herramientas diagnosticas en el laboratorio clínico

"Herramientas diagnosticas en el Laboratorio Clínico"

Beatriz Livellara

En el diagnostico de la Hepatitis B Es importante establecer: Hepatitis Aguda vs Hepatitis crónica En Hepatitis crónicas: estratificación del estado de replicación viral Respuesta a tratamiento antiretrovirales y

desarrollo de resistencia Estado de replicación residual. Marcadores subrogantes del ccc-DNA del

HBV

Organización Genómica del VHB

Dienstag JL. Management of Hepatitis B: A Case-Based Approach. Available at:

http://www.meds.com/hepatitis/casebased/dienstag.html

• S – Codifica las proteínas del

AgsHB

• Core –Codifica la proteína

core y el AgeHB

• Polimerasa – codifica a la

enzima ADN polimerasa con

actividad de transcriptasa

reversa

• X – proteina involucrada en la

génesis de CHC,

indispensable para

replicación y propagación

Marcadores Serológicos

HBsAg: Antígeno de Superficie

Anti-HBc (total): Anticuerpo anti-core total

Anti-HBc (IgM): Anticuerpo anti-core a clase IgM

Anti-HBs: Anticuerpo anti-HBs

HBeAg: Antígeno e

Anti-HBeAg: Anticuerpo anti-e

AntiHBs Inmunidad

AntiHBc Exposición

Infección

Replicación

Infección Aguda

HBeAg

Anti HBcIgM

HBsAg ADN

HBV

ADN

HBV

ADN

HBV

Inicio del diagnóstico de Hepatitis B

Solicitar HBsAg y IgG antiHBc

Escenario 1 HBsAg (-)

IgG antiHBc(-)

Sin contacto con HBV Vacunar contra VHB

Escenario 2 HBsAg (+) IgG antiHBc(+)

IgM anti HBc

No reactivo

Infección crónica por HBV

Reactivo

Infección aguda por HBV

Escenario 3 HBsAg (+) IgG antiHBc(-)

Repetir a los 30 días con una nueva muestra

HBsAg (+) IgG antiHBc(+)

CASO CONFIRMADO

HBsAg (+) IgG antiHBc(-)

Caso poco probable de infección por HBV

Estudiar HBeAg/AntiHBe y

carga viral HBV

Resultado NO REACTIVO para

ambos marcadores

Vacunar contra HBV

Escenario 4 HBsAg (-) IgG antiHBc(+)

Realizar anti HBs

Anti HBs (+) Hepatitis B

resuelta

Anti HBs (-) Iniciar Vacunación. Repetir a

los 30 días

Anti HBs (+) Hepatitis B resuelta

AntiHBs (-) Estudiar carga viral HBV posible infeccion oculta

AntiHBc aislado completar esquema de vacunación

Caso confirmado de HBV OCULTA por

HBV

Falso positivo metodológico

Anti-HBc positivo aislado

1. Recuperación de infección aguda

2. Test no sensible para anti-HBs

3. Falso positivo

4. Mutante del HBsAg

5. Niveles no detectables de HBsAg

Infección oculta (OBI)

Infección por HBV oculta

HBV oculta HBcAc + HBcAc -

Perdida HBsAg

Hepatitis aguda

Perdida HBsAg

Aňos depues de

una portacion

cronica

Ac anti HBV

nunca +

Ac anti HBV

Que se pierden

con el tiempo

HBV DNA +

Semin Immunopathol (2013) 35:39–52 DOI 10.1007/s00281-012-0327-7

HBV-ADN en suero <103 copias/ml

Seronegativa

HBsAg negativo

antiHBc negativo

antiHBs negativo

antiHBe negativo

Seropositiva

HBsAg negativo

antiHBc positivo

antiHBs positivo / negativo

antiHBe positivo / negativo

1. Virus

2. Hospedador

HBsAg 1. No se produce

2. Se produce en concentraciones no detectables

3. Se produce una variante no detectable por los métodos convencionales

HBV oculta (OBI)

HBV-ADN en hígado

• HBeAg • Anti HBeAg • HBV-DNA cuantitativo.

Caracterización de una Hepatitis B crónica

HBV-DNA 2 X 10 ⁸ 2 X 10 9 < 2000 2X 10 5- 9 (UI/mL)

ALT N ↑ N ↑

Inmuno Tolerancia

Reactivación Inmuno

Clearence o Eliminación

Titu

lo

VN

Portador Inactivo

Tiempo

antiHBe HBeAg

Historia natural de la infección crónica

Curso serológico

Semanas post exposición

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 52 años

Título

HBsAg

HBV-ADN

HBsAg +

antiHBc +

HBV-ADN +

Infección crónica

Total anti-HBc

IgM anti-HBc

HBsAg anti HBs HBc IgM HBc total HBeAg anti HBe

Marcadores Moleculares

HBV-DNA cuantitativo - Carga Viral.

