desarrollo de un mÉtodo de pcr mÚltiple en tiempo …

Profesor Patrocinante Dr. Alejandro J. Yáñez C. Instituto de Bioquímica Facultad de Ciencias

DESARROLLO DE UN MÉTODO DE PCR MÚLTIPLE EN TIEMPO REAL PARA LA DETECCIÓN DE PISCIRICKETTSIA

SALMONIS.

Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Licenciado en Bioquímica y Título Profesional de Bioquímico

PAULINA ANDREA CALQUÍN HEINSOHN

VALDIVIA – CHILE

2010

A mi hijo, por quien fue todo posible.

A mis padres, quienes a pesar de todo siempre me apoyaron.

A mis abuelos, por su amor incondicional.

AGRADECIMIENTOS

Agradezco a mis padres, Marcia y Guillermo, por su paciencia y el apoyo que me

entregaron durante todos los años de mi formación. A mi hijo Javier, quien a pesar de

ser tan pequeño ha entendido que la mamá tenía tanto que trabajar día y noche, él es

mi familia, mi fuerza y mi amor. Muchas gracias abuelos, Laly y Tata, que me acogieron

en los momentos más difíciles, gracias por regalarme mi segunda casa. Le agradezco a

mi hermano Coté, por todos los ciber problemas que me solucionó con gran paciencia,

a mis amigos incondicionales, Pamela, Jéssica, Vanessa y Marcos, quienes siempre

tuvieron una palabra de aliento cuando me sentía cansada o vencida. Siempre fue un

honor trabajar con el Dr. Alejandro Yañez, un hombre sabio y sensible, que siempre

tuvo tiempo para escucharme y apoyarme incondicionalmente. Le doy gracias además

por invitarme a aprender en su laboratorio desde que recién iniciaba mis estudios de

bioquímica y por creer en mí siempre. A la Dra. Cecilia Rauch le agradezco su calidez y

la tranquilidad que trajo a mi corazón. Quiero agradecerle a Claudio por su apoyo en la

realización de esta tesis. Es importante mencionar a mis compañeras de laboratorio y

amigas Romina y Karen, también a Eli, con las que pasamos largas horas conversando

de mi futuro, gracias por sus valiosos consejos. Sé que se me olvidarán muchas

personas importantes en este trabajo pero no quiero dejar de mencionar a todos los

docentes, estudiantes y personal no académico del Instituto de Bioquímica, que en

algún momento me entregaron tiempo, conocimiento, material y estímulo para lograr

finalizar este trabajo. Este trabajo fue realizado en el Laboratorio de Metabolismo y

Biotecnología del Instituto de Bioquímica de la Universidad Austral de Chile y fue

financiado Proyecto INNOVA 07CN13PPT-256.

i

INDICE GENERAL

Página

1. RESUMEN 1

1.1. Summary. 2

2. INTRODUCCIÓN 3

2.1. Septicemia Rickettsial Salmonídea (SRS). 3

2.2. Piscirickettsia salmonis. 3

2.3. Signos clínicos de la enfermedad. 4

2.4. Tratamiento. 5

2.5. Identificación y diagnóstico de P. salmonis. 6

3. MATERIALES Y METODOS 10

3.1. MATERIALES 10

3.1.1. Reactivos. 10

3.1.2. Kits. 11

3.1.3. Soluciones. 11

3.1.4. Instrumentos utilizados. 11

ii

3.2. METODOS 13

3.2.1. Diseño de partidores para amplificación de gen 23S del operón 13

ribosomal de P. salmonis.

3.2.2. Aislamiento de ADN genómico desde cultivo bacteriano mediante un 16

sistema comercial.

3.2.3. Cuantificación de ADN genómico. 16

3.2.4. Reacción de la polimerasa en cadena (PCR). 17

3.2.5. Análisis electroforético de productos de PCR en gel de agarosa. 17

3.2.6. Purificación de ADN desde gel de agarosa mediante un sistema 18

comercial.

3.2.7. Poliadenilación de productos de PCR purificados. 18

3.2.8. Ligación al vector de clonamiento pGEM-T Easy. 18

3.2.9. Transformación de Escherichia coli cepa JM 109 con el producto de 19

ligación y selección de clones.

3.2.10. Purificación de ADN plasmidial mediante un sistema comercial. 19

3.2.11. Cuantificación de ADN plasmidial. 20

3.2.12. Digestión del ADN plasmidial. 20

iii

3.2.13. Secuenciación parcial. 21

3.2.14. Diseño de partidores específicos para Hsp60 y Hsp70 de P. 21

salmonis y ARNr 23S de patógenos de salmones.

3.2.15. Aislamiento de ADN genómico desde tejido de salmón mediante 22

un sistema comercial.

3.2.16. PCR en tiempo real. 23

4.0. RESULTADOS 24

4.1. Aislamiento de ADN genómico de distintos aislados chilenos de 24

Piscirickettsia salmonis y patógenos de peces.

4.2. Análisis de la especificidad del sistema de detección por tiempo real 27

descrito para P. salmonis.

4.3. Clonamiento del gen 23S del operón ribosomal (ARNr 23S) de P. 30

Salmonis.

4.3.1. Amplificación mediante PCR en gradiente de secuencias parciales 31

del gen ARNr 23S de P. salmonis.

4.3.2. Clonamiento de secuencias parciales del gen ARNr 23S de P. salmonis 38

en el plásmido pGEM-T Easy en Escherichia coli JM109.

iv

4.3.3. Secuenciación del gen ARNr 23S de P. salmonis. 40

4.4. Diseño de partidores específicos para genes de P. salmonis y para un 43

gen conservado entre patógenos de salmones.

4.5. Análisis de la especificidad de los partidores diseñados para los genes 44

Hsp60, Hsp70 y ARNr 23S.

4.5.1. Selección de partidores para los genes Hsp60, Hsp70 y ARNr 23S. 47

4.5.2. PCR en tiempo real de los aislados de P. salmonis PPT-001, 3, 5 y 8, 51

además de patógenos de peces con partidores PS_1.





4.6. Estandarización de PCR múltiple para detección de P. salmonis. 60

4.7. Análisis de la especificidad del PCR múltiple generado para P. salmonis 64

4.7.1. PCR múltiple en tiempo real de distintos aislados chilenos de P. 64

salmonis.

v

4.7.2. Análisis de la especificidad del PCR múltiple en tiempo real diseñado 67

utilizando ADN de otros patógenos de peces.

4.7.3. PCR múltiple en tiempo real de peces control o infectados con P. 69

salmonis.

5. DISCUSIÓN. 71

6. BIBLIOGRAFÍA. 80

vi

INDICE DE FIGURAS

Página

Figura 1: Estrategia de amplificación por PCR y secuenciación del gen ARNr 15

23S de P. salmonis.

Figura 2: Electroforesis en gel de agarosa al 0,5% en buffer SB 1X de ADN 25

genómico extraído de distintos aislados chilenos de Piscirickettsia salmonis.

Figura 3: Electroforesis en gel de agarosa al 0,5% en buffer SB 1X de ADN 26

genómico extraído de aislados chilenos de Aeromonas hydrophila,

Flavobacterium psychrophilum, Edwarsiella ictaluri, Vibrio vulnificus,

Flavobacterium aquatile y Tenacibaculum maritimum.

Figura 4: PCR en tiempo real de Piscirickettsia salmonis aislados PPT-001, 28

3, 5 y 8 con partidores descritos por Karatas.

Figura 5: PCR en tiempo real de Aeromonas hydrophila, Flavobacterium 29

psychrophilum, Tenacibaculum maritimum con partidores descritos por

Karatas.

vii

Figura 6: Análisis electroforético en gel de agarosa 2% en buffer SB 1X de 32

productos de PCR en gradiente de secuencias parciales del extremo 5’ del

gen ARNr 23S de Piscirickettsia salmonis aislado PPT-001.

Figura 7: Análisis electroforético en gel de agarosa 1,5% en buffer TAE 1X 34

de productos de PCR en gradiente de secuencias parciales del extremo 3’

del gen ARNr 23S de Piscirickettsia salmonis aislado PPT-001.


de productos de PCR en gradiente de secuencias parciales de la región

central del gen ARNr 23S de Piscirickettsia salmonis aislado PPT-001.


de productos de PCR en gradiente de secuencias parciales de la región

central del gen ARNr 23S de Piscirickettsia salmonis aislado PPT-001.

Figura 10: Análisis electroforético de la digestión con EcoRI de los plásmidos 39

purificados conteniendo insertos de secuencias parciales del gen ARNr 23S

de Piscirickettsia salmonis aislado PPT-001.

Figura 11: Secuencia nucleotídica del gen ARNr 23S de P. salmonis. 41

viii

Figura 12: Confirmación de la amplificación del gen ARNr 23S de P. salmonis 42

mediante secuenciación

Figura 13: Comparación de la secuencia del par de partidores PS_1 con la 48

base de datos utilizando la herramienta BLAST.





Figura 16: PCR en tiempo real de P. salmonis aislados PPT-001, 3, 5 y 8 con 52

partidores PS_1.

Figura 17: PCR en tiempo real de P. salmonis PPT-001, A. hydrophila, F. 53

psychrophilum, E. ictaluri, V. vulnificus, F. aquatile y T. maritimum con

partidores PS_1.

Figura 18: PCR en tiempo real de P. salmonis aislados PPT-001, 3, 5 y 8 55

con partidores PS_5.



partidores PS_5.

ix

Figura 20: PCR en tiempo real de P. salmonis aislados PPT-001, 3, 5 y 8 58

con partidores PS_7.



partidores PS_7.

Figura 22: Electroforesis en gel de agarosa al 1,8% en buffer SB 1X de 62

productos de PCR de P. salmonis PPT-003.

Figura 23: PCR en tiempo real de P. salmonis aislados PPT-005 y 8, 63

además de T. maritimum con partidores PS_5 375nM, PS_7 62,5nM y

PS_1 375nM ó 187,5µM.

Figura 24: Curva de disociación de productos de PCR en tiempo real de 65

distintos aislados chilenos de P. salmonis con partidores PS_1 187,5nM,

PS_5 375nM y PS_7 62,5nM.

Figura 25: Electroforesis en gel de agarosa al 2% en buffer SB 1X de 66

productos de PCR en tiempo real de distintos aislados chilenos de P.

salmonis con partidores PS_1 187,5nM, PS_5 375nM y PS_7 62,5nM.

x

Figura 26: PCR en tiempo real de A. hydrophila, F. psychrophilum, E. 68

ictaluri, V. vulnificus, F. aquatile y T. maritimum con partidores PS_1

187,5nM, PS_5 375nM y PS_7 62,5nM.

Figura 27: PCR en tiempo real de riñón control e infectado con P. salmonis 70

con partidores PS_1 187,5nM, PS_5 375nM y PS_7 62,5nM.

xi

INDICE DE TABLAS

Página

Tabla I: Descripción partidores utilizados para realizar la secuenciación del 14

gen ARNr 23S de P. salmonis.

Tabla II: Resumen de valores de Tm extraídos de las curvas de disociación 45

de productos de PCR en tiempo real con partidores para detección y ADN

genómico de diferentes especies de patógenos de salmones.

Tabla III: Resumen de resultados de electroforesis de productos de PCR en 46

tiempo real con partidores para detección y ADN genómico de diferentes

especies de patógenos de salmones.

.

xii

LISTA DE ABREVIATURAS

ARNr ácido ribonucléico ribosomal.

DMSO dimetil sulfoxido.

Hsp heat shock protein.

LB Luria-Bertani.

Taq DNA polimerasa de Termophylus acuaticus.

Tm Temperatura de melting.

Tris-Base 2-Amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol.

X-GAL 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido.

T.m. Tenacibaculum maritimum.

A.h. Aeromonas hydrophila.

F.p. Flavobacterium psychrophilum.

V.v. Vibrio vulnificus.

F.a. Flavobacterium aquatile.

E.i. Edwarsiella ictaluri.

N.A. No presentó amplificación.

1

1 RESUMEN

La septicemia rickettsial salmonídea (SRS) es una enfermedad sistémica

producida por Piscirickettsia salmonis (P. salmonis), responsable de una alta mortalidad

en el cultivo de salmónidos en Chile. Por ello, su detección certera es necesaria para

decidir de la utilización de antibióticos como tratamiento. Existen diversos métodos de

PCR para el diagnóstico de P. salmonis que no han sido validados en Chile. Así, en

esta tesis se postuló desarrollar e implementar un kit de PCR múltiple en tiempo real

para la detección específica de P. salmonis. Se diseñaron partidores específicos a partir

de la secuencia de 3 genes de cepas de P. salmonis que afectan al cultivo nacional, los

que se combinaron en una única reacción de PCR múltiple. La especificidad del kit de

partidores se evaluó con muestras de ADN de 31 aislados diferentes de P. salmonis, de

seis distintos patógenos de salmones y de tejidos de peces control e infectados con P.

salmonis. Los resultados mostraron que los partidores utilizados en la industria poseen

alta sensibilidad y baja especificidad para P. salmonis, ya que reconocieron ADN de

otros patógenos. El patrón de amplificación del par de partidores control resultó positivo

con todas las muestras y los tres pares de partidores amplificaron tres fragmentos sólo

en muestras conteniendo ADN de P. salmonis, confirmando que los oligonucleótidos

diseñados para este kit de PCR presentan alta especificidad. Asimismo, los resultados

indican que este PCR múltiple en tiempo real permite la detección rápida y específica

de P. salmonis en órganos de salmón infectados con la bacteria. Estos datos nos

permiten concluir que el formato de PCR en tiempo real diseñado proporciona la

identificación más precisa y rápida de este patógeno tan diseminado en los cultivos del

salmón en Chile.

2

1.1 SUMMARY

Salmonid rickettsial septicemia (SRS) is a systemic disease caused by

Piscirickettsia salmonis (P. salmonis). In Chile, this pathology is responsible for high

mortality in salmon farming. A precise detection of the bacteria is a requisite to start the

antibiotic treatment. There are several PCR methods for the diagnostic of P. salmonis

but they have not been validated in Chile. In this thesis we postulated the development

and implementation of a multiplex real-time PCR kit for the specific detection of P.

salmonis. Specific primers were designed using the sequences of 3 genes from P.

salmonis strains that affect national farming, and they were combined in a single

multiplex PCR reaction. Primer specificity was evaluated using DNA samples from 31

different isolates of P. salmonis, from 6 different salmon pathogens, and from tissues of

control and P. salmonis-infected fishes. Results showed that primers commonly used in

the salmon industry present high sensitivity but low specificity for P. salmonis, since they

recognized DNA from other pathogens than P. salmonis. The amplification pattern of

individual genes showed that positive amplification is obtained with control primers in all

samples but the 3 set of primers from the kit only amplified samples with P salmonis

DNA, confirming that the primers designed for the PCR kit display high specificity.

