02-metodo de determinacion de sensibilidad antimicrobiana por difusion 2012

7/25/2019 02-Metodo de Determinacion de Sensibilidad Antimicrobiana Por Difusion 2012

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Servicio Antimicrobianos - INEI ANLIS Dr. Carlos G. Malbrn

26 Curso Intensivo de Actualizacin en Antimicrobianos Dra. Alicia Rossi

27Curso Latinoamericano de Actualizacin en Antimicrobianos

METODO DE DETERMINACION DE SENSIBILIDAD

ANTIMICROBIANA POR DIFUSION

1.0. OBJETIVO

La sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos in vitrose puede determinar por varios mtodosEn este documento se describe la tcnica estndar de difusin en agar para bacterias decrecimiento aerbico. Se incluye: preparacin de las placas, condiciones de prueba (preparaciny densidad del inculo, tiempo y temperatura de incubacin), interpretacin de los resultados,procedimientos de control de calidad y las limitaciones de la prueba de difusin. Se provee unagua donde se detallan los antimicrobianos a ensayar e informar rutinariamente que puede serde mucha ayuda para el microbilogo clnico. La metodologa estandarizada para ladeterminacin de la sensibilidad por dilucin de bacterias que crecen aerbicamente se puedeencontrar en el documento M7 del CLSI (Methods for dilution Antimicrobial Susceptibility Testsfor Bacteria That Grow Aerobically). Las normativas correspondientes a la determinacin de lasensibilidad a los antimicrobianos de bacterias que crecen anaerbicamente estn comprendidasen el Documento M11 del CLSI (Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of AnaerobicBacteria). Las normativas para determinar la sensibilidad de bacterias fastidiosas o aisladas

poco frecuentemente, no incluidas en los documentos M02, M07 o M11, estn disponibles enel documento M45 del CLSI.

2.0. INTRODUCCION

La sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos in vitro se puede determinar por variosmtodos. La prueba de difusin en agar se utiliza de rutina en muchos laboratorios clnicos parala determinacin de la sensibilidad a los antimicrobianos de bacterias de comunes de desarrollorpido y tambin para algunas bacterias con requerimientos nutricionales especiales. En elpresente documento se describen el procedimiento, las aplicaciones y las limitaciones de estametodologa estandarizada. En este estndar se revisaron e incluyeron las recomendaciones del

Internacional Collaborative Study (ICS) y las regulaciones propuestas por la United States Foodand Drug Administration (U.S. FDA). Hay otros mtodos para la evaluacin de la sensibilidad alos antimicrobianos que proveen resultados equivalentes a los obtenidos con lasrecomendaciones del CLSI. El CLSI no aprueba ni recomienda productos o equipos comerciales.La responsabilidad para la aprobacin o no de ellos para su comercializacin en EEUU est enmanos de la FDA.

Las pruebas de sensibilidad por difusin donde slo se observa la presencia o ausencia de zonasde inhibicin sin tener en cuenta el tamao del halo no son aceptables. El respeto de lametodologa estandarizada es la nica manera de obtener resultados confiables en las pruebasde difusin. Esta es la nica forma de que los dimetros de inhibicin correlacionen con lasConcentraciones Inhibitorias Mnimas (CIMs) para cepas con sensibilidad o resistencia conocidaa los distintos antibiticos.

La reproducibilidad del mtodo depende del seguimiento explcito de la metodologa descripta en

este documento. El mtodo estandarizado por el Subcomit on Antimicrobial SusceptibilityTesting del CLSI se basa en las recomendaciones originales de Bauer et al. Este es el mtododescrito de manera ms completa y para el que se han desarrollado tablas de interpretacinque estn respaldadas por datos clnicos y de laboratorio.


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Este documento describe la metodologa, el control de calidad y los criterios de interpretacinactualizados de las pruebas de sensibilidad por difusin con discos. El reconocimiento de nuevosproblemas o el mejoramiento en los criterios actuales se comunicarn a travs de futuras

ediciones de esta normativa o sern distribuidos mediante suplementos de informacin anuales(M100).

3.0 PRECAUCIONES SOBRE MATERIAL INFECCIOSO

Dado que es imposible reconocer de antemano que aislamiento o muestra podra ser infecciosa,toda muestra de laboratorio y/o paciente debern ser tratados como infecciosos y se debernadoptar precauciones estndar. Las precauciones estndar son guas que combinan lasprincipales caractersticas de las precauciones universales y prcticas de aislamiento demuestras clnicas. Las precauciones estndar cubren la transmisin de todos los agentesinfecciosos, mientras que las precauciones universales slo se aplican a la transmisin depatgenos sanguneos. Las precauciones estndar y universales se encuentran disponibles en elCentro de Control y Prevencin de Enfermedades de USA (CDC). Para precauciones especificassobre el riesgo de transmisin de patgenos al personal de laboratorio y para lasrecomendaciones sobre el manejo de la exposicin a todos los agentes infectantes, refirase ala edicin mas actualizada del documento M29 del CLSI.

4.0 TERMINOLOGIA

4.1 DEFINICIONES

Categora de interpretacin de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos:

Clasificacin basada en la respuesta in vitrode un microorganismo a un antibitico en losniveles que ste alcanza en sangre o tejidos con una dosificacin habitual;1)Categora de interpretacin SENSIBLE: Esta categora implica que una infeccin dadapor la cepa en estudio se puede tratar apropiadamente con la dosis de antibitico

recomendada para el tipo de infeccin y la especie infectante, a menos que hubierancontraindicaciones;2) Categora de interpretacin INTERMEDIO: Esta categora incluye cepas que puedenser inhibidas por concentraciones de antibitico ms elevadas, siempre que se puedaaumentar la dosis.(ej. -lactmicos) o que la droga concentre fisiolgicamente en el tejidoinfectado (ej. quinolonas y -lactamicos en orina). Tambin nos indica una "zona buffer" quedebera evitar que pequeos factores tcnicos difciles de controlar causen mayoresdiscrepancias de interpretacin;

3) Categora de interpretacin RESISTENTE:Las cepas resistentes no son inhibidaspor las concentraciones sricas normalmente alcanzadas a dosis habituales y/o caen en elrango donde son comunes mecanismos especficos de resistencia microbiana (por ejemplo -lactamasas) y la eficacia clnica no ha sido comprobada;4) Categora de interpretacin NO SENSIBLE: esta categora se utiliza para

microorganismos que slo tienen categora de interpretacin sensible, debido a la ausencia oa la rara aparicin de cepas reisistentes. Aquellos aislamientos con CIMs mayores o halos deinhibicin menores al punto de corte de sensible, se denominan no sensibles; NOTA 1:Esta designacin no implica necesariamente que exista un mecanismo de resistencia en elmicroorganismo. Puede suceder que, posteriormente al establecimiento del punto de cortede sensibilidad, se encuentren aislamientos con CIMs mayores al punto de corte desensibilidad, que no posean un mecanismo de resistencia, y que estn dentro de ladistribucin wild-type. NOTA 2:para cepas con resultados en la categora de no sensiblese debe confirmar la identificacin y la sensibilidad antimicrobiana.


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Punto de corte / criterio de interpretacin: el valor de CIM o el halo de inhibicinutilizados para indicar sensible, intermedio y resistente se definen como se explicanteriormente.Por ejemplo, para el antimicrobiano X con el siguiente criterio de interpretacin:

CIM (g/ml) Halos de inhibicin (mm)

Sensible 4 20

Intermedio 8-16 15-19

Resistente 32 14

Punto de corte de sensibilidad es 4 g/ml o 20 mmPunto de corte de resistencia es 32 g/ml o 14 mm

D-test:prueba de difusin que utiliza discos de clindamicina y eritromicina colocados a unadistancia determinada, para detectar la presencia de resistencia inducible a clindamicina enestafilococos y estreptococos.

Aseguramiento de la Calidad:parte de la calidad focalizada en proveer confianza en quese cumplirn los requerimientos de calidad (ISO 9000), NOTA: prctica que abarca todoslos procedimientos y actividades dirigidos a asegurar que se alcanza y mantiene una calidadespecifica de producto. Esto incluye el monitoreo de todos los materiales, insumos,instrumentos, procedimientos, recoleccin/transporte/almacenamiento, y procesamiento demuestras, registros, calibracin y mantenimiento de equipos, control de calidad, pruebas dedesempeo, entrenamiento del personal y todo aquello que est involucrado en la produccinde un informe.

Control de calidad:incluye todas aquellas tcnicas operativas y procedimientos utilizadospara cumplir los requerimientos de calidad (ISO 9000); NOTA: sistema para asegurar elmantenimiento de los estndares mediante la inspeccin peridica de los resultados ytcnicas usadas para asegurar exactitud y reproducibilidad.

Solucin salina: una solucin de 0,85 a 0,9 % de ClNa.

4.2 ABREVIATURAS/ACRONIMOS

AST Prueba de sensibilidad a los antimicrobianosATCC American Type Culture CollectionBHI Infusin Cerebro CoraznBLNAR lactamasa negative, ampicilina resistente.BSC Gabinete de Seguridad Biolgica.BSL Nivel de Seguridad Biolgica (USA)CDC Centro para el Control y Prevencion de Enfermedades (USA).CFU Unidades Formadoras de Colonias.CMRNG N. gonorrhoeaeresistente a penicilina por mecanismo cromosmico.CSF/LCR Liquido cefalorraqudeo.

DNA Acido deoxiribonucleico.EDTA Acido etilendiaminotetracetico.ESBL/BLEE Beta-lactamasa de espectro extendido.FDA Food and Drug Administration (FDA).HTM Haemophilus Test Mdium.hVISA S. aureusintermedio a vancomicina, heterorresistente.ICS Estudio internacional colaborativo.KPC K. pneumoniaecarbapenemasa.MDR Resistente a mltiples drogas.


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MHA/AMH Agar Mueller Hinton.MHB/CMH Caldo Mueller Hinton.MHT Test de Hodge modificado.MIC/CIM Concentracin Inhibitoria Mnima.MLSB Macrlidos, lincosamidas y estreptograminas tipo B.MRS Estafilococo meticilino-resistente.MRSA/SAMR S. aureusmeticilino-resistente.

NAD Nicotinamida adenina dinucleotido.PBP 2 a Proteina ligadora de penicilina 2a.QA Aseguramiento de la calidad.QC Control de calidad.RNA Acido ribonucleico.TEM Temoneira (primer paciente reportado con una cepa productora de -

lactamasa tipo TEM).US Estados Unidos.VISA S. aureusintermedio a vancomicina.VRE/EVR Enterococo resistente a vancomicina.

