estandarización de la técnica q-pcr para la identificación
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Estandarización de la técnica Q-PCR para la
identificación de la enzima SoxA en bacterias asociadas a
la degradación del concreto
Adriana Olaya Acosta
Estudiante de Ingeniería Ambiental, Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental,
Universidad de los Andes, Bogotá, Colombia.
Asesora:
Johana Husserl Orjuela
Profesora asistente, Departamento de Ingeniería Civil y Ambiental, Universidad de
los Andes, Bogotá, Colombia.
Resumen
La corrosión microbiana del concreto ha sido un grave problema durante mucho tiempo.
Las bacterias que coexisten en las alcantarillas utilizan el sulfuro de hidrógeno para
producir ácido sulfúrico, el cual es el responsable de la corrosión. Estas bacterias contiene
la enzima SoxA la cual es la encargada de catalizar las reacciones sulfato oxidantes que se
llevan a cabo. Cuantificar estas bacterias en una muestra es de gran importancia para
realizar un análisis de riesgo y así poder tomar acciones preventivas en lugar de correctivas.
La técnica de Q-PCR brinda la posibilidad de cuantificar copias de ADN que contiene una
muestra a partir de primers específicos.
En el siguiente trabajo se expone el procedimiento necesario para la estandarización de la
técnica Q-PCR y el diseño de primers a partir de las bacterias que se encuentran
involucradas en la corrosión del concreto.
Palabras clave: corrosión microbiana, enzima SoxA, bacterias sulfato reductoras, Q-PCR.
Abstract
Microbial corrosion has been a grave issue for a long time. Bacteria that coexist in sewers
use hydrogen sulfide to produce sulfuric acid, which causes corrosion. These bacteria
contain SoxA enzyme, which is in charge of catalyzing the sulfide oxidation reactions that
are performed. It is very important to quantify these bacteria in order to make a risk
analysis and therefore take preventive actions instead of corrective actions. Q-CPR
technique provides the possibility of using specific primers to quantify copies of DNA that
are found inside a sample. This work presents the required procedure for the
standardization of Q-PCR technique and the design of primers by means of the bacteria that
are involved in concrete corrosion.
Keywords: microbial corrosión, SoxA enzyme, sulfate-reducing bacteria, Q-PCR.
1. Introducción
El sistema de alcantarillado constituye en un componente fundamental para una
ciudad ya que se encarga de transportar dentro de ella las aguas residuales que se
generan. Estos sistemas son fabricados principalmente con concreto, el cual es un
material muy utilizado en la construcción y se compone principalmente de cemento,
agregados y agua (Gutiérrez de López, 2003). Sin embargo dichos sistemas con el
paso del tiempo se van deteriorando, produciendo fracturas lo cual puede afectar el
funcionamiento adecuado del sistema.
El deterioro de estos sistemas requiere de un inmediato mantenimiento el cual
genera altos costos a la ciudad. En ciudades como Bogotá el problema es grande, ya
que no se tiene un diagnóstico detallado del estado de las tuberías (Gómez, 2012)
por lo que el mantenimiento generalmente es de carácter correctivo y no preventivo.
Uno de los mayores inconvenientes que se presenta en el sistema de alcantarillado
es la degradación del concreto, la cual se produce por diferentes mecanismos, uno
de ellos es el biológico. Estos sistemas contienen bacterias, sulfatos y materias
orgánicas, es decir, tienen todos los elementos requeridos para que se generen
compuestos sulfurosos (Elizondo Barquero, 2004).
Las bacterias más agresivas para el concreto son la H. neapolitanus y la A.
thiooxidans (Valdes, Ossandon, Quatrini, & Holmes, 2011), las cuales utilizan el
sulfuro de hidrógeno que se produce en las aguas residuales y producen ácido
sulfúrico, el cual es el causante de la corrosión afectando sus propiedades mecánicas
(Elizondo Barquero, 2004).
Estas bacterias tienen
. La enzima SoxA ayuda a catalizar la oxidación del azufre
(Espinosa . Gracias a la identificación de esta
enzima en las bacterias que actúan en el proceso de corrosión, se puede realizar una
cuantificación de ellas.