Moreover, the results show that this multiplex real-time PCR kit permit the rapid and

specific detection of P. salmonis in salmon tissues infected with the bacteria.

These data allow us to conclude that the designed format of real-time PCR is the faster

and more precise way to identify this pathogen which affects salmon farming in Chile.

3

2 INTRODUCCIÓN

2.1 Septicemia Rickettsial Salmonídea (SRS).

La septicemia Rickettsial Salmonídea (SRS) o piscirickettsiosis es una

enfermedad sistémica producida por la bacteria intracelular Piscirickettsia salmonis (P.

salmonis), la cual es responsable de la alta mortalidad en la industria de cultivo de

especies salmonídeas en Chile (Branson y Nieto, 1991; Fryer et al., 1990; Lannan and

Fryer, 1993). Los primeros brotes de piscirickettsiosis en Chile se presentaron a fines

del año 1989, aunque se ha sugerido que ésta habría estado presente desde 1981

(Bravo y Campos, 1989). Inicialmente se describió sólo en salmón Coho (¨Síndrome del

salmón Coho¨), pero pronto fueron afectadas todas las especies salmonídeas cultivadas

en Chile, llegando a producir hasta un 90% de mortalidad en algunos centros de cultivo

(Bravo y Campos, 1989; Cvitanich et al., 1991). En 1990 se aisló el organismo desde

una línea celular de embrión de salmón Rey y fue clasificado como una rickettsia (Fryer

et al., 1990). La patogenicidad de este organismo fue confirmada en 1991 por el

cumplimiento de los postulados de Koch (Ingraham and Ingraham 1998). El aislado

Chileno ha sido clasificado como Piscirickettsia salmonis, un nuevo género de rickettsia

y especie (Fryer et al., 1992).

2.2 Piscirickettsia salmonis.

El agente etiológico corresponde a un microorganismo Gram negativo, inmóvil,

no encapsulado, pleomórfico, habitualmente cocoide, en pares o en forma de anillo, de

tamaño variable entre 0,5-1,5µm de diámetro (Fryer et al., 1990; Cvitanich et al., 1991).

4

En frotis de sangre y tejidos la bacteria se tiñe con hematoxilina-eosina (HE),

Giemsa y azul de metileno (Bravo y Campos, 1989; Cvitanich et al., 1991),

observándose dentro de vacuolas citoplasmáticas rodeadas por una membrana (Fryer

et al., 1990; Cvitanich et al., 1991), en forma esparcida o agrupaciones que le dan un

aspecto de mórula (Cvitanich et al., 1991). Mediante microscopía electrónica se ha

observado que esta bacteria posee dos membranas en su superficie, una externa

ondulada y una interna citoplasmática, lo que es característico de agentes rickettsiales

(Fryer et al., 1990). Además, posee estructuras similares a ribosomas cerca de la

membrana plasmática, un ADN fibrilar en la región central y estructuras esféricas

electro densas (Fryer et al., 1990; Cvitanich et al., 1991). P. salmonis es capaz de

infectar los salmones Coho (Oncorhynchus kisutch), Atlántico (Salmo salar), y Rey

(Oncorhynchus tshawytscha), así como también para la trucha arco iris (Oncorhynchus

mykiss) (Garcés et al. 1991), sin embargo el salmón Coho parece ser más susceptible a

SRS que el salmón Atlántico (Mauel and Miller, 2002).

2.3 Signos clínicos de la enfermedad.

Los signos clínicos externos de SRS incluyen coloración corporal oscura y

acentuada palidez branquial consecuencia de anemia severa (Bravo y Campos 1989),

marcada exoftalmia bilateral, masas eritematosas, erosiones cutáneas, pequeñas

manchas blancas, úlceras y extensas áreas descamadas (Larenas et al., 1995).

Internamente se observa necrosis severa, decoloración, aumento de tamaño e

inflamación del riñón hematopoyético y bazo (Garcés et al. 1991), grave nefritis

intersticial crónica con vasculitis y degeneración tubular secundaria. El hígado está

5

aumentado de tamaño, con presencia de nódulos subcapsulares de color blanco a

amarillento, presentando hepatitis necrotizante crónica grave con fibrosis (Fryer and

Hedrick, 2003). Además, presenta estomatitis ulcerativa grave, hemorragias internas,

miocarditis necrotizante crónica severa y miositis poligranulomatosa; en el bazo se

observa coagulación intravascular diseminada con trombos de fibrina, el tubo digestivo

se encuentra sin contenido presentando petequias y el estómago contiene un líquido

transparente seromucoso (Bravo y Campos, 1989; Larenas et al., 1995; Cvitanich et al.,

1991).

2.4 Tratamiento.

Se ha demostrado que los alevines infectados no presentan signos de la

enfermedad pero son capaces de excretar el agente por vía fecal (Larenas et al., 2005).

Buenas prácticas de cultivo, como el mantenimiento de peces separados por edad y por

especie son medidas prácticas para reducir la prevalencia de infección en la industria

en Chile.

Recientemente el SRS ha sido parcialmente controlado a través del uso de

antibióticos que no son totalmente eficaces y tienen problemas derivados de su

toxicidad y la generación de resistencia. La eficacia del tratamiento antibiótico para SRS

es baja debido a la naturaleza intracelular de P. salmonis, de este modo se hace difícil

el manejo de esta enfermedad (Lannan et al. 1993). En la actualidad no existen

vacunas eficaces disponibles para el control de P. salmonis (Wilhelm et al., 2005).

6

2.5 Identificación y diagnóstico de P. salmonis.

Para el diagnostico preliminar de P. salmonis se utilizan diferentes tinciones,

como naranja de acridina, Gram y azul de toluidina (Fryer et al., 1990; Cvitanich et al.,

1991, Lannan et al., 1991, Larenas et al., 1995), siendo poco sensibles e inespecíficas.

La confirmación de piscirickettsiosis se realiza por métodos serológicos utilizando la

técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFAT) (Lannan et al., 1991; Larenas et al.,

1996) y ELISA (Aguayo et al., 2002; Jamett et al., 2001).

La detección de P. salmonis por métodos microbiológicos requiere de un largo

cultivo celular en CHSE214 o SHK-1 sin antibióticos, debido a su sensibilidad a ellos in

vitro (Fryer and Hedrick, 2003), con el consecuente peligro de contaminación. Por esta

razón se comenzó a detectar la presencia de P. salmonis por PCR anidado, en el cual

se realiza una primera amplificación utilizando partidores generales que amplifican el

gen 16S del operón ribosomal (ARNr 16S) bacteriano y partidores específicos para P.

salmonis en la segunda reacción.

Estos fragmentos de ADN son identificados sólo por tamaño mediante

electroforesis en gel, para la confirmación parcial se debe realizar digestión con

enzimas de restricción y una nueva electroforesis. Para obtener confirmación adicional

del aislamiento es necesario secuenciar o realizar southern blot (Mauel et al., 1996). Sin

embargo se ha utilizado el gen ARNr 16S para identificar pequeñas diferencias

específicas en la secuencia de cepas distintas mediante la amplificación por PCR y su

posterior secuenciación, basado en el grado de variación que este gen posee (Reid et

al., 2004).

7

Se ha descrito también la detección temprana de P. salmonis a partir de suero de

peces asintomáticos por medio de PCR utilizando partidores específicos dirigidos a

secuencias del espaciador interno del transcrito (ITS) y la región flanqueante del gen

23S del operón ribosomal (ARNr 23S), cuya secuencia provee discriminación fina en la

descripción de nuevos aislados de P. salmonis (Marshall et al, 1998).

PCR semi-cuantitativos y cuantitativos de punto final para la detección de P.

salmonis permiten determinar el producto de la amplificación luego de alcanzada la fase

de saturación de la reacción. Sin embargo la cantidad de producto de amplificación

obtenido no suele guardar mucha relación con la concentración inicial de ADN en la

muestra. Además se requiere de electroforesis, que agrega tiempo al análisis y puede

generar contaminación. A esto se suma el aumento del error en la cuantificación, pues

la densitometría de los geles es limitada en su rango dinámico y de sensibilidad.

(Higuchi et al. 1993, Heid et al., 1996).

En contraste, la técnica de PCR en tiempo real permite cuantificar productos

luego de cada ciclo de amplificación, elimina análisis posteriores, requiere menos

tiempo y manipulación durante su realización y ha mostrado ser preciso y exacto.

Además, al ser un sistema cerrado, el riesgo de contaminación disminuye de forma muy

significativa, permite cuantificar la concentración inicial de ácido nucleico presente en

las muestras de manera mucho más sencilla, más precisa y sobre todo en un rango

mucho mayor que en los procedimientos convencionales (Wittwer et al., 2001). De

echo, un ensayo de PCR en tiempo real fue diseñado para la detección específica de P.

salmonis, cuya implementación permite un diagnóstico rápido y seguro de

piscirickettsiosis (Karatas et al., 2008).

8

Se han desarrollado ensayos de PCR para la identificación de microorganismos,

utilizando como blanco varios genes simultáneamente en un formato múltiple, es decir

utilizando más de un set de partidores en la misma reacción (Bej et al., 1999; Kaufman

et al., 2002) y se ha podido detectar múltiples microorganismos, utilizando PCR en

tiempo real dúplex con SYBR Green I (Fukushima et al., 2003).

En la actualidad se utilizan ensayos de PCR tiempo real para la detección de P.

salmonis, los que son altamente sensibles pero se observa reacción cruzada con otros

patógenos. Lo anterior se debe a que los genes blanco utilizados son muy conservados

entre diferentes especies bacterianas. Por esto nos propusimos aumentar la

especificidad de detección de P. salmonis mediante el diseño de un PCR múltiple en

tiempo real.

En base a estos antecedentes, se postuló la siguiente hipótesis: El desarrollo de

un PCR múltiple en tiempo real para P. salmonis permitirá la detección específica

y sensible de este patógeno en órganos de salmón.

9

OBJETIVO GENERAL

Desarrollar e implementar un método de PCR múltiple en tiempo real para la

detección específica de P. salmonis en muestras de salmones infectados con

SRS.

OBJETIVOS ESPECIFICOS

1. Secuenciar el gen ARNr 23S de P. salmonis.

2. Analizar las secuencias de los genes Hsp60, Hsp70 y ARNr 23S de P.

salmonis y compararlas con las de otras bacterias que provocan

enfermedades en peces.

3. Diseñar sondas específicas para los genes Hsp60, Hsp70, ARNr 23S de P.

salmonis.

4. Desarrollar e implementar un kit de PCR múltiple en tiempo real altamente

específico para la detección de P. salmonis en muestras de salmones.

10

3 MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 MATERIALES

3.1.1 Reactivos

BioLabs: Gel loading dye blue 6X, 50 bp DNA Ladder, 100 bp DNA Ladder, 1 kb DNA

Ladder.

Calbiochem: Ácido etilendiaminotetraacético sal disódica dehidrato (grado biología

molecular).

Fermentas: X-GAL.

Gibco: Ampicilina.

HYCLONE: Agua HyPure (grado biología molecular).

Integrated DNA Technologies (IDT): Síntesis de Partidores.

Invitrogen: 100 bp DNA Ladder, SYBR Safe DNA gel stain 10000X concentrate in

DMSO.

LONZA: Agarosa (Sea Kem LE agarosa para electroforesis en gel).

Merck: Ácido clorhídrico (1N), Ácido acético glacial 100% (para análisis), Agar-agar

(granulado, purificado y exento de inhibidores para microbiología), Cloruro de calcio

dihidrato (para análisis), Cloruro de sodio (para análisis), Cloruro de potasio (para

análisis), Etanol absoluto (para análisis), Glicerol 85% (para análisis), Hidróxido de

sodio (1N).

MoBio laboratories: Medio LB Broth.

Omega Bio-Tek: Desoxinucleótidos trifosfato.

Promega: Escherichia coli cepa JM 109.

11

Sigma Chemical: Isopropil-β-D-tio-galactósido (IPTG).

USBiological: Cloruro de sodio (grado biología molecular), Cloruro de potasio (grado

biología molecular), Fosfato ácido disódico (grado ACS), Tris-Base USP.

Winkler: Marcador de DNA escala 1 Kb.

3.1.2 Kits

Agilent: 2X Brilliant II SYBR Green QPCR master mix.

E.Z.N.A: E.Z.N.A.Plasmid Miniprep Kit I, E.Z.N.A. Eazy Nucleic Acid Isolation Gel

Extraction Kit, E.Z.N.A. tissue DNA Kit.

Promega: pGEM-T Easy vector system, EcoRI (3U/µl), GoTaq Flexi DNA polymerase.

3.1.3 Soluciones

Agar LB: 25g de LB Broth, 15g de agar-agar en 1L de agua ultra pura, autoclavado 20

minutos a 120ºC.

SB 1X: 0,4 g hidróxido de sodio en 1L de agua ultra pura pH final 8,0 ajustado con ácido

bórico.

TAE 1X: 0,968g Tris-base, 0,204 ml ácido acético glacial, 0,4ml EDTA 0,5M pH 8,0 en

1L de agua ultra pura.

3.1.4 Instrumentos utilizados.

-Agitador magnético, BARNSTEAD THERMOLYNE Nuova Stirrer.

-Agitador orbital termorregulado, Heidolph polymax 1040.

-Autoclave, MARKET FORGE STERILMATIC.

12

-Balanza analítica RADWAG AS310/C/2.

-Balanza RADWAG WTB 200.

-Baño termorregulado, Memmert.

-Cámara de electroforesis, Bio-Rad wide mini-sub cell GT, Bio-Rad mini-sub cell GT.

-Cámara de PCR, BIOAIR AuraPCR, Escoclass II BSC Airstream.

-Centrífuga, Eppendorf centrifuge 5810 R.

-Destilador de agua, THERMO SCIENTIFIC BARNSTEAD MEGA-PURE STILL MP-11.

-Espectrofotómetro, Thermo scientific Evolution 60.

-Estufa de cultivo, Memmert.

-Fuente de poder, Bio-Rad PowerPac Basic.

-Microcentrífuga, Heahrow scientific sprout, Hettich, Heraeus BIOFUGE Fresco,

Sigma.

-Microondas, Somela fancy WT 1700.

-Micropipetas, Gilson pipetman, Accubiotech primepet.

