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quantitative polymerase chain reaction
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La reacción en cadena de la polimerasa, cuyasiniciales en inglés son PCR ("polymerase chain
reaction"), es una técnica que fuedesarrollada por Kary Mullis a mediados delos años 80. Con esta metodología se puedenproducir en el laboratorio múltiples copias de
un fragmento de ADN específico, incluso enpresencia de millones de otras moléculas deADN.
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Es una variante de la reacción en cadena de lapolimerasa (PCR) utilizada para amplificar y
simultáneamente cuantificar de forma absolutael producto de la amplificación de ácidodesoxirribonucleico (ADN).Para llevar a cabo esta basado en la utilización
de otro fragmento de ADN (sonda)
complementario a una parte intermedia delADN que queremos amplificar.
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Esta sonda lleva adherida una moléculafluorescente y otra molécula que inhibe estafluorescencia ("quencher"), de tal forma quesólo cuando la sonda es desplazada de susitio por acción de la ADN polimerasa lamolécula fluorescente se libera de la accióndel "quencher" y emite fluorescencia al seriluminada con un láser.
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La PCR cuantitativa se realiza en untermociclador con capacidad de hacer incidirsobre cada muestra un haz de luz de unalongitud de onda determinada y de detectar
la fluorescencia emitida por el fluorocromoexcitado. Este termociclador es un aparatocon capacidad para calentar y enfriarrápidamente las muestras, de modo que se
aprovechen las cualidades fisicoquímicas delos ácidos nucleicos y las enzimáticas de laADN polimerasa.
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Podemos clasificar las técnicas de PCRcuantitativa según el empleo de fluorocromosno específicos o bien de sondas moleculares dependientes de la secuencia.
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En las técnicas basadas en fluorocromosinespecíficos se detecta la generaciónexponencial de ADN de doble cadenaempleando un fluorocromo que se uneinespecíficamente a aquél. Un ejemplo decolorante que permite esta detección es el
SYBR Green), que excitado mediante luz azul(λmax = 488 nm) emite luz verde (λmax = 522nm).
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Las técnicas basadas en sondas específicasutilizan al menos un oligonucleótido marcado
fluorescentemente. Típicamente esta sondaestá unida a dos fluorocromos e hibrida en lazona intermedia entre el cebador directo(forward ) y el inverso (reverse ); esto es, en el
amplicón. De este modo, cuando la sondaestá intacta, presentan una transferenciaenergética de fluorescencia por resonancia(FRET).
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Las sondas de hidrólisis, frecuentementeempleadas en esta técnica, sonoligonucleótidos que presentan fluorocromosen ambos extremos y tienen una secuencia
complementaria a parte del fragmento deADN que se quiere amplificar.
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Uno de los fluorocromos actúa como donadorde fluorescencia en el extremo 5’ y el otro
como aceptor de esta fluorescencia en elextremo 3’.
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La ADN polimerasa se desplaza sobre lacadena de ADN sintetizando la cadenacomplementaria a partir de un fragmento deADN que sirve de molde (cebador). Al llegar alpunto en el que la sonda se ha hibridado, lahidroliza. El fluorocromo del extremo 5’ de la
sonda (el donador) es liberado.
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El fluorocromo aceptor no puede entoncesabsorber la fluorescencia del donador por
estar alejado de él espacialmente. Un detectorrealiza la medida de esta emisión defluorescencia, que es proporcional a lacantidad de ADN presente, y la representa
gráficamente.
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