestra de sangre. En la cirugía se obtendrá una muestra de su tejido auricular (orejuela derecha), sin riesgo para Ud., junto a una nueva muestra de sangre. La muestra de corazón será utilizada para estudios histológicos y bioquímicos; mientras que en la sangre se medirán parámetros relacionados con inflamación y estrés oxidativo. Mientras se encuentre hospitalizado será visitado diariamente por el equipo tratante y por alguno de los investigadores y enfermera del proyecto; junto a ello se le practicará un electrocardiograma diario y previo al alta se le tomará una nueva muestra de sangre y un registro del ritmo cardíaco de un día de duración. Será controlado en el policlínica del hospital de manera habitual, además por el equipo investigado
11 o
Riesgos: La administración de vitamina C, vitamina E y ácidos grasos omega-3 carece de efectos indeseados. Cualquier efecto que Ud. considere que puede ser causado por el uso de estas sustancias deberá comunicarlo al Dr. Rodrigo Castillo Peñaloza al teléfono 02-9786943
Costos: Los medicamentos en estudio (vitamina C, vitamina E y ácidos grasos omega-3) serán aportados por los investigadores sin costo alguno para Ud. durante el desarrollo de este proyecto. Todos los exámenes o prestaciones que no sean necesarias para el estudio o tratamiento habitual de su enfermedad serán igualmente financiados por el proyecto. Con respecto a este punto las determinaciones en plasma (Capacidad antioxidante), glóbulo rojo (enzimas antioxidantes) y en tejido (factores transcripcionales) contempladas en el proyecto serán financiados íntegramente por el proyecto, además de el estudio de electrocardiograma.
Beneficios: Este estudio podría protegerlo a Ud. o a futuros pacientes de una arritmia que complique la evolución de su enfermedad. También significará un beneficio para el progreso del conocimiento y el mejor tratamiento de ella.
Alternativas: Si Ud. decide no participar en esta investigación recibirá el estudio y tratamiento que se aplica habitualmente.
Compensación: Ud. no recibirá ninguna compensación económica por su participación en el estudio.
Confidencialidad: Toda la información derivada de su participación en este estudio será conservada en forma de estricta confidencialidad, lo que incluye el acceso de los investigadores o agencias supervisoras de la investigación. Cualquier publicación o comunicación científica de los resultados de la investigación será completamente anónima.
Información adicional: Ud. o su médico tratante serán informados si durante el desarrollo de este estudio surgen nuevos conocimientos o complicaciones que puedan afectar su voluntad de continuar participando en la investigación.
Voluntariedad: Su participación en esta investigación es totalmente voluntaria y se puede retirar en cualquier momento comunicándolo al investigador y a su médico tratante, sin que ello signifique modificaciones en el estudio y tratamiento habituales de su enfermedad. De igual manera su médico tratante o el investigador podrán determinar su retiro del estudio si consideran que esa decisión va en su beneficio.
Complicaciones: En el improbable caso de que Ud. presente complicaciones directamente dependientes de la administración de vitamina C, vitamina E y ácidos grasos omega-3, Ud. recibirá el tratamiento médico completo de dicha complicación, financiado por el proyecto, y sin costo alguno para Ud. o su
111
sistema previsional. Esto no incluye las complicaciones propias de su enfermedad y de su curso natural.
Derechos del participante: Si Ud. requiere cualquier otra información sobre su participación en este estudio puede llamar a:
Investigador: Dr. Rodrigo Castillo Peñaloza. Tel: 08-2337566
Autoridad de la Institución: Dr. Mauricio Cereceda Brantes, teléfono 02-9789044.
Conclusión:
Después de haber recibido y comprendido la información de este documento y de haber podido aclarar todas mis dudas, otorgo mi consentimiento para participar en el proyecto "Prevención de la fibrilación auricular en el postoperatorio de cirugía cardíaca".
Nombre del paciente Firma
Nombre de informante Firma
Nombre del investigador Firma
Si se trata de un paciente incompetente, registrar nombre del paciente y de su apoderado.
Fecha
Fecha
Fecha
112