Mutantes pre-Core

Mutantes de Resistencia a antivirales

Genotipos de HBV

NAT en banco de sangre

Detección de HBV-DNA cualitativo Aplicaciones: Definición de replicación activa del HBV en pacientes con

patrón compatible con infección crónica Definición de infección HBV oculta (HBsAg negativa) Monitoreo de respuesta de tratamiento antiviral Métodos: comerciales, no comerciales Límites de detección: 5 - 50 copias/ml Aplicación principal: TAN en bancos de sangre con métodos

comerciales específicos para este objetivo diagnóstico

Detección de HBV-DNA cuantitativo Carga Viral

Permite detectar y cuantificar la viremia Sólo se utilizan métodos comerciales Estandardización de las unidades de

cuantificación del HBV DNA en UI/ml La alta sensibilidad de métodos como

Taqman permiten usarlo como test cualitativos (Sensibilidad analítica de 6 UI/ml)

Usos de DNA-HBV cuantitativo

Diagnostico de estadío

Riesgo de transmisión

Riesgo de progresión

Selección del paciente a tratar

Indica respuesta al tratamiento

Diagnostica resistencia del HBV

Chen CJ, et al. JAMA 2006

Iloeje UH, et al. Gastroenterology 2006

Carga viral y evolución de la infección (REVEAL)

< 300 (No detectable)

300-9,999

10,000-99,999

100,000-999,999

1 Million

Carga Viral inicial

3.6

9.7

2.0 1.0

10.6

RR de cirrosis (n = 3482)

0

2

4

6

8

10

12

Incidencia de HCC (%) (n = 3653)

1.4 3.6

14.9

1.3

12.2

0

5

10

15

20

Secuenciación: Gold Standar

Genotipos (A-H)

Mutaciones:

Pre-core/ promotor del precore

Superficie: escape a la vacuna

Polimerasa: Resistencia a antivirales

Diagnóstico molecular

Patrones de Resistencia

Secuenciación : gold-standard

INNO-LiPA HBV Drug Resistance

Assay

PCR-RFLP para búsqueda de

mutaciones mas comunes

Genotipos HBV

Potenciales diferencias biológicas entre los genotipos de HBV

* Tasa de replicación del HBV

* Eliminación natural del HBeAg.

* Expresión y reconocimiento de los epítopes inmunes.

* Evolución de la enfermedad Hepática

* Patogénesis

* Asociación con desarrollo de cirrosis y hepatocarcinoma

* Sensibilidad a la terapia antiviral.

En el presente :

Valores indetectables de HBV-DNA sérico, aún con ensayos de alta sensibilidad, no implican la ausencia o clearence de los virus ni de la infección viral

La evaluación de la carga viral en diferentes momentos del tratamiento es utilizada como marcador de efectividad de la actividad antiviral y la persistencia de la respuesta

Hasta el momento, no existen marcadores que identifiquen el logro de que el sistema inmune del paciente logra controlar efectivamente la infección viral y el progreso de la enfermedad

El Futuro …. Detección de variantes minoritarias de escape al

tratamiento : impacto de las nuevas tecnologías

(Next Generation Sequencing) que permitirán

detectar poblaciones en % inferiores al 1%

Ensayos biológicos de fenotipos del HBV, permitirán

correlacionar los hallazgos genotípicos minoritarios

con respuesta biológica y sentido clínico de las

mismas.

Detección y cuantificación del ccc-HBV-DNA

HBsAg cuantitativo: Marcador subrogante de ccc-

HBV-DNA

Hepatitis C

Hepatitis C

La enfermedad aguda dura aproximadamente 6

meses

25 % de las personas infectadas eliminan el virus

75 % llegan a desarrollar la enfermedad crónica

La enfermedad crónica se define como que dura

más de 6 meses

Hepatitis C y su efecto sobre el hígado

1 de cada 3 pacientes desarrollan cirrosis grave durante un período de 20 años

La cirrosis conduce a un daño permanente del hígado

Puede conducir a cáncer de hígado

Muerte prematura

(British Liver Trust 2009)

Estructura del virus C

Bicapa lipídica 2

glicoproteínas de

Envoltura E1,E2

Envoltura RNA viral

Proteínas

de la

Cápside

Género: Hepacivirus, Familia: Flaviviridae Tiene 6 genotipos y más de 100 subtipos El HCV no se integra en el genoma del huésped Producción diaria: 1012 viriones Genoma: 9600 nucleótidos

Infección Aguda con Recuperación

Infección Aguda con Progresión a la Cronicidad

Tit

ulo

s anti-HCV

ALT

Normal

0 1 3 4 5 6 1 2 3 4

HCV RNA

Realizar diagnóstico precoz

Derivación precoz para la evaluación del especialista y

oportunidad de un tratamiento temprano

Se podría tener éxito aclaramiento de la enfermedad

(hasta 80 % )

Reducir la transmisión

¿Por qué solicitar el test de HCV ?