La técnica de Q-PCR es utilizada para amplificar y cuantificar las copias de ADN
mediante fluorescencia (Salto Sánchez, 2006), es decir se podría cuantificar las
bacterias con enzima SoxA en una muestra y a partir de allí realizar un análisis de
riesgo.
Para realizar la Q-PCR es necesario empezar con una estandarización de la técnica,
la cual se realiza con una cantidad de ADN conocido. En el siguiente trabajo se
expone el procedimiento para realizar dicha estandarización, haciendo énfasis en el
diseño de primers los cuales son obtenidos mediante la alineación de la secuencia
genética de la enzima SoxA de las bacterias involucradas en la corrosión del
concreto.
2. Marco teórico
2.1 Degradación del concreto
La corrosión microbiana del concreto afecta significativamente la vida útil de las
estructuras realizadas con este material. Esto provoca un aumento en los costos de
mantenimiento y en las acciones correctivas que las empresas deben realizar.
Las estructuras de concreto que principalmente se ven afectadas por la corrosión
biológica son las tuberías o tanques que contienen lixiviados, los sistemas de
drenaje, y las tuberías de alcantarillado, entre otros (Sanchez-Silva & Rosowsky,
2008).
Los alcantarillados sanitarios contienen bacterias, sulfatos y materias orgánicas, es
decir, tienen todos los elementos requeridos para que se generen compuestos
sulfurosos. Una condición que se debe cumplir siempre es la de tener condiciones
anaeróbicas. Estas condiciones anaeróbicas se desarrollan fácilmente dentro de un
alcantarillado sanitario debido a la diversidad de bacterias que hay presentes y que
consumen el oxígeno disuelto (Elizondo Barquero, 2004).
En el fondo de la tubería se genera una capa anaeróbica de lodos típicamente de
1mm de grosor. En esta parte los sulfatos de las aguas residuales son
biológicamente reducidos a sulfuros SO4= → S
= (Elizondo Barquero, 2004).
El sulfuro de hidrógeno es producido en el agua residual y posteriormente es
liberado como gas en la atmósfera de la tubería. En el techo de la tubería se realiza
la condensación y en esta parte varias bacterias coexisten, las cuales son las
encargadas de oxidar el sulfato de hidrógeno (Sawyer, McCarty, & Parking, 2003).
El sulfuro de hidrógeno es oxidado a ácido sulfúrico por las bacterias que viven en
las zonas húmedas no sumergidas (gotas de agua que se acumulan en la parte
superior de la tubería) (Elizondo Barquero, 2004). Químicamente lo que sucede es
que las bacterias utilizan el sulfuro de hidrógeno como un donador de electrones y
el oxígeno del aire como un aceptor de electrones, produciendo ácido sulfúrico H2S
+ 2O2 → H2SO4 (Madigan, Martinko, & Parker, 2000). El ácido sulfúrico produce la
corrosión.
Ilustración 1. Proceso de corrosión biológica en los alcantarillados sanitarios. Tomado de
Hydrogen Sulfide corrosion: its consequences, detection and control, EPA 1991
2.2 Bacterias asociadas a la degradación del concreto
El proceso de degradación del concreto se debe principalmente a las bacterias que
habitan en las alcantarillas, ya que estas son las encargadas de realizar todo el
proceso hasta la generación del ácido sulfúrico el cual es el principal agente para la
corrosión.
Las bacterias que se encuentran en estos lugares se deben a las grandes cantidades
de compuestos de azufre que hay en el sistema. La exposición a sulfuro de
hidrógeno, el cual es producido en el agua residual, baja rápidamente el pH hasta un
punto en el que las bacterias neutrofílicas oxidantes de azufre pueden crecer y
producir ácido sulfúrico. Durante la fase inicial de la degradación del concreto,
como el pH comienza a caer, el azufre elemental se acumula ligeramente hasta que
se alcanza un pH de aproximadamente 2. Cuando se forma el sulfuro de hidrógeno
las bacterias oxidantes del azufre comienzan a acumularse en la superficie del
concreto, las bacterias más abundantes que se encuentran son la Thiobacillus
plumbophilus, T. Intermedia, S. Novella, y H. Neapolitanus. Cuando el pH
disminuye aun más la bacteria A. Thiooxidans es la que predomina (Okabe, M., Ito,
& Satoh, 2007) (Vincke, Boon, & W., 2001).
