qrt pcr final
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Julián Danilo Bonilla 070100062009
Germán Andrés Caicedo070150052009
Técnica de laboratorio usada para reproducir
segmentos ácidos nucleídos mediante un
proceso cíclico, que genera gran cantidad de copias que pueden ser usadas en estudios o análisis posteriores
Cuantificación extremadamente difícil, ya que la PCR da origen a la misma cantidad de
producto independientemente de
la cantidad inicial de moléculas de DNA
presente en las muestras
- Higuchi et al- Producto es monitoreado durante el curso de la reacción y no en el punto final (end point)- Sondas fluorescentes
PCR En Tiempo Real
Técnica de amplificación y cuantificación de ADN yARNm que utiliza tecnologías fluorescentes paraevidenciar la amplificación de una secuencia corta
sistemas fluorescentes
agentes intercalantes
sondas de hidrolisis y de
hibridación
sondas Taqman Sondas
molecular Beacons
Sondas FRET
Fluorocormos que aumentan su fluorescencia cuando se unen a una doble cadena de DNA
SYBR Green
Facilita las condiciones de optimización y es mas barato que las sondas especificas
Unión inespecífica a cualquier doble cadena de DNA y también a los dímeros de cebadores
(fluorescencia inespecífica)
Soluciones
Fundamento: Curva De Fusión
(melting curve)
Diferentes moléculas de DNA de doble cadena se abren a diferente temperaturas
Factores
Concentración de guanina y
citosina
La longitud de fragmento de amplificación
Estructura secundaria y
terciaria
Factores químicos que hacen parte de
los componentes de reacción
Buen diseño de los cebadores y
condiciones optimas de reacción
Desventajas
1. Las sondas Taqman2. Sondas Molecular Beacons3. Sondas FRET
Oligonucleótidos lineales que son etiquetados con un fluorocromo donador (reporter) en la porción 5’ como FAM (6-carboxifluoresceína) y un aceptor (quenber) en la porción 3’ como TAMRA (6-carboxitetrametilrodamina).
Dependen de la actividad 5’ nucleasa de la Taq ADN polimerasa para su ruptura durante la síntesis de una nueva hebra.
El lugar en el que
anilla la sonda
fragmento de
amplificación o secuencia
blanco
Antes que los cebadores
Señal emitida se genera
Cada
ampliconnuevo
sintetizado
Oligonucleótidos de cadena simple zona de apareamiento de bases interna No dependen de su hidrólisis
para generar la señal fluorescente
Forman una horquilla (harpin)
La emisión de fluorescencia se da durante la etapa de
anillamiento
la sonda se linealisa lo que permite que los fluorocromos se
separen
el donador emita su señal la cual es
detectada por el equipo.
Se compone de dos sondas que se unen específicamente a
secuencias del ADN blanco.
Una de la sonda lleva una molécula donadora en su
porción 3’ y la otra lleva un aceptor en su porción 5’
La fluorescencia emitida es
directamente proporcional al
aumento de ADN en cada
ciclo
Cuando la sondas se anillan
al ADN blanco, estas se unen
se excitar a la molécula
donadora en una longitud de onda
determinada
se da la trasferencia de energía hacia el aceptor que absorbe la energía
emitida por el donador y la emite en otra longitud de
onda
En PCR en tiempo real se deben manejar una serie de conceptos relacionados con el análisis e interpretación de graficas generadas por el software luego de un proceso de amplificación.
La curva de amplificación
Componentes
Fase inicial o background
Fase exponencial
Fase de meseta o plateau
Línea base (baseline)
• Nivel basal de la fluorescencia emitida
• Definido durante los primeros ciclos de la PCR
• Programada en cada software de PCR en tiempo real
Umbral (threshold)
• Es el punto de corte de la fluorescencia por encima de la línea base
• A partir de esta línea de corte se calcula los valores de Ct
Ct o CP (threshold cycle)
• Refleja el punto en el cual un numero suficiente de amplicones se ha acumulado dentro de la reacción y se presenta un crecimiento exponencial
Parámetro que permite establecer la confiabilidad de la estimación del numero de copias y se debe calcular para cada reacción.