5.0. INDICACIONES PARA LA REALIZACION DE LOS TEST DE SENSIBILIDAD.

Las pruebas de sensibilidad estn indicadas para cualquier microorganismo capaz de producir unproceso infeccioso que requiera tratamiento antimicrobiano si su sensibilidad no puede serpredicha a partir del conocimiento de la identidad del germen. Estn indicadas en los casos enque la bacteria infectante sea capaz de mostrar resistencia a los antibiticos usadoshabitualmente para tratamiento. Los mecanismos de resistencia incluyen: produccin deenzimas inactivantes de antibiticos, alteracin de su sitio blanco y entrada alterada de drogas oeflujo, Algunos microorganismos mantienen su sensibilidad original a algunas drogas por lo que,en esos casos, la terapia emprica es totalmente reconocida y no es necesario realizar pruebasde sensibilidad.Las pruebas de sensibilidad pueden ser necesarias cuando an, conocindose la sensibilidad delgermen a drogas altamente efectivas, el paciente no puede recibir dicha medicacin (porejemplo: S. pyogenesen pacientes alrgicos a la penicilina, en este caso se puede probar su

sensibilidad frente a eritromicina y otros macrlidos).El antibiograma tambin es importante en estudios epidemiolgicos de resistencia y en el estudiode nuevos antibiticos.Las pruebas de identificacin y sensibilidad a los antimicrobianos se deben realizar sobre cadauno de los microorganismos con probable rol patgeno aislados de una muestra clnica. Las pruebas de sensibilidad se deben realizar a partir de una cepa aislada. Se debera evitarrealizar el antibiograma en forma directa a partir del material clnico, excepto en lasemergencias donde la coloracin directa de GRAM sugiere la presencia de una sola bacteria. Eneste caso, el resultado se debe informar como preliminar y luego se debe repetir usando lametodologa estandarizada.

Cuando la naturaleza de la infeccin no es clara y la muestra contiene mezcla de distintosmicroorganismos o flora normal, las pruebas de sensibilidad no son necesarias y probablementelos resultados lleven a errores en el tratamiento.


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6.0. SELECCION DE LOS AGENTES ANTIMICROBIANOS PARA LAS PRUEBAS DESENSIBILIDAD

La seleccin de los agentes antimicrobianos apropiados para la prueba de difusin, es unadecisin de cada laboratorio clnico en consulta con el cuerpo mdico, el comit de farmacia y elcomit de enfermedades infecciosas. Las Tabla 1A y 1B del documento M100, enumeran losagentes de eficacia clnica probada para el tratamiento de infecciones producidas por distintostipos de microorganismos. Estos antimicrobianos muestran resultados aceptables en laspruebas in vitro.

Las consideraciones que se han tenido en cuenta para la designacin de un agenteantimicrobiano en un grupo especfico de prueba e informe incluyen: eficacia clnica, prevalenciade resistencia, minimizacin de la emergencia de resistencia, costo, indicaciones de la FDA y lasrecomendaciones consenso para drogas de primera eleccin y alternativas. La evaluacin de lasensibilidad a determinados antimicrobianos debe ser til para el propsito de control deinfecciones.

6.1. Informes de rutina

Las tablas 1A y 1B del documento M100, contienen recomendaciones de los antibiticos a

ensayar e informar frente a cada grupo de microorganismos considerados apropiados en laactualidad. Para evitar una mala interpretacin, el informe de rutina al mdico, deber incluirnicamente las drogas apropiadas para el uso teraputico como sugieren las Tabla 1A y 1B.Se podrn incluir o retirar antibiticos de esta lista de drogas a ensayar e informar deacuerdo a necesidades particulares. Otras drogas inapropiadas para tratamiento se puedenprobar para proveer datos taxonmicos o informacin epidemiolgica. Sin embargo, talesresultados debern estar disponibles (en el laboratorio) slo para el comit de control de

infecciones y/o para los epidemilogos hospitalarios.

6.2. Nombre genrico

Para minimizar confusiones, todos los antibiticos debern ser referidos por su nombregenrico. Para resaltar la relacin que guardan muchas drogas disponibles en la actualidad,se puede agrupar en clases de la siguiente manera:

6.2.1.-Lactmicos(ver M100 Glosario I, Parte 1)

Los antibiticos -lactmicos poseen un anillo central de cuatro tomos denominado anillo-lactmico. El mecanismo de accin de este grupo de drogas es la inhibicin de la sntesisde pared celular. El agregado de grupos sustituyentes u otras estructuras cclicas

adicionales al anillo -Lactmico determinan si el agente es una penicilina, un cefem, uncarbapenem o un monobactam.

6.2.1.1 Penicilinas

El espectro de las penicilinas est dirigido a bacterias gram positivas no productoras de -Lactamasas, algunas bacterias gram negativas fastidiosas aerbicas y algunosanaerobios. Las amino-penicilinas (ampicilina y amoxicilina) poseen actividad frente a otrasespecies de bacterias gram negativas, incluyendo miembros de la familiaEnterobacteriaceae. Las carboxi-penicilinas (carbenicilina y ticarcilina) y las ureido-penicilinas (mezlocilina y piperacilina) poseen un amplio espectro contra bacterias gramnegativas incluyendo muchas Pseudomonas y Burkholderiaspp. Las penicilinas establesfrente a penicilinasas (cloxacilina, dicloxacilina, meticilina, nafcilina y oxacilina) poseen


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actividad contra cocos gram positivos incluyendo Staphylococcus productores depenicilinasas.

6.2.1.2 Combinacin de -Lactmico / inhibidor de -Lactamasas

Esta combinacin antimicrobiana incluye un agente -lactmico y un segundo agente queposee una actividad antibacteriana mnima pero funciona como inhibidor de algunas -

lactamasas. Los inhibidores de -lactamasas generalmente no poseen actividadantimicrobiana per se, pero potencian la actividad del agente -lactmico con el que estncombinados. En la actualidad estn en uso tres inhibidores de -lactamasas: cidoclavulnico, sulbactam y tazobactam. El resultado de las pruebas de sensibilidad para elagente -lactmico solo no predice la actividad de su combinacin con el inhibidor de -lactamasas.

6.2.1.3 Cefemes (incluidas Cefalosporinas)

Los distintos cefemes frecuentemente poseen un espectro de actividad diferente contrabacterias aerbicas y anaerbicas gram positivas y gram negativas. Este grupo de drogasincluye las clsicas cefalosporinas y antibiticos de otras subclases como las cefamicinas,oxacefemes y carbacefemes; as como una nueva subclase, las cefalosporinas con

actividad anti MRSA (ver glosario I). Las distintas cefalosporinas se denominan comocefalosporinas de "primera", "segunda", "tercera" o cuarta generacin, dependiendo engran parte de su actividad frente a las bacterias gram negativas ms resistentes a losantimicrobianos. Todos los miembros de un grupo o generacin especfica no tienennecesariamente el mismo espectro de actividad. Debido a las diferencias entre algunosmiembros de este grupo, se deberan seleccionar representantes de cada uno para laspruebas de rutina.

6.2.1.4 Penemes

Incluye dos subclases: los carbapenemes y los penemes cuyas estructuras difierenlevemente de la estructura de las penicilinas pero son mucho ms resistentes a lahidrlisis por las -lactamasas. Esta caracterstica les confiere un amplio espectro deactividad contra muchas bacterias gram negativas y gram positivas.

6.2.1.5 Monobactames

Los monobactames son antibiticos -lactmicos monocclicos. En la actualidad elaztreonam (slo posee actividad frente a bacterias gram negativas) es el nico miembrode esta familia aprobado por la FDA para uso clnico.

6.2.2 No -Lactmicos (ver M 100 Glosario I, Parte 2)

6.2.2.1 Aminoglucsidos

Son un grupo de antibiticos de estructura similar que inhiben la sntesis de protenas anivel ribosomal. Esta clase de antimicrobianos est compuesta por drogas que tienendistinta estabilidad frente a las enzimas modificadoras de aminoglucsidos. Estodetermina diferencias en el espectro de actividad de cada uno de sus miembros. Seutilizan principalmente para el tratamiento de infecciones causadas por bacilos gramnegativos aerbicos o en combinaciones sinrgicas (con antibiticos inhibidores de lasntesis de pared celular) contra algunas bacterias gram positivas resistentes, ej.enterococos.


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6.2.2.2 Inhibidores del metabolismo del folato (Sulfonamidas y Trimetoprima)

Este grupo de compuestos, abarca varios agentes quimioterpicos con similar espectrode actividad, los cuales inhiben el metabolismo del folato. El sulfisoxazol es la sulfonamidams comnmente usada para el tratamiento de infecciones del tracto urinario y por lotanto su seleccin podra ser apropiada para la evaluacin in-vitro. El sulfametoxazolusualmente se ensaya en combinacin con trimetoprima porque en conjunto, producenuna inhibicin secuencial en dos pasos del metabolismo del folato de algunas bacterias

gram positivas y negativas.

6.2.2.3 Glicopptidos

Los glicopptidos que incluyen a la vancomicina (en la subclase glicopptido) y a lateicoplanina (en la subclase lipoglicopptido) poseen una compleja estructura qumica yactan inhibiendo la sntesis de pared celular en un sitio blanco diferente al de losantibiticos -lactmicos. La actividad de este grupo est dirigida principalmente a lasbacterias gram positivas aerbicas. La vancomicina se recomienda para el tratamiento deinfecciones por bacterias gram positivas en pacientes alrgicos a la penicilina y tambin estil para la terapia de infecciones debidas a microorganismos gram positivos resistentes a

los antibiticos -lactmicos, ej: Staphylococcus aureusmeticilino resistentes (MRSA) yalgunos enterococos.

6.2.2.4 Lipopptidos

Incluye a un grupo de compuestos estructuralmente relacionados cuyo principal sitioblanco es la membrana celular. La subclase de las polimixinas incluye a la polimixina B y alcolistin, activos frente a bacteria gram negativas. La daptomicina es un lipopptido cclicoactivo frente bacterias gram positivas. La actividad de estos lipopptidos estfuertemente influenciada por la presencia de cationes divalentes en el medio de cultivoutilizado. El exceso de Ca++ inhibe la actividad de las polimixinas mientras que esesencial la presencia de niveles fisiolgicos de Ca++ (50 mg/L) para la correcta actividadde la daptomicina.