Estas bacterias son capaces de crecer en compuestos de azufre reducidos pero la
forma de metabolizar dicho compuesto difiere entre ellas. Debido a los diferentes
donadores de electrones existen diferentes vías de oxidación del azufre que estas
bacterias pueden realizar (Friedrich, Bardischewsky, Rother, Quentmeier, &
Fischer, 2005). Se ha encontrado que las bacterias más agresivas para el concreto
son la H. neapolitanus y la A. thiooxidans (Valdes, Ossandon, Quatrini, & Holmes,
2011).
Estas bacterias tienen diferentes metabolismos y rutas de oxidación del azufre.
-2 a +6) ha propiciado la
aparición de una gran variedad de enzimas redox que
. El complejo de enzimas Sox es una de ellos, el
cual abarca cuatro A, SoxYZ, SoxB y Sox(CD)2. El
complejo SoxA ayuda a catalizar la oxidación del azufre, por lo que juega un papel
importante en la corrosión del concreto
2010).
Como en la actualidad faltan estudios sobre el comportamiento de estas enzimas,
especialmente en el caso de la corrosión microbiológica, en donde se podrían
diseñas inhibidores específicos de la actividad sulfoxidante, se puede realizar una
cuantificación de estas bacterias que contienen la enzima SoxA con el fin de realizar
un análisis de riego en las superficies afectadas por la corrosión.
2.3 Q-PCR
Una de las técnicas que permite realizar la cuantificación del número de bacterias
con enzima SoxA en las alcantarillas es la Q-PCR; también conocida como PCR en
tiempo real. Es una técnica de laboratorio de biología molecular utilizada para
amplificar y cuantificar las copias de ADN (Salto Sánchez, 2006).
El Q-PCR es más avanzada que el PCR convencional ya que una única copia de una
secuencia en particular podría ser detectada y amplificada específicamente
.
La Q-PCR se basa en la detección y cuantificación de un marcador fluorescente
cuya señal aumenta en proporción directa a la cantidad de producto de PCR en la
reacción y al empleo de un termociclador que tiene acoplado un sistema de
detección que es capaz de adquirir y cuantificar la señal emitida por el reportero al
final de cada ciclo para cada muestra (Cortazar Martínez & Silva Rincón, 2004).
Los marcadores fluorescentes se incluyen en la reacción de amplificación, así la
detección en Tiempo Real de productos amplificados se realiza monitoreando el
aumento de la fluorescencia después de cada ciclo de amplificación. Esta señal
fluorescente se genera mediante el uso de agentes intercalantes (SYBR Green) o
sondas de hibridación específicas (Biotools).
El SYBR Green es un agente intercalante que se une al ADN de doble cadena dando
un incremento de la fluorescencia a medida que aumenta la cantidad de producto de
PCR. Es simple y económico, fácil de usar, sensible, versátil y no se necesitan
sondas específicas. Sin embargo durante la reacción de PCR puede unirse a dímeros
de primers y a otros productos inespecíficos, resultando en una sobreestimación de
la concentración del DNA blanco (Cortazar Martínez & Silva Rincón, 2004)
(Cortazar Martínez & Silva Rincón, 2004, pp. 17-18).
Las sondas de hibridación específicas son sondas marcadas con dos tipos de
fluorocromos, un donador y un aceptor. Detectan solamente el ADN que contiene la
secuencia de la sonda.