Directamente en el software.
Debe estar entre el 90 y el 100%
Doble de moléculas de DNA que en el ciclo anterior
Establecer un numero relativo
de copias cuando se
utiliza un gen de referencia.
cuantificación relativa
(expresión de un gen
determinado en un
momento estableció del ciclo celular)
cuantificación absoluta (numero
exacto de copias de un
gen)
Método mas sensible parala detección y cuantificaciónde niveles de expresión degenes a partir de muestraspequeñas de tejido
Depende de una RT-PCR entiempo real (retrotranscripción o kinetic RT-PCR)
mide el cambio relativo en losniveles de expresión deARNm y se basa en compararlos niveles de expresión deuna muestra problema frentea un gen constructivo
La curva estándar produce una relación linealentre Ct y la concentración inicial de ARN oADN, lo que permite la determinación de laconcentración de muestras desconocidas conbase a sus valore de Ct
Se utiliza una curva de calibración, la cual se realiza con diluciones
seriadas de un estándar con una concentración conocida
Son altamente reproducibles ypermiten generar datosespecíficos y sensibles.
Control Negativo de Extracción
• Muestra negativa a la que se realiza todo el proceso de extracción.
• No debe generar curva de amplificación.
Control Positivo de Reacción
• Muestra positiva a la que se realiza todo el proceso de extracción.
• Debe generar curva de amplificación.
Control sin DNA (NTC) con solo
mezcla de reacción.
• Es muy importante incluir los NTCs siempre en cada reacción para asegurar que lo que se esta midiendo no corresponde a algún tipo de contaminación.
El equipo necesario:1. Termociclador2. Lector de fluorescencia3. Filtros 4. Fuente lumínica (lámpara halógena, LED o
un laser)
TERMOCICLADOR
• Permite el análisis de los datos para reportarla cuantificación, análisis de curvas de fusióny la discriminación alélicas
LECTOR DE FLUORESCENCIA
• Es una seria de componentes que colectan la luza través de varios dispositivos ópticos quepermiten el paso y la salida de la luz visible sobreel tubo de reacción gracias a un grupo de filtrosque detectan todo el rango de la luz visible.
FUENTE LUMINICA
• Genera las longitudes de onda requeridaspara excitar los fluorocromos utilizados en laPCR
• Identificar pequeñas mutaciones o
polimorfismos en genes causantes de
enfermedades heredadas.
1.
• La utilización de las curvas de fusión para el genotipaje, ya que cada
fragmento generado tendría diferente tamaño y por ende, diferente Tm.
2.
• En la detención de patógenos de
importancia medica, con gran énfasis en ensayos cuantitativos para virus,
bacterias, levaduras y parásitos protozoos.
3.
• En oncología ya que se requiere de pequeñas
cantidades de tejido y es útil en ensayos de
amplificación y expresión de genes, duplicación y
delección genética
4.
• en la detección de mutaciones puntuales,
diagnostico, seguimiento y respuesta al tratamiento.
5.
• Monitorización para la seguridad de alimentos, bioterrorismo, en la área
de biotecnología, etc.
6.VIDEO
Permite obtener resultados reproducibles,confiables, rápidos y ofrece gran cantidad deaplicaciones.
Facilita la cuantificación de ADN y ARN sea masprecisa ya que se utilizan curvas estándar y losresultados se basan en la obtención de losvalores de Ct
Algunas complicaciones se pueden solucionar sise tiene un experimento diseñado y realizadorigurosamente y con lo controles adecuados.
Detección cuantitativa del virus psorosis de cítricos mediante RT–PCR tiempo real
Quantitative diagnosis of citrus psorosis virus by real time RT–PCR
Implementar un protocolo de RT–PCR tiemporeal para la detección del CPsV y determinarconcentración viral en hojas de árboles denaranja Mars afectados por psorosis en elEstado de Nuevo León (NL), México.