-NanoDrop 2000 SPECTROPHOTOMETER, Thermo SCIENTIFIC.

-pHmetro, WTW inolab pH720.

-Purificador de agua, ELGA PURELAB Option.

-Sistema de documentación de geles, VILBER LOURMAT DOC-PRINT HOOD-DP-

CF-011.C.

-Termociclador PCR tiempo real, STRATAGENE Mx 3000P.

-Termocilador, Axygene Maxygene.

-Vórtex, mrc VM-2000.

13

3.2 MÉTODOS

3.2.1 Diseño de partidores para amplificación de gen 23S del operón ribosomal de

P. salmonis. A partir de las secuencias nucleotídicas del gen ARNr 23S y la región

intergénica del operón ribosomal de Legionella pneumophila (gi 54295983, gi

148358139, gi 52840256, gi 52840256, gi 54292964), Francisella tularensis (gi

56707187, gi 110669657), Pseudomonas stutzeri (gi 2244673, gb U65012.1), las

secuencias parciales del gen ARNr 23S de Piscirickettsia salmonis de las cepas SBPLO

(gb AY607585.1), ATL-4-91 (gb U36945.2), EM90 (gb AF205384.1), LF89 (gb

AF205383.1) y AL10015 (gb EU289216.1), todas presentes en la base de datos del

National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), se

diseñaron partidores heterólogos (Tabla I) dirigidos a las regiones más conservadas.

Para el diseño se realizó un alineamiento múltiple de los genes de estas especies

emparentadas con P. salmonis, utilizando el software disponible en la red

(http://www.ebi.ac.uk/clustalw). De esta manera se planteó la estrategia de

secuenciación para obtener el gen ARNr 23S de P. salmonis que se observa en el

esquema mostrado en la Figura 1.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

http://www.ebi.ac.uk/clustalw

14

Tabla I. Descripción partidores utilizados para realizar la secuenciación del gen ARNr

23S de P. salmonis.

Tipo de Partidor Nombre Secuencia nucleotídica 5`- 3`

Específico sentido 23Sf GAT GAA ACA AGA GTA GGT CGG G

Heterólogo sentido 300AF CAT ACG GTG GAT GCC TTG

Heterólogo antisentido 300AR GCA GGC CGA CTC GAC TAG T

Heterólogo sentido 300BF GGG AAC TGA AAC ATC TAA GTA CCC

Heterólogo antisentido 300BR CCC TAG CCG AAA CAG TGC T

Heterólogo sentido 800f CAA ACT CGG AGA TAG CTG GTT C

Heterólogo antisentido 1500Rb TCGTCATCAGCTCTCAGCAT

Heterólogo sentido 1600F GGT AGA GAA TAC CAA GGC GC

Heterólogo antisentido 1700r CCT TCT CCC GAA GTT ACG GT

Heterólogo antisentido 2700pbR ACA ACC CGA ACA CCA GAG G

Heterólogo antisentido 2900pbR GGT CAA GCC TCA CGG GCA ATT AG

15

800f

1200pb

2900

Gen 23S Legionella sp.ITS

300BF300BR

685pb

300AF

300AR

1094pb

2900pbR

1600F2700pbR

1000pb

1300pb

1600F

23Sf1500Rb

800pb 1700r

2783

1 2

3800f

1200pb

2900


300BF300BR

685pb

300AF

300AR

1094pb

2900pbR

1600F2700pbR

1000pb

1300pb

1600F

23Sf1500Rb

800pb 1700r

2783

800f

1200pb

2900


300BF300BR

685pb

300AF

300AR

1094pb

2900pbR

1600F2700pbR

1000pb

1300pb

1600F

23Sf1500Rb

800pb 1700r

2783

800f

1200pb

2900


300BF300BR

685pb

300AF

300AR

1094pb

2900pbR

1600F2700pbR

1000pb

1300pb

1600F

23Sf1500Rb

800pb 1700r

2783

800f800f

1200pb

2900


300BF300BR

685pb

300AF

300AR

1094pb

2900pbR

1600F2700pbR

1000pb

1300pb

1600F

23Sf1500Rb

800pb 1700r

2783

2900

Gen 23S Legionella sp.ITS Gen 23S Legionella sp.Gen 23S Legionella sp.ITS

300BF300BR

685pb

300BF300BF300BR300BR

685pb

300AF

300AR

1094pb

300AF300AF

300AR300AR

1094pb

2900pbR

1600F2700pbR

1000pb

1300pb

1600F2900pbR2900pbR

1600F1600F2700pbR2700pbR

1000pb

1300pb

1600F1600F

23Sf1500Rb1500Rb

800pb 1700r1700r

2783

1 2

3

Figura 1. Estrategia de amplificación por PCR y secuenciación del gen ARNr 23S

de P. salmonis. El gen ARNr 23S de Legionella sp. tiene un tamaño de 2783 pb. Las

flechas indican las regiones donde se diseñaron partidores en las secuencias más

conservadas luego de realizar el múltiple alineamiento con bacterias Gram negativas

patógenas para salmones filogenéticamente cercanos a P. salmonis. En corchetes se

describe los productos esperados luego de la amplificación por PCR.

16

3.2.2 Aislamiento de ADN genómico desde cultivo bacteriano mediante un

sistema comercial. El cultivo líquido bacteriano se centrifugó a 5000 xg por 10

minutos, luego se resuspendió el sedimento celular, o directamente la masa celular

cosechada desde cultivo en placa, en 200 μl de Buffer TL, se agregaron 25 μl de OB

Protease reconstituida y se homogeneizó en vórtex. Se agregaron 225 μl de Buffer BL,

se mezcló en vórtex y se incubó a 65ºC por 10 minutos. Posteriormente, se agregaron

225 μl de etanol absoluto y se mezcló suavemente en vórtex. En paralelo, se insertó

una mini columna Hi-Bind DNA en un tubo colector de 2 ml y se equilibró con 100 de

Equilibration Buffer. Luego de centrifugar la columna vacía a ≥10000 por 1 minuto, se

transfirió la muestra completa a la columna y se centrifugó a 10000 xg por 1 min. El

filtrado se eliminó. Se agregaron 500 μl de Buffer HB y se repitió la centrifugación

anterior. Luego la columna se lavó con 700 μl de DNA Wash Buffer y se centrifugó. Se

agregaron 400 μl más de DNA Wash Buffer y se centrifugó a 10000 xg por 3 minutos.

Finalmente, la columna se insertó en un tubo estéril de 1,5 ml y se agregaron 150 μl de

Elution Buffer preincubado a 70ºC. Se incubó 2 minutos a temperatura ambiente y se

centrifugó a 10000 xg por 1 minuto.

3.2.3 Cuantificación de ADN genómico. La cuantificación de ADN genómico obtenido

como se describió en la sección 3.2.2 se realizó mediante el registro de la absorbancia

a 260 nm de 2 µl de la preparación de ADN, utilizando el equipo NanoDrop. Se

consideró que una unidad de absorbancia equivale a 50 ng/µl de ADN doble hebra. El

cálculo final lo realiza el software NanoDrop2000 incorporado al equipo (Sambrook et

al., 2001).

17

3.2.4 Reacción de la polimerasa en cadena (PCR). Se amplificaron fragmentos de las

secuencias Hsp60, Hsp70 y 23S del operón ribosomal utilizando partidores diseñados

para clonamiento o detección. Para las reacciones de PCR se utilizaron 4 μl de MgCl2

25 mM, 2 μl de dNTPs (10 mM c/u), 5 μl de 5X Green Go Taq Flexi Buffer, 0,2 μl de Go

Taq Flexi DNA polimerase (5U/μl), 1 μl de cada partidor (25 μM), 9,8 μl de agua HyPure

grado biología molecular y 2 μl de ADN o agua HyPure grado biología molecular (como

control negativo) y se homogenizó en vórtex. El programa de amplificación consistió de

una primera etapa de denaturación a 95ºC por 5 minutos, una segunda fase de 30

ciclos de: 45 segundos de denaturación a 94ºC, 1 minuto de alineamiento a 45-66,9ºC y

45-90 segundos de extensión a 72ºC además de un ciclo de extensión final de 7

minutos a 72ºC (Sambrook et al., 2001).

3.2.5 Análisis electroforético de productos de PCR en gel de agarosa. Los geles se

prepararon pesando la cantidad necesaria de agarosa en polvo, se agregó el volumen

necesario de buffer TAE 1X o SB 1X, se fundió en microondas, se agregó el volumen

necesario de SYBR SAFE 10000X para obtener concentración 1X, y la mezcla

resultante se enfrió y gelificó. Se cargaron 5-10 μl de producto de PCR y 7 μl de

marcador de tamaño molecular de ADN, de escala 50 pb, 100 pb o de 1 Kb. La corrida

electroforética se llevó a cabo en el mismo tampón en que se preparó el gel de agarosa,

aplicando una corriente de 100 V durante 30-50 minutos o 70 V por 45 min. Finalmente,

las bandas se visualizaron en un transiluminador y las imágenes fueron capturadas

utilizando un sistema de documentación de geles (Sambrook et al., 2001).

18

3.2.6 Purificación de ADN desde gel de agarosa mediante un sistema comercial.

Luego de realizada la electroforesis en las condiciones ya descritas, se cortó con bisturí

el trozo de gel que contenía la banda de interés y se introdujo en un tubo de

microcentrífuga de 1,5 ml. Se agregó 1 ml de Binding Buffer XP2 por gramo de gel y se

incubó a 65˚C para fundir el gel. La mezcla de ADN/agarosa se cargó en una

minicolumna Hi-Bind DNA inserta en un tubo colector y se centrifugó a 10000 xg por 1

minuto. Se agregaron 300 µl de Binding Buffer XP2 y se repitió la centrifugación

descrita. Luego, se agregaron 700 µl de SPW Wash Buffer, se repitió la centrifugación

descrita, y además se centrifugó la columna vacía a ≥13000 xg por 2 minutos. Se

insertó la columna en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, y el ADN se eluyó

agregando 40 µl de agua HyPure, grado biología molecular. Se incubó a temperatura

ambiente 1 minuto y se centrifugó 1 minuto a ≥13000 xg.

3.2.7 Poliadenilación de productos de PCR purificados. Se agregaron 30 μl de

producto de PCR purificado, 10 μl de 5X Colorless GoTaq Flexi Reaction Buffer, 0,5 μl

de Go Taq FlexiDNA Polymerase (5U/ μl), 2 μl de dATP 10 mM, 1 μl de MgCl2 25 mM y

6,5 μl de agua HyPure, grado biología molecular, para completar un volumen total de 50

μl. Se incubó por 30 minutos a 72ºC.

3.2.8 Ligación al vector de clonamiento pGEM-T Easy. La ligación del amplicón al

vector se realizó en una mezcla conteniendo 1 μl de vector pGEM-T Easy (50 ng/ μl), 5

μl de 2X Rapid Ligation Buffer T4 DNA Ligase, 1 μl de T4 DNA ligase (3U/ μl) y 3 μl de

producto de PCR poliadenilado (volumen final de 10 μl). Se incubó a 4°C toda la noche.

19

3.2.9 Transformación de Escherichia coli cepa JM 109 con el producto de ligación

y selección de clones. Una alícuota de 30 μl de Escherichia coli cepa JM 109

competentes se descongeló en hielo, se agregó el producto de ligación (10 µl) y se

incubó por 20 minutos en hielo agitando suavemente cada 5 minutos. Se realizó una

incubación a 42˚C por 45 segundos y se incubó en hielo por 2 minutos. Luego, se

inoculó 1 ml de medio LB con la totalidad de la suspensión bacteriana y se incubó a

37˚C con agitación constante de 250 r.p.m. por 90 minutos. Posteriormente, se

centrifugó a 4500 xg por 5 minutos, se eliminaron 900 μl del sobrenadante y el

sedimento celular se resuspendió en el volumen de medio restante. Finalmente, esta

suspensión se sembró en placa de LB-agar más ampicilina 50 μg/ml con 7 μl de IPTG

1M y 16 μl de X-Gal 50mg/ml. Se incubó a 37ºC por 16 horas. Para seleccionar los

clones positivos, se inocularon 3 réplicas de 5 ml de medio LB-ampiclina 50 μg/ml con 3

diferentes colonias de color blanco. El cultivo se incubó 12 a 16 horas a 37ºC, con

agitación constante de 250 xg (Ausubel et al., 1992).

3.2.10 Purificación de ADN plasmidial mediante un sistema comercial. El cultivo

bacteriano en LB-ampicilina de la sección 3.2.9 se centrifugó a 10000 xg por 1 minuto y

el sedimento se resuspendió en 250 μl de Solución I/RNAsa A. Se homogenizó en

vórtex, se agregaron 250 μl de Solución II y se mezcló hasta obtener un lisado claro.

Luego, se agregaron 350 μl de Solución III, se mezcló hasta obtener un precipitado

floculento y se centrifugó a ≥13000 xg por 10 minutos. En paralelo, se insertó una

minicolumna Hi-Bind DNA en un tubo colector, se equilibró con 100 μl de Equilibration

Buffer y se centrifugó a ≥13000 xg por 1 minuto.

20

El sobrenadante claro, separado del precipitado floculento, se cargó en la columna

y se centrifugó a ≥13000 xg por 1 minuto. Se eliminó el filtrado. La columna se lavó con

500 μl de Buffer HB y 700 μl de DNA Wash Buffer, centrifugando a ≥13000 xg por 1

minuto cada vez. Posteriormente, la columna vacía se centrifugó por 2 minutos a

≥13000 xg. Finalmente, la columna se insertó en un tubo de microcentrífuga nuevo y el

ADN de eluyó con 90 μl de agua HyPure, grado biología molecular. Se centrifugó a

≥13000 xg por 1 minuto y se colectó el eluato.

3.2.11 Cuantificación de ADN plasmidial. La cuantificación se realizó mediante el

registro de la absorbancia a 260 nm de una dilución de 350 veces de la preparación

anterior. Se consideró que una unidad de absorbancia equivale a 50 µg/ml de ADN

doble hebra (Sambrook et al., 2001).

3.2.12 Digestión del ADN plasmidial. Para la reacción de digestión se utilizó 5 µl de

ADN plasmidial purificado, 0,2 µl de BSA 100X, 2 µl de Buffer H, 12,5 µl de agua

HyPure grado biología molecular y 0,5 µl de EcoRI (3U/µl) o agua Hypure grado

biología molecular (como control negativo), se incubó 3 horas 37ºC. Para el análisis

electroforético se mezcló 5 μl de producto de digestión con 1 μl de buffer de carga Gel

Loading Dye Blue 6X, se cargó 5 μl las muestras preparadas y se realizó el

fraccionamiento en gel de agarosa descrito en el punto 3.2.5 que permitió visualizar los

insertos liberados del tamaño esperado. Luego de comprobar la correcta transformación

de las bacterias, se almacenó los clones a -80ºC en glicerol al 50%.