6.2.2.5 Macrlidos

Los macrlidos son antibiticos estructuralmente relacionados que inhiben la sntesisproteica a nivel ribosomal. Hay varios miembros de este grupo disponibles en el mercadoque podran ser considerados para ensayar frente a bacterias gram negativas conrequerimientos nutricionales especiales. Para organismos gram positivos solo deberaensayarse rutinariamente la eritromicina. Este grupo de antibiticos consiste de distintossubgrupos que incluyen la azitromicina, claritromicina, diritromicina, el cetlidotelitromicina y el fluorocetlido solitromicina.

6.2.2.6. Nitroimidazoles

Los nitroimidazoles, que incluyen al metroinidazol y al tinidazol, son agentes bactericidas

que son convertidos intracelularmente en los organismos sensibles a metabolitos quedesarregla el DNA del husped; son activos slo sobre bacterias anaerobias estrictas.


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6.2.2.7. Oxazolidinonas

El grupo de las oxazolidinonas es una clase de agentes antimicrobianos cuyo nicomecanismo de accin es inhibir la sntesis de protenas. El primer agente aprobado deesta clase fue el linezolid que tiene actividad contra organismos Gram positivos.

6.2.2.8. Quinolonas

Este grupo de compuestos incluye un nmero de agentes antimicrobianos ntimamenterelacionados cuyo principal mecanismo de accin es la inhibicin de la DNA-girasa (o laactividad de la topoisomerasa) de muchas bacterias gram positivas y negativas. Algunasdiferencias en sus espectros de actividad, pueden requerir que se las ensaye comoagentes individuales.

6.2.2.9. Estreptograminas

Las estreptograminas, que incluyen al quinupristn-dalfopristin y linopristin-flopristin, son

una combinacin de dos pptidos cclicos producidos por Streptomycesspp. Ellos actanen forma sinrgica para inhibir la sntesis de protenas, principalmente en organismosGram positivos, aunque poseen limitada actividad frente a algunos organismo Gramnegativos y anaerobios.

6.2.2.10. Tetraciclinas

Las tetraciclinas inhiben la sntesis de protenas de ciertas bacterias gram positivas y

negativas a nivel ribosomal. Las drogas de este grupo estn muy relacionadas y salvoescasas excepciones, slo la tetraciclina debera ser ensayada de rutina. Las bacteriasque son sensibles a tetraciclina se pueden considerar sensibles tambin a doxiciclina yminociclina. Sin embargo, algunos microorganismos intermedios o resistentes a

tetraciclina pueden ser sensibles a doxiciclina, minociclina o a ambos. La Tigeciclina, unaglicilciclina, es un derivado de la minociclina con actividad contra microorganismos quepodran ser resistentes a otras tetraciclinas.

6.2.2.11. Clases de antibiticos con una nica droga

En este grupo encontraremos antimicrobianos para los que no existen drogasrelacionadas. Cloranfenicol (fenicoles), clindamicina (lincosamidas), cido fuscdico(esferoidales), mupirocina (cido pseudomnicos), y espectinomicina (aminociclitoles), loscuales inhiben la sntesis de protenas; y rifampicina (ansamicinas) y fidaxomicina(macrocclicos) que inhiben la sntesis de RNA. La nitrofurantoina (nitrofuranos) actainhibiendo varios pasos en la sntesis y ensamblado de las protenas a nivel ribososmal.

Slo es til para infecciones en el tracto urinario. Fosfomicina (fosfomicinas), aprobadapor la FDA slo para el tratamiento de infecciones urinarias, inhibe una enzima necesariapara la sntesis de pared celular.


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6.3. Gua para la seleccin de antimicrobianos

Para obtener resultados relevantes y prcticos, el nmero de antibiticos ensayados en laspruebas de sensibilidad debe ser limitado. En las tablas 1A y 1B del documento M100 sepuede encontrar la lista bsica de drogas a ensayar en un laboratorio clnico. Las tablasestn divididas en columnas de acuerdo a microorganismos especficos o grupos debacterias. En esa tabla se indican las drogas segn el orden de prioridad para ayudar almicrobilogo a optimizar la batera de antibiticos a ensayar en el antibiograma. Cada casillade la tabla contiene drogas con actividad comparable. Slo es necesario incluir una de ellas

en el antibiograma porque, en general, las interpretaciones son las mismas y sus eficaciasclnicas comparables. La letra o designa grupos de drogas que tiene espectro de actividade interpretacin casi idnticos. En estos casos tanto la sensibilidad como la resistencia sueleser cruzada. Esto quiere decir que la combinacin de errores major y very major es menorde 3% y los errores minor son menores del 10%, en base a una gran poblacin ensayada.Para designar la letra o, se probaron al menos 100 cepas resistentes a los antibiticos enconsideracin y se obtuvo un resultado de resistencia por lo menos para el 95 % de lascepas. La letra o tambin se usa para drogas comparables cuando stas se ensayan paramicroorganismos para los cuales slo hay categora de interpretacin sensible (Ej:cefotaxima o ceftriaxona con H. influenzae). Por lo tanto, el resultado obtenido para unaagente se puede usar para predecir el del otro. Por ejemplo, un aislamiento de la familiaEnterobacteriaceae no productor de BLEE, sensible a cefotaxima, se puede considerarsensible a ceftriaxona. Cuando los antibiticos no estn conectados por la letra o, no sepuede predecir el resultado de cada uno de ellos en base a otros ensayados ya sea por quese hallaron discrepancias o porque la informacin es an insuficiente.

6.4. Recomendaciones para el ensayo e informe selectivo y de rutina

Como se ve en las Tablas 1A y 1B los agentes del Grupo A se consideran apropiados paraensayar e informar en las pruebas de rutina para cada grupo de microorganismos

El Grupo B comprende agentes que son de importancia clnica particularmente para

infecciones hospitalarias y se debern incluir en el panel primario. Sin embargo, ellos sedeben ser informar selectivamente en el caso en que el microorganismo en estudio searesistente a los agentes de la misma familia de Grupo A. Otro ejemplo en donde se debeinformar la sensibilidad a los agentes de este grupo, sera cuando el foco de infeccin lojustifique (por ejemplo: trimetoprima-sulfametoxazol para aislamientos del tracto urinario ouna cefalosporina de tercera generacin para bacilos gram negativos entricos aislados delquido cefalorraqudeo). Tambin se debern informar en caso de infecciones polimicrobianas,infecciones que involucren mltiples sitios del organismo, alergia, intolerancia o falla derespuesta a los antibiticos del Grupo A o como ayuda epidemiolgica en el control deinfecciones.

El Grupo C est compuesto por agentes antimicrobianos alternativos o suplementarios quese deben ser probar en el caso de instituciones donde se aslen cepas endmicas o

epidmicas resistentes a varias de las drogas primarias (especialmente en la misma familia,por ejemplo -lactmicos o aminoglucsidos), para el tratamiento de pacientes alrgicos a lasdrogas primarias, as como tambin para el tratamiento de microorganismos inusuales (porejemplo: cloranfenicol para aislamientos extraintestinales de Salmonellaspp.) o como ayudaepidemiolgica en el control de infecciones.

El Grupo U (Orina) enumera ciertos antimicrobianos, cuyo uso se limita a las infecciones deltracto urinario (p. ej. nitrofurantoina y ciertas quinolonas). Estos agentes no se debeninformar en caso de infecciones que se encuentren en otra localizacin que no sea la va


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urinaria. En este grupo se pueden incluir otras drogas con indicaciones ms amplias paraalgunos patgenos urinarios especficos (Ej.: P. aeruginosa y ofloxacina).

El Grupo O (Otros) incluyen antibiticos que poseen indicacin clnica para un grupo de

organismos determinado, pero en general no son candidatos para las pruebas de rutina einforme en los Estados Unidos.

El Grupo Inv. (Investigacin) incluye agentes que estn bajo investigacin y an no han sidoaprobados por la FDA para su uso en los Estados Unidos.

Informe Selectivo: Cada laboratorio debera elegir los agentes listados en las Tablas 1A y 1Bpara el ensayo e informe de rutina (Grupo A) y aquellos que podra informar soloselectivamente (Grupo B), en consulta con la farmacia, los comits de teraputica y control

de infecciones y el plantel mdico del hospital. El informe selectivo debera ayudar a mejorarla relevancia clnica del informe y minimizar la seleccin de cepas nosocomialesmultirresistentes por uso excesivo de antibiticos de amplio espectro. Los resultados de losantibiticos del Grupo B que no se informan de rutina deberan estar disponibles slo apedido, o para algn microorganismo especial. Las resistencias inusuales siempre debeninformarse pero slo si fueron confirmadas (Ej.; resistencia a agentes del grupo B consensibilidad a los del grupo A). Adicionalmente, cada laboratorio debera desarrollar un

protocolo dirigido a aquellos aislamientos que presenten resistencia a todos losantmicrobianos probados de rutina. Este protocolo debera incluir las opciones de probarotros antimicrobianos en el mismo laboratorio o enviar el aislamiento a un laboratorio dereferencia.

7.0. REACTIVOS PARA LA PRUEBA DE DIFUSION POR DISCO

7.1. Agar Mueller-Hinton

El agar Mueller Hinton se considera el mejor de los medios disponibles para las pruebas de

sensibilidad de rutina por las siguientes razones:Demuestra buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de sensibilidad

.

Tiene bajo contenido de inhibidores de sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina.

Es adecuado para el desarrollo de la mayora de las bacterias patgenas.

Existen muchos datos y experiencia recopilados que avalan las pruebas de sensibilidadrealizadas con este medio.

Aunque el agar M. Hinton es generalmente confiable para las pruebas de sensibilidad, losresultados obtenidos con algunos lotes pueden, en ocasiones, variar significativamente. Si unlote de medio no permite el crecimiento adecuado de los microorganismos, los halos

obtenidos en las pruebas por difusin podran ser mayores quedando fuera de los lmites decontrol de calidad. Slo se deben utilizar para las pruebas de sensibilidad de cepas clnicas,los lotes de medio Mueller Hinton cuyo control de calidad se encuentre dentro de los lmitesestablecidos en el documento M6 del CLSI (Protocols for Evaluating Dehydrated Mueller-Hinton Agar). Se pueden usar placas comerciales o se pueden preparar de acuerdo a lodescripto en el Apndice B.


