Tecnología del ADN recombinante

•PCR

•Southern Blot

PCR

• El aislamiento de grandes cantidades de segmentos específicos de ADN puede ser realizado utilizando varias técnicas, una de las cuales es la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR).

• La PCR está basada en una reacción de síntesis de DNA llevada a cabo in vitro por la enzima Taq Polimerasa, una polimerasa de DNA resistente a la temperatura.

Componentes de la reacción:

• El tampón (buffer)

• Los nucleótidos (dNTP´s)

• Los cebadores (primers)

• El ADN (muestra)

• La polimerasa (taq Polimerasa)

Parámetros de la reacción:

• Temperaturas en cada parte del ciclo

• Duración de cada parte del ciclo

• Velocidad de enfriamiento y calentamiento

• Número de ciclos

• En abril de 1983, Kary Mullis da a conocer la técnica de reacción en cadena de la polimerasa, o PCR. Esta técnica ha invadido de tal forma la Biología Molecular, que hoy en día es muy difícil imaginar esta ciencia sin ella. En 1989, Science seleccionó el PCR como el principal desarrollo científico, y la Taq polimerasa como la molécula del año. En 1993, Kary Mullis recibió por este descubrimiento el Premio Nobel de Química.

• Gracias a la PCR, la "insuficiente cantidad de ADN" ya no es una limitación en la investigación en Biología Molecular, ni en los procedimientos de diagnóstico basados en el estudio del ADN. El número de aplicaciones de esta técnica parecen infinitas, y continúan creciendo sin parar. Una de sus posibles aplicaciones se centra en la secuenciación del ADN de muestras biológicas.

Desnaturalización• Dos pequeños fragmentos de ADN, típicamente

de 10 pares de bases, llamados primers, son sintetizados a través de otra técnica. Esos primers son pequeños fragmentos de ADN que son complementarios a cada una de las extremidades de la secuencia de ADN de interés. En un tubo de reacción son adicionados los primers, nucleótidos libres de todas las bases nitrogenadas (adenina, guanina,, timina y citosina), el ADN y una enzima especial resistente al calor llamada Taq polimerasa, que promueve la síntesis de ADN. La mezcla es calentada a 95°C lo que provoca la separación de las dos cadenas de ADN.

Alineamiento

• Enseguida, la mezcla es enfriada hasta 55°C, temperatura en la cual los primers se unirán a las regiones complementarias de las moléculas de ADN que están separadas. En este momento, dentro del tubo de reacción, todo el ADN está en forma de cadena simple, menos las dos pequeñas regiones en las cuales los primers de 20 pares de bases se ligarán a los dos lados de la secuencia de ADN.

Alargamiento (polimerización)

• La temperatura se eleva entonces hasta 72°C y la Taq polimerasa comienza a sintetizar un nuevo ADN, comenzando por las regiones en doble cadena, en donde cada uno de los primers se unió al molde de la muestra de ADN. La Taq polimerasa promueve la síntesis de ADN apenas en la región de doble cadena. La síntesis ocurre a una tasa de aproximadamente 20 nucleótidos por segundo, y en un minuto es sintetizada una nueva copia del fragmento que se quiere analizar.

Repetición del ciclo

• La reacción entonces es nuevamente calentada a 95°C causando nuevamente la separación de todo el ADN en las cadenas simples. Al final del primer ciclo hay dos cadenas de la molécula original de ADN mas dos copias de la región de interés.

• La temperatura es disminuida de nuevo a 55°C y ahora los primers se irán a unir a los cuatro sitios en las dos copias nuevas y también en la molécula original de ADN. LA temperatura del ciclo es nuevamente elevada a 72°C y se multiplican entonces las cuatro cadenas individualizadas.

• Estos ciclos son repetidos varias veces, típicamente 30 veces, en un aparato llamado termociclador. Al final de 30 ciclos de amplificación existen aproximadamente un millón de copias del segmento de ADN de interés por cada molécula molde original de la muestra inicial. Es así que podemos seleccionar un fragmento específico dentro de todo el ADN.

• Estos ciclos son repetidos varias veces, típicamente 30 veces, en un aparato llamado termociclador. Al final de 30 ciclos de amplificación existen aproximadamente un millón de copias del segmento de ADN de interés por cada molécula molde original de la muestra inicial. Es así que podemos seleccionar un fragmento específico dentro de todo el ADN