21

3.2.13 Secuenciación parcial. Una alícuota del ADN plasmidial purificado desde las

colonias transformadas con el vector pGEM-T Easy con los insertos del gen ARNr 23S

se envió a la empresa Macrogen (Seúl, Corea), que llevó a cabo la secuenciación

utilizando partidores complementarios a las secuencias de los promotores SP6 y T7 que

flanquean la región de múltiple clonamiento (MCS) del vector. Alícuotas de los

productos de PCR del gen ARNr 23S extraídos desde electroforesis en gel, junto a los

partidores utilizados para su amplificación, fueron enviados a la empresa antes

mencionada para realizar la secuenciación, que utilizó estos partidores para llevarla a

cabo. La secuenciación se realizó por el método de didesoxinucleótidos.

3.2.14 Diseño de partidores específicos para Hsp60 y Hsp70 de P. salmonis y

ARNr 23S de patógenos de salmones. Se llevó a cabo un rastreo in sílico de las

secuencias nucleotídicas de los genes Hsp60, Hsp70, ARNr 23S y la región ITS del

operón ribosomal de Legionella pneumophila (gi 54295983, gi 148358139, gi 54295983,

gi 148358139, gi 52840256), Yersinia pestis (gi 16120353, gi 162418099, gi 22123922,

gi 22123922, gi 54295983, gi 142849896, gi 142849896, gi 23092306, gi 117617447, gi

208007585, gi 30407161, gi 22002119, gi 30407161, gi 30407161, gi 30407161, gi

108805998 gi 45439865), Flavobacterium columnare (gi 154759415, gi 154759415, gi

54301253, gi 46361295), Flavobacterium psychrophilum (gi 150024114 gi 150024114,

gi 61967803, gi 150024114, gi 149770655, gi 150024114), Aeromonas hydrophila (gi

197295669, gi 66277316, gi 66277316, gi 117558854, gi 117617447, gi 66474769),

Aeromonas salmonicida (gi 145297124, gi 145297124, gi 66277313, gi 3004891, gi

66277313, gi 66474766), Francisella tularensis (gi 56707187, gi 56707187, gi

22

240248234, gi 110669657, gi 110669657), Francisella philomiragia (gi 167626225),

Renibacterium salmoninarum (gi 162952245, gi 6693867), Vibrio anguillarum (gi

112012510), Vibrio ordalii (gb EU570973.1), Pseudomonas perfectomarina (gi 151549),

Piscirickettsia salmonis de las cepas; SBPLO (gb AY607585.1), ATL-4-91 (gb

U36945.2), EM90 (gb AF205384.1), LF89 (gb AF205383.1), AL10015 (gb EU289216.1),

Pseudomonas stutzeri (gi 146280397, gi 2244673, gb U65012.1, gi 2244673), entre

otros, presentes en la base de datos del National Center for Biotechnology Information

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov). En base a estas secuencias se realizaron alineamientos

nucleotídicos utilizando el software disponible en la red http://www.ebi.ac.uk/clustalw, a

partir de los cuales se diseñaron partidores para amplificar los genes Hsp60, Hsp70 y

ARNr 23S.

3.2.15 Aislamiento de ADN genómico desde tejido de salmón mediante un sistema

comercial. 20-30 mg de tejido de salmón se cortaron con bisturí y se transfirieron a un

tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Se agregaron 200 µl de Buffer TL y 25 µl de OB

Protease reconstituida, y se homogenizó en vórtex. Luego, se incubó en baño a 56ºC y

se mezcló en vórtex cada 20-30 minutos, hasta lograr la lisis completa del tejido. Se

centrifugó por 2 minutos a máxima velocidad (≥13000 xg). Posteriormente, se aspiró el

sobrenadante y se traspasó a un tubo de microcentrífuga estéril. Se agregaron 220 µl

de Buffer BL y se homogenizó en vórtex. Se agregaron 220 µl de etanol absoluto y se

mezcló en vórtex. En paralelo, se insertó una minicolumna Hi-Bind DNA en un tubo de 2

ml y se equilibró con 100 µl de Equilibration Buffer, se centrifugó a ≥13000 xg por 1

minuto, se transfirió la muestra completa a la columna, se centrifugó a 10000 xg por 1

http://www.ebi.ac.uk/clustalw

23

minuto. Se agregaron 500 μl de Buffer HB, se centrifugó a 10000 xg por 1 minuto, se

agregaron 700 μl de DNA Wash Buffer, se centrifugó a 10000 xg por 1 minuto, se

agregaron 400 μl de DNA Wash Buffer, se centrifugó a 10000 xg por 3 minutos. Se

insertó la columna en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril y se le agregó 100 μl

de Elution Buffer preincubado a 70ºC, se incubó 2 minutos a temperatura ambiente y se

centrifugó a 10000 xg por 1 minuto. Se agregó nuevamente 100 μl de Elution Buffer

preincubado a 70ºC, se incubó 2 minutos a temperatura ambiente y se centrifugó a

10000 xg por 1 minuto. El ADN extraído fue cuantificado según el método 3.2.3.

3.2.16 PCR en tiempo real. Se amplificó fragmentos de las secuencias de los genes

Hsp60, Hsp70, ARNr 23S de P. salmonis utilizando diferentes cantidades de partidores,

7,5 µl de 2X Brilliant II SYBR Green QPCR master mix, 2 µl de ADN genómico o agua

HyPure grado biología molecular (como control negativo) y un volumen de agua HyPure

grado biología molecular suficiente para completar 15 µl, se homogenizó en vórtex. Se

utilizó el termociclador MX Pro 3000P para realizar las reacciones de PCR en tiempo

real, utilizando un programa de amplificación compuesto por una primera etapa de

denaturación a 95ºC por 10 minutos, una segunda fase de 35-45 ciclos de: 15 segundos

de denaturación a 95ºC, 15 segundos de alineamiento a 57ºC y 15 segundos de

extensión a 72ºC o 40 segundos de alineamiento-extensión a 60ºC, además de una

curva de disociación compuesta por 10 segundos a 95ºC, 10 segundos a 25ºC, 1

segundo a 70ºC y 1 segundo a 95ºC. Los resultados de las reacciones se evaluaron

utilizando el programa MXPRO y electroforesis en gel según lo descrito en el punto

3.2.5.

24

4. RESULTADOS

4.1 Aislamiento de ADN genómico de distintos aislados chilenos de Piscirickettsia

salmonis y patógenos de peces.

Se obtuvo masa bacteriana de los distintos aislados de P. salmonis en estudio,

desde cultivo puro en placas de agar tripticasa de soya enriquecido y además, se

colectó masa celular de patógenos de peces como Aeromonas hydrophila,

Flavobacterium psychrophilum, Edwarsiella ictaluri, Vibrio vulnificus, Flavobacterium

aquatile y Tenacibaculum maritimum desde cultivo puro en medio líquido tripticasa de

soya. A todos ellos se les extrajo el ADN genómico utilizando un kit comercial y se

cuantificó mediante la medición de absorbancia a 260 nm. Se analizó la integridad y

calidad de este ADN genómico mediante un análisis electroforético en el que se cargó

1,0 µg de cada muestra (Figuras 2 y 3). En estas figuras, se observa que todos los ADN

purificados tienen una calidad suficiente, ya que su movilidad electroforética muestra un

alto tamaño molecular, encontrándose en el extremo superior del gel. Las muestras de

ADN purificados no mostraron degradación al no detectarse bandas inferiores

características de este fenómeno. Luego de demostrar que las muestras poseen las

características óptimas para realizar las reacciones de PCR, se analizó la especificidad

de un método de detección para P. salmonis descrito en la literatura.

25

ST 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20A

500 200

12000

pb

ST 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 B

500 200

12000

pb

Figura 2: Electroforesis en gel de agarosa al 0,5% en buffer SB 1X de ADN

genómico extraído de distintos aislados chilenos de Piscirickettsia salmonis. A:

ST: Estándar de 1 kb, 2: PPT-002, 3: PPT-003, 4: PPT-005, 5: PPT-008, 6: PPT-009, 7:

PPT-010, 8: PPT-011, 9: LF-89, 10: IBM2, 11: IBM3, 12: IBM5, 13: IBM6, 14: IBM7, 15:

IBM9, 16: IBM10, 17: IBM11, 18: IBM13, 19: IBM14, 20: IBM15. B: ST: Estándar de 1

kb, 2: IBM 16, 3: IBM17, 4: IBM18, 5: IBM21, 6:IBM22, 7: IBM24, 8: IBM25, 9: IBM27,

10: IBM30, 11: IBM32, 12: IBM34. En A y B se observa el alto tamaño molecular del

ADN genómico extraído.

26

ST 2 3 4 5 6 7

12000

500

200 pb

Figura 3: Electroforesis en gel de agarosa al 0,5% en buffer SB 1X de ADN

genómico extraído de aislados chilenos de Aeromonas hydrophila,

Flavobacterium psychrophilum, Edwarsiella ictaluri, Vibrio vulnificus,

Flavobacterium aquatile y Tenacibaculum maritimum. Se observa el alto tamaño

molecular del ADN genómico extraído. ST: Estándar de 1 kb, 2: E. ictaluri, 3: T.

maritimum, 4: F. aquatile, 5: F. psychrophilum, 6: V. vulnificus, 7: A. hydrophila.

27

4.2 Análisis de la especificidad del sistema de detección por tiempo real descrito

para P. salmonis.

En la literatura se ha descrito un método para la detección de P. salmonis

utilizando PCR en tiempo real (Karatas et al., 2008). Esta metodología basada en la

amplificación del gen ARNr 16S, es la que se utiliza actualmente en la industria. El gen

ARNr 16S presenta baja tasa de variación genética entre distintas familias de bacterias.

Con el objetivo de comprobar la amplificación de P. salmonis, se analizaron los

partidores 16SRNAF1 y 16SRNAR por medio de PCR en tiempo real. Primero se

utilizaron estos partidores con ADN genómico de P. salmonis, aislados PPT-001, 3, 5 y

8, como templado. En la Figura 4A se observa el resultado de las curvas de disociación

de estos PCR. La imagen destaca la amplificación de fragmentos con Tm de 85,5ºC

para todos los aislados de P. salmonis en estudio. A continuación se realizó un

fraccionamiento en gel de los productos de amplificación, cuyo resultado muestra una

banda de 150 pb de tamaño (Figura 4B). Con el objetivo de comprobar la especificidad

de los partidores 16SRNAF1 y 16SRNAR por medio de PCR en tiempo real, se

repitieron las reacciones de PCR ahora utilizando ADN genómico de distintas especies

de patógenos de salmones. Los resultados presentados en la Figura 5A muestran la

curva de disociación de Aeromonas hydrophila, Flavobacterium psychrophilum y

Tenacibaculum maritimum con los partidores descritos por Karatas et al., en la que se

observa la generación de productos con Tm de 85ºC. Para verificar el tamaño de los

fragmentos amplificados se efectuó una electroforesis, la que permitió visualizar bandas

de 150 pb (Figura 5B).

28

AA

B

500

ST 2 3 4 5 C-

100

200 150

pb pb

Figura 4: PCR en tiempo real de Piscirickettsia salmonis aislados PPT-001, 3, 5 y 8

con partidores descritos por Karatas. Se utilizó el protocolo de 40 ciclos con

alineamiento a 57°C por 15 seg y extensión a 72°C por 15 seg. A: Curva de disociación

de productos de PCR. B: Electroforesis en gel de agarosa al 1,8% en buffer TAE 1X de

productos de PCR. ST: Estándar de 100 pb, 2: PPT-005 3: PPT-008, 4: PPT-003, 5:

PPT-001, C-: control-. 2-5: se observa la amplificación de un fragmento de 150pb.

29

AA

B

200

ST 2 3 4 C-

100

pb

150 pb

Figura 5: PCR en tiempo real de Aeromonas hydrophila, Flavobacterium

psychrophilum, Tenacibaculum maritimum con partidores descritos por Karatas.

Se utilizó el protocolo de 40 ciclos con alineamiento a 57°C por 15 seg y extensión a

72°C por 15 seg. A: Curva de disociación de productos de PCR. B: Electroforesis en

gel de agarosa al 1,8% en buffer TAE 1X de productos de PCR. ST: Estándar de 100

pb, 2: T. maritimum, 3: A. hydrophila, 4: F. psychrophilum, C-: control-. 2-4: se observa

la amplificación de un fragmento de 150pb.

30

Estos experimentos permitieron demostrar la baja especificidad del método de

detección para P. salmonis descrito en la literatura. A partir de esta problemática surgió

la necesidad de desarrollar un PCR en tiempo real que permita la detección específica

de P. salmonis en órganos de salmón. Para lograrlo se utilizó un formato múltiple

basado en tres genes, cuyo desarrollo se detalla a continuación.

4.3 Clonamiento del gen 23S del operón ribosomal (ARNr 23S) de P. salmonis.

Un gen bacteriano característico es el que codifica el ARNr 23S, que presenta una

baja tasa de variaciones genéticas entre distintas familias de bacterias. Postulamos que

este gen es un buen candidato como control interno de la presencia de una bacteria

infecciosa en los salmones. La secuencia del gen 23S de P. salmonis no se encuentra

disponible en la base de datos del GenBank, por lo que, con el objetivo de secuenciar

completo el gen ARNr 23S de P. salmonis, se amplificaron fragmentos parciales por

PCR en gradiente. Como primer paso, y basados en el gen ARNr 23S e ITS de

diferentes patógenos de salmónidos emparentados, se diseñaron partidores (Tabla I en

Materiales y Métodos). Las secuencias utilizadas de Legionella pneumophila (gi

54295983), Francisella tularensis (gi 56707187), Pseudomonas stutzeri (gi 2244673) y

Piscirickettsia salmonis (gb AY607585.1, gb U36945.2, gb AF205384.1, gb AF205383.1,

gb EU289216.1) están disponibles en GenBank (www.ncbi.com). La estrategia de

clonamiento, utilizando los distintos partidores diseñados, se describe en un esquema

representativo (Figura 1, en Materiales y Métodos).

31

Con el objetivo de determinar las temperaturas de hibridación de cada par de

partidores se realizaron diferentes PCRs en gradiente con ADN de P. salmonis aislado

PPT-001. Finalmente, los productos de cada reacción se visualizaron mediante

electroforesis en gel de agarosa.