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7.1.1PH

Se debe controlar el pH de cada lote cuando se prepara el medio. El medio debe tener unpH

entre7,2 y 7.4 a temperatura ambiente. El mtodo para medir el pH, se describe en elApndice B1.1.

7.1.2 Humedad

Las placas de agar Mueller Hinton no deben presentar exceso de humedad en lasuperficie. Si esto ocurre, se deben colocar abiertas en estufa a 35C o en una cabina deflujo laminar por el trmino de 10 - 30 min. La superficie del agar deber estar hmedapero no mostrar gotas de agua de condensacin. Las tapas de las placas deben estarbien secas.

7.1.3 Efecto de la Timina o Timidina

Los medios que contienen excesiva cantidad de timina o timidina pueden revertir losefectos inhibitorios de las sulfonamidas y trimetoprima, produciendo as zonas mspequeas, menos ntidas o sin halo que pueden dar como resultado un informe de falsaresistencia.Se debe utilizar un agar Mueller Hinton que contenga la menor cantidad de timidinaposible. Dado que se pueden presentar problemas en las pruebas de control de calidadcon sulfonamidas y trimetoprima, se hace necesario controlar el agar Mueller Hinton.

Para evaluar cada lote de Mueller Hinton en su contenido de Timidina se debe ensayar unacepa control (Enterococcus faecalisATCC 29212 o ATCC 33186) frente a discos detrimetoprima / sulfametoxazol.Un medio adecuado mostrar un halo de inhibicin claro y definido de 20 mm o ms. Enlos medios con alto contenido de timidina se observarn zonas de inhibicin con coloniasdentro del halo, menores de 20 mm o ausencia de zona de inhibicin.

7.1.4 Efectos por variacin en la composicin de cationes divalentes

La variacin en cationes divalentes principalmente Ca++ y Mg++ afectarn losresultados con tetraciclina y aminoglucsidos frente a P. aeruginosa. Un excesivocontenido de cationes reducir la zona de inhibicin, mientras que bajas concentracionesde cationes resultarn en zonas de inhibicin mayores que las esperadas. Un exceso dezinc podra reducir las zonas de inhibicin de los carbapenemes. La variacin en elcontenido de calcio afecta el resultado de las pruebas de sensibilidad con daptomicina:concentraciones de Ca++ insuficientes reducen las zonas de inhibicin y concentracionesexcesivas producen el efecto opuesto. Por lo tanto, las pruebas de difusin con discos noson confiables para evaluar la sensibilidad a daptomicina. Un exceso de iones Zn podrareducir la zona de inhibicin de los carbapenemes.Las pruebas de control de calidad interno realizadas con cada lote de agar M. Hintondeben estar dentro de los lmites establecidos en la Tabla 3A del documento M100.

7.2 Cepas con dificultades de crecimiento

Solo bacterias aerbicas o facultativas que crecen satisfactoriamente en agar M. Hinton sinsuplementar se podran ser ensayar en este medio. Algunos microorganismos conrequerimientos nutricionales especiales como Haemophilus spp, N. gonorrhoeae, S.


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pneumoniaey estreptococos del grupo viridans y -hemolticos no desarrollan adecuadamenteen agar M. Hinton sin suplementos. Estos microorganismos requieren suplementos odeterminados medios para crecer, como los listados debajo y descritos en el Apndice B.Los suplementos requeridos por estos microorganismos se describen en la seccin 10 de

este documento y Apndice C. Agar MH con 5 % de sangre de carnero.

HTM: HaemophilusTest Medium. Agar GC + 1 % de suplemento de crecimiento.

7.3 Discos de Antimicrobianos

7.3.1 Informacin de los Discos

Los discos se deben adquirir a proveedores confiables y se debe solicitar un certificado deanlisis que garantice la carga de los discos, el nmero de lote y que son aptos deacuerdo a los parmetros establecidos para los distintos microorganismos recomendadospara el control de calidad.

7.3.2 Almacenamiento de los discos de ATB

Los envases comerciales estn generalmente diseados para proteger de la humedad alos discos de papel para pruebas de sensibilidad. Los discos de ATB se debernalmacenar de la siguiente manera:

Mantenerlos refrigerados a 8 C o en freezer a -14 C o menos. Los discos quecontienen drogas de la familia de antibiticos -lactmicos deben mantenerse congeladospara mantener su potencia, dejando en la heladera (no ms de una semana) slo elenvase que est siendo utilizado en las pruebas de sensibilidad de rutina. Las drogas msinestables (Ej. imipenem, cefaclor, combinaciones de antibiticos -lactmicos coninhibidores de -lactamasas) se deben mantener congelados hasta el da de uso.

Los cartuchos hermticos de discos se deben sacar del refrigerador o freezer 1 2 horas antes a fin de lograr un equilibrio con la temperatura ambiente antes de serabiertos. Este proceso minimiza la condensacin que podra ocurrir cuando la humedadambiente alcanza los frascos fros.

Una vez que se abri un cartucho, se debe colocar en un contenedor hermtico quecontenga una sustancia desecante apropiada. Cuando se utilizan dispensadores de discosse deben mantener cerrados con una cubierta hermtica con el desecante apropiado. Losdispensadores deben alcanzar la temperatura ambiente antes de abrirse. Cuando elindicador del desecador usado cambia de color se debe interpretar como un exceso dehumedad y se debe reemplazar el desecador.

Los dispensadores que contienen los discos deben mantenerse refrigerados.

Use solo los discos que no han alcanzado la fecha de vencimiento indicada por susfabricantes.


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8.0. PREPARACION DEL INOCULO PARA LA PRUEBA DE DIFUSION

8.1 Turbidez estndar para la preparacin del inculo

Para estandarizar la densidad del inculo se usa una suspensin de sulfato de bario comoestndar de turbidez (0.5 de la escala de Mc Farland) o su equivalente ptico (suspensin de

partculas de ltex). Prepare el estndar 0.5 de Mc Farland como se describe en el ApndiceB. Como alternativa, se puede usar un equipo fotomtrico.

8.2 Preparacin del inculo

8.2.1 Mtodo directo de inoculacin a partir de colonia aislada

Es el mtodo mas conveniente para la preparacin del inoculo. Se puede usar para lamayora de los microorganismos y es el mtodo recomendado para microorganismosfastidiosos como Haemophilus spp, N. gonorrhoeae, Neisseria meningitidis,

Streptococcusspp y Staphylococcusspp potencialmente meticilino resistentes.

Prepare el inculo realizando en solucin salina o caldo, una suspensin de colonias

seleccionadas de una placa de cultivo no selectivo de 18 a 24 horas de incubacin (Ej.agar sangre)

La suspensin se debe ajustar a la escala 0,5 de Mc Farland. Esta suspensincontendr aproximadamente 1 a 2 x 108 UFC/ml para E.coli ATCC 25922. Para ajustarla densidad del inculo se pueden utilizar equipos fotomtricos o por comparacin visualcontra el estndar. Para este procedimiento utilice luz adecuada y mire los tubos contra

un fondo blanco con lneas negras como contraste.

8.2.2 Mtodo de desarrollo previo

Se puede utilizar como mtodo alternativo y se prefiere en algunas ocasiones ,por ejemplofrente a bacterias con dificultad para obtener suspensiones homogneas. Tambin sepuede utilizar para organismos no fastidiosos (excepto estafilococos) cuando no se

disponen cultivos frescos (24 hs.)

Seleccione 3 a 5 colonias bien aisladas de igual morfologa de la placa de cultivo.Prepare una suspensin en 4 5 ml de un caldo apropiado (ej.: Tripteina Soja) tocando laparte superior de cada colonia.

Incube a 35 2C hasta que este alcance o exceda la turbidez del estndar (2-6hs).

Ajuste la turbidez del inculo con solucin salina o caldo hasta que su densidadptica se asemeje a la del tubo 0,5 de la escala de Mc. Farland Esta suspensincontendr aproximadamente 1 a 2 x 108 UFC/ml para E .coli ATCC 25922. Paraajustar la densidad del inculo se pueden utilizar equipos fotomtricos o por comparacinvisual contra el estndar. Para este procedimiento utilice luz adecuada y mire los tuboscontra un fondo blanco con lneas negras como contraste.


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9.0. PROCEDIMIENTO PARA LA REALIZACIN DEL TEST DE DIFUSION POR DISCOS

9.1 Inoculacin de las placas

Dentro de los 15 minutos despus de ajustado el inculo siembre las placas de M.Hinton con un hisopo estril. Presione el hisopo contra las paredes del tubo por encima del

nivel de lquido a fin de escurrir el exceso de inculo.

Inocule la superficie seca del M. Hinton por hisopado en tres direcciones rotando laplaca 60 cada vez para asegurar una completa distribucin del inculo. Como paso final sedebe hisopar la circunferencia de la placa. De esta manera se deberan obtener zonas deinhibicin uniformemente circulares y desarrollo homogneo.

Deje la tapa de la placa abierta de 3 a 5 minutos, pero no ms de 15 min. antes deaplicar los discos para que el exceso de humedad superficial sea absorbido.

NOTA: Nunca use cultivos overnight en medio lquido ni otros inculos no estandarizadospara el hisopado de las placas. Evitar extremos en la densidad del inculo.

9.2 Aplicacin de los discos de ATB en las placas inoculadas

Colocar los discos sobre la superficie del agar inoculada con pinza estril o dispensadoraplicando una ligera presin a una distancia no menor a 24 mm desde un centro al otro. Nodeben colocarse ms de 12 discos por placa de 150 mm y no ms de 5 discos por placa de

100 mm. En todos los casos en conveniente colocar un disco con zona de inhibicinpredeciblemente pequea (ej. vancomicina o gentamicina) prximo a otro con zona deinhibicin predeciblemente grande (cefalosporinas) a fin de evitar superposiciones de laszonas de inhibicin. Independientemente de la cantidad de discos colocados se debe evitarcolocarlos muy prximos al borde de la placa ya que no se obtendrn zonas de inhibicincircularmente completas.

Debido a que algunas drogas difunden casi instantneamente, no se debe reubicar un discouna vez que tom contacto con la superficie del agar. En su lugar coloque otro disco que nohaya tomado contacto con la superficie del agar en una nueva posicin en la placa de agar. Sise realiza el D-test para la deteccin de la resistencia inducible a clindamicina, ver la Seccin12 y las Tablas 2C y 2H para guiar la ubicacin de los discos.

