PCR a Tiempo Real o PCR PCR a Tiempo Real o PCR cuantitativa (Qcuantitativa (Q--PCR) para PCR) para medir la expresimedir la expresióón gn géénicanica

SERVICIO DE GENÓMICA Y PROTEÓMICAUNIDAD DE EXPRESIÓN GÉNICA

PCR a tiempo Real o PCR a tiempo Real o PCR cuantitativaPCR cuantitativa

La PCR a tiempo Real o PCR cuantitativa es una variación de la técnica PCR estándar que se emplea para la cuantificación tanto de DNA como de mRNA en una muestra (medida de la expresión génica)Utilizando primers específicos puede medirse el número de copias relativo de mRNA que contienen una muestra (RT-PCR para la medida de la expresión génica)

CuantificaciCuantificacióón del n del producto de PCRproducto de PCR

Teóricamente en cada ciclo se duplica la cantidad de producto: Producto (P) aumentaexponencialmente con el número de ciclosde PCR (n)El producto de PCR depende del númerode copias inicial del molde de cDNA (T)– Si partimos del doble de moléculas iniciales de

cDNA obtendremos el doble de productoP = (2)n T

RepresentaciRepresentacióón n grgrááfica de la PCRfica de la PCR

Visión lineal

Visión logarítmica

Elevada variabilidad

Detección PCR tradicional

Detección PCR tradicional

Elevada precisión

Elevada precisión

Problemas asociados Problemas asociados a la PCR tradicionala la PCR tradicional

Detección fase finalBaja resolución del gel de agarosa: no se pueden detectar pequeños cambios Procesamiento post-PCRTinción de bromuro de etidio no es muy cuantitativaPobre precisión y menor sensibilidad

Problemas asociados Problemas asociados a la PCR tradicionala la PCR tradicional

Misma cantidad de material de inicioda lugar a diferente cantidad de producto final

Diferente cantidad de material de inicio da lugar a la misma cantidad de producto final

SoluciSolucióón: PCR a n: PCR a tiempo realtiempo real

Detecta la acumulación de amplicón o producto durante la reacción.La detección se realiza por medio de la fluorescencia– El producto de PCR es marcado con un fluorocromo

reporter– La cantidad de fluorescencia es directamente

proporcional a la cantidad de producto– Se cuantifica la cantidad de fluorescencia en cada ciclo

y se representa una gráfica: fluorescencia vs. Ciclo PCR– El análisis de los datos y cuantificación de producto se

realiza en la fase exponencial de la PCR, elevada precisión.

Resultados de PCR a Resultados de PCR a tiempo realtiempo real

Fluo

resc

enci

a

Fluo

resc

enci

a

Umbral o Threshold

Valor CT

CT: Thresholdcycle o ciclo

umbral

Línea baseBaseline

Fluorescencia basal

Escala lineal

Escala logarítmica

DefinicionesDefiniciones

Línea Base o Baseline: Ciclos iniciales de PCR, donde no hay cambios significativos en la señal de fluorescencia. Determina la fluorescencia basal.Umbral o Threshold: Nivel determinado automáticamente o manualmente y fijado en la región exponencial de la gráfica de amplificación, por encima de la línea base, determina el nivel de fluorescencia significativamente superior a la fluorescencia basal. Se emplea para la determinación del Ciclo umbral o CT.CT: Ciclo umbral, ciclo en el que la fluorescencia de la muestra supera el umbral. Se calcula en escala logarítmica. El CT se emplea para la cuantificación relativa de la expresión génica.

AnAnáálisis de lisis de resultados o resultados o

cuantificacicuantificacióónnSe emplean muestras estándar, muestras con concentración conocida. En expresión génica se emplean diluciones seriadas de un cDNA de concentración conocida.Se determina el CT de las muestras estándar y de las muestras desconocidasSe realiza una curva estándar a partir de los datosde CT y concentración de las muestras estándar.Se calcula la concentración de las muestrasdesconocidas extrapolando el valor de CT de dichas muestras en la curva estándar.

