Control molecular de la LMC

Dolors

Colomer, PhD

UNITAT D’HEMATOPATOLOGIA

HOSPITAL CLINIC

BARCELONA

t(9;22)(q34;q11) BCR-ABL

LMC

Cronologia LMC

Mecanismo de formación de un gen de fusión y expresión de una proteína quimérica como

consecuencia de una traslocación cromosómica

Gen de fusión

Proteína

quiméricaBCR-ABL

mRNA

DNAGen A

mRNA

Proteína

normal

BCR

DNAGen B

Proteína

normal

mRNA ABL

Proteínas aberrantes Bcr-Abl

e13a2

e14a2

Kurzrock, R. et. al. Ann Intern Med 2003;138:819-830

Frecuencia del cromosoma Philadelphia, p210Bcr-Abl y

p190Bcr-Abl

Gen BCR-ABL: mecanismos

patogenéticos

ADHESION

PROLIFERACION

INHIBICION DE LA APOPTOSIS

BCR ABL

La traslocación tienelugar en la zona no codificante (intrones)

La traslocación tienelugar en la zona no codificante (intrones)

PROTEINA DE FUSIONBCR-ABL

Es diferente paracada paciente

Se forma la mismaproteína anómala

Es una zona demasiada grande

para su análisis por PCR

Copia de RNA a DNA (transcripción reversa RT)

CELULAS

Extracción

RNA

Reacción

de PCR

Detección

del productoamplificado

Oligo region Oligo regiónBCR ABL

RT-PCR

cDNABCR-ABL

mRNABCR-ABL

ProteínaBCR-ABL

Transcripción

Traducción

Leukemia

1999

309 246

b2a2

b3a2

K56

2

Jurk

at

b2a2

/b3a

2

H2O

NO ES DE UTILIDAD PARA EL ANÁLISIS DE ENFERMEDAD MINIMA

RESIDUAL

Es un proceso cualitativo

No es cuantitativo

PCR

PCR Tradicional PCR a tiempo real

2500 copias 100 copias7000 copias

Baseline

Δ

Fluorescence

PCR a tiempo Real o PCR cuantitativa

Área detección

PCR

a tiempo

real

PCR tradicional

Threshold es

el punto

de detección

Cycle Threshold

(Ct) Ciclo en la que la muestra

cruza

el threshold

Sensibilidad RT-PCR cuantitativa

1 a 10 células en 1.000.000 células normales

IMATINIB

Mecanismo de acción de Imatinib : inhibición específica de actividad tirosin- quinasa

Dinámica BCR-ABL en tratamiento con Imatinib

Buena respuestaStop tratamiento

RESISTENCIA

Protocolo de cuantificación GEN BCR-ABL

R. Hematologica

R. Citogenética

R. Molecular

Respuesta óptima

3-6 meses RHC

6-12 meses RCiC

12!!-18 meses RMM

Tiempo AlertasRespuestaSubóptima

Fracaso

DxAlto riesgo LMC

Del 9q+ACA en células Ph+

- -

3 meses < RHC No RH

6 meses < RCiP< RHCNo RCi

12 meses < RMoM < RCiC < RCiP

18 meses < RMoM < RCiC

En cualquier momento

BCR-ABL ratioACA en células Ph-

ACA en células Ph+Pérdida de RMoM

Mutaciones

Pérdida de RHCPérdida de RCiC

Mutaciones

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

6 9 12 183 24 27 30 33 36 39 42 45 48 51 54

% o

f pa

tien

ts

57 60

≥

4 log drop

undetectable BCR-ABL (≥

4.5 log)

≥

3 log drop (MMR)

Cortesy of T. Hughes 2006

Respuesta Molecular a Imatinib

Mecanismos de resistencia a Imatinib

BCR/ABL-dependiente:

- Mutaciones Puntuales

- Amplificación / sobreexpresión

BCR/ABL-independiente:

- Evolución Clonal (p53 loss ...)