Recomendación del Testeo HCV

Drogadictos IV

Aquellos que recibieron factores antes de 1985

Receptores de sangre/organos antes de 1993

Hemodialisados crónicos

Enfermedad hepática

Trabajadores de la salud, emergencias,etc despues de injuria con aguja de un individuo HCV+

Chicos nacidos de portadora HCV+

Basado en el grupo de riesgo

Basado en la exposición

( DOH Get Tested Get Treated Campaign 2009)

HCV

TECNICAS DE DIAGNOSTICO

Serologicas: EIA (screening) RIBA (confirmatoria)

Solicitar anti -HVC

Reactivo

Estudiar ARN-HVC

Detectable No detectable

No reactivo

Caso descartable

por HCV

DIAGNOSTICO POR

BIOLOGIA MOLECULAR

Ensayos :

Cualitativos

Genotipificación

Cuantitativos

Técnicas Moleculares: Indicaciones

en Infección por HCV

• Diagnóstico

Serología indeterminada

Primoinfección asintomática

Recién nacido de madre HCV positiva

Contacto de alto riesgo

Pronóstico y seguimiento de tratamiento

Evaluación indirecta de resistencia

Utilidad Clínica de la Carga Viral

HCV

• Infección aguda: Altos niveles de RNA

antes de la seroconversión

• Evaluación del estado de la enfermedad,

pronóstico (progresión vs estabilidad)

• Monitoreo de la terapia antiretroviral,

iniciación, mantenimiento, falla-resistencia

Detección de Genotipos/Tratamiento

Genotipos (11): Seis (1,2,3,4,5, 6 ) son generalmente tratados Estos difieren entre un 31-34% en la secuencia de sus nucleótidos en el extremo 5’

Subtipos: con letras a,b,c ,etc. Aproximadamente son 100: estos difieren entre 20-23 % en sus bases en toda la longitud de la secuencia genómica

Utilidad: de acuerdo al genotipo hallado, se implementara el tratamiento adecuado

Métodos de Genotipificacion

Secuenciación : gold-standard

INNO-LiPA

PCR-RFLP para búsqueda de

mutaciones mas comunes

Restriction Fragment Length Polymorphism:

RFLP

Una Población Difícil

Anti-HCV positivo

RIBA indeterminado

HCV RNA negativo

¿Falso positivo o expuesto no

virémico? (infección de larga data)

Analizar el patrón de reactividad

Verdaderos (+): c22 y c33 Falsos (+): c100 y NS5

Avanzando en el Diagnóstico Diferencial

Anti-HCV (+)

HCV RNA PCR (+) HCV RNA PCR (-)

ALT Normal ALT Elevada

Seguimiento

(ALT)

Biopsia

Hepática

Viremia Genotipo

RIBA (-) RIBA (+)

Falso (+) Infectado

No Virémico

Seguimiento

(ALT y PCR)

Conclusiones

Los métodos de detección cualitativos prácticamente están en

desuso

Solo los métodos con límite de detección > 15 UI/Ml son utilizables

en el contexto de los nuevos tratamientos

Un resultado detectable no cuantificable, entre el límite de

detección (25 UI/mL) y el límite de detección (15 UI/mL) debe

considerarse positivo para la toma de decisiones sobre

respuesta temprana, suspensión o reactivación post-suspension

del tratamiento

Existen métodos que presentan límites de cuantificación y

detección diferentes

Valores superiores al limite máximo de cuantificación no

requieren diluciones en función de que los nuevos

esquemas plantean requerimientos de disminución de la

carga viral que no están relacionados con el valor inicial

del tratamiento

Se recomienda medir la carga viral con el mismo método y

en el mismo laboratorio en lo posible

Asimismo , se recomienda a los laboratorios que realicen

estos ensayos que estén suscritos a programas de control

de calidad o que tengan acreditadas esta técnica ante

requisitos internacionales (CAP – ISO 15189)

Conclusiones

Muchas gracias!!!!