pcr y variantes_final

PCR Fundamentos, variantes y aplicaciones

MSc. Edgar Neyra Valdez

Unidad de Genomica

Universidad Peruana Cayetano Heredia

Sntesis de cidos nucleicos: generalidades

La hebra nueva de DNA o RNA se sintetiza en direccin 5 3

Las DNA polimerasas pueden iniciar la sntesis de una cadena nueva utilizando una hebra molde

Las DNA polimerasas adems de la hebra molde, necesitan un iniciador (primer o cebador de extensin)

Se requieren adicionalmente los dNTP y el cofactor Mg

Reaccin en cadena de la polimerasa -

PCR

PCR es bsicamente una tcnica de

amplificacin del DNA.

PCR

amplificacin

DNA

(molecula sencilla)

Muchas

moleculas

Sntesis por DNA polimerasa

-A T G C A T G C A T G C * *

A C G T -T

Reaccin en cadena de la polimerasa - PCR

5 3



A C G T -T A 5 3




A C G T -T A C


5 3



A C G T -T A C G


5 3



A C G T -T A C G T


5 3



A C G T -T A C G T A


5 3

Despues del primer periodo de sintesis de

DNA, tenemos copiada una cadena de

DNA

Primer 1 Extensin de la cadena

Cadena original de DNA

Cmo produce este proceso una AMPLIFICACIN?


PCR

Primero, la separacin de las dos cadenas de DNA a alta

temperatura (94C)


PCR

Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva

cadena con la DNA polimerasa

Al mismo tiempo, la cadena original se copia

nuevamente, dado que hay un exceso de Primer 1

2

1

Ahora tenemos dos copias de la molcula original


PCR

Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura

Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias


PCR

Fusin

94C

Hibridizacin

50-60C

Extensin de

La cadena

72C

Primer Ciclo

2do Ciclo

94C

50 - 60C

72C

Mltiples ciclos darn un incremento exponencial en el

nmero de copias

Reaccin en Cadena de la Polimerasa

PCR Melting

94 oC

Tem

per

atu

ra

100

0

50

Tiempo

5 3

3 5 DNA de

cadena doble

PCR Melting

94 oC

Tem

per

atu

ra

100

0

50

Tiempo

3 5

5 3

Calor

DNA de

cadena simple

PCR Melting

94 oC Annealing

Primers

50 oC

Extension

72 oC T

emp

erat

ura

100

0

50

Tiempo

3 5

5 3 5

5

Melting

94 oC

Hibridacin

de primers

PCR Melting

94 oC

Melting

94 oC Annealing

Primers

50 oC

Extension

72 oC T

emp

erat

ura

100

0

50

Tiempo

30 ciclos

3 5

5 3

Calor

Calor

5

5

5

PCR Melting

94 oC

Melting

94 oC Annealing

Primers

50 oC

Extension

72 oC T

emp

erat

ura

100

0

50

Tiempo

30ciclos

3 5

5 3 5

5

5

5

5

5

PCR Melting

94 oC

Melting

94 oC Annealing

Primers

50 oC

Extension

72 oC T

emp

erat

ura

100

0

50

Tiempo

30ciclos

3 5

5 3 5

5 5

5

5

5

Calor

Calor

PCR Melting

94 oC

Melting

94 oC Annealing

Primers

50 oC

Extension

72 oC T

emp

erat

ura

100

0

50

Tiempo

30ciclos

3 5

5 3 5

5 5

5

5

5

5

5

5

5

Fragmentos de

tamao definido

PCR Melting

94 oC

Melting

94 oC Annealing

Primers

50 oC

Extension

72 oC T

emp

erat

ura

100

0

50

Tiempo

30ciclos

3 5

5 3 5

5 5

5

5

5

5

5

5

5

El numero de copias del DNA delimitado por los primers se duplica en cada ciclo de PCR.