AnAnáálisis de resultados: lisis de resultados: determinacideterminacióón de Cn de CTT y cuantificaciy cuantificacióónn

Determinación de CT en escala logarítmica(en verde, la curva de la muestra desconocida)

Fluo

resc

enci

a CT´s

Log [cDNA]

CT

valu

e

Curva estándar: generada a partir de los CT´s de las muestras estándar

Extrapolación de la concentración de cDNA a partir del valor CT de la muestra desconocida

VentajasVentajas de la PCR a de la PCR a tiempotiempo RealReal

Elevada precisión y exactitud en la cuantificación

VentajasVentajas de la PCR a de la PCR a tiempotiempo RealReal

Elevada sensibilidad (capaz de detectar 0.5 femtogramos de RNAr)Amplio rango dinámico lineal: 9-logs

QuQuíímica: tipos de mica: tipos de fluorocromosfluorocromos

Sondas especSondas especííficas ficas Basadas en la técnica FRET (fluorescenceresonance energy transfer)– Marcadas con dos fluorocromos, uno de elevada

energía (Reporter), y el otro de baja energía (Quencher)– Cuando ambos fluorocromos están cercanos, la energía

emitida por el Reporter es absorbida por el Quencher: No hay emisión de fluorescencia

– Cuando se separa el Reporter del Quencher éste no absorve energía y se detecta un aumento en la fluorescencia del Reporter

Sondas Sondas TaqManTaqMan

Amplicon

FRET

Amplicon

Emission

EXTENSION

ANNEALING

Excitation

5’-3’ exonuclease

Reporter

Quencher:

FRET

5’ Exonucleasa

: FAM o VIC

TAMRA

Sondas Sondas TaqManTaqManMGBMGB

R NFQ

MGB

NFQ: non-fluorescent QuencherMGB: Minor Groove Binder

MGB: Estabiliza los últimos 5-6 pb del extremo 3’•Sondas más cortas para la misma Tm

NFQ: no emite fluorescencia basal: menor background o ruido, mayor sensibilidad

FluorocromoFluorocromo no no especespecíífico: SYBR fico: SYBR

GreenGreenDesnaturalización

Hibridazión

Polimerización

La fluorescencia de SYBR Green es proporcional a la cantidad de producto

FluorocromoFluorocromo no no especespecíífico: SYBR fico: SYBR

GreenGreenProblemas: No es específico, se une a cualquier producto de doble cadena– Detección de productos inespecíficos– Detección de dímeros de primer

Solución:– Diseño muy estricto y cuidadoso de los primers– Optimización de la reacción PCR

Al finalizar la PCR hay que realizar una Curva de desnaturalización o disociación– Al desnaturalizar el producto disminuye la

fluorescencia

SYBR SYBR GreenGreen: curva : curva de disociacide disociacióónn

De esta manera se pude analizar si hay diferentes productos de PCR o inespecificidades, ya que cada tipo de amplicón tendráuna Tm diferente

Tm del amplicon o producto de PCR

SYBR SYBR GreenGreen: curva de : curva de disociacidisociacióónn

NTC: no template control: contiene todos los reactivos excepto el molde (cDNA o DNA): permite detectar la amplificación de dímeros de primer

Detección de productosinespecíficos

DiseDiseñño y Validacio y Validacióón de la n de la reaccireaccióónn

DiseDiseñño de o de primersprimers y y sondas especsondas especííficasficas

Existen múltiples programas informáticos y webs para el diseño de primers y sondas TaqMan

DiseDiseñño de sondas o de sondas especespecííficasficas

Tm : 8- 10 ºC superior a la Tm de los primersSondas TaqMan:– Máximo 30 pb de largo (si no, diseñar sondas MGB), mínimo 13

pb– Contenido GC 30-80%– Evitar runs de nucleótidos idénticos (>3), especialmente 4 o más G’s.– No G’s en el extremo 5’ (quencher)– Seleccionar la hebra que contenga más C’s que G’s

Diseñar primero la sonda y luego los primers, lo más cerca posible a la sonda, sin que se solapenSe recomiendan amplicones entre 50-150 pb

DiseDiseñño de los o de los primersprimers18-30 nucleótidosTm: 58-60ºCContenido GC: 30-80 %Evitar complementariedad interna y complementariedad entre los primers, especialmente en los extremos 3’Evitar runs de nucleótidos idénticos, especialmente 4 o más G’s.Los 5 últimos nucleótidos del extremo 3’ no deberían contener más de dos G y/o C’s.Cercanos a la sonda pero sin solapamiento