Las sondas de hidrólisis son las más utilizadas, las cuales son oligonucleótidos
5’
y ’ b b b
el donador. Mientras la sonda está intacta la fluorescencia emitida por el donador es
absorbida por el aceptor. Durante la amplificación del ADN la sonda se une con su
cadena complementaria, al desplazarse a lo largo de la cadena el ADN polimerasa
b 5’ b
fluorocromo donador. Como donador y aceptor están ahora espacialmente alejados
la fluorescencia emitida por el primero es captada por el lector (Lejona, Benetti,
Fay, & Fay, 2006)
2.4 Diseño de Primers
Para la estandarización de la técnica de Q-PCR se debe precisar una secuencia
específica con el fin de diseñar los primers que servirán de señal para que a partir de
ellos actúe la ADN polimerasa y comience a copiar dicha secuencia específica
(Salto Sánchez, 2006).
-30 bases con una secuencia complementaria
a las regiones de cada extremo de la secuencia de ADN que se pretende amplificar
(Salto Sánchez, 2006).
Para el diseño de estos primers se utilizaron las secuencias SoxA de las bacterias
que se encuentran asociadas con la degradación del concreto. Se realizó una
alineación de los Soxs mediante la herramienta computacional CLC Main
Workbench. Sin embargo, no fue posible encontrar una secuencia que se ajustara a
todas las bacterias, por los que se debió realizar diferentes combinaciones de
alineaciones con el fin de encontrar una apta para diseñar los primers.
Se realizó una alineación con las bacterias A. thiooxidans y H. neapolitanus ya que
como se encontró en estudios anteriores son las más agresivas para el concreto,
utilizando la enzima SoxA para catalizar la reacción y crear ácido sulfúrico.
En esta alineación se encontraron secuencias que podían llegar a ser útiles aunque
con algunas interrupciones. Cabe recalcar que se utilizaron 2 secuencias de A.
thiooxidans y una para H. neapolitanus.
Los resultados fueron los siguientes:
’-5’
Ilustración 2. Secuencia genética de ’-5’ SoxA de A.thiooxidans y
H.Neapolitanus
5’- ’
Ilustración 3. Secuencia genética de 5’- ’ de la alineación SoxA de A. thiooxidans y H.
Neapolitanus
Como se observa en las ilustraciones anteriores, en las secuencias encontradas
existen posiciones en las que diferentes bases son posibles. Por esta razón se
realizaron primers degenerativos con el fin de encontrar un secuencia que se ajuste a
las 2 secuencias de bacterias seleccionadas.
Al utilizar primers degenerativos se muestran las diferentes combinaciones de bases
que una secuencia puede llegar a tener (Linhart & Shamir, 2002). Estas son las
posibles combinaciones de bases:
R = A+G
M = A+C
S = G+C
W = A+T
Y = C+T
H = A+T+C
B = G+T+C
D = G+A+T
V = G+A+C
N = A+T+G+C
A partir de esto se obtienen las secuencias de primer degenerativos. Para el primer
5’- ’ SoxA de cada bacteria (A.
thiooxidans y H. neapolitanus), a estas se le saco su respectiva complementaria y su
reversa a la cual con la ayuda de las combinaciones de base para primer
degenerativo se obtuvo la secuencia final.
Los primers definitivos son los siguientes:
Primer Forward
Ilustración 4. P ’-5’
Utilizando la calculadora de oligonucleótidos de la Universidad del Norte de
Carolina (University of North Carolina, 1997-2010), se obtuvieron las propiedades
de los primers como las constantes físicas, las temperaturas de fusión para la Q-PCR
y las constantes termodinámicas.
Propiedades Primer Forward
Longitud: 20 bases
Peso molecular 6031 a 6148.1
Temperatura de fusión (básica)
35 a 44 °C
Primer Reverse
Ilustración 5. P 5’- ’
Propiedades Primer Reverse
Longitud: 20 bases
Peso molecular 6045 a 6222.1
Temperatura de fusión (básica)
46 a 54 °C
En el Anexo 1 se encuentran todas las propiedades obtenidas por la calculadora para
el primer forward y el primer reverse.
Existen posibles inconvenientes que pueden ocurrir con los primers durante la Q-
PCR, uno de ellos es que los primers se unan entre sí y no al ADN para su
amplificación, esto se conoce como complementariedad interna y
complementariedad entre los primers ’.