- quinasas de la familia Src

- Expresión diferente de proteínas implicadas

en el transporte de proteínas

- Barreras farmacológicas(e.g., CYP450)

- Niveles plasmáticos bajos de IM

Resistencia aImatinib

sobreexpresión

BCR-ABL

Otros defectos genéticos

Mutaciones BCR-ABL

Amplificación BCR-ABL

Evolucion Clonal

Fallo Primario (%)Pérdida Respuesta a los 3 años (%)

FC precoz FC tardía FA (600 mg)

CB (600 mg)

0

25

50

75

100

47

20

4

24

6066

93

Frecuencia de resistencia a Imatinib a los 3 años

Perc

ent

Hochhaus and La Rosée Leukemia. 2004

Mas de 40 mutaciones diferentes se han descrito !

Mutaciones de Abl

Phospate-binding site

P-loop

Imatinib-binding site

Catalitic site Activation Loop

G250E

Q252R/HY253F/H

E255K/VT315I/S

F317L

M351T

E355G/DF359V/I

V379I

L387M/F

H396R/P

F311L/I

M343T

F382LS417Y/F

E459K/Q

V289A

D276GT277A

A380T

E279K

E281A/K

E292V

V299L

L364I

L384M

E453G/K

M244V

L248V

F486S

carboxy terminal

0123456789

10111213141516171819202122

no.

of m

utat

ions

M244

VL2

48V

G250

EQ2

52R/

HY2

53F/

HE2

55K/

VD2

76G

T277

AP2

96H

F311

L/I

T315

IF3

17L

M343

TM3

51T/

VE3

55G/

DF3

59V/

IV3

79I

A380

TF3

82L

L387

F/M

H396

R/P

S417

YE4

59K/

QF4

86S

(Soverini

et

al, Clin

Cancer

Res 2006)

7 mutaciones (M244V, G250E, Y253H, E255K, T315I, M351T, F359V) corresponden al 85% de todas las mutaciones asociadas a resistencia

Frecuencia de las mutaciones

P-loop

Nuevos Inhibidores

Se une a la conformación inactiva Se une a la conformación inactiva

Se une a la conformación activa e inactiva

Nilotinib

O'Hare et al. Cancer Res 2005

Dasatinib (BMS-354825) y Nilotinib (AMN107) son mas efectivos que Imatinib en inhibir la proliferación de células

Ba/F3 que presentan el gen Bcr-Abl o con mutaciones exceptuando la T315I

Copyright ©2005 American Association for Cancer Research

BCR-ABLImatinib IC50 (nM)

bioquimica celular

WT 300 260-500

M244V 380 2000

L248V n.a. 1500

G250E 1500 3900

Q252H n.a. 1200-2800

Y253F >5000 3475

Y253H >5000 >10000

E255K 2800 4400-8400

E255V >5000 >5000

D276G n.a. 1500

F311L 775 480

T315I >5000 >10000

F317L 900 810-1500

M351T 820 930

E355G n.a. 400

F359V 4700 1200

V379I 800 1630

A380T 340 2450

L387M 1500 1100

L387F n.a. 1100

H396P 340-800 850-4200

H396R 1950 1750

F486S 1230 2800

Mutaciones que pueden

superarse aumentando

dosis de Imatinib

P-LO

OP

ACT

IVATIO

N

LOOP

CATALY

TIC

DOM

AIN

BCR-ABLImatinib IC50 (nM)

biochemical cellular

WT 300 260-500

M244V 380 2000

L248V n.a. 1500

G250E 1500 3900

Q252H n.a. 1200-2800

Y253F >5000 3475

Y253H >5000 >10000

E255K 2800 4400-8400

E255V >5000 >5000

D276G n.a. 1500

F311L 775 480

T315I >5000 >10000

F317L 900 810-1500

M351T 820 930

E355G n.a. 400

F359V 4700 1200

V379I 800 1630

A380T 340 2450

L387M 1500 1100

L387F n.a. 1100

H396P 340-800 850-4200

H396R 1950 1750

F486S 1230 2800

P-LO

OP

ACT

IVATIO

N

LOOP

CATALY

TIC

DOM

AIN

Mutaciones que confieren una

gran resistencia a Imatinib

T315I- Mutación con mayor trascendencia clínica:

- Resistencia TOTAL a Imatinib- Resistencia a los nuevos inhibidores (Nilotinib y Dasatinib)

T315I

Como detectar las mutaciones ?

Goldman et al., Blood 2006

SECUENCIACIÓN DIRECTA

- Amplificación de BCR-ABL por PCR- 2ª Amplificación de ABL- Purificación producto de PCR- Reacción de secuenciación

Sensibilidad limitada 25-40%

Screening

Método de elección o estándar

100%T315I

50%T315I

25%T315I

10%T315I

5%T315I

1%T315I

Diluciones de Baf3-T315I en K562

DETECCIÓN DE LA MUTACION T315I MEDIANTE SECUENCIACIÓN

Cortesía de X. Agirre, A. Jiménez y J. Román.

T C A T T G A G TT C A C T G A G TCC C

T C A T T G A G TT C A C T G A G TCC C

T C A T T G A G TT C A C T G A G TCC C

T C A T T G A G TT C A C T G A G TCC C

T C A T T G A G TT C A C T G A G TCC C

T C A T T G A G TT C A C T G A G TCC C

PCR específica de secuencia (ASO-PCR)

CGTAGGTCATGAACTCAAGCATCCAGTACTTGAGTT …………………………………TGAGGTCTGACAGGTGTCGTA

ACTCCAGACTGTCCACAGCAT

BCR

ABLDISEÑO DE CEBADORES ESPECÍFICOS PARA LA SECUENCIA CON LA MUTACIÓN

Elevada Sensibilidad (1 / 100.000)

Falsos positivos en niveles altos de sensibilidad.

No Screening

semi-CUALITATIVA o CUALITATIVA

MUTACIÓN

Willis et al. Blood 2005

Pueden detectarse mutaciones antes del tratamiento con inhibidores pero no se correlaciona con resistencia clinica.

Debe realizarse el screening mutacional en pacientes no tratados?

NONO

El hecho que las mutaciones se detecten en una pequeña proporción de pacientes en RCC y que sean transitorias se considera UN TRABAJO INUTIL a no ser que haya un aumento de 10 veces en el nº de cópias del gen BCR-ABL.

Debe realizarse el screening mutacional en pacientes en RCC?

NONO

¿Cuándo realizar un estudio mutacional?

•NO es necesario al Diagnóstico

RESISTENCIA PRIMARIA•No respuesta hematológica a los 3 meses•No respuesta citogenética a los 12 meses (RMC, RCC)

RESISTENCIA ADQUIRIDA•Ante una pérdida de respuesta hematológica•Ante una pérdida de respuesta citogenética•¿Ante un incremento en los niveles de BCR-ABL?

•Según el grupo de Adelaida ante un > de 2 veces el valor anterior•Lo recomendable es ante un > de 10 veces (1 log) y esaconsejable demostrar el > en dos muestras consecutivas

•Progresión a FA o CB

Indicaciones para screening de mutaciones

Cuando debe realizarse el estudio mutacional?

Pacientes en la 2nda generacíon de TKIs:

•En TODOS los pacientes, el ESTUDIO MUTACIONAL deberia realizarse al inicio y a intervalos regulares para analizar la cinética de las mutaciones existentes o las que emergen de nuevo

Shah NP, Skaggs BJ, Branford S, Hughes TP, Nicoll JM, Paquette RL, Sawyers CL. Sequential ABL kinase inhibitor therapy selects for compound drug-resistant BCR-ABL mutations with altered oncogenic potency. J Clin Invest. 2007 Sep;117(9):2562-9.

• La cuantificación de la enfermedad residual y el estudio mutacional son herramientas básicas para realizar un tratamiento racional en los pacientes afectos de LMC.

• Casi la mitad de los pacientes que son resistentes a imatinib presentan mutaciones en el dominio kinasa ABL.

• Las mutaciones son responsables de >90% de resistencias y pueden beneficiarse del tratamiento con la 2nda generación de TKIs.

Conclusiones

Centros 46 laboratorios- Unificar la técnica de cuantificación del gen BCR-ABL mediante RQ- PCR.-Unificar el sistema deexpresar los resultados comoel ratio de copiasBCR-ABL/gen control %.-Detectar problemasmetodológicos.-Realizar un programa de control de calidad.

AGRADECIMIENTOS: Grupo de Biologia Molecular de la Asociación Española de Hematologia y Hemoterapia y NOVARTIS