4.3.1 Amplificación mediante PCR en gradiente de secuencias parciales del

gen ARNr 23S de P. salmonis.

Para amplificar la secuencia del extremo 5’ del gen 23S desde ADN genómico de

P. salmonis aislado PPT-001, se realizaron dos reacciones de PCR en gradiente

independientes. En una de ellas se usaron los partidores 300AF y 300AR (Tabla I), y el

resultado se muestra en la Figura 6A. Como resultado de la electroforesis en gel de

agarosa de este primer PCR en gradiente se observa un producto de 1000 pb (con

temperaturas de hibridación desde 50°C a 62°C), mientras que con 66,9°C de

temperatura de hibridación el fragmento es de 1300 pb. En la segunda PCR en

gradiente se usaron los partidores 300BF y 300BR (Tabla I) y el resultado se analizó

nuevamente por electroforesis en gel de agarosa (Figura 6B). Se aprecia que con una

temperatura de hibridación de 52,2°C se logró amplificar un producto de 700 pb, en

tanto que con 57,8°C y 62°C la banda fue de 600 pb, mientras que con 66,9°C fue de

650 pb.

32

2900

Gen 23S Legionella sp. ITS 2783

900

500

ST1 C- 50°C 52,2°C 57,8°C 62°C 66,9°C ST2 1350

500 pb

A

pb

300BF 300BR

685pb

300AF 300AR

1094pb

1

pb

650

B

pb

A

500

700

Figura 6: Análisis electroforético en gel de agarosa 2% en buffer SB 1X de

productos de PCR en gradiente de secuencias parciales del extremo 5’ del gen

ARNr 23S de Piscirickettsia salmonis aislado PPT-001. Se utilizaron distintas

temperaturas de alineamiento que se muestran en la parte superior de cada carril y 1

min 20 seg de extensión. A: Se utilizó los partidores heterólogos 300AF y 300AR. ST1:

Estándar de 1kb, C-: control- (alineamiento a 50°C). 3-6: Se observa la amplificación del

fragmento esperado de 1000pb, 7: Se observa la amplificación de un fragmento de

1300pb. ST2: Estándar de 100pb. B: Se utilizaron los partidores heterólogos 300BF y

300BR. ST: Estándar de 100pb, C-: control- (alineamiento a 50°C). 4: Se observa la

amplificación de un fragmento de 700pb. 5-6: Se observa la amplificación de un

fragmento de 600pb, 7: Se observa la amplificación de un fragmento de 650pb.

33

Igualmente, para analizar el extremo 3’ del gen ARNr 23S de P. salmonis se

realizaron dos PCR en gradiente distintas. En una de ellas se usaron los partidores

1600F y 2700pbR (Tabla I) y la amplificación se confirmó por medio de una

electroforesis (Figura 7A). En el gel se muestra que el tamaño del fragmento obtenido

es de 1000 pb para todas las temperaturas de hibridación estudiadas (45°C a 59,6°C).

Para la otra reacción de la polimerasa en cadena se probaron los partidores 1600F y

2900pbR (Tabla I), cuyos productos fueron visualizados en una electroforesis (Figura

7B). De este experimento se deduce que los partidores permiten amplificar una banda

de 1300 pb al utilizar temperaturas de hibridación desde 46,6°C a 57,6°C.

34

2900

Gen 23S Legionella sp. ITS

1600F 2700pbR

1000pb

1300pb

1600F

2783

2900pbR

2

Figura 7: Análisis electroforético en gel de agarosa 1,5% en buffer TAE 1X de

productos de PCR en gradiente de secuencias parciales del extremo 3’ del gen

ARNr 23S de Piscirickettsia salmonis aislado PPT-001. Se utilizaron distintas

temperaturas de alineamiento que se muestran en la parte superior de cada carril y 1

min 30 seg de extensión. A: Se utilizó los partidores heterólogos 1600F y 2700pbR. ST:

Estándar de 1 kb, C-: control- (alineamiento a 45°C). 3-8: Se observa la amplificación

del fragmento esperado de 1000pb. B: Se utilizaron los partidores heterólogos 1600F y

2900pb. ST: Estándar de 1 kb, C-: control- (alineamiento a 45°C), 4-6: Se observa la

amplificación del fragmento esperado de 1300pb.

3000

500

1000

ST C- 45°C 46,6°C 50,8°C 54°C 57,6°C 59,6°C

pb

A

pb 1300

B

1500 ST C- 45°C 46,6°C 54°C 57,6°C 59,6°C

1000 pb

35

Finalmente, para amplificar la región central del gen en estudio se llevó a cabo una

primera PCR en gradiente, cuyo producto fue purificado desde el gel y utilizado como

templado para una segunda reacción en gradiente. La Figura 8 muestra el producto de

amplificación de la primera ronda de PCR, usando los partidores 23Sf y 1700R (Tabla

I), obteniéndose un producto de 1200 pb (hibridación a 58,8°C y 64,4°C). Una vez

obtenido el fragmento, cuya temperatura de hibridación fue de 64,4°C, se purificó desde

el gel de agarosa. Posteriormente, se efectuó una segunda ronda de PCR usando como

templado el producto de amplificación purificado anteriormente (banda de 1200 pb) y los

partidores 800F y 1500Rb (Tabla I). Los productos se analizaron mediante una nueva

electroforesis (Figura 9), verificándose una banda de 800 pb al realizar la PCR con

temperaturas de hibridación desde 45°C a 59,6°C.

En general, en las Figuras 6 a 9, correspondientes a las electroforesis de los

distintos PCRs en gradiente usando como templado ADN genómico de P. salmonis, se

determinaron las temperaturas de hibridación adecuadas para cada par de partidores.

Estas condiciones resultaron en la amplificación de fragmentos cuya movilidad

electroforética generó bandas bien definidas, del tamaño esperado y ausencia de

bandas inferiores características de inespecificidad. Estas bandas fueron extraídas y

purificadas desde el gel de agarosa utilizando un sistema comercial.

36

1200pb

2900


23Sf

1700r

2783

1500

ST 45°C 47,5°C 54°C 58,8°C 64,4°C C- A

pb 1000


productos de PCR en gradiente de secuencias parciales de la región central del

gen ARNr 23S de Piscirickettsia salmonis aislado PPT-001. Se utilizó el partidor

23Sf, específico para la región ITS de P. salmonis y el partidor heterólogo 1700r para el

gen ARNr 23S con distintas temperaturas de alineamiento que se muestran en la parte

superior de cada carril y 1 min 30 seg de extensión. ST: Estándar de 1 kb, C-: control-

(alineamiento a 45°C), 5 y 6: Se observa la amplificación del fragmento esperado de

1200pb.

37

800


productos de PCR en gradiente de secuencias parciales de la región central del

gen ARNr 23S de Piscirickettsia salmonis aislado PPT-001. Se utilizaron los

partidores heterólogos 800F y 1500Rb con distintas temperaturas de alineamiento que

se muestran en la parte superior de cada carril y 1 min 20 seg de extensión. ST:

Estándar de 1 kb, C-: control- (alineamiento a 45°C), 3-8: Se observa la amplificación

del fragmento esperado de 800pb.

3000

500

1000

ST C- 45°C 46,6°C 50,8°C 54°C 57,6°C 59,6°C

pb

2900


1500R

800p

2783

38

4.3.2 Clonamiento de secuencias parciales del gen ARNr 23S de P. salmonis

en pGEM-T Easy en Escherichia coli JM109.

Una vez purificados los fragmentos de algunas de las secuencias parciales del

gen ARNr 23S de P. salmonis aislado PPT-001, se procedió a ligarlos al vector pGEM-T

Easy. Al plásmido se ligaron los productos de PCR obtenidos con los partidores 800F y

1500Rb (800pb), 1600F y 2700pbR (1000pb), y 1600F y 2900pbR (1300pb). Con el

producto de ligación se transformaron Escherichia coli JM109 competentes, las que

fueron crecidas y posteriormente se les extrajo el ADN plasmidial. El vector purificado

se digirió con EcoRI y estos productos fueron fraccionados mediante electroforesis en

gel de agarosa (Figura 10), observándose la liberación de los fragmentos de 800, 1000

y 1300 pb, además del vector linearizado (3000 pb aproximadamente). Finalmente, con

el objetivo de corroborar que las secuencias clonadas correspondían al gen ARNr 23S,

cada plásmido purificado fue sometido a secuenciación.

39

3000

500 pb

1000

ST C- 3 4 5 6 7 8 ST

1500 inserto

vector

Figura 10: Análisis electroforético de la digestión con EcoRI de los plásmidos

purificados conteniendo insertos de secuencias parciales del gen ARNr 23S de P.

salmonis aislado PPT-001. Electroforesis en gel de agarosa al 1% en buffer TAE 1X

de productos de digestión de ADN plasmidial aislado desde colonias de E. coli JM109

transformadas con vector pGEM-T Easy con los insertos de 800F-1500Rb, 1600F-

2700pbR ó 1600F-2900pbR. ST: Estándar de 1 kb, C-: control- (sin EcoRI). 3-5: clones

800F-1500Rb 1 al 3 (inserto de 800pb), 6: clon 1600F-2900pbR 1 (inserto de 1400pb), 7

y 8: clones 1600F-2700pbR 1 y 2 (inserto de 1200pb), 3-8: Se observa el vector

linearizado del tamaño esperado (3015pb).

40

4.3.3 Secuenciación del gen ARNr 23S de P. salmonis.

Con el objetivo de obtener la secuencia del gen 23S de P. salmonis, se llevó a

cabo la secuenciación de los productos de PCR purificados y clonados en el pGEM-T-

Easy. Los productos de PCR fueron secuenciados utilizando los partidores que

generaron su amplificación (300AF y 300AR, 300BF y 300BR, 23Sf y 1700R). Además,

los productos de amplificación (800F con 1500Rb, 1600F con 2700pbR y 1600F con

2900pbR) clonados en el vector pGEM-T fueron secuenciados utilizando los partidores

SP6 y T7.

La secuencia completa obtenida fue de 2095pb, la que se muestra en la Figura 11

y utilizando la herramienta BLAST se determinó un 87% de identidad con la secuencia

descrita para el ARNr 23S de Pseudomonas stutzeri (Figura 12). Mediante estos

resultados se confirmó la amplificación de la secuencia del gen ARNr 23S de P.

salmonis.

41

gtaatagacttctgggggtagagcactgtttcggctaggggcccatcccgggttaccaacccgatgcaaactccgaat

accagaaagttgttttacgggagacacacggcgggtgataaggtccgtcgtggagagggaaacagcccagaccgccag

ttaaggtccctaaatattactaagtggtaaacgatgtgggaaggcttagacagctaggaggttggcttagaagcagcc

atcctttaaagaaagcgtaatagctcactagtcgagtcggcctgcgcggaagatttaacggggctaagtaatataccg

aaactgcgggttcataatttattatgagcggtagcgaagcgttctgtaggccggagaaggtgatctgagagggttgct

ggaggtatcagaagtgagaatgctgacatgagtaacgataaagggggtgagaatccccctcgccggaagtccaaggtt

ttctacgcaacgttcgtcgacgtagagtgagtcggcccctaaggcgaggcagaaatgcgtagtcgatgggaatcaggt

taatattcctgaacttcttacaattgcgatgtggagacggagaaggctaggccagcgcagtgatggttatctgcgttt

aaggtggtaggcagagtacttaggcaaatccgggtacttaatgctgagagctgatgacgaagccacttttagtggtga

agtggttgatgccctgcttccaggaaaatcctctaagcttcagattgtaagaaaccgtacccgaaaccgacacaggtg

gacaggtagagaataccaaggcgcgtgagagaactcaggtgaaggaactaggcaaaatggtaccgtaacttcgggaga

aggtacgccctggctggtgatggactttacgtcctaagctggttggggccgcagagaccagttggctgcgactgttta

ttaaaaacatagcactgtgcgaactcgaaagaggatgtatacggtgtgacgcctgcccggtgccggaaggttaattga

tggggttagcgtaagcgaagctcttgatcgaagccccggtaaacggcggccgtaactataacggtcctaaggtagcga

aattccttgtcgggtaagttccgacctgcacgaatggcgtaacgatggccaagctgtctccacctgagactcagtgaa

attgaaatcgctgtgaagatgcagtgtatccgcggctagacggaaagaccccgtgaacctttactacagctttgcgct

ggactttgagactatctgtgtaggataggtgggaggctatgaaatgtgaacgctagtttgcatggagccgtccttgaa

ataccaccctggtattcttgaggttctaacctaggcccgttaaccgggttggggacagcgtatggtgggtagtttgac

tggggcggtctcctccgaaagagtaacggaggagtacgaaggtgtgctaagcatggtcggacatcatgcggttagtat

aaaggcaaaagcacgcttgactgcgagacggacatgtcgagcaggtacgaaagtaggtcttagtgatccggtggttct

gtatggaagggccatcgctcaacggataaaaggtactccggggataacaggctgataccacccaagagttcatatcga

cggtggtgtttggcacctcgatgtcggctcatctcatcctggggctgtagcaggtcccaagggtatggctgttcgcca

tttaaagaggtacgcgagctgggtttagaacgtcgtgagacagttcggtccctatctgccgtggacgttggagatttg

agaggggttgctcctagtacgagaggaccggagtgaacgaacctctggtgttcgggttgtgtcgccagacgcattgcc

gggtagctatgttcggaatagataaccgctgaaagcatctaagcgggaagctagcctcaagangagatctccctgagg

gcttgaccctcctaaaggctcgtctaagactaagacgttgataggttggatgtggaagtgcagtaatgtatgaagcta

accaatactaattgcccgtgaggcttgaccaatcgaattcccgcggccgccatggcggccggaagc.

Figura 11. Secuencia nucleotídica del gen ARNr 23S de P. salmonis.

42

Figura 12: Confirmación de la amplificación del gen ARNr 23S de P. salmonis

mediante secuenciación. El ADN plasmidial aislado de las colonias transformadas con

el vector pGEM-T Easy con los insertos 800F-1500Rb, 1600F-2700pbR y 1600F-

2900pbR, además de los productos de PCR 23Sf-1700r ,300AF-300AR y 300BF-300BR

extraídos desde electroforesis en gel se enviaron a secuenciar. La secuencia obtenida

se alineó con las descritas en la base de datos utilizando la herramienta BLAST. EL

análisis revela un 87% de identidad con la secuencia descrita para el gen ARNr 23S de

Pseudomonas stutzeri, lo que confirma la amplificación del gen ARNr 23S de P.

salmonis.