Incubar las placas invertidas a 352 C (temperaturas mayores de 35C puedenafectar la deteccin de MRSA) dentro de los 15 minutos posteriores a que los discos fueronaplicados. Con excepcin de Haemophilusspp., Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidisy Streptococcus spp. (ver seccin 10), las placas no se deben incubar en atmsfera con

concentracin incrementada de CO2 porque los estndares de interpretacin fuerondesarrollados usando incubacin ambiente y el agregado de CO2 alterara significativamente eltamao de las zonas inhibitorias para algunos agentes antibiticos.

9.3 Lectura de las placas e interpretacin de resultados

Despus de 16 a 18 horas de incubacin examine cada placa y mida los dimetros delas zonas de inhibicin. Si las placas fueron correctamente hisopadas y el inculo fue eladecuado, las zonas de inhibicin sern uniformemente circulares y habr desarrollobacteriano confluente. La aparicin de colonias aisladas indica un inculo bajo por lo que el


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ensayo debe repetirse. Se debe medir el dimetro de la zona de inhibicin a ojo desnudoincluyendo el dimetro del disco. Las zonas de inhibicin se deben medir en la base de la placade Petri utilizando calibre o regla y la lectura obtenida se debe aproximar al valor entero enmilmetros ms cercano. Para esto se debe sostener la placa contra un fondo negro e

iluminada con luz reflejada. Recordar las siguientes excepciones:

Si se adicion sangre al agar M. Hinton, la zona de inhibicin se debe medir del ladodonde se colocaron los discos retirando la tapa de la placa y utilizando luz reflejada.

Si se ensaya oxacilina, cefoxitina, meticilina o nafcilina para Staphylococcus spp,incube 24 horas antes de informar los microorganismos como sensibles. El resto delos antimicrobianos deben leerse entre las 16-18 hs. Use luz transmitida paradetectar cualquier ligero crecimiento dentro de las zonas de inhibicin de oxacilina.Cualquier desarrollo dentro de la zona de inhibicin es indicativo de resistencia aoxacilina.

Si se ensaya vancomicina frente a S. aureuso Enterococcusspp. incube 24 horasantes de informar los microorganismos como sensibles. El resto de losantimicrobianos deben leerse entre las 16-18 hs. El mtodo de diofusin por discospara vancomicina no est recomendado para estafilococos coagulasa negativos. Para

ver los detalles de los mtodos de deteccin de sensibilidad disminuida a vancomicina,ver Seccin 11.1.3.1.

Si se ensaya cefoxitina para Staphylococcusspp, se debe leer la zona de inhibicincon luz reflejada, no transmitida.

Si se ensaya linezolid para Staphylococcusspp, se debe leer la zona de inhibicin conluz transmitida.

El punto final deber tener en cuenta el rea que no muestre desarrollo obvio a ojodesnudo, no incluyendo velo de crecimiento o colonias muy pequeas que puedan serdetectadas slo con mucha dificultad en el borde de la zona.

Sin embargo, cuando crecen colonias de tamao significativo dentro de una zonaclara de inhibicin, se debe repetir el ensayo a partir de un cultivo puro o subcultivaruna colonia a partir de la placa original. Si esas colonias continan creciendo, se debemedir la zona interna libre de colonias.

Proteus spp. podra presentar swarming dentro de las zonas de inhibicin conalgunos antimicrobianos. En estos casos el velo o swarming se debe ignorar.

En medios suplementados con sangre, se deber medir la zona de inhibicin delcrecimiento, no la zona de inhibicin de la hemlisis (Ej. Streptococcusspp).

Cuando se prueban discos de trimetoprima/sulfametoxazol se puede observar uncrecimiento con aspecto de niebla dentro de la zona del halo de inhibicin por lapresencia de sustancias antagnicas contenidas en el M. Hinton. En estos casos noconsiderar en la lectura un crecimiento del 20% o menos del desarrollo total. Utilicelos mrgenes ms obvios para determinar la zona de inhibicin.

Los tamaos de las zonas de inhibicin sern interpretados con las Tabla 2A a 2I deldocumento M100 y los organismos se informarn sensibles, intermedios o resistentesfrente al antimicrobiano ensayado (ver Seccin 14). Algunas drogas slo se pueden informar


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como sensibles porque se dispone nicamente de puntos de corte para esta categora ya quese han identificado muy pocas o ninguna cepa resistente.

10.0 MICROORGANISMOS CON REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES ESPECIALES

El medio M. Hinton descrito anteriormente para patgenos aerbios de rpido crecimiento no

es adecuado para el desarrollo de microorganismos con requerimientos nutricionales especiales.Cuando se deban probar microorganismos de este tipo, el medio, los procedimientos de controlde calidad y las categoras de interpretacin deben ser adaptados para cada uno de ellos.Est demostrado que la tcnica de difusin por discos es un mtodo confiable para ladeterminacin de la sensibilidad a los antimicrobianos de microorganismos con requerimientosnutricionales especiales como: H. influenzae, N. gonorrhoeae, N. meningitidis, Streptococcuspneumoniae, y estreptococos B-hemolticos y del grupo viridans. Estos se describirn en lasSecciones 10.1 a 10.4. Otras bacterias con requerimientos nutricionales especiales distintas a

las mencionadas arriba, debern ensayarse por el mtodo de dilucin o difusin segn eldocumento M45. Los microorganismos anaerobios no se deberan ensayar por el mtodo dedifusin por disco (ver documento M11).

10.1 Haemophilus influenzaey H. parainfluenzae

El medio de eleccin para la prueba de difusin por discos para Haemophilusspp. es elHaemophilusTest Medium (HTM).Este mtodo fue validado slo para H. influenzaey H.parainfluenzae (a partir de ahora, cada vez que se nombre Haemophilusspp. se refiereslo a estas dos especies. Para otras especies de Haemophilusver el Documento M45).Las instrucciones para la preparacin del medio estn descritas en el Apndice B. El agarM. Hinton chocolate no se recomienda para las pruebas de sensibilidad de Haemophilusspp.

10.1.1 Procedimiento

Siga el procedimiento de la Seccin 9 con las siguientes excepciones:

Realice una suspensin en caldo M. Hinton o solucin salina al 0,9 % (seccin8.2.1.) a partir de una placa de agar chocolate incubada durante 20 - 24 horas. Ajuste auna turbidez equivalente al estndar 0,5 Mc Farland utilizando un aparato fotomtrico.Esta suspensin contendr aproximadamente 1 a 4 X 108UFC/ml. Tener la precaucinde no preparar inculos muy densos que puedan llevar a resultados de falsos resistentescon algunos antibiticos -lactmicos, especialmente cuando se trabaja con H. influenzaeproductores de -lactamasa. Hisope la placa de HTM dentro de los 15 min. de haberajustado el inculo.

No se debern aplicar ms de 9 discos en las placas de 150 mm y no ms de 4en las placas de 100 mm.

Las placas se deben incubar 16-18 hs. en una atmsfera con 5% CO 2a 352C.

(ver Seccin 9.3)

10.1.2 Interpretacin

Los antibiticos que se deben probar para Haemophilus spp. estn enumerados en laTabla 1B del documento M100 . El criterio para la interpretacin de la medida de losdimetros de halo estn enumerados en la Tabla 2E del mismo documento. No se


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recomienda la prueba por difusin para Haemophilusspp. con otros discos que no seanlos enumerados en la Tabla 1B.

10.2 Neisseria gonorrhoeae

El medio recomendado para probar la sensibilidad de N. gonorrhoeae, es agar GCautoclavado, con un 1 % de un suplemento de composicin definida Las instruccionespara la preparacin del medio estn descritas en el Apndice B. No se requiere de

suplemento de crecimiento libre de cistena para la prueba de difusin por discos.El agar chocolate enriquecido no se recomienda para determinar la sensibilidad de N.gonorrhoeae.



Utilice el mtodo de resuspensin directa de colonias indicado en 8.2.1.Resuspenda el microorganismo en caldo M. Hinton o sol. salina al 0.9 % a partir de unaplaca de agar chocolate over night y ajuste a turbidez equivalente al estndar 0,5 de laescala de Mc Farland. Hisope la placa dentro de los 15 min. de haber ajustado el inculo.

No se debern aplicar ms de 9 discos en las placas de 150 mm y no ms de 4 enlas placas de 100 mm. Cuando se prueben agentes que produzcan grandes zonas deinhibicin (ej. quinolonas o cefalosporinas) sera recomendable ensayar menor cantidad dediscos.

Las placas sern incubadas 20 - 24 horas a 361 C (la temperatura no deberexceder los 37C) en atmsfera de CO2(5 %). (ver Seccin 9.3)

10.2.2 InterpretacinLos antibiticos sugeridos para ensayar frente a N. gonorrhoeaeestn enumerados en laTabla 1B del documento M100. La Tabla 2F nos brinda los detalles de criterios deinterpretacin. No se recomienda la prueba por difusin para N. gonorrhoeaecon otrosdiscos que no sean los enumerados en la Tabla 1B.Nota: Las cepas productoras de -lactamasa generalmente presentan dimetros deinhibicin


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laboratorio est asociada a un 50% de mortalidad. El principal riesgo para la infeccinadquirida en el laboratorio es la generacin de aerosoles o gotas, por lo cual se debe utilizarproteccin rigurosa.

Si no se dispone de cabina, se debe minimizar la manipulacin de los aislamientos, limitndosea la coloracin de gram e identificacin de serogrupo. Se debe usar una solucin fenolizada,guardapolvo, guantes y mscara protectora de salpicaduras. Cuando existe alto riesgo de

generar aerosoles o se trabaja con altas concentraciones de material infeccioso, se debetrabajar en un BSL-3. Si no se dispone de un Laboratorio de Bioseguridad BSL-2 o BSL-3 sedeben derivar los aislamientos a un Laboratorio de Salud Pblica o de Referencia que cuenteal menos con un Laboratorio de Bioseguridad BSL-2.Se debe considerar la vacunacin del personal de laboratorio de acuerdo a lasrecomendaciones del Comit Asesor de Inmunizacin del CDC(http://www.cdc.gov/vaccines/recs/acip). La vacunacin disminuye, pero no elimina el riesgode infeccin porque no es el 100% efectiva y no provee proteccin contra el serogrupo B,causa frecuente de infecciones adquiridas en el laboratorio.

