PCR

Julián Sanz Ortega

Índice

• Concepto

• Técnica

• Puesta a punto, problemas

• PCR- transcripción inversa

• ¿Qué hacer con el producto de PCR?

• Aplicaciones

Genoma humano

3.1 x 109 pb

22,000 genes = 5% of genome 30% con instrucciones

para hacer proteínas

70% con instrucciones para regular la translación a proteínas de otros genes:

• Ribosomal (rRNA) • Transfer RNA (tRNA) • Small nucleolar RNA

(snoRNA) • Micro RNA (miRNA)

1.- Concepto

RNA transcription

pre-mRNA

splicing

mRNA

ribosome

mRNA A(n)

exon intron exon intron exon Gene

translation

protein

Genética y epigenética 1.- Concepto

Concepto

1.- Concepto

2.- Técnica

3 PASOS 2.- Técnica

2.- Técnica

PCR a “tiempo real”

• “Semicuantitativa”.

2.- Técnica

Diseño oligonucleótidos

• Longitud: 18-24 nucleótidos.

• “Melting temperatures” (Tm)(G+Cx4,A+Tx2), “Annealing temperatures” (Ta) similares en ambos primers. (Ta = Tm - 2-4º)

• No complementarios: evitar “primer dimer”.

• No secuencias palindrómicas . Distancia óptima entre oligos: 100-500 bp (parafina preferiblemente menos de 300).

2.- Técnica

Diseño de oligos

• Revisar literatura

• Genebank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=Nucleotide) , buscar “amplimer” y “protocols” para cada gen.

• Online. Ej: – Primer3: WWW primer tool (University of

Massachusetts Medical School, U.S.A.)

– GeneFisher - Interactive PCR Primer Design (Universitat Bielefeld, Germany)

– PCR Now (Computational Biology Group, PathoGene, Southwestern Medical Center, U.S.A.)

2.- Técnica

Confirmar amplificación

• Electroforesis: Tamaño

adecuado ¿?

• Enzimas de restricción

(al menos 2).

• PCR nested

• Secuenciación.

• Hibridación.

2.- Técnica

Optimización de PCR

• SIEMPRE examen histopatológico previo. (¿Microdisección?)

• SIEMPRE ajustar condiciones a nuestro laboratorio.

• Sensibilidad y especificidad. Trucos:

– Ta: bajar si no hay producto, subir si bandas inespecíficas.

– MgCl2: Bajar si bandas inespecíficas.

– Otras: Taq, temperaturas y tiempos, nº ciclos

• SIEMPRE CONTROLES.

3.- Puesta a punto, problemas

Controles

• Control calidad de ADN

• Control positivo

• Control negativo: No ADN.

• ¿Control normal del mismo paciente?

3.- Puesta a punto, problemas

Evitar contaminaciones

• 2 habitaciones: Pre y post-PCR

• Cabinas con RX UV.

• Cuidado con “Hot-Start” !!

• Hacer alícuotas.

• Sentido común.

3.- Puesta a punto, problemas

RT-PCR

4.-PCR- trascripción inversa

Paso1: Extracción de ARN

Paso2: Transcriptasa inversa: cADN

Paso 3: Amplificación- PCR

Paso 4: Visualizar en gel

METILACION ONLINE: www.urogene.org/methprimer

3´-CTACTGATTGCAGG-5´ m

3´-CTACTGATTGCAGG-5´

3´-UTAUTGATTGCAGG-5´ m

5´-AATAACTAACG-3 3´-UTAUTGATTGCAGG-5´ m

3´-UTAUTGATTGUAGG-5´

PCR

5´-AATAACTAACG-3 3´-UTAUTGATTGUAGG-5´

mismatch

No PCR

Bisulfite treatment

MS PCR

• Identificar secuencias “intrusas”: infeccioso.

• Identificar mutaciones:

– Mutaciones puntuales: secuenciación, SSCP, RFLP, DGG…

– Deleciones: secuenciación, análisis fragmentos

– Amplificaciones: PCR tiempo real

– Traslocaciones: RT-PCR

• Identificar polimorfismos

• Expresión:

– ARNm: RT-PCR

– Hipermetilación

• Electroforesis

• Análisis de fragmentos

• Restricción

• Técnicas adicionales

5.-¿Qué hacer con el producto de PCR?

microARN?

Diagnóstico

• Traslocaciones específicas: linfomas,

sarcomas

• Mutaciones específicas tumores sólidos:

GIST, renal, tiroides.

• Cáncer familiar: Colon, mama, riñon..

• Reordenamientos en linfomas.