43

4.4 Diseño de partidores específicos para genes de P. salmonis y para un gen

conservado entre patógenos de salmones.

Se llevó a cabo una revisión de las secuencias de los genes Hsp60, Hsp70 y

ARNr 23S de especies patógenas de salmones descritas en la red (ver Materiales y

Métodos), además de la secuencia obtenida en el punto 4.2.3 para P. salmonis. En

base a esta revisión se realizaron alineamientos múltiples de las secuencias utilizando

el programa ClustalW2. A partir del análisis anterior, se diseñaron tres pares de

partidores basados en las secuencias de cada uno de los genes en estudio. Es así

como PS_ 1 al 3 poseen como blanco el gen ARNr 23S de múltiples especies

bacterianas de salmones, PS_ 4 al 6 poseen amplicones contenidos en el gen Hsp60

de P. salmonis y PS_ 7 al 9 se basan en la secuencia del gen Hsp70 de P. salmonis. Se

analizó la especificidad de todos estos pares de partidores por medio de amplificaciones

por PCR en tiempo real y electroforesis de sus productos, cuyo resultado se detalla a

continuación.

44

4.5 Análisis de la especificidad de los partidores diseñados para los genes Hsp60,

Hsp70 y ARNr 23S.

Se analizó la capacidad de amplificación y especificidad de los partidores

basados en los genes Hsp60, Hsp70 y ARNr 23S por medio de PCR en tiempo real.

Para comprobar la amplificación de ADN de P. salmonis se utilizó material genómico de

los aislados PPT-001, 3, 5 y 8. Finalmente, la especificidad de los partidores se analizó

con muestras de ADN genómico de Aeromonas hydrophila, Flavobacterium

psychrophilum, Edwarsiella ictaluri, Vibrio vulnificus, Flavobacterium aquatile y

Tenacibaculum maritimum. Los valores de Tm observadas en las curvas de disociación

de estas reacciones se muestran en la Tabla II, mientras que en la Tabla III se resumen

los tamaños de los productos de estos PCRs, determinados por comparación con la

migración de un estándar de tamaño conocido mediante electroforesis en gel de

agarosa. En todas estas reacciones se amplificó un fragmento único, con ausencia de

más de una banda (dato no mostrado).

45

Tabla II: Resumen de valores de Tm extraídos de las curvas de disociación de

productos de PCR en tiempo real con partidores para detección y ADN genómico de

diferentes especies de patógenos de salmones.

Tm (ºC) de PCR con patógenos de salmones. Par de

Partidores

Gen que

amplifican PPT

001

PPT

003

PPT

005

PPT

008 T.m. A.h. F.p. V.v. F.a. E.i.

PS_1 ARNr 23S 84,0 84,0 83,8 83,9 85,7 84,1 84,2 86,6 84,7 84,7

PS_2 ARNr 23S 83,6 83,1 83,3 83,4 - - - - - -

PS_3 ARNr 23S 84,2 84,2 84,4 83,9 - - - - - -

PS_4 Hsp60 81,4 81,5 81,8 81,3 81,6 81,6 81,6 - - -

PS_5 Hsp60 80,5 80,5 80,8 80,3 N.A N.A N.A N.A N.A N.A.

PS_6 Hsp60 81,6 81,7 81,8 81,3 - - - - - -

PS_7 Hsp70 81,3 81,2 81,2 81,2 N.A N.A N.A N.A N.A N.A.

PS_8 Hsp70 81,5 81,8 81,3 81,3 81,9 81,3 75,1 81,3 N.A. 81,3

PS_9 Hsp70 76,7 76,7 76,7 76,7 - - - - - -

46

Tabla III: Resumen de resultados de electroforesis de productos de PCR en tiempo real

con partidores para detección y ADN genómico de diferentes especies de patógenos de

salmones.

Tamaños Observados (pb) con patógenos de salmones Nombre

partidores

Tamaño

Esperado

P. salmonis

PPT

001

PPT

003

PPT

005

PPT

008 T.m. A.h. F.p. V.v. F.a. E.i.

PS_1 276 pb 300 300 300 300 300 300 300 300 300 300

PS_2 177 pb 180 180 170 170 - - - - - -

PS_3 233 pb 250 250 220 220 - - - - - -

PS_4 260 pb 270 250 250 250 N.A. N.A. 250 - - -

PS_5 191 pb 200 200 200 200 N.A N.A N.A N.A N.A N.A

PS_6 230 pb 250 250 210 210 - - - - - -

PS_7 147 pb 150 150 150 150 N.A N.A N.A N.A N.A N.A

PS_8 183 pb 200 200 200 200 200 200 N.A. 200 N.A. 200

PS_9 117 pb 100 100 100 100 120 120 120 120 120 120

47

4.5.1 Selección de partidores para los genes Hsp60, Hsp70 y ARNr 23S.

En base a los datos de las Tablas II y III se seleccionó los pares PS_1, PS_5 y

PS_7, pues presentaron Tm superiores a 80ºC y amplificaron una única banda del

tamaño esperado, cuyas diferencias de tamaños permiten su discriminación en gel de

agarosa. Finalmente se comparó las secuencias de estos oligonucleótidos con la base

de datos utilizando la herramienta BLAST. Determinándose un 85% de identidad entre

la secuencia PS_1 y la descrita para el ARNr 23S de Neisseria sp. (Figura 13), lo que

refleja su capacidad de amplificar este gen de diversas especies de microorganismos

patógenos. La figura 14 muestra el análisis de la secuencia del par de partidores PS_5

que posee un 100% de identidad con el gen dnaK (Hsp60) de P. salmonis

(AY686757.1), mientras que en la Figura 15 se observa un 100% de identidad entre la

secuencia del par de partidores PS_7 y el gen groEL (Hsp70) de P. salmonis

(AY686756.1). El resultado de los BLAST de los partidores PS_5 y PS_7 reflejan la

capacidad de unión a sus genes blanco en el ADN de P. salmonis y un grado de

divergencia con otras secuencias existentes en la base de datos. De lo anterior se

deduce su especificidad de amplificación, propiedad que fue confirmada

experimentalmente en las reacciones de PCR en tiempo real que se muestran a

continuación.

48

Figura 13: Comparación de la secuencia del par de partidores PS_1 con la base de

datos utilizando la herramienta BLAST. La secuencia del par de partidores PS_1 se

alineó con las descritas en la base de datos utilizando la herramienta BLAST. EL

análisis revela un 85% de identidad con la secuencia descrita para el gen ARNr 23S de

Neisseria sp., lo que confirmaría la capacidad de los partidores de amplificar el gen

ARNr 23S de bacterias.

49




análisis revela un 100% de identidad con la secuencia descrita para el gen Hsp60 de

Piscirickettsia salmonis, lo que confirmaría la capacidad de los partidores de amplificar

específicamente este gen.

50




análisis revela un 100% de identidad con la secuencia descrita para el gen Hsp70 de

Piscirickettsia salmonis, lo que confirmaría la capacidad de los partidores de amplificar

específicamente este gen.

51

4.5.2 PCR en tiempo real de los aislados de P. salmonis PPT- 001, 3, 5 y 8,


Se realizaron diferentes reacciones de PCR en tiempo real para probar la

especificidad de los partidores PS_1. Primero se utilizó ADN genómico de P. salmonis,

aislados PPT-001, 3, 5 y 8, como templado. En la Figura 16A se observa la curva de

disociación. La imagen muestra que los productos de la reacción presentan un pick

único de 83,9ºC, correspondiente a la temperatura de hibridación promedio con P.

salmonis PPT-001, 3, 5 y 8. La Figura 16B muestra el resultado de la electroforesis en

gel de agarosa de la PCR en tiempo real de P. salmonis, aislados PPT-001, 3, 5 y 8,

con partidores PS_1. Se observa una banda única de 300pb con las cuatro cepas de P.

salmonis analizadas. Las mismas reacciones se llevaron a cabo pero ahora utilizando

ADN genómico de otros patógenos de salmones como templado. Los resultados de las

curvas de disociación se muestran en la Figura 17A. Las temperaturas de hibridación

para Aeromonas hydrophila, Flavobacterium psychrophilum, Edwarsiella ictaluri,

Flavobacterium aquatile, Tenacibaculum maritimum y Vibrio vulnificus fueron de 84,1ºC,

84,2ºC, 84,6ºC, 84,7ºC, 85,7ºC y 86,6 ºC, respectivamente. El tamaño de estos

productos de PCR fue de 300pb, los cuales se determinaron por medio de electroforesis

(Figura 17B). Todos estos resultados confirman al par de primers PS_1 como un buen

control interno de la presencia de ADN bacteriano, por lo que se seleccionaron para el

kit de detección de P. salmonis.

52

A

B ST C- 3 4 5 6

300

1000 500

pb

Figura 16: PCR en tiempo real de P. salmonis aislados PPT-001, 3, 5 y 8 con

partidores PS_1. Se utilizó el protocolo de 40 ciclos con alineamiento a 57°C por 15

seg y extensión a 72°C por 15 seg. A: Curva de disociación de productos de PCR. B:

Electroforesis en gel de agarosa al 1,8% en buffer SB 1X de productos de PCR. ST:

Estándar de 100 pb, C-: control-, 3: PPT-001, 4: PPT-003, 5: PPT-005, 6: PPT-008. 3-6:

Se observa el fragmento esperado de 300pb.

53

A

B

200

300

ST C- 3 4 5 6 7 8 9 500

pb

Figura 17: PCR en tiempo real de P. salmonis PPT-001, A. hydrophila, F.

psychrophilum, E. ictaluri, V. vulnificus, F. aquatile y T. maritimum con partidores

PS_1. Se utilizó el protocolo de 40 ciclos con alineamiento a 57°C por 15 seg y

extensión a 72°C por 15 seg. A: Curva de disociación de productos de PCR. B:


Estándar de 50 pb, C-: control-, 3: control+ (PPT-001), 4: F. aquatile, 5: T. maritimum, 6:

F. psychrophilum, 7: A. hydrophila, 8: E. ictaluri, 9: V. vulnificus. 3-9: Se observa el

fragmento esperado de 300pb.

54

4.5.3 PCR en tiempo real de los aislados de P. salmonis PPT 001, 3, 5 y 8,


Se llevaron a cabo reacciones de PCR en tiempo real en las mismas condiciones

descritas anteriormente (4.4.2) pero con los partidores PS_5. El resultado de estas

pruebas evidencia que la temperatura de hibridación promedio del amplicón de P.

salmonis, aislados PPT-001, 3, 5 y 8, fue de 80,5ºC, con presencia de un pick único en

la curva de disociación (Figura 18A). En la Figura 18B se presenta el resultado del

fraccionamiento electroforético de los amplicones obtenidos en esta PCR, donde se

aprecia una banda única de 200pb en cada una de las cuatro cepas de P. salmonis

analizadas. Al evaluar la especificidad de los partidores PS_5 con ADN de otros

patógenos como templado (A. hydrophila, F. psychrophilum, E. ictaluri, V. vulnificus, F.

aquatile y T. maritimum) se observa ausencia de amplificación (Figura 19A), mientras

que el control positivo (P. salmonis aislado PPT 001) generó una banda discreta de 200

pb (Figura 19B). La amplificación de todos los aislados de P. salmonis en estudio,

además del nulo reconocimiento de A. hydrophila, F. psychrophilum, E. ictaluri, V.

vulnificus, F. aquatile y T. maritimum confirman la especificidad de los partidores PS_5

para detección de P. salmonis, por lo tanto fueron seleccionados como parte del kit.

55

1500

300

1000

100 pb

ST 2 3 4 5 C- B





Estándar de 100pb, 2: PPT-001, 3: PPT-003, 4: PPT-005, 5: PPT-008, C-: control. 2-5:

Se observa el fragmento esperado de 200pb.

56

A

200 300

100

pb

ST 2 3 4 5 6 7 8 C- B





Electroforesis en gel de agarosa al 2% en buffer SB 1X de productos de PCR. . ST:

Estándar de 50 pb, 2: control+ (PPT001), 3: A. hydrophila, 4: T. maritimum, 5: F.

psychrophilum, 6: F. aquatile, 7: E. ictaluri, 8: V. vulnificus, C-: control-. 2: fragmento

esperado de 200pb. 3-8: Se observa la esperada ausencia de amplificación.

57

4.5.4 PCR en tiempo real de los aislados de P. salmonis PPT 001, 3, 5 y 8,


Con la finalidad de evaluar la capacidad de amplificación del par de partidores

PS_7 se realizaron estudios de PCR en tiempo real utilizando como templado ADN

genómico de P. salmonis, aislados PPT-001, 3, 5 y 8. La Figura 20A muestra la curva

de disociación, con un pick de Tm de aproximadamente 81ºC, que además posee un

hombro con temperatura de disociación de 78,5ºC. Los productos de la reacción

anterior fueron sometidos a electroforesis en gel de agarosa, verificándose la

amplificación de un fragmento único de 150pb en todas estas muestras de P. salmonis

(Figura 20B). Por el contrario, no hubo amplificación cuando se usó ADN de A.

hydrophila, V. vulnificus y T. maritimum como templado, y muy baja intensidad de

fluorescencia en las muestras F. aquatile, E. ictaluri y F. psychrophilum. Estas últimas

muestras exhibieron temperaturas de hibridación menores a 79ºC, todo lo que se

verifica en la curva de disociación (Figura 21A). En la posterior electroforesis de estos

productos de PCR se evidencia una banda discreta de 150 pb, correspondiente a P.

salmonis aislado PPT 001 (control positivo) y ausencia de amplificación en las muestras

de ADN genómico de patógenos (Figura 21B).

En resumen los partidores PS_7 resultaron específicos para P. salmonis,

mostrando amplificación de bandas discretas de igual tamaño y Tm para todos los

diferentes aislados en estudio, y ausencia de amplificación para Aeromonas hydrophila,

Flavobacterium psychrophilum, Edwarsiella ictaluri, Vibrio vulnificus, Flavobacterium

aquatile y Tenacibaculum maritimum. Estas características lo confirman como parte del

kit.

58

A

B

150

200

100

ST C- 3 4 5 6

pb




Electroforesis en gel de agarosa al 2% en buffer SB 1X de productos de PCR. ST:

Estándar de 100 pb, C-: control-, 3: PPT001, 4: PPT003, 5: PPT005, 6: PPT008. 3-6: Se

observa el fragmento esperado de 150pb.