A continuación se muestran como este inconveniente puede suceder, marcando en
rojo donde ocurre la unión.
Primer Forward
’:
Todas las posibles complementariedades se pueden encontrar en el
Anexo 2.
Primer Reverse
’:
Todas las posibles complementariedades se pueden encontrar en el
Anexo 2.
3. Procedimiento
Para realizar un análisis de riesgo en las alcantarillas mediante Q-PCR se debe
comenzar por una estandarización de la técnica en donde se conozca la cantidad de
ADN por ciclo.
Para la estandarización se debe seguir el siguiente procedimiento, teniendo en
cuenta que la extracción del ADN ya se ha realizado:
1) Dilución de la muestra de ADN
Para la Q-PCR se deben realizar como mínimo 5 puntos.
Se recomienda empezar con una concentración de 30 ng/ μL ya que con
una concentración mayor la fluorescencia es tal que la lectura de los
resultados resultaría compleja.
A partir de esta concentración se realizarán diluciones de 1/8 para que la
última dilución no sea tan pequeña y pueda ser medida (se busca que la
última dilución sea de 0,007 ⁄ ).
Desde la segunda punta los volúmenes serán de 26,25 de agua para
llegar a un volumen de 30 .
Para la conocer el volumen de la primera dilución se parte de la
concentración inicial la cual puede ser hallada por un nanodrop, con la
cual se mira la eficiencia del ADN.
concentración inicial de ADN = 133,3 ⁄
Los cálculos realizados para los volúmenes y concentraciones se
encuentran en el anexo 3.
2) Preparación de la reacción
Para 1 reacción se tiene:
_____________________________________________
Por cada estándar se deben realizar 3 réplicas además de negativos y +1
de solo reactivo (en este caso se hizo +4), con el fin de asegurar que el
reactivo alcance para toda la prueba. Es decir en total se harán:
para la reacción final los volúmenes se multiplicaran por 22. Los
volúmenes finales son:
Es de suma importancia que las reacciones se realicen en la oscuridad,
pues se puede afectar las propiedades del mastermix. Este contiene el
SYBR GREEN el cual es muy sensible a la luz.
3) Temperatura de cada ciclo
En la Q-PCR se tiene como mínimo 3 segmentos en donde hay una serie de
cambios de temperatura que se repiten en diferentes ciclos.
Segmento 1:
1 ciclo
15 minutos - 95 °C
Segmento 2:
35 ciclos
15 segundos - 95 °C
30 segundos - 60 °C
Segmento 3:
1 ciclo
1 minuto - 95 °C
30 segundos - 55 °C
30 segundos - 95 °C
Ilustración 6 Asignación de temperaturas y ciclos en los segmentos de la Q-PCR
4) Ubicación muestras en el equipo
En el programa aparecerá una cuadrícula la cual indica la posición de cada punta
en el equipo. Se debe seleccionar si es estándar o blanco. Al ser estándar se debe
especificar que se utilizará SYBR Green.
Asegurarse de que la posición tanto en el programa como en el equipo sea la
misma.
Ilustración 7 Ubicación de las puntas en el programa
Ilustración 8 Ubicación de las puntas en el equipo
5) Resultados
Al cerrar la cabina donde se ubicarán los puntas o el plato, el equipo empezará a
correr. El tiempo total es establecido de acuerdo a los ciclos que se asignaron
previamente.
Al cabo de este tiempo se tendrán los siguientes resultados:
Gráfica de amplificación:
El eje vertical representa la cantidad de fluorescencia normalizada y
b
y b b
y b l
umbral en el que se produce un cambio significativo en la fluorescencia,
y el corte entre el Threshold y la curva de amplificación determina el Ct
o ciclo umbral que se emplea para la cuantificación (Sandoval Villasana,
Medrano Baca, & Cervantes Dacasa, 2010).