DiseDiseñño de los o de los primersprimers

Diseñarlos en las uniones exón-exón o en exones diferentes: no-coamplificación de DNA genómico contaminante– Si se desconoce la estructura exónica o se

trata de genes con un único exon: tratar la muestra de RNA con DNase RNAse-free

Verificar la especificidad de los primersutilizando herramientas como el Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)

ValidaciValidacióón de la n de la eficiencia de PCReficiencia de PCR

Unos resultados reproducibles requiere que la eficiencia de la PCR sea del 100 % (duplicación del producto en cada ciclo)

– T: cantidad de muestra inicial– P: producto– Si la eficiencia es 1 (100%): P = T (2)n

P = T(1 + E)n

Eficiencia de la PCREficiencia de la PCRLa realidad es que las eficiencias no son del 100%

CYCLE AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA100% EFFICIENCY 90% EFFICIENCY 80% EFFICIENCY 70% EFFICIENCY

0 1 1 1 11 2 2 2 22 4 4 3 33 8 7 6 54 16 13 10 85 32 25 19 146 64 47 34 247 128 89 61 418 256 170 110 709 512 323 198 11910 1,024 613 357 202

110

1001,000

10,000100,000

1,000,000

10,000,000100,000,000

1,000,000,00010,000,000,000

0 10 20 30

PCR CYCLE NUMBER

AM

OU

NT

OF

DN

A

100% EFF90% EFF80% EFF70% EFF

CCáálculo de la lculo de la eficiencia de PCReficiencia de PCR

Slope: -3.34

Eficiencia = [10 (-1/slope) ] - 1

E = 10 (-1/-3.34) – 1 = 10 0.30 – 1 = 1.995 – 1 = 0.995 = 99.5%

La eficiencia se calcula a partirde la pendiente(slope) de la curva estándar

CCáálculo de la lculo de la eficiencia de PCReficiencia de PCR

Stratagene Application Notes #10

Factores que afectan Factores que afectan a la eficiencia de a la eficiencia de

PCRPCRTamaño del amplicón: amplicones de menor tamaño tienen una eficiencia mayor– Recomendado: 50-150 pb. Para sondas TaqMan se recomiendan <

100 pb)Diseño de los primers: hibridación con secuencias inespecíficasContenido GCConcentración de reactivosPresencia de inhibidores – SDS >0.01 %, fenol >0.2%, etanol <1%, sod. Acetato >5mM, DTT

>1 mM, DMSO >5%

Factores que afectan Factores que afectan a la eficiencia de a la eficiencia de

PCRPCREstructura secundaria del amplicón.– Analizar la estructura secundaria con el servidor DNA mfold del

Dr. Michael Zuker u otro programa equivalente.http://frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/

La Tm de cualquier estructura secundaria debe ser inferior a 60ºCPara mejorar la eficiencia puede ser necesario que tengan que diseñarse los primers fuera de las regiones con estructura secundaria del amplicón. Esto también mejora la sensibilidad

Controles y Controles y replicadosreplicados

Siempre migrar replicados de las reacciones– Comenzar por triplicados. Desviación estándar entre

triplicados <0.30Migrar NTCs o No Template Control por cada ensayo (mezcla de PCR) o gen– Recciones sin muestra añadida– Dímeros de primer

Migrar controles RT minus– Muestras de RNA sin haber realizado la RT (no cDNA)– Amplificación de DNA genómico

CuantificaciCuantificacióón de la expresin de la expresióón n ggéénicanica

Cuantificación relativa

CuantificaciCuantificacióón n relativarelativa

Analiza los cambios de expresión del gen analizado de una muestra dada respecto a la expresión dicho gen en una muestra de referencia (calibrador)– Calibrador: muestra de referencia respecto a la

que se cuantifica los cambios de expresiónMuestra no tratada, t=0 de estimulación, muestra normal, sano, tejido de referencia, ratón salvaje, etc.

