UNIVERSIDAD TÉCNICA PARTICULAR DE LOJA Biología General 1er Ciclo Paralelo “E”

Bioquímica y Farmacia

“Si no quieres ser olvidado, escribe cosas dignas de ser leídas, o haz cosas dignas de ser escritas”

¿Qué es PCR?¿Qué es PCR?¿Qué es PCR?¿Qué es PCR? Es la reacción en cadena de la polimerasa , conocida como PCR por sus siglas en inglés (Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular descrita en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener "in Vitro" un gran número de copias de un fragmento de ADN, Esta técnica utiliza una enzima denominada ADN polimerasa que copia cadenas de ADN en un proceso que simula la forma en la que el ADN se replica de modo natural en la célula. Este proceso, que ha revolucionado todos los campos de la biología, permite a los científicos obtener gran número de copias a partir de un segmento determinado de ADN. ¿Qué es primer?¿Qué es primer?¿Qué es primer?¿Qué es primer? PRIMER: oligonucleotidos sintéticos de unos 15-20 nucleótidos complementarios a la zona flanqueante de la región que se quiere amplificar, estos actúan como sebadores para la síntesis de ADN in Vitro la cual esta catalizada por la Taq polimerasa, los primer actúan como marcadores del sitio de inicio de la enzima. Además a la hora de elegir unos primer para la amplificación un determinado fragmento de ADN hay una serie de reglas a seguir:

• longitud de los primer: debe estar comprendida entre 18 y 24 bases, se ha comprobado que primer de mayor longitud (30 a 35 bases) no aumentan su rendimiento y los primer muy cortos carecen de especificidad.

• Ambos primer deben tener una temperatura de hibridación similar (como mucho con una diferencia de -/+ 5°C) la relación bases puricas-ba ses pirimidinicas debe ser 1:1 (o como mucho 40-60%) una con respecto a la otra.

• La secuencia de los primer debe comenzar y terminar con 1 o 2 bases puricas.

¿Cuáles son los pasos para realizar una PCR y para ¿Cuáles son los pasos para realizar una PCR y para ¿Cuáles son los pasos para realizar una PCR y para ¿Cuáles son los pasos para realizar una PCR y para quéquéquéqué sirve?sirve?sirve?sirve?

La PCR común se realiza con ciclos que tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de ciclos a menudo están precedidos por un choque térmico (llamado "hold") a alta temperatura (> 90°C), y seguido por otro hold al final del proceso para la extensión de producto final o el breve almacenaje.

Inicialización Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96ºC, que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto sólo es necesario para ADN polimerasas que requieran activación por calor. Desnaturalización En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos hebras de las cuales está constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95ºC) de la muestra la forma más habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalización depende, por ejemplo, de la proporción de G+C que tenga la hebra, como también del largo de la misma. Alineamiento/Unión del cebador A continuación se producirá la hibridación del cebador, es decir, el cebador se unirá a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 50-65ºC durante 20-40 segundos (según el caso), permitiendo así el alineamiento. Los puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión ADN-ADN) sólo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a

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sintetizar ADN. Los cebadores actuarán como límites de la región de la molécula que va a ser amplificada. Extensión/Elongación de la cadena Actúa la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. Hay una regla básica: en su temperatura óptima, la polimerasa de ADN polimerizará mil bases en un minuto. Elongación Final Etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74°C durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado. Conservación Este paso se lleva a cabo a 4-15°C durante un tiemp o indefinido para conservar la reacción a corto plazo. La PCR normalmente se realiza con un volumen de reacción de 15-100 µL, en pequeños tubos de 0.2-0.5 mL que se colocan en el termociclador. ¿P¿P¿P¿Para qué sirveara qué sirveara qué sirveara qué sirve una una una una PCR?PCR?PCR?PCR? Debido a su simplicidad, PCR es una técnica popular con una amplia gama de aplicaciones: incluyendo ordenar directo, la reproducción genomic, la DNA que pulsa, la detección de microorganismos infecciosos, la mutagénesis sitio-dirigida, la investigación genética prenatal de la enfermedad, y el análisis de las variaciones allelic de la secuencia (1.7.13.16) que dependen de esencialmente tres ventajas importantes del método: Velocidad y facilidad de empleo: La reproducción de la DNA de PCR se puede realizar en una cantidad de tiempo relativamente corta, dentro de algunas horas. Sensibilidad: PCR es capaz de amplificar las secuencias de cantidades minuciosas de DNA de la blanco, incluso la DNA de una célula (24). Tal sensibilidad exquisita ha producido nuevos métodos de estudiar la patogenesia molecular y ha encontrado aplicaciones numerosas en ciencia forense, en diagnosis, en análisis genético del acoplamiento usando la solo-esperma que pulsaba y en los estudios moleculares de la paleontología, donde las muestras pueden contener números minuciosos de células. Robustez: Un amplio rango de las fuentes del ácido nucleico es modelos convenientes para la amplificación de PCR. DNAs purificado de la varia especie y las fuentes se han amplificado. PCR puede permitir la amplificación de secuencias específicas del material en el cual la DNA se degrada o se embute gravemente en un media de el cual el aislamiento convencional de la DNA sea problemático. REFERENCIAS ELECTRÓNICAS

http://www.unilibrebaq.edu.co/ubaq/Mis%20Webs/PCR.htm http://www.molecularstation.com/es/pcr/history-of-pcr/ http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/Soluciones-Q-PCR-Introduccion.pdf http://es.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3n_en_cadena_de_la_polimerasa