• Errores filiación, metástasis de laboratorio

• Infeccioso

6.- Aplicaciones

El cáncer de riñón no es una única enfermedad:

6.- Aplicaciones

THYROID TUMORS

• PAX8/PPARg rearrangement • RAS mutation

• RET mutation • bRAF mutation

• Mitochondrial DNA mutation

FOLLICULAR CA

PAPILLARY CA

6.- Aplicaciones

TUMOR CLS. HÜRTHLE

GIST www.ensembl.org (SNPs) K

ACTTCCTTATGATCACAAATGGGAGTTTCCCAGAAACAGGCTGAGT

-L--P--Y--D--H--K--W--E-=F=-P--R--N--R--L--S--F--G--K--T--

6.- Aplicaciones

Tumour Chrom. abnormality Fusion gene Prevalence Prognosis

-Rhabdomyosarcoma

Botryoid NA NA NA Good

Spindle cell NA NA NA Good

Embryonal Gains of 2, 7, 8, 12, 13; GF2, GOK, NA Good

losses of 1, 6, 9, 14, 17 PTCH TP53

Alveolar t(2;13)(q35;q14); PAX3-FKHR 75% Poor

t(1;13)(p36;q14) PAX7-FKHR 10%

Undifferentiated NA NA NA Poor

- EWS family

EWS/PNET t(11;22)(q24;q12) EWS-FLI-1 85–95%

Good (type I) t(21;22)(q22;q12) EWS-ERG 5–10%

t(7;22)(p22;q12) EWS-ETV1 <1%

t(17;22)(q21;q12) EWS-E1AF <1%

t(2;22)(q33;q12) EWS-FEV <1%

Inversion of 22q EWS-ZSG <1%

- DSRCT t(11;22)(p13;q12) EWS-WT1 >95% Poor

6.- Aplicaciones

Type of tumor Chrom. abnormality Fusion gene Prevalence Prognosis

Clear cell sarcoma t(12;22)(q13;q12) EWS-ATF1 90% Poor

Extraskeletal myxoid t(9;22)(q22–23;q11–12) EWS-TEC (CHN) 75% Good

chondrosarcoma t(9;15)(q22;q21) TCF12-TECNA

t(9;17)(q22;q11) TAF2N-TEC 25%

Extraskeletal mesenchymal CS der(13;21)(q10;q10) NA Poor

Synovial sarcoma t(X;18)(p11;q11) SYT-SSX1 65% Poor

SYT-SSX2 35%

SYT-SSX4 rare

Congenital/infantile-fibrosarcoma t(12;15)(p13;q25) ETV6-NTRK3 80%

Inflammatory myofibroblastic tumor t(1;2)(q25;p23) TPM3-ALK NA Good

t(2;19)(p23;q13) TPM4-ALK NA t(2;17)(p23;q23) CLTC-ALK NA

t(2;11;2)(p23;p15;q31) CARS-ALKNA

Myxoid/round cell liposarcoma t(12;16)(q13;p11) TLS-CHOP 95% Good

t(12;22)(q13;q12) EWS-CHOP rare

6.- Aplicaciones

Type of tumor Chrom. abnormality Fusion gene Prevalence Prognosis

Tenosynovial giant cell tumor t(1;2)(p11;q35–37) NA 40% NA Good

t(1;5)(p11;q22–31) 10%

t(1;11)(p11;q11–12) 10%

t(1;8)(p11;q21–22) 10%

Lipoblastoma Rearrang. 8q12, polysomy 8 PLAG1 70% Good

Malignant peripheral nerve sheath tumor

Complex changes NA NA Poor

DFSP Ring chromosome with sequences from chromosomes 17 and 22,

t(17;22)(q22;q13) COL1A1-PDGFB >99% Good

Giant cell fibroblastoma (juvenile form of DFSP)

t(17;22)(q22;q13) COL1A1-PDGFB

Desmoid tumor +8, +20, Deletion (5)(q21–22) NA

Alveolar soft part sarcoma t(X;17)(p11;q25) ASPL-TFE3 > 90% NA

6.- Aplicaciones

Ej: Diagnosis of the Small Round Blue Cell

Tumors Using Multiplex Polymerase Chain

Reaction (Chen at al, JMD 2007)

Chen et al., JMD 2007, Vol. 9,

Pronóstico

• Mutaciones específicas: GIST, carcinomas

renales y de tiroides.

• Inestabilidad de microsatélites en

carcinoma colo-rectal

• Pérdidas 1p/19q en oligodendroglioma

• Diferentes genes de fusión

(traslocaciones) en sarcomas?

• Otros: N-myc (neuroblastoma), HPV…

6.- Aplicaciones

Tratamiento

• Enfermedad mínima residual (mama

aprobado por FDA), micrometástasis.

• Tratamiento “a la carta”:

– Respuesta a inhibidores de EGFR

(Gefitinib) en Cáncer de pulmón.

– Respuesta a Imatinib en GIST. – Her2 (FISH)

6.- Aplicaciones

Conclusiones

• PCR es una técnica de amplificación.

• Útil para detectar mutaciones genómicas

(deleciones, puntuales, reordenamientos ..),

polimorfismos o agentes infecciosos.

• Útil para estudiar la expresión de ARNm

(RT-PCR) y la metilación.

• Aplicaciones al diagnóstico, pronóstico y

tratamiento.