59

A

pb

200

100

150

ST C- 3 4 5 6 7 8 9 B





Electroforesis en gel de agarosa al 2% en buffer SB 1X de productos de PCR. STD:

Estándar de 50pb, C-: control-, 3: control+ (PPT001), 4: A. hydrophila, 5: F.

psychrophilum, 6: T. maritimum, 7: F. aquatile, 8: E. ictaluri, 9: V. vulnificus. 3:

Fragmento esperado de 150pb. 4-9: Se observa la esperada ausencia de amplificación.

60

4.6 Estandarización de PCR múltiple para detección de P. salmonis.

Luego de haber seleccionado los pares de partidores adecuados para generar el

kit de PCR múltiple en tiempo real, se procedió a determinar la razón adecuada de

concentraciones entre cada par de partidores que generará la amplificación de los tres

fragmentos esperados, pues al mezclarlos en la misma concentración en una misma

reacción se observó dominancia. Es por esto que se realizaron diferentes PCRs

utilizando ADN genómico de P. salmonis, aislado PPT-003, y sólo dos pares de

partidores por reacción. Para la primera de estas reacciones se utilizaron los partidores

PS_7 en concentración 332 nM y PS_1 desde 33,2 nM a 332 nM, cuyo resultado se

visualizó en una electroforesis en gel de agarosa que muestra la amplificación de las

bandas esperadas de 150 pb y 300pb con las diferentes concentraciones de PS_1

probadas, en todas estas condiciones se obtuvo sólo las bandas del tamaño esperado y

ausencia de fragmentos inespecíficos (Figura 22A). Luego, se realizaron PCRs

utilizando ADN genómico de P. salmonis, aislado PPT-003, pero con los partidores

PS_7 en concentración 332 nM y PS_5 33,2 a 265,6 nM. En la Figura 22B se observa la

amplificación de la banda de 150 pb, mientras que aparece una banda de 200 pb al

utilizar las concentraciones 132,8 nM y 265,6 nM de PS_5.

61

A ST C- 3 4 5 6 7

300

Figura 22: Electroforesis en gel de agarosa al 1,8% en buffer SB 1X de productos

de PCR de P. salmonis PPT-003. Se utilizó el protocolo de 35 ciclos con 1 minuto de

alineamiento a 55ºC y 45 segundos de extensión a 72ºC. A: Se utilizó partidores PS_7

332nM y PS_1 en gradiente de concentración. ST: Estándar de 50 pb, C: control-, 3:

PS_1 33,2nM, 4: PS_1 66,4nM, 5: PS_1 132,8nM, 6: PS_1 265,6nM, 7: PS_1 332nM.

3-7: Se observa la amplificación de las bandas esperadas de 150 y 300pb. B: Se utilizó

partidores PS_7 332nM y PS_5 en gradiente de concentración. ST: Estándar de 50 pb,

C: control-, 3: PS_5 33,2nM, 4: PS_5 66,4nM, 5: PS_5 132,8nM, 6: PS_5 265,6nM. 5 y

6: Se observa la amplificación de los fragmentos esperados de 200 y 150 pb.

200

100

300

150

pbpb

B

100

200

50

ST C- 3 4 5 6

200

150 pb

pb

62

Finalmente, se utilizó ADN genómico de P. salmonis, aislados PPT-005 y PPT-

008, y de T. maritimum con los tres pares de partidores en concentraciones diferentes

para realizar PCRs múltiples en tiempo real, con el objetivo de determinar las que

generen la amplificación de los fragmentos esperados para P. salmonis y T. maritimum

Para esto, se analizó la combinación de los partidores PS_1 en concentración 375 nM o

PS_5 375 nM y PS_7 62,5 nM. Los resultados se muestran en la curva de disociación

de la Figura 23A, que muestra la Tm de 84,2ºC para PPT-005 con PS_1 en

concentración 375 nM, de 84,3ºC para PPT-005 y PPT-008 con PS_1 187,5 µM, de

83,8ºC para PPT-008 con PS_1 375 nM, de 85,3°C para T. maritimum con PS_1 375

nM y de 85,8ºC para T. maritimum con PS_1 187,5 µM. Se analizaron los productos de

esta PCR múltiple en tiempo real por medio de un fraccionamiento electroforético en gel

de agarosa (Figura 23B), observándose la amplificación de tres bandas con P. salmonis

PPT-005 y 008, de 300, 200 y 150pb; sin embargo, se observa mayor definición de las

bandas y una intensidad similar entre cada una de ellas al utilizar PS_1 187,5 µM. Por

otro lado, con T. maritimum se observa una banda única de 300pb, sin importar si se

utiliza 375 nM ó 187,5 µM. Como resultado de todas estas pruebas se determinó que

los partidores se utilizarán en el kit en las siguientes concentraciones: PS_1 187,5 µM,

PS_5 375 nM y PS_7 62,5 nM.

63

A

B

pb

150

200

300 300

100 pb

ST C- 3 4 5 6 7 8

200

500

Figura 23: PCR en tiempo real de P. salmonis aislados PPT-005 y 8, además de T.

maritimum con partidores PS_5 375nM, PS_7 62,5nM y PS_1 375nM ó 187,5µM. Se

utilizó el protocolo de amplificación de 45 ciclos con 40 seg de alineamiento-extensión a

60°C. A: Curva de disociación de productos de PCR. B: Electroforesis en gel de

agarosa al 2% en buffer SB 1X de productos de PCR. ST: Estándar de 100 pb, C-:

control-, 3: PPT-005 PS_1 375nM, 4: PPT-005 PS_1 187,5µM, 5: PPT-008 375nM, 6:

PPT-008 187,5µM, 7: T. maritimum PS_1 375nM, 8: T. maritimum PS_1 187,5µM. 3-6:

Se observa las bandas esperadas de 150, 200 y 300pb. 7 y 8: Se observa la

amplificación del fragmento esperado de 300pb.

64

4.7 Análisis de la especificidad del PCR múltiple generado para P. salmonis.

Una vez determinada la razón de concentraciones entre los partidores que

generan los tres fragmentos esperados en una misma mezcla de reacción, se evaluó la

especificidad del kit de partidores desarrollado en esta tesis. Para esto se llevaron a

cabo diferentes PCR múltiples en tiempo real, utilizando como templado de la reacción

diferentes muestras: ADN genómico de diferentes aislados chilenos de P. salmonis, de

patógenos de peces, y ADN total de órganos de salmones control o infectados

experimentalmente con P. salmonis.

4.7.1 PCR múltiple en tiempo real de distintos aislados chilenos de P.

salmonis.

Primero se evaluó la capacidad de amplificación que posee el kit de partidores

desarrollado en esta tesis. Así se realizó PCR múltiples en tiempo real utilizando como

templado ADN genómico de distintos aislados de P. salmonis. En la Figura 24 se

muestran las curvas de disociación de 30 reacciones de PCR múltiple en tiempo real

que utilizaron como templado diferentes aislados chilenos de P. salmonis. El resultado

evidencia que las Tm de todas las reacciones se encuentran en el rango de 84,4 a

85,4ºC, además se logra distinguir un segundo pick entre 81 y 82ºC. El fraccionamiento

en gel de agarosa de los productos de estos PCR múltiples en tiempo real verifica la

amplificación de los tres fragmentos esperados de 300, 200 y 150 pb (Figura 25). En

base a estos resultados se puede afirmar que el kit de PCR múltiple en tiempo real es

capaz de detectar diferentes aislados chilenos de P. salmonis.

65

Figura 24: Curva de disociación de productos de PCR en tiempo real de distintos

aislados chilenos de P. salmonis con partidores PS_1 187,5nM, PS_5 375nM y

PS_7 62,5nM. Se utilizó el protocolo de amplificación de 35 ciclos con 40 seg de

alineamiento-extensión a 60°C. PCR.

66

A ST C- 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

200

300

100 pb

300200150

pb

pb pb

300 200 150

300

200

100

ST C- 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 B

Figura 25: Electroforesis en gel de agarosa al 2% en buffer SB 1X de productos de

PCR en tiempo real de distintos aislados chilenos de P. salmonis con partidores

PS_1 187,5nM, PS_5 375nM y PS_7 62,5nM. Se utilizó el protocolo de amplificación de

35 ciclos con 40 seg de alineamiento-extensión a 60°C. A: ST: Estándar de 100 pb, C-:

control-, 3: PPT-002, 4: PPT-003, 5: PPT-005, 6: PPT-008, 7: PPT-009, 8: PPT-010, 9

PPT-011, 10: LF-89, 11: IBM2 12: IBM3, 13: IBM5, 14: IBM6, 15: IBM7, 16: IBM9, 17:

IBM10. B: Electroforesis en gel de agarosa al 2% en buffer SB 1X de productos de

PCR. ST: Estándar de 100 pb, C-: control-,3: IBM11, 4: IBM13, 5: IBM14, 6: IBM15, 7:

IBM 16, 8: IBM17, 9: IBM18, 10: IBM21, 11:IBM22, 12: IBM24, 13: IBM25, 14: IBM27,

15: IBM30, 16: IBM32, 17: IBM34. A y B 3-17: Se observa las bandas esperadas de

150, 200 y 300pb.

67

4.7.2 Análisis de la especificidad del PCR múltiple en tiempo real diseñado

utilizando ADN de otros patógenos de peces.

Se realizaron diferentes reacciones de PCR múltiple en tiempo real para probar la

especificidad del kit de partidores desarrollado en este trabajo utilizando ADN genómico

de distintas especies bacterianas como templado. La Figura 26A presenta las curvas de

disociación de los productos de PCR múltiple en tiempo real a partir de diversas

especies de patógenos de salmones. En el gráfico se observan las Tm de los productos

de amplificación, que fueron de 87ºC para Aeromonas hydrophila, 84,9ºC para Vibrio

vulnificus, Flavobacterium psychrophilum y Edwarsiella ictaluri, 85,4ºC para

Flavobacterium aquatile y para Tenacibaculum maritimum. Debe destacarse la

presencia de un segundo pick con temperatura de disociación de 86,95ºC para F.

psychrophilum y de 87,4ºC para F. aquatile. Se corroboró la amplificación de

fragmentos únicos de 300 pb y la ausencia de otros productos por medio de

electroforesis en gel de agarosa (Figura 26B). Gracias a este análisis se comprobó la

especificidad del kit de PCR múltiple en tiempo real para detección de P. salmonis, pues

los partidores PS_5 y PS_7 no permiten amplificar un producto a partir del ADN de otros

patógenos de salmones en estudio.

68

A

pb

ST C- 3 4 5 6 7 8

300 400

B

Figura 26: PCR en tiempo real de A. hydrophila, F. psychrophilum, E. ictaluri, V.

vulnificus, F. aquatile y T. maritimum con partidores PS_1 187,5nM, PS_5 375nM y

PS_7 62,5nM. Se utilizó el protocolo de amplificación de 35 ciclos con 40 seg de

alineamiento-extensión a 60°C. A: Curva de disociación de productos de PCR. B:

Electroforesis en gel de agarosa al 2% en buffer SB 1X de productos de PCR. ST:

Estándar de 100pb, C-: control-, 3: E. ictaluri, 4: T. maritimum, 5: F. aquatile, 6: F.

psychrophilum, 7: V. vulnificus, 8: A. hydrophila. 3-8: Se observa las bandas esperadas

de 300pb.

69

4.7.3 PCR múltiple en tiempo real de peces control o infectados con P.

salmonis.

Luego de demostrar que el kit de partidores para PCR múltiple en tiempo real

desarrollado en este trabajo permitió amplificar productos de tamaño esperado a partir

de ADN genómico de 30 diferentes aislados de P. salmonis, y de probar la especificidad

de este kit al analizar el ADN genómico de diversas familias de patógenos de peces, se

procedió a evaluarlos con ADN extraído desde tejidos de salmones. Esta vez, se

repitieron las reacciones de PCR múltiple en tiempo real utilizando ADN total extraído

desde riñón de salmones control o infectados con P. salmonis. Los resultados de estos

experimentos se muestran en las curvas de disociación en la Figura 27A, que destacan

la amplificación de un producto con Tm de 85ºC a partir de ADN de riñón infectado, y

mostrando un segundo pick de 81ºC, independientemente de la cantidad de ADN

utilizado como templado en la PCR. En la muestra de riñón control, con 22 ng de ADN

se observó un producto con Tm de 85º y un segundo pick con Tm de 87,5ºC; sin

embargo, al realizar la PCR con 6 ng de la misma muestra se observó una Tm de

87,5ºC y un segundo pick con temperatura de 85,5ºC. Para analizar los tamaños de los

productos de amplificación se llevó a cabo una electroforesis en gel de agarosa,

observándose una banda de 300 pb en la muestra de riñón control, mientras que con

ADN de riñón infectado con P. salmonis se logró la amplificación de las tres bandas

esperadas de 300, 200 y 150 pb (Figura 27B). Estos resultados demuestran que el kit

de partidores desarrollado en esta tesis permite la detección específica de P. salmonis

en órganos de salmón.

70

pb 150 pb

ST C- 3 4 5 6

200 300

B

A

Figura 27: PCR en tiempo real de riñón control e infectado con P. salmonis con

partidores PS_1 187,5nM, PS_5 375nM y PS_7 62,5nM. Se utilizó el protocolo de

amplificación de 35 ciclos con 40 seg de alineamiento-extensión a 60°C. A: Curva de

disociación de productos de PCR. B: Electroforesis en gel de agarosa al 2% en buffer

SB 1X de productos de PCR. ST: Estándar de 100 pb, C-: control-, 3: riñón sin infectar

con P. salmonis (6ng), 4: riñón sin infectar con P. salmonis (22 ng), 5: riñón infectado

con P. salmonis (6ng), 6: riñón infectado con P. salmonis (22ng).

71

5. DISCUSIÓN

La septicemia rickettsial salmonídea es una infección de tipo sistémica y crónica

que afecta generalmente a los salmónidos durante la fase marina del cultivo, sin

embargo se han descrito brotes de la enfermedad en agua dulce en la Décima Región

de Chile (Bravo, 1994, Gaggero et al. 1995).

El diagnóstico presuntivo, en peces enfermos, se puede realizar mediante la

detección de bacterias dentro de macrófagos o hepatocitos, en cortes histológicos o en

improntas de tejido, utilizando Hematoxilina-Eosina o Giemsa (Fryer et al., 1990;

Cvitanich et al., 1991, Lannan et al., 1991, Larenas et al., 1995). Para confirmar la

presencia de P. salmonis se debe aislar este patógeno desde cultivo celular y realizar la

prueba de inmunofluorescencia indirecta (Lannan et al., 1991) o ELISA (Aguayo et al.,

2002), mientras que el ensayo de PCR convencional (Mauel et al., 1996, Marshall et al.