Ilustración 9 Gráfica de amplificación de la Q-PCR
Curva de disociación: En el eje y encontramos la fluorescencia y en el eje x la temperatura. Con la curva de disociación se evidencia la especificidad de la amplificación. Con esta curva se puede monitorizar la cinética de disociación de los fragmentos amplificados. Se alcanza distinguir la fluorescencia emitida entre el primer y la emitida por el ADN amplificado, además de considerar la posibilidad de ver la amplificación en el punto de mayor eficiencia Rodriguez Prieto, & Kukielka Zunzunegui, 2007).
Ilustración 10 curva de disociación de la Q-PCR
Curva estándar: Esta curva es generada a partir de las diluciones en serie de una muestra de concentración conocida de ADN (el procedimiento se mostró anteriormente). Esta curva es utilizada para cuantificar muestras desconocidas por interpolación (Capriotti & Gariglio, 2008).
Ilustración 11 Curva estándar Q-PCR
Tabla de resultados:
En la tabla de resultados se pueden ver la características de las muestras realizadas tanto de las estándar como de los blancos. se arrojan los valores del umbral o Threshold (dR), el ciclo umbral (Ct), la cantidad de muestra en nanogramos y la pendiente.
Ilustración 12 Tabla de resultados Q-PCR
4. Conclusiones y recomendaciones
Los sistemas de alcantarillado son los medios perfectos para que bacterias con
enzima SoxA utilicen el sulfuro de hidrógeno que se produce en el agua residual
para generar ácido sulfúrico, el cual degrada el concreto, material principal de estos
sistemas.
La principal característica que se cumple durante el proceso de corrosión, son las
condiciones anaeróbicas en el fondo de la tubería donde se reducen los sulfatos a
sulfuros. En el agua residual se genera sulfuro de hidrógeno el cual asciende al
techo de la tubería donde se condensa y gracias a las bacterias aerobias que
coexisten en ese lugar se genera ácido sulfúrico.
Un análisis de riesgo es una solución para realizar acciones preventivas en lugar de
correctivas en los sistemas de alcantarillados.
La técnica más acertada para realizar un análisis de riesgo es la Q-PCR ya que
permite cuantificar el número de bacterias en una muestra. Para realizar esta técnica
se deben diseñar primers específicos. Mediante la alineación de la secuencia
genética de la enzima soxA en las bacterias involucradas en el proceso de corrosión,
se pueden crear primers específicos los cuales servirán de señal para que a partir de
ellos actúe la ADN polimerasa y comience a copiar dicha secuencia específica. Es
importante tener en cuenta que al no encontrar una secuencia igual para todas las
bacterias involucradas en el proceso, el uso de primers degenerativos es una
solución a este problema.
En esta técnica la estandarización es de vital importancia para que en pruebas
futuras a partir de la curva de estandarización se pueda conocer la cantidad de ADN
en una muestra. Con la explicación del proceso de estandarización que se realizó en
este trabajo se puede concluir que se debe tener especial cuidado con las
concentraciones que se quieren obtener ya que de estas dependen que se pueda leer
la fluorescencia que estas generan. Se recomienda realizar una prueba de efectividad
a la extracción del ADN para así conocen la concentración inicial y a partir de allí
conocer los volúmenes de la dilución. Además es de vital importancia que las
reacciones de la Q-PCR se realicen sin la presencia de luz, ya que se pueden afectar
las propiedades del agente intercalante (SYBR Green).
Por último se puede concluir que este trabajo sirve como base para estudios sobre la
importancia de la enzima SoxA en la corrosión del concreto. Además de la
importancia que genera realizar un análisis de riesgo para estas estructuras.
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6. Anexos
Anexo 1
Propiedades Primers
Propiedades Primer Forward
Constantes físicas
Longitud: 20 bases
contenido GC1: 10 a 30 %
Peso molecular 6031 a 6148.1
1 ml de una solución con una absorbancia de 1 a 260 nm
es 4.158 a 4.961 microMolar y contiene 25.1 a 30.5 microgramos
Temperatura de fusión
35 a 44 °C (Básica)
42 a 50 °C (Ajustada con sal)2
34 a 38 °C (Interacción base más cercana)3
50 nM Primer
50 mM Sal (Na+)
Constantes termodinámicas Condiciones: 1 M NaCl a 25 °C con pH