Control endControl endóógeno o geno o gen de referenciagen de referencia

Housekeeping genes o genes de mantenimiento, están presentes en todos los tipos celularesSu expresión se mantiene relativamente constante en las condiciones del ensayo

– Entre diferentes tejidos, durante el tratamiento o estimulación, etc.Sirve para corregir diferencias de expresión relacionadas con diferencias en la cantidad de RNA total de las muestrasNo existe un control endógeno perfecto para todos los tipos de experimentos. Cada investigador debe poner a punto cuál es el mejor control endógeno en sus condiciones experimentales, es decir, aquel que varíe lo menos posible en sus condiciones experimentales concretas. Es posible que para el mismo tejido pero diferentes condiciones o experimentos sean necesarios diferentes controles.Se recomienda testar varios controles endógenos.

Tipos de controles Tipos de controles endendóógenosgenos

Esta es una lista de los controles endógenos más utilizados– Beta-actina– GAPDH– Beta-2-microglobulina– TATA box binding protein (TBP)– Ciclofilina (varias tipos, mejor la ciclofilina B)– 18S rRNAs– Receptor de transferrina– HPRT– Ribosomal protein, large PO– Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2)– Factor de elongación 1 alpha

β-glucuronidasaPodría emplearse como control cualquier gen que se exprese en el tejido o tipo celular y que no varíe entre las condiciones experimentales a comparar.

CuantificaciCuantificacióón relativa n relativa en Real time PCRen Real time PCR

Tres métodos alternativos:Método de la curva estándar– Una curva estándar para cada gen, target y referencia– Ventaja: se puede aplicar cuando ambos genes tienen distintas

eficienciasMétodo del CT comparativo– La eficiencias del gen target y del control endógeno debes ser

comparablesMétodo Pfaff1 y el método E-Method, Roche– El cambio o fold-change del gen diana se “normaliza” frente al gen

referencia– Se puede aplicar cuando las eficiencias de ambos son diferentes.– Se incluye la eficiencia de cada gen en el cálculo– Se obtiene una gran reproducibilidad y exactitud con estos método

ComparaciComparacióón de n de eficienciaseficiencias

Si las eficiencias son distintas, la diferencia de CT (Δ CT)entre gen y control endógeno no son iguales para las distintas concentraciones de muestra (ΔCT vs. Log [RNA] slope > 0.1)

Si las eficiencias son comparables, la diferencia de CT (Δ CT)entre gen y control endógeno es constante para las diferentes concentraciones (Δ CT vs. Log [RNA] slope < 0.1)

Curvas estándar CT comparativoMétodo PffafI

MMéétodo del Ctodo del CTTcomparativocomparativo

MMéétodo del Ctodo del CTTcomparativocomparativo

Se normaliza la cantidad o CT del gen targetrespecto al gen referencia (ΔCT)Se comparan los ΔCT de cada muestra experimental o referencia (c) (ΔCT, r), con el ΔCT de la muestra calibrador (ΔCT, cb): ΔΔCTLa cantidad relativa en cada muestra viene definida por la siguiente fórmula

MMéétodo del Ctodo del CTTcomparativocomparativo

Muestra CT

c-mycCT

GAPDHΔCT

c-myc−GAPDHΔΔCT

ΔCT−ΔCT,cerebro2- ΔΔCT

C-myc relativo al cerebro

Cerebro: Calibrador

30.49 23.63 6.86 0.00

-2.50

-5.21

1.00

Riñon 27.03 22.66 4.37 5.66

Hígado 26.25 24.60 1.65 37.0

MMéétodo de las curvas todo de las curvas estestáándarndar

IL-1

Log [IL-1]

GAPDH

Log [gapdh]

R2 = 0.999Y = -3.488x + 39.04

R2 = 0.995Y = -3.33x + 37.21

Muestra [IL-1] [GAPDH] [IL-1][GAPDH]

[IL-1][GAPDH]

Cerebro: Calibrador

0.039 0.54 0.07 1.00

Riñon 0.41 1.02 0.40 5.7

Hígado 0.70 0.28 2.49 35.6

relativo al calibrador

MMéétodo todo PffafIPffafI

Etarget : eficiencia del gen diana o target (c-myc)Ereference: eficiencia del gen referencia o control endógeno (GAPDH)ΔCPtarget (control-sample): cambio en los valores de los ciclos umbral (CP = CT) del gen target entre la muestra calibradora (control) y la muestra referencia o experimental (sample)ΔCPreference (control-sample): cambio en los valores de los ciclos umbral (CP = CT) del control endógeno entre la muestra calibradora (control) y la muestra referencia o experimental (sample)