1998) o en tiempo real (Corbeil et al., 2003, Karatas et al., 2008) puede ser aplicado

directamente en tejidos.

Se realizó análisis de especificidad al método de diagnóstico desarrollado para P.

salmonis, por Karatas et al. (2008). Este se basa en la amplificación del gen ARNr 16S

por PCR en tiempo real. El resultado al utilizar ADN genómico de aislados de P.

salmonis, Aeromonas hydrophila, Flavobacterium psychrophilum y Tenacibaculum

maritimum fue la generación, en todos los casos, de productos de amplificación con Tm

de alrededor de 85ºC y tamaño de 150 pb.

72

Estos resultados permiten afirmar que el sistema de detección descrito por Karatas

et al. no discrimina entre P. salmonis y otros patógenos de peces. En base a estos

antecedentes, se propuso el desarrollo un PCR múltiple en tiempo real para la

detección específica y sensible de P. salmonis, aplicable directamente en extractos de

ADN de órganos de salmón.

El procarionte Piscirickettsia salmonis es un patógeno intracelular que fue aislado

por primera vez en Chile en el año 1989 desde salmones de cultivos afectados por alta

mortalidad (Fryer et al., 1990). Todas las edades son susceptibles, desde los alevines

hasta los adultos y los peces enfermos muestran síntomas compatibles con muchas

enfermedades inflamatorias crónicas y sistémicas de los salmónidos (Schafer et al.

1990), sin embargo aparecen nódulos poligranulomatosos agrupados, multifocales, de

color blanquecino amarillento en el hígado, que son en cierta medida únicas en la

piscirickettsiosis, aunque muchos peces enfermos no las presentan (Fryer et al., 1990,

Cvitanich et al., 1991, Larenas et al., 1995, Olsen et al., 1997).

Ya que la infección con diferentes patógenos de salmónidos provoca en los peces

signos clínicos similares a la septicemia rickettsial salmonídea, se incluyó dentro del kit

de partidores un control interno de la presencia de ADN bacteriano, basado en el gen

ARNr 23S, con el objetivo de evitar resultados confusos, como sería reportar una

muestra como libre de infección cuando el agente causante sea distinto de P. salmonis.

Los procariontes poseen ribosomas que presentan un coeficiente de

sedimentación de 70S (Svedberg), formados por una subunidad (50S) que contiene dos

moléculas de ARNr (23S y 5S) y 34 proteínas básicas; mientras que la subunidad (30S)

contiene una molécula de ARNr de 16S además de 21 proteínas.

73

En bacterias, los genes que codifican los ARN ribosomales están organizados en

operones. Cada operón ribosómico incluye genes para los ARNr 23S, 16S y 5S,

separados por regiones espaciadoras o intergénicas (ITS), y contiene además genes

para uno o más ARN de transferencia (ARNt; Watson et al., 1987, Rodicio y Mendoza

2004).

Los genes de los ARNr son esenciales para la supervivencia de todos los

organismos y son altamente conservados entre las bacterias y miembros de otros

reinos (Woese 1987, Amann et al., 1995). Estos genes se encuentran presentes en

todas las especies bacterianas, de los cuales, el gen ARNr 16S se encuentra bien

caracterizado como un marcador genético para la identificación de familias, género y

especies bacterianas (Woese 1987, Amann et al., 1995).

Piscirickettsia salmonis fue clasificada como gammaproteobacteria en base a la

secuencia del gen ARNr 16S (Fryer et al. 1992). Además ha sido demostrado que la

secuenciación de la región ITS es útil para diferenciar especies procariontes (Barry et

al., 1991, Jensen et al., 1993), sin embargo realizar análisis filogenéticos en especies

que poseen más de un operón ribosomal puede ser complicado debido a la variación de

secuencia entre los operones (Frothingham y Wilson 1993).

Casanova et al, en el año 2001 describieron la amplificación de dos regiones

ITS, confirmadas por Southern Blot y secuenciación, una de las cuales corresponde a

la anteriormente descrita por Mauel et al. en 1999, mientras que la segunda contiene la

inserción de los genes que codifican para los ARNt de isoleucina y alanina. También se

ha descrito que el análisis de ciertas regiones del ARNr 16S, ITS y 23S proveen similar

información filogenética entre diferentes aislados de P. salmonis (Mauel et al., 1999).

74

Sin embargo hasta la fecha, no se ha descrito la secuencia completa del gen

codificante del ARNr 23S de P. salmonis, por lo que en nuestro laboratorio se propuso

secuenciar este gen y así contribuir en la investigación de la detección de la septicemia

rickettsial salmonídea.

Como primer paso, se diseñó los partidores heterólogos, basados en el gen ARNr

23S de patógenos de peces cercanamente emparentados con P. salmonis. Mediante

múltiples PCR en gradiente, utilizando estos partidores, se logró amplificar un producto

de 3034 pb.

Este tamaño es el esperado para la secuencia del gen ARNr 23S, según lo

descrito en la base de datos, para otras proteobacterias, como son Legionella sp. (gi

54295983, gi 148358139, gi 52840256, gi 52840256, gi 54292964), Francisella sp. (gi

56707187, gi 110669657), Coxiella sp. (gi 212011950) y Pseudomonas sp. (gb

U65012.1, gi 151549), todas pertenecientes a la subdivisión gamma (Forsman et al.,

1994, Kersters et al.,1996, Roux et al., 1997).

Sin embargo, según el análisis nucleotídico de la secuencia obtenida en esta

tesis, de la región ITS y las secuencias parciales del gen ARNr 23S descritas en la base

de datos (gb AY607585.1, gb EU289216.1, gb AF205384.1, gb AF205383.1, gi

159906328, gi 159906320, gi 159906321, gi 159906322, gi 159906323, gi 159906324,

gb U36946.2, gb U36944.2, gb U36943.2, gb U62104.2, gb U62103.2, gi 159906327, gi

159906326, gi 159906325), sólo 2095 pb corresponden al gen 23S de P. salmonis.

Se observó que ésta presentó un alto grado de identidad con la secuencia descrita

para el ARNr 23S de Pseudomonas stutzeri (gi 2244673), cuyo género se encuentra

cercanamente relacionado a P. salmonis. (Fryer et al., 1992).

75

A partir de la secuencia del gen ARNr 23S obtenida para P. salmonis y las

descritas en la base de datos para diferentes especies bacterianas, se realizó

alineamientos múltiples, con el fin de identificar regiones altamente conservadas

(Aeromonas hydrophila gi 66277316, Aeromonas salmonicida gi 142849896,

Flavobacterium psychrophilum gi 150024114, Flavobacterium columnare gi 154759415,

Renibacterium salmoninarum gi 162952245, Yersinia pestis gi 22123922, entre otros).

Se desarrolló, en secuencias altamente conservadas, un par de partidores que fue

capaz de amplificar diferentes aislados de P. salmonis con Tm de 83,9ºC, así como

también A. hydrophila, F. psychrophilum, E. ictaluri, F. aquatile, T. maritimum y V.

vulnificus con Tm entre 84,1ºC y 86,6ºC. Todos estos productos de PCR en tiempo real

presentaron un tamaño de 300 pb.

Las proteínas de shock térmico como Hsp60 y Hsp70 están involucradas en el

proceso patogénico de bacterias como P. salmonis. Estas proteínas actúan como

chaperonas, es decir, ayudan en el plegamiento de otras proteínas, siendo claves

durante estrés térmico o estrés en general, ayudando a la bacteria a sobrevivir en esas

situaciones (Morano 2007, Zeilstra-Ryalls et al., 1991).

Los genes Hsp60 y Hsp70 son omnipresentes, de una sola copia en los genomas

y son un blanco de ADN más universal para identificación microbiana a nivel de

especie, pues posee secuencias bien conservadas intraespecie, pero con variaciones

suficientes para permitir la identificación especie específica, además se ha demostrado

que posee mayor poder discriminador que el gen ARNr 16S entre géneros (Goh et al,.

1996, 1998 y 2000, Blaiotta et al., 2008).

76

Las secuencias de los genes Hsp60 y Hsp70 de P. salmonis se encuentran

descritas en GenBank (gi 56131582, gi 56131584), al igual que las de otros patógenos

de salmónideos (Yersinia pestis gi 30407161, Flavobacterium psychrophilum gi

61967803, Legionella pneumophila gi 52840256, Aeromonas salmonicida gi

145297124, Aeromonas hydrophila gi 117558854, Francisella philomiragia gi

167626225, Renibacterium salmoninarum gi 162952245, entre otras).

Se desarrollaron entonces dos pares de partidores capaces de amplificar

secuencias específicas de P. salmonis. El primero de ellos, PS_5, basado en el gen

Hsp60, permitió amplificar productos de 200 pb con Tm de 80,5ºC con los distintos

aislados de P. salmonis analizados. El segundo, PS_7, que está basado en el gen

Hsp70, amplificó fragmentos únicos de 150 pb con Tm de 81ºC, además de un hombro

con temperatura de disociación de 78,5ºC con los distintos aislados de P. salmonis

estudiados.

Estos dos pares de partidores basados en los genes Hsp60 y Hsp70 de P.

salmonis no amplificaron ADN de los aislados de A. hydrophila, F. psychrophilum, E.

ictaluri, F. aquatile, T. maritimum y V. vulnificus, corroborado en la electroforesis y en la

curva de disociación luego de ejecutado el programa de amplificación.

PS_7 que mostró una pequeña fluorescencia residual en las muestras F. aquatile,

E. ictaluri y F. psychrophilum, debida probablemente a la fluorescencia basal que

presenta SYBR Green I libre en solución, o bien a la formación de dímeros de

partidores pues mostró una Tm baja, cuya intensidad es tan reducida que no se observa

en la electroforesis.

77

Una vez comprobada la capacidad de amplificación de los partidores diseñados en

esta tesis, se procedió a estandarizar las concentraciones de estos partidores que

generan la amplificación de los fragmentos esperados para P. salmonis. Por PCR

convencional, la razón entre los partidores PS_7 y PS_1 fue de 10 a 1 hasta 1 a 1, de lo

que se deduce que no hay problemas de amplificación para ambos juegos de

partidores, mientras que para PS_7 y PS_5 fue de 10 a 4-8, por lo que la concentración

de este último partidor fue mayor a la de PS_1 en el kit múltiple. Por PCR múltiple en

tiempo real la razón de concentraciones entre los partidores PS_1, PS_5 y PS_7 fue de

3: 6: 1, la Tm promedio determinada con ADN de P. salmonis fue de 84,2ºC, mientras

que con T. maritimum fue de 85,6ºC. En todas las condiciones sólo se obtuvieron las

bandas del tamaño esperado y ausencia de fragmentos inespecíficos.

Por PCR múltiple en tiempo real con 30 muestras de P. salmonis las Tm se

encontraron en el rango de 84,4 a 85,4ºC, de acuerdo con lo esperado al utilizar los

partidores PS_1. Se observó un segundo pick con Tm entre 81 y 82ºC, que

probablemente se deba a la amplificación de los fragmentos generados por PS_5 y/o

PS_7, con Tm esperadas de 80,5ºC y 81ºC, respectivamente, generando bandas de

300 pb, correspondiente a lo esperado para la amplificación con PS_1, de 200 pb,

concordante con el amplicón de PS_5 y de 150 pb según lo esperado para PS_7. Al

realizar el análisis con muestras de patógenos de salmones, las Tm variaron entre

84,9ºC y 87ºC, con presencia de un segundo pick con temperatura de disociación de

86,95ºC para F. psychrophilum y de 87,4ºC para F. aquatile, aún cuando estos

fragmentos fueron de 300 pb, con ausencia de otros productos inespecíficos. Además,

los productos de amplificación de F. psychrophilum y F. aquatile mostraron dos picks en

78

las curvas de disociación, al igual que las de P. salmonis, sin embargo la diferencia en

las temperaturas de melting permite una clara diferenciación entre muestras positivas

para P. salmonis y negativas para P. salmonis que contienen ADN de otros patógenos.

Un resultado muy importante de esta tesis es el hecho de que se demostró la baja

especificidad que presenta el método de detección para P. salmonis descrito en la

literatura (Karatas et al., 2008), al observar amplificación de fragmentos de 150 pb y Tm

cercana a 85ºC tanto con ADN de P. salmonis, como de A. hydrophila, F. psychrophilum

y T. maritimum.

Se ha descrito que los tejidos de peces infectados por Piscirickettsia salmonis

apropiados para el examen en cultivos celulares, PCR, improntas de tejido e histología

son riñón, hígado y sangre, recogidos de los peces enfermos durante las enfermedades

visibles o encubiertas (Lanan and Fryer, 1991). Es por esto que finalmente se analizó la

capacidad del kit de partidores desarrollado en esta tesis para detectar P. salmonis en

riñón de salmón infectado y riñón de salmón control. La muestra infectada generó

productos de PCR con Tm de 85ºC y un segundo pick de 81ºC, mostrando bandas

únicas de 300 pb, de acuerdo a lo observado en los PCR múltiples en tiempo real que

utilizaron como templado diferentes aislados chilenos de P. salmonis. Las curvas de

disociación de los productos amplificados a partir de estos órganos infectados con P.

salmonis son tan similares a las obtenidas con ADN genómico de cultivo puro de P.

salmonis, que permiten su detección a partir de muestras de ADN total extraído

directamente desde el tejido completo. Además, se debe mencionar que los riñones

infectados con P. salmonis fueron extraídos de salmones que no murieron de SRS, por

lo que con este kit es posible detectar tempranamente la infección por P. salmonis, lo

79

que permite el manejo adecuado para prevenir la transmisión. En el caso de

presentarse falsos negativos, debido a una muy baja cantidad de ADN de este

patógeno, puede utilizarse un kit de extracción de ADN bacteriano desde tejidos, pues

en este trabajo se utilizó un kit para extracción de ADN total. La muestra de riñón

control presentó dos picks de disociación, uno de alrededor de 85ºC y el otro de 87,5ºC,

correspondientes a una banda única de 300 pb. De lo anterior se concluye la presencia

de ADN bacteriano en esta muestra de riñón de salmón, pues las curvas de tejido

control son tan diferentes de las que se obtuvieron con ADN puro de P. salmonis y con

riñón infectado con P. salmonis, que permiten su discriminación clara sólo basada en el

análisis de estos datos.

El conjunto de características antes descritas de este kit de PCR múltiple en

tiempo real, entre las que destacan su alta eficiencia y específicidad, lo presentan como

un potencial método para utilizarse en la industria, para la detección de P. salmonis en

muestras de salmones.

80

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