pcr en tiempo real
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Mg.Sc. Blgo. LUIS GUZMÁN MASIASINSTITUO PERUANO DE BIOLOGÍA MOLECULAR
PCR en Tiempo Real
Uso de PCR en tiempo real en publicaciones indexadas
(Medline)
PCR1983 – 1985 : Reacción en cadena de la polimerasa
(PCR) Kary Mullis
Ventajas: Alta sensibilidad Alta especificidad Rapidez
Otras ventajas: • Detección a partir de cualquier muestra biológica
(sangre, piel, cabellos, saliva, líquido cefaloraquídeo, etc…)
• No es necesario que la muestra sea estéril • Detección de un patógeno en particular aún en
presencia de otros patógenos.
RT-PCR : detección de mRNA PCR-RFLP : polimorfismo genético RAPDs : amplificación con random primers - polimorfismo
PCR Nested : amplificación de una secuencia dentro de otra
previamente amplificada
PCR Multiplex: varios targets diferentes en forma simultánea
Inverted PCR: para conocer secuencias flanqueadoras Long PCR : amplificación de fragmentos grandes 10 -20 kb.
VARIANTES DE PCR
APLICACIONES DE PCR
Diagnóstico clínico
Monitoreo y Evaluación de terapia
Detección de cepas resistentes a antibióticos
Detección de mutaciones puntuales
Polimorfismo genético Filiación humana Medicina Forense Pedigrí animalControl de calidad
POR QUÉ PCR EN TIEMPO REAL ESTÁ DESPLAZANDO AL PCR ESTANDAR?
QUE VENTAJAS PRESENTA EL PCR EN TIEMPO REAL?
PCR Standard vs. PCR Tiempo Real
Análisis de punto finalDetección del producto por Electroforesis en gel
Análisis de la cinética de la reacción
Detección del producto en cada ciclo de la reacción
1. Compuestos fluorescentes: - compuestos que emiten fluorescencia cuando se unen a dsDNA - interacción inespecífica - Sybr green, EtBr,YOYO-1, entre otros… - Puede unirse a dimeros
2. Reporteros fluorescentes : - Sondas Taqman- Beacons moleculares- FRET
DETECCION DEL PRODUCTO EN CADA CICLO DE REACCION
SYBR Green
Absorbe a 480 nm, y emite a 520 nm.
Desventaja: se une a cualquier DNA de doble cadena de forma inespecífica (dímeros de primers y/o productos inespecíficos).
Beacons moleculares
El Fluoróforo emite señal cuando el agente bloqueador (Quencher) se encuentra alejado por efecto de la hibridación a la secuencia target
TaqMan PCR : generación de señal por hidrólisis de sonda.
FAM : maxima emisión a 535 nm
TAMRA : máxima absorción a 560nm
FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfer
HARDWARE & SOFTWARE
SOFTWARE
Ventajas del PCR en tiempo real
Simple y rápida (semi-automatizada).No hay manipulación post-PCR: disminuye el
riesgo de contaminación por amplicones.Cuantificación precisa del DNA o RNA inicial.Alta sensibilidad y especificidadDiscriminación de productos inespecíficos con la
opción “curva de desnaturalización” (Melt-Curve).Detección de más de un producto específico en una
misma reacción.
DETECCION DEL PRODUCTO EN CADA CICLO DE REACCION LO CUAL PERMITE UN ANALISIS DE LA CINETICA DE REACCION
• En teoría el Producto (P) se incrementa exponencialmente con el # ciclos (n).
• Depende del numero de copias templado iniciales (T)
P (2)nT
0
10
0 5 10 15 20
PCR
pro
duct
Cycle number
4T
2T
T
“FASE PLATEAU”
Sin embargo, reacciones con diferentes numero de copias iniciales llegan al mismo nivel de
“plateau”
El producto de PCR no siempre se duplica con cada ciclo.
E = eficiencia del PCR
– Generalmente la eficiencia es de 80-90%– Los productos pequeños se amplifican con
mayor eficiencia que los productos largos
PCR no es 100% eficiente
PT(1 E)n
EFECTO DE LA EFICIENCIA EN LA CANTIDAD DE PRODUCTO OBTENIDO
• Factores limitantes en la eficiencia del PCR:
- cantidad de cebadores disponibles
- actividad de la Taq DNA Polimerasa
• Plateau : no hay mayor incremento del producto
• PCR Standard: Análisis de punto final (End point detection) Detección al final del total de ciclos por electroforesis en gel (en fase plateau)
CANTIDAD DE DNA (escala aritmética) vs. NUMERO DE CICLOS
Los productos de amplificación no se detectan en los primeros ciclos porque están por debajo de la escala utilizada.Recién se observa la curva en los últimos ciclos hasta llegar a la fase de plateau.
CANTIDAD DE DNA (escala logaritmica) vs NUMERO DE CICLOS
Se observa diferencias ya desde los ciclos iniciales. Relación como línea recta al utilizar logaritmos, porque la amplificación por PCR es una reacción logarítmica.
Escala aritmética
La misma reacción de PCR en escala logaritmica - se aproxima a la gráfica teórica.