El mtodo de difusin se estandariz en este germen para la deteccin de posiblesresistencias emergentes. A la fecha las resistencias detectadas involucran a los viejosagentes utilizados en el tratamiento (penicilina o ampicilina) o aquellas drogas utilizadas en la

profilaxis de los contactos. Debido a que no se ha detectado resistencia a cefotaxima oceftriaxona, drogas de eleccin para el tratamiento de enfermedad invasiva, no es necesarioel ensayo de rutina en el laboratorio clnico.

El medio recomendado para N. meningitidis. es el AMH suplementado con 5% de sangre decarnero desfibrinada. No se recomienda el uso de agar chocolate para las pruebas desensibilidad de N. meningitidis, excepto como medio de crecimiento para la preparacin delinculo. Las instrucciones para la preparacin del medio estn descritas en el Apndice B.



Utilice el mtodo de resuspensin directa de colonias indicado en 8.2.1.Resuspenda el microorganismo en caldo M. Hinton o sol. salina al 0.9 % a partir de unaplaca de agar chocolate incubada previamente de 20-22 hs. a 352 en 5% CO2y ajustea turbidez equivalente al estndar 0,5 de la escala de Mc Farland. Hisope la placa dentrode los 15 min. de haber ajustado el inculo.

El procedimiento a seguir es idntico al descrito anteriormente para bacterias sinrequerimientos nutricionales especiales (seccin 9.1.), con la excepcin que no sedebern aplicar ms de 5 discos en las placas de 150 mm y no ms de 2 en las placasde 100 mm.

Las placas sern incubadas 20 - 24 horas a 352 C en atmsfera de CO2(5 %)

antes de medir las zonas de inhibicin (ver Seccin 9.3).

10.3.2 Interpretacin

Los criterios para la interpretacin de las medidas de los dimetros de los halos estnenumerados en la Tabla 2I. No se recomiendan; en los ensayos de difusin; otros agentesno enumerados en dicha tabla.


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10.4. Streptococcus pneumoniae y otros Streptococcus spp.

El medio recomendado para Streptococcus pneumoniae y otros Streptococcus spp. es elagar MH suplementado con 5% de sangre de carnero desfibrinada. Las instrucciones para lapreparacin del medio estn descritas en el Apndice B.

10.4.1Procedimiento


Resuspenda el microorganismo en caldo MH o sol. salina al 0,9 % a partir de unaplaca de agar sangre de carnero over night (18-20 hs.) y ajuste a turbidez equivalenteal estndar 0,5 de la escala de Mc Farland (seccin 8.2.1). Hisope la placa dentro de los15 minutos de haber ajustado el inculo.

No se debern aplicar ms de 9 discos en las placas de 150 mm y no ms de 4 en

las placas de 100 mm. Las placas se deben incubar a 352 C en atmsfera con 5 % de CO2. por 20 -24 hs antes de medir las zonas de inhibicin (ver Seccin 9.3).

10.4.2. Interpretacin de S. pneumoniae

Los antibiticos sugeridos para S. pneumoniae estn indicados en la Tabla 1B deldocumento M100 y los criterios para la interpretacin de las medidas de los dimetrosde los halos estn enumerados en la Tabla 2G.

NOTA: Los aislamientos no menngeos de S. pneumoniae con zonas de inhibicin paraoxacilina >20 mm se pueden considerar sensibles (CIMs < 0.06 g/ml) a penicilina (oral

o parenteral), ampicilina (oral o parenteral), ampicilina/sulbactam, cefaclor, cefnidir,cefditoren, cefpodoxima, cefprozil, ceftizoxime, cefuroxima, imipenem, loracarbef ymeropenem, Se pueden obtener zonas de inhibicin de oxacilina < 19 mm con cepasresistentes, intermedias y algunas cepas sensibles a penicilina. Por lo tanto, a todosaquellos aislamientos que presenten zonas de inhibicin < 19 mm con el disco de oxacilina(1 g) se les debera determinar las CIMs a penicilina y cefotaxima o ceftriaxona omeropenem. Para aislamientos de S. pneumoniae con zonas de inhibicin < 19 mm con eldisco de oxacilina, no se debe informar como resistente a penicilina sin determinarpreviamente el valor de CIM.

10.4.3 Interpretacin de otrosStreptococcus spp

Los antibiticos sugeridos para otros estreptococos estn indicados en la Tabla 1B deldocumento M100 y los criterios para la interpretacin de las medidas de los dimetrosde los halos estn enumerados en la Tabla 2H-1 y 2H-2.

No se recomienda usar el disco de oxacilina (1g) para determinar la sensibilidad apenicilina en otros estreptococos distintos a S. pneumoniae. El disco de penicilina oampicilina se puede usar para predecir la sensibilidad de estreptococos -hemolticos aestas drogas, no as para estreptococos del grupo viridans. En aislamientos deestreptococos del grupo viridans obtenidos de sitios normalmente estriles (ej.: hueso,


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LCR, sangre, etc.), se debera determinar la CIM a penicilina. Las pruebas de difusin conpenicilina y ampicilina no son apropiadas para estreptococos del grupo viridans.La resistencia inducible a clindamicina se puede detectar usando la metodologa descriptaen la seccin 12

11.0. MICROORGANISMOS QUE REQUIEREN CONSIDERACIONES ESPECIALES

Esta seccin discute grupos de organismos o mecanismos de resistencia particulares para loscuales hay consideraciones significativas para las pruebas de sensibilidad (dilucin y difusin).

11.1 Staphylococcusspp.

11.1.1 Resistencia a Penicilina y -lactamasa

La Penicilina prcticamente no es opcin de tratamiento para infecciones porestafilococos debido a que la mayora de estos son resistentes a penicilina. Las cepasresistentes a penicilina producen -lactamasa y se debera ensayar penicilina para

predecir la sensibilidad a todas las penicilinas labiles a -lactamasas, tales comoampicilina, amoxicilina, carbenicilina, mezlocilina, piperacilina y ticarcilina.

Algunos aislamientos de Staphylococcusproductores de -lactamasa resultan sensibles apenicilina en las pruebas de sensibilidad. Debido a que esta -lactamasa es inducible,existe un riesgo si se utiliza penicilina para estas cepas. Por esta razn, cuando unaislamiento de Staphylococcusspp presenta CIM a/para penicilina 0.12g/ml o zona deinhibicin 29mm de debe realizar una prueba de -lactamasa inducida, antes deinformarlo sensible a penicilina. Se han descrito varias pruebas para deteccin de -lactamasa, entre estas, las pruebas de deteccin en base a nitrocefin o la evaluacin del

borde del halo de inhibicin de penicilina en el mtodo de difusin con discos. Para esteultimo mtodo, un borde de halo difuso indica un resultado negativo, mientras que unborde de halo definido indica un resultado positivo para la produccin de -lactamasa. Eltest del borde del halo de inhibicin de penicilina result ms sensible que el nitrocefin parala deteccin de -lactamasa en S. aureus. Si solo va a utilizarse un test para la deteccinde -lactamasa en S. aureus, se recomienda utilizar el test del borde del halo de inhibicinde penicilina. Otros laboratorios pueden optar por utilizar primero el nitrocefin, y si esteda positivo se informa como -lactamasa positivo o penicilino resistente. Si el nitrocefin esnegativo se recomienda la realizacin del test del borde del halo de inhibicin de penicilinaantes de informar la sensibilidad a penicilina (en los casos en donde la penicilina pueda serutilizada como terapia para S. aureus). Para estafilococos coagulasa negativos, incluyendoS. lugdunensis, slo se recomienda el nitrocefin. Para ms recomendaciones sobredeteccin de -lactamasas en Staphylococcus spp ver la Tabla 2C del DocumentoM100.

11.1.2 Meticilino/Oxacilino Resistencia

11.1.2.1Clasificacin

Histricamente la resistencia a penicilinas antiestafilocccicas estables a las -lactamasasde estafilococo se ha referido como meticilino resistencia y ha recibido lasdenominaciones de MRSA (para S. aureusmeticilino resistente) o MRS (para estafilococometicilino resistente) an cuando la meticilina no ha sido, desde hace tiempo, el agente de


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eleccin ni para las pruebas de sensibilidad ni para el tratamiento clnico. En estedocumento, usaremos varios trminos para referirnos a la resistencia a estos agentes:MRS, meticilino resistencia u oxacilino resistencia.La mayor parte de la resistencia a oxacilina en estafilococos esta mediado por la

presencia del gen mecA que codifica para la produccin de una PBP adicional, PBP 2a.Esta puede expresarse en forma homognea como heterognea. La resistenciahomognea es fcil de detectar con los mtodos estndares mientras que la resistencia

heterognea puede presentar dificultades de deteccin ya que solo una fraccin de lapoblacin (por ej. 1 de a 100.000 clulas) expresan el fenotipo de resistencia.En el pasado la resistencia acompaante a otros agentes era indicativo de resistencia aoxacilina. Sin embargo algunos MRSA como los asociados en infecciones adquiridas en lacomunidad no presentan el fenotipo de multi-resistencia.

11.1.2.2 Grupo de organismos

Actualmente S. lugdunensis esta agrupado con S. aureusen lo que refiere a deteccin deoxacilino resistencia. La mayora de S. lugdunensis no producen -lactamasa y todos sonprcticamente, sensibles a oxacilina. Las cepas sensibles a oxacilina, mecA negativas,presentan un rango de CIM para oxacilina entre 0.25 g/ml y 1g/ml mientras que lascepas mecA positivas, generalmente presentan CIMs 4 g/ml, lo cual es mas

caracterstico de S. aureus que de otro estafilococo coagulasa negativa. Por lo tanto, enS. lugdunensis, la resistencia mediada por la presenica del gen mecA se detecta mejorcon el criterio de interpretacin para S. aureus.Los mtodos para ensayar los discos decefoxitina en estafilococos coagulasa negativa excluyen a S. lugdunensis.

11.1.2.3Mtodospara la deteccin de Resistencia a Oxacilina

Para detectar la resistencia a oxacilina mediada por mecA en Staphylococcus spp se

pueden emplear los mtodos basados en oxacilina o cefoxitina. No se debera ensayar eldisco de oxacilina en S. lugdunensisy otros estafilococos coagulasa negativa. Los mtodosbasados en cefoxitina solo predicen la resistencia mediada por el gen mecA. Estosmtodos son mejores predictores de la presencia del gen que los mtodos basados enoxacilina, incluida la placa de screening. Se puede encontrar algn aislamiento de S.aureusresistente a oxacilina, pero mecA negativo. Esto se puede deber a mecanismos deresistencia distintos a la presencia de mecA, los cuales son aun muy raros. Por logeneral, estos ltimos aislamientos son sensibles a cefoxitina.