0

# ciclos

Numero de copias

1

3

8

2

4

1

2

4

16

5

32

6

64

Termociclador

Electroforesis en agarosa

VENTAJAS DE PCR SOBRE

OTRAS TECNICAS

ALTA SENSIBILIDAD

ALTA ESPECIFICIDAD

RAPIDEZ

DESVENTAJA:

PROBLEMAS DE CONTAMINACION (a partir de trazas de DNA

templado especfico o productos amplificados previamente)

TECNICAS DERIVADAS/ BASADAS EN PCR

PCR Multiplex: varios targets diferentes en forma simultnea

PCR Nested: amplificacin de una secuencia dentro de otra previamente amplificada

RT-PCR : deteccin de mRNA

IC-PCR : inmunocaptura previa a PCR

Real Time PCR : cuantificacin de copias iniciales en tiempo real

PCR-Diagnstico Molecular

Un aproximacin ha sido encontrar secuencias genmicas especficas de gnero o especie: protenas de choque trmico 90 (Hsp 90), lanosterol demetilasa, proteinasa aspartica, quitina sintasa, y actina son algunos ejemplos.

Estas secuencias se encuentran casi exclusivamente en copias simples en el genma, hacindolas altamente especficas.


Otra aproximacin es la de amplificar secuencias genmicas altamente conservadas que se encuentran en copias mltiples (generalmente unidades transcripcionales de 50-100 copias) presentes en las especies fngicas: tenemos el gen 18S rRNA, 5S, 28S rRNA mitocondrial, regiones ITS.

PCR Multiplex

- Varias secuencias target en forma simultnea.

- La eficiencia de amplificacin de ambos targets no es

necesariamente la misma:

- Secuencia de DNA de los diferentes targets

(%GC)

- Temperatura de hibridacin de los diferentes

primers

- Tamao de las diferentes secuencias target

- Artefactos / dmeros entre diferentes primers.

Diagnstico Molecular


NESTED PCR o PCR anidado

Se realiza una segunda reaccin de PCR a partir del amplicn , usando primers internos a la primera amplificacin

Aumenta la sensibilidad , ya que se realizan dos reacciones de PCR

consecutivas Aumenta la especificidad, ya que se utilizan otros primers internos

especificos

Nuclear rDNA 18S 5.8S Nuclear rDNA 26S ITS I ITS II

Its-1 Its-4 PCR

Sequencing

Base de Datos ITS, ID y GeneBank

Its-1

Its-4

Levaduras

Diagnstico Molecular


Base de

Datos

mRNA

cDNA (simple cadena)

cDNA (doble cadena)

PCR

RT-PCR

Consiste en dos pasos:

Transcripcin reversa

PCR

OBJETIVO:

Deteccin de la expresin de

un gen por presencia de mRNA

Transcripcin Reversa

1. Purificacin de RNA mensajero

2. Transcripcin reversa a cDNA (DNA copia)

RT-PCR (Reverse Transcription PCR) RNAc DNA

Prueba cuantitativa para determinar la carga viral del VIH

Carga Viral = Viremia, virus en sangre

HIV es un retrovirus, se obtiene RNA y se realiza el RT-PCR

Seguimiento de la terapia del paciente infectado

Limite de deteccin de 40 Copias virales/mL (ultrasensible)

Inmuno PCR-Diagnstico Molecular

Se emplean dos tecnologas, la deteccin basada en

anticuerpos y PCR, La deteccin del antgeno por el

anticuerpo se ve enormemente potenciada por la

conjugacin del sistema de deteccin del anticuerpo con

un fragmento de ADN que posteriormente es amplificado

mediante PCR.

Esta tcnica recuerda a ELISA (anlisis inmuno

absorbente ligado a enzima) y permite detectar incluso 10

femtogramos de protena.

Immuno-PCR vs ELISA

protein

E

S P

ELISA

antibody with

linked enzyme

St B

protein

Immuno-PCR

antibody with

linked DNA

B

El Producto de PCR puede ser detectado por

electroforesis o por ELISA

REAL TIME PCR - PCR EN TIEMPO REAL

Cuantificacin del nmero de copias de DNA presentes en la muestra (diagnstico, monitoreo de

carga viral, comparacin entre nmero de copias en

diferentes subespecies, etc.)

Cuantificacin del mRNA por RT-PCR en tiempo real (anlisis de la expresin de genes en diferentes

tejidos o en diferentes condiciones normales vs

patolgicas, efecto de drogas, etc)

Anlisis de la cintica de la reaccin

PCR en tiempo real

Deteccin y cuantificacin de reporteros fluorescentes.

La fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de producto formado en cada ciclo de PCR.

Reporteros fluorescentes: TaqMan, Beacons moleculares, SYBR Green

PCR en tiempo Real sondas de hidrolisis

Sonda especfica

PCR en Tiempo Real: deteccin mediante sondas de hidrlisis.

Se lleva a cabo mediante la hibridacin con una sonda

complementaria a una regin interna de la secuencia blanco,

previamente a la amplificacin. Tm sonda debe ser 10C > que el de los

cebadores, de modo que hibride antes que los mismos.

PCR en Tiempo Real: deteccin mediante sondas de hidrlisis.

SYBR Green

Agente que se intercala

en DNA de doble

cadena.

Desventaja: se une a

CUALQUIER DNA de

doble cadena (dmeros

de primers y productos

inespecficos).

CYCLE NUMBER DNA copy number

0 1

1 2

2 4

3 8

4 16

5 32

6 64

7 128

8 256

9 512

10 1,024

11 2,048

12 4,096

13 8,192

14 16,384

15 32,768

16 65,536

17 131,072

18 262,144

19 524,288

20 1,048,576

21 2,097,152

22 4,194,304

23 8,388,608

24 16,777,216

25 33,554,432

26 67,108,864

27 134,217,728

28 268,435,456

29 536,870,912

30 1,073,741,824

31 1,400,000,000

32 1,500,000,000

33 1,550,000,000

34 1,580,000,000

PCR reagent is the limiting factor!!

Copies of DNA=2N

0.0E+00

2.0E+08

4.0E+08

6.0E+08

8.0E+08

1.0E+09

1.2E+09

1.4E+09

1.6E+09

1.8E+09

0 5 10 15 20 25 30 35

PCR cycle

DN

A c

op

y n

um

ber

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 5 10 15 20 25 30 35

PCR cycle

DN

A c

op

y n

um

ber

(lo

g)

CANTIDAD DE DNA (escala logaritmica) vs NUMERO DE CICLOS

Se observa diferencias en los ciclos iniciales. Relacin como lnea recta

al utilizar logaritmos, porque la amplificacin por PCR es una reaccin

logartmica.

Real Time PCR

2a. excitation

filters

2b. emission

filters

1. halogen

tungsten lamp

4. sample plate

3. intensifier 5. ccd

detector

350,000

pixels

Log phase Level off/ plateau

Amplification Plot of real-time PCR D

NA

co

py n

um

ber

(log)

PCR cycle (Ct)

ARTEFACTOS - PRODUCTOS NO ESPECIFICOS:

Unin inespecfica de primers (mispriming): por unin de los

primers a secuencias parcialmente complementarias presentes en

el DNA o cDNAs de la muestra

Dmeros : los primers pueden hibridarse entre ellos creando

productos pequeos

PROBLEMAS

PRODUCTOS NO ESPECIFICOS (artefactos) : que

pueden incrementar el valor de fluorescencia obtenida

durante la reaccin. Esto es mas frecuente cuando se utiliza

SYBR-green.

DISEO EN PLACA

Ventajas del PCR en tiempo real

Simple y rpida (semi-automatizada).

No hay manipulacin post-PCR.

Eliminacin de contaminacin por amplicones.

Cuantificacin del DNA o RNA molde inicial.

Muy sensible.

Deteccin de productos inespecficos con la opcin curva de desnaturalizacin (Melt-Curve).

Deteccin de ms de un producto especfico en una misma reaccin.

Extraordinariamente especfico.

Journal of Virological Methods 102:119-128, 2002

Journal of Clinical Virology 28:233-238, 2003

Polymerase chain reaction (PCR)

DNA polimerasas para PCR :Termoestables


APLICACIONES DE PCR

MUTAGENESIS

RT-PCR

PRODUCCION DE SONDAS

DETECCIN DE INFECCIONES BACTERIANAS Y VIRALES

DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES HEREDITARIAS

ESTUDIOS DE EVOLUCIN MOLECULAR

ESTUDIOS DE MEDICINA FORENSE

ESTUDIOS DE FILIACIN

pcr y variantes_final

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