Según las curvas teóricas, se debe obtener una línea recta en la parte lineal de la reacción de PCR. En este caso entre ~20 a ~1500 unidades de fluorescencia arbitraria.
Analizando la misma región en una escala regular (aritmética), veremos que la parte lineal es la primera parte de la curva. IMPORTANTE: se debe examinar la reacción de PCR mientras se encuentra en la fase lineal.
Para cada muestra, el software determina en qué ciclo, el valor de la fluorescencia emitida cruza la linea arbitraria (Threshold). Este punto se denomina CT (Ciclo crítico / Threshold cycle). Este valor es inversamente proporcional a la cantidad inicial de moléculas específicas en la muestra original.
Valores de Threshold & CT
NTC:tubo control sin DNA templado
RUIDO
CONTROLES DE REACCION : ELIMINACION DE RUIDO
Es importante que el threshold este en la parte lineal de la reacción. Esto se ve mas facilmente en la grafica logaritmica.Aún cuando el threshold estará cerca al fondo de la curva regular, deberá ser lo suficientemente alto para que los valores de fluorescencia sean debido a la amplificación y no al ruido.
Grafica regular
Grafica semi-logaritmica
Cuantificación de DNA o cDNA (colocando diluciones de la misma muestra)
A menor concentración de la secuencia target en la muestra inicial, se necesitará mas ciclos para ser detectada, por lo tanto se obtienen valores de CT mayores para muestras mas diluidas
.
El Plot de valores Ct de las diluciones vs. concentración resulta en una gráfica lineal, y debe presentar un alto coeficiente de correlación (>0.990).
• Unión inespecífica de primers (mispriming): por unión de los primers a secuencias parcialmente complementarias presentes en el DNA o cDNAs de la muestra
• Dímeros : los primers pueden hibridarse entre ellos creando productos pequeños
PROBLEMAS
PRODUCTOS NO ESPECIFICOS (artefactos) : que pueden incrementar el valor de fluorescencia obtenida durante la reacción. Esto es mas frecuente cuando se utiliza SYBR-green.
CURVA DE DENATURACIONMuesta el perfil de denaturación de los productos amplificados.
(no se observan productos inespecíficos)
Una temperatura de denaturación diferente significa un producto diferente. Dímeros: menor temperatura de fusión.
dímeros
PCR en tiempo real
Detección y cuantificación utilizando reporteros fluorescentes.
Fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de producto del PCR.
Se puede realizar el análisis de varios targets a la vez (Multiplex) utilizando sondas marcadas con diferentes fluoróforos
• Controles• Problemas de Inhibición - falsos
negativos• Estándares internos (genes de
referencia, control interno, control de carga, triplicados)
• Optimización• Reproducibilidad• Validación• Personal• Costos
Otras consideraciones
APLICACIONES EN INVESTIGACION
DNA : - Identificación de genes de virulencia o de resistencia a drogas - Genotipificación de cepas o subespecies
- Detección de mutaciones puntuales - Estudio de de polimorfismos de un solo
nucleótido (SNPs) - Cuantificación del número de copias por célula, o determinación de células iniciales en una muestra.
RNA : - Detección de la expresión de genes - Efecto de mutaciones sobre la expresión - Análisis de mRNAs variantes producidos
por procesamiento diferencial - Cuantificación de la expresión
Detección de la expresión de genes (detección de mRNA)
Perfíl de expresión génica en diferentes tipos celulares en adultos o durante el desarrollo /diferenciación
Cambios en la expresión génica en condiciones patológicas
Expresión génica en respuesta a estímulos: hormonas, citoquinas, etc…
Expresión génica en respuesta a la presencia de antígenos de patógenos
Efecto de drogas sobre el perfíl de expresión
APLICACIONES AL DIAGNOSTICO CLINICO
Detección /Cuantificación / Genotipificación de patógenos: Virales (carga viral, carga pro-viral) Bacterianos Protozoarios Hongos
Diagnóstico temprano (pacientes asintomáticos)Detección de genes de resistencia – mejor elección de
terapiaMonitoreo de terapia (enfermedad residual - recaída)Detección de marcadores tumoralesEstado del desarrollo / progresión de la enfermedad
DETECCION DE SNPs o DE MUTACIONES PUNTUALES
Células Madre y su diferenciación a Linaje
Neuronal:
Ejemplo de Cuantificación Relativa
Modificaciones covalentes de las histonas nucleosómicas
ATP ADP
NUCLEOSOMA
La herencia epigenética es regula procesos como proliferación y diferenciación celular manteniendo estados transcripcionales
(Modificada de Mohrmann y Verrijzer 2005)
(Turner 2002)
Modificación de la cromatina por complejos multi-ptoteícos
que hidrolizan ATP
RNA interferencia
30 min en hielo y cultivo
Análisis de Melt
ACTINA OSA1
End-Point
Curva patrón BCR-ABLCurva patrón BCR-ABL
Segunda Derivada
CUANTIFICACION ABSOLUTA
Translocación (9,22)
Real Time PCRejemplo de detección en embarazadas a
partir de la sexta semana