Todos los mtodos requieren el uso de una suspensin directa de colonias parala preparacin del inoculo (Seccin 8.2)

Las pruebas para detectar MRS, cuando se ensaye oxacilina, se deben incubar24 hs completas a 35 2 C. (el uso de temperaturas mayores de 35C nodetecta MRS).Las pruebas en base a cefoxitina, de deben incubar 16 a 20 hspara S. aureus y S. lugdunensis y 24 hs para Staphylococcus coagulasanegativa.

Referirse a la Tabla 2C para las recomendaciones para las pruebas desensibilidad e informe.

11.1.2.4 Mtodos basados en Oxacilina

De las penicilinas estables a las penicilinasas se prefiere a la oxacilina para losensayos in vitro. La oxacilina es ms resistente a la degradacin y detecta mejorlas cepas hetero-resistentes. La cloxacilina no se debera usar ya que no detecta


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todos los S. aureusresistentes a oxacilina. El resultado con el disco de oxacilinapuede extrapolarse a otras penicilinas estables a las penicilinasas (cloxacilina,dicloxacilina, flucoxacilina, meticilina, nafcilina).

Es necesario agregar ClNa (2% p/v; 0.34 mol/L) para las pruebas de dilucin enagar y caldo para mejorar la deteccin de MRSA hetero-resistente. Para laspruebas de difusin, no se debe suplementar el agar MH.

En las pruebas de difusin cuando se usa el disco de oxacilina, se debe examinarcuidadosamente la zona alrededor del disco de OXA usando luz transmitida parapoder as visualizar pequeas colonias o la presencia de un fino desarrollo dentrode la zona de inhibicin. Cualquier crecimiento discernible dentro del halo deoxacilina es indicativo de resistencia a oxacilina.

Si para S. aureusse obtiene un resultado intermedio para oxacilina en las pruebasde difusin, realice una prueba para detectar mecA o PBP2a, la CIM de cefoxitinao el disco de cefoxitina, una CIM de oxacilina o la placa de screening de oxacilina.Informe el resultado de cualquiera de estos mtodos en lugar del resultadointermedio a oxacilina. (ver Seccin 11.1.2.5).

11.1.2.5 Mtodos basados en Cefoxitina

Los resultados de las pruebas que utilizan cefoxitina (microdilucin en caldo odifusin con el disco de 30 g) se pueden usar para predecir resistencia aoxacilina mediada por mecA en S. aureus. Las pruebas con cefoxitina sonequivalentes a la CIM de oxacilina en cuanto a sensibil idad y especificidad para S.aureus.

Para SCN; se valido solo la prueba de difusin con disco para cefoxitina parapredecir la resistencia mediada por mecA. La prueba de difusin de cefoxitinatiene una sensibilidad equivalente a la CIM de oxacilina, pero tiene mayorespecificidad (El disco de cefoxitina tiene mayor exactitud que la CIM a oxacilinapara identificar las cepas sensibles a oxacilina. No hay recomendaciones para la

prueba de difusin con disco de oxacilina para SCN.

Para S. aureusy SCN, el disco de cefoxitina presenta mejores lecturas de laszonas de inhibicin que el disco de oxacilina y por eso es el disco de preferenciapara la prueba de difusin.

Para S. lugdunensissolo se prueba el disco de cefoxitina.

Para todos los estafilococos se deber leer el disco de cefoxitina utilizando luzreflejada.

La cefoxitina se usa como alternativa para detectar resistencia a oxacilina. En

base al resultado para cefoxitina, se informara sensible o resistente oxacilina.

11.1.2.6 Mtodos de Deteccin Molecular

Los mtodos mas exactos para deteccin de resistencia a oxacilina son aquellos queevidencian la presencia del gen mecA o de la PBP 2a (tambin llamada PBP 2). En casode usar disco de cefoxitina, se deber informar el resultado obtenido como oxacilinosensible o resistente.


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11.1.2.7 Informe

Si despus de 16 hs de incubacin se observa resistencia a oxacilina, se puedeinformar sin necesidad de esperar las 24 hs completas.

Cuando se ensaye cefoxitina para detectar resistencia a oxacilina, en base alresultado obtenido, se informara sensible o resistente oxacilina.

Los aislamientos de estafilococos que posean el gen mecA o que produzcan la PBP2a (producto del gen mecA) deben informarse como resistentes a oxacilina.Aquellos aislamientos que no posean el gen o no produzcan la PBP2a se deberninformar como sensibles a oxacilina.

Los estafilococos resistentes a oxacilina se deben informar como resistentes atodas las penicilinas, carbapenemes, cefemes (con excepcin de cefalosporinas conactividad anti-MRSA) y combinacin -lactamicos/inhibidores de -lactamasasindependientemente de los resultados in-vitro con estos agentes. Esto es debido aque la mayora de los casos documentados de infecciones por MRS han respondidopobremente a la terapia con -lactmicos o porque an no se han presentado datosclnicos convincentes que documenten la eficacia clnica de estos agentes.

Para estafilococos sensibles a oxacilina, el resultado de los cefemes, combinacin -lactamicos/inhibidores de -lactamasas y carbapenemes (orales o parenterales) sedeber informar segn los resultados obtenidos en la prueba de difusin.

11.1.3.Resistencia a Vancomicina en S. aureus

En el ao 2006 (M100-S16), el punto de corte para vancomicina y S. aureusse bajo a 2 g/ml para sensible, 4 g/ml a 8 g/ml para intermedio y 16 g/ml para resistente.Para SCN se mantuvieron en 4 g/ml para sensible, 8g/ml a 16 g/ml intermedio y 32 g/ml para resistente.

El primer S. aureus con sensibilidad disminuida a vancomicina (CIM 4 a 16 g/ml) fueinformado en Japn en el ao 1997, seguidamente se detectaron cepas concaractersticas similares en US y Francia. Se desconoce el mecanismo exacto deresistencia que resulta en estas CIMs elevadas, aunque es probable que involucrealteraciones en la pared celular y cambios en mltiples vas metablicas. A la fecha, lamayora de S. aureusintermedios a vancomicina, parecen haber evolucionado de MRSA.

Desde 2002, se detectaron en Estados Unidos cepas de S. aureuscon CIMs de entre32 y 1024 g/ml. Todos estos aislamientos posean un gen vanA similar al descrito enEnterococcusspp. Estas cepas se pueden detectar utilizando el mtodo de microdilucinen caldo, el mtodo de difusin y la prueba de screening en agar (ver Seccin 11.1.3.1)despus de incubar 24 hs de incubacin a 352 C


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11.1.3.1 Mtodos para detectar sensibilidad disminuida a vancomicina

Un aislamiento de S. aureus con CIM a vancomicina 32 g/ml se puede detectar porCIM, difusin o agar screening. Para reconocer las cepas de estafilococos para las cualesla CIM a vancomicina es 4 - 16 g/ml, se debe realizar la CIM e incubar durante 24 hscompletas a 35 2C. Los aislamientos con CIM 1 colonia) o velo decrecimiento, indicativos de sensibilidad disminuida a vancomicina (tabla 2C).

(5) Los organismos que desarrollen en esa placa debern ser re identificados y debedeterminarse la CIM a vancomicina por el mtodo de dilucin o similares.


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(6) Use como QC:

Enterococus faecalis ATCC 29212 o S. aureus ATCC 29213 (sensible avancomicina): control negativo. (no use S. aureusATCC 25923 ya que podra darresultados falsos positivos)

E. faecalisATCC 51299 (resistente a vancomicina): control positivo.

(7) No reutilice las placas una vez incubadas.

Muchos S. aureuscon CIMs de vancomicina de 4g/ml no crecen en el Agar Screening devancomicina (ver Seccin 11.1.3.1).

Actualmente no hay datos suficientes pararecomendar este ensayo para estafilococos coagulasa negativos.

11.1.3.3 S. aureusIntermedio a Vancomicina, Hetero-resistente (hVISA)

Los hVISA se describieron por primera vez en 1997. Se trataban de aislamientos quecontenan una subpoblacin de clulas (1 en 100.000 a 1.000.000) con CIM avancomicina entre 8 g/ml y 16 g/ml. Como la microdilucin en caldo utiliza un inoculo de5 x 105UFC/ml, estas subpoblaciones no se detectaban y la CIM a vancomicina de dichosaislamientos corresponda al rango de sensibilidad (antes, entre 1 g/ml y 4 g/ml). Enun principio no se crey que la heteroresistencia resultara en fracaso teraputico dadoque las CIMs por el mtodo de referencia eran sensibles. Sin embargo despus de revisarlos datos clnicos y de laboratorio, el CLSI disminuyo el punto de corte de intermedio a 4g/ml (solo para S. aureus) y el punto de corte de resistencia a 16 g/ml, para poderpredecir la evolucin clnica. Actualmente el punto de corte de sensibilidad para S. aureuses 2 g/ml, el rango de intermedio es de 4 g/ml a 8 g/ml y el punto de corte deresistencia es 16 g/ml. De esta manera se pueden detectar aquellos hVISA co CIM de4 g/ml los cuales antes categorizados como sensibles. De todas maneras hayaislamientos de S. aureuscon CIM a vancomicina de 1 g/ml a 2 g/ml que pueden serhVISA.

EL perfil de anlisis poblacional (PAP) es el Gold Standard para investigar la relevanciaclnica de los aislamientos de hVISA. En este estudio se plaquea un rango de diluciones deun inoculo estandarizado de S. aureus (101 a 108 UFC) sobre una serie de placascorrespondientes a un rango de concentraciones de vancomicina, se grafica la curvapoblacional, se dividen los recuentos bacterianos y se compara con las cepas patronesMu3 y Mu 50. Se trata de una tcnica laboriosa y no conveniente para realizar de rutinaen laboratorio clnico. Desafortunadamente no hay una tcnica confiable estandarizadapara detectar hVISA. Es difcil identificar aquellas infecciones que pueden no responder ala terapia con vancomicina dado que tantos los equipos automatizados como los mtodos

de referencia no son capaces de detectar hVISA. Por lo tanto, confirmar la presencia deuna cepa de S aureusheteroresistente continua siendo un desafi.

11.1.3.4 Informe

Los estafilococos sensibles a vancomicina se deberan informar de acuerdo a losprotocolos de rutina del laboratorio. En el caso de cepas no sensibles a vancomicina (CIM4 g/ml y/o crecimiento en el agar screening), se debe hacer un informe preliminar deacuerdo a la rutina del laboratorio y el resultado final se debe informar despus de laconfirmacin por un laboratorio de referencia. Remitirse a la Tabla 2C del DocumentoM100 para ver las recomendaciones ms recientes para que ensayar e informar.


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11.1.4 Resistencia Inducible a clindamicina

La resistencia inducible a clindamicina se puede detectar usando la metodologa descriptaen la Seccin 12 y 13 del Documento M07 del CLSI.

11.1.5Resistencia a Linezolid

Cuando se ensaya linezolid en las pruebas de difusin, se debe leer las zonas de inhibicincon luz trasmitida despus de una incubacin de 16 a 18 hs a 35 2C.

11.1.6Resistencia a Mupirocina

La resistencia de alto nivel a mupirocina en S aureus. puede aumentar (CIMs 512g/ml)y se asocia a la presencia del gen mupA (ubicado en un plasmido) El alto nivel deresistencia se puede detectar por difusin o microdilucin. Para el mtodo de difusin seutiliza un disco mupirocina de 200 g, se incuba 24 hs completas y se lee la zona de

inhibicin con luz transmitida, considerando cualquier crecimiento o patina .Si no hay zonade inhibicin, existe resistencia de alto nivel; la presencia de cualquier halo de inhibicin, seinterpreta como ausencia de resistencia de alto nivel. En un estudio resiente, la mayora deaislamientos negativos para el gen mupA, presentaron zonas de inhibicin >18 mm con el

disco de 200 g. Para microdilucin en caldo, una CIM 512 g/ml se interpreta comoresistencia de alto nivel y CIMs 256 g/ml, como ausencia de dicho mecanismo. Para laspruebas de dilucin, se podra usar una sola concentracin de 256 g/ml: si se observacrecimiento, hay resistencia de alto nivel a mupirocina y si no hay crecimiento, ausencia deresistencia de alto nivel a dicho antibitico.

11.2. Enterococcusspp.

11.2.1. Resistencia a Penicilina / Ampicilina

Los enterococos pueden ser resistentes a penicilina y ampicilina debido a la produccin de

protenas ligadoras de penicilina (PBPs) de baja afinidad o con menor frecuencia a laproduccin de -lactamasas. El mtodo de difusin por discos puede detectaradecuadamente aislamientos con PBPs alteradas, pero no es confiable para la deteccinde cepas productoras de -lactamasas. Estas ltimas se pueden detectar mejormediante el uso de Nitrocefn (ver seccin 13.2.). Un resultado de -lactamasa positivoindica resistencia a penicilina como tambin a amino, carboxi y ureido-penicilinas. Ciertosenterococos penicilino o ampicilino resistentes pueden presentar alto nivel de resistencia(ej. CIM a penicilina > 128 g/ml o ampicilina > 64 g/ml). La prueba de difusin nodiferencia aquellos aislamientos con resistencia normal de aquellos con alto nivel. Ellaboratorio debera determinar la CIM a penicilina o ampicilina para aquellos enterococosaislados de sangre y LCR, dado que Enterococcus spp con bajo nivel de resistencia(penicilina < 64 g/ml y ampicilina < 32 g/ml) podran ser potencialmente sensibles a lasinergia con un aminoglucsido (en el caso de ausencia de alto nivel de resistencia a

aminoglucsidos) si se administran altas dosis de un antibitico -lactmico, mientras quecepas con alto nivel de resistencia podran ser refractarias a tal sinergia Si fuerasolicitado, debera considerarse realizar CIM a penicilina o ampicilina en aquellosaislamientos de LCR o sangre.


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11.2.2. Resistencia a Vancomicina

La deteccin de enterococos resistentes a vancomicina mediante el mtodo de dilucin encaldo o agar, requiere una incubacin por 24 hs. (en vez de 16 a 20 hs.), y un examencuidadoso de las placas, tubos o pocillos para evidenciar cualquier film tenue decrecimiento. Tambin se puede utilizar la prueba de screening a vancomicina, como sedescribe en la Seccin 11.2.3 y la tabla suplementaria de la Tabla 2D del Documento

M100.

11.2.3 Prueba de screening de vancomicina en agar

Este mtodo se puede utilizar en conjunto con el mtodo de dilucin en caldo descrito enla Seccin 12.2.2., para la deteccin de resistencia a vancomicina en Enterococcus spp.Para este ensayo se inocula una placa de agar BHI (infusin cerebro corazn)suplementado con 6 g/mL con el aislamiento de enterococo a estudiar.

(1) Preparar una suspensin de enterococoequivalente al 0.5 de Mc Farland obtenidapor el mtodo de resuspensin directa de colonias

(2) Inocular la placa con ansa de 1 10 l o con hisopo estril(a) Si se utiliza ansa de 1 o 10 l desparramar el inoculo en un rea de 10-15 mm

de dimetro.(b) Cuando se utilice hisopo, descargar su contenido en un rea circular de al

menos 10-15 mm de dimetro.

(3) Incubar la placa en atmsfera de aire a 352C por 24 hs y examinar con luz

transmitida la presencia de pequeas colonias (> 1 colonia) o velo de crecimiento, sonindicativos de resistencia a vancomicina (ver la tabla suplementaria de la Tabla 2D deldocumento M100).

(4)Use como QC: Enterococcus faecalisATCC 29212(sensible a vancomicina): control negativo.

Enterococcus faecalisATCC 51299 (resistente a vancomicina): control positivo.

11.2.4. Alto nivel de resistencia a aminoglucsidos

El alto nivel de resistencia a gentamicina/estreptomicina en enterococos predice que no seobservar sinergia bactericida de penicilina o glicopptidos con aminoglucsidos. Paradetectar este tipo de resistencia se puede realizar un screening en agar o caldo, utilizandoaltas concentraciones de gentamicina (500 g/ml) y estreptomicina (1000 g/ml paramicrodilucin; 2000 g/ml para agar). Ver la tabla suplementaria de la Tabla 2D deldocumento M100. El control de calidad de estas pruebas tambin se explica en la tablasuplementaria de la Tabla 2D del documento M100. No es necesario probar otrosaminoglucsidos porque sus actividades contra enterococo no son superiores a la

gentamicina o la estreptomicina.

11.3. Bacilos Gram Negativos

11.3.1 Introduccin

El principal mecanismo de resistencia a antibioticos -lactamicos en bacilos gram negativoses la produccin de -lactamasas. Se han publicado muchos tipos de enzimas diferentes.


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Las -lactamasas se nombran en funcin de los sustratos que hidrolizan, las propiedadesbioqumicas, la bacteria donde se detect la -lactamasa, el paciente de donde se aisl lacepa productora, etc. Por ejemplo, TEM es la abreviatura de Temoniera, el primerpaciente del que se aisl una cepa productora de -lactamasa tipo TEM. Se pueden

clasificar molecularmente como enzimas de Clase A, B, C o D.

Las cuatro clases de -lactamasas inactivan a los agentes -lactmicos con diferentesvelocidades. Los genes que codifican para las -lactamasas pueden ubicarse en loscromosomas expresndose con o sin induccin, o pueden encontrarse en plsmidos enuna o varias copias. Un aislamiento puede producir -lactamasas y poseer otromecanismo de resistencia como ser mutaciones en las porinas que restringen el accesodel antimicrobiano a su sitio activo dentro de la clula bacteriana. La variedad demecanismos de resistencia a -lactmicos que se encuentra en Gram negativos da lugara un amplio rango de valores de CIM. Uno podra esperar que el punto de corte (sea laCIM o el valor de halos de inhibicin) diferencie cepas -lactamasa /otro mecanismo deresistencia- negativo (sensible), de cepas -lactamasa /otro mecanismo de resistencia-

positivo (resistente). Sin embargo, una actividad dbil o un bajo nivel de expresin de las-lactamasas, no necesariamente implica que el aislamiento sea refractario a la terapiacon -lactmicos. En la prctica, algunos aislamientos que son interpretados comosensibles producirn -lactamasas con actividad enzimtica sin consecuencias clnicas.Estas pueden ser BLEE, AmpC o carbapenemasas, ver secciones 11.3.2, 11.3.3 y11.3.4.

La identificacin de un mecanismo de resistencia por -lactamasas (ej. BLEE, KPC, NDM)no es necesario para la determinacin de la interpretacin como sensible o resistente. Sinembargo, la identificacin de una enzima especfica puede ser de utilidad para losprocedimientos de control de infecciones o investigacin epidemiolgica. Las tablassuplementarias a la 2A describen pruebas que pueden ser utilizadas para el tamizaje yconfirmacin de la presencia de BLEE en E. coli, K. pneumoniae, K. oxytocay P. mirabilis,y la produccin de carbapenemasas en Enterobacteriaceae.

11.3.2-actamasas de Espectro Extendido

Las -lactamasas de espectro extendido (BLEEs) son enzimas cuyo origen proviene demutaciones en genes que codifican -lactamasas plasmdicas (Nota de la editorial:tipo BLEA) tales como TEM-1, SHV-1 y OXA-10 u otras con poca relacin con unaenzima nativa como es la familia de las CTX-M. Las BLEEs pueden conferir resistencia apenicilinas cefalosporinas y aztreonam en aislamientos clnicos de Klebsiella pneumoniae,K. oxytoca, E. coli, P. mirabilis y algunos otros gneros de la flia. Enterobacteriaceae.Cuando se utilizan los puntos de corte para cefalosporinas y aztreonam previamente

Clase Sitio activo Ejemplos

A Sensibles a inhibidores(raras excepciones)

TEM-1, SHV-1, KPCs,OXY y la mayora de

BLEEs incluida CTX-M.

B Metalo--lactamasas Metaloenzimas;VIM, IMP, SPM, NDM

C -lactamasas resistentesa inhibidores

AmpC

D -lactamasas oxacilinasasque pueden ser sensibles

a inhibidores

OXA (incluye fenotiposraros de BLEE)


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27Curso Latinoamericano

02-metodo de determinacion de sensibilidad antimicrobiana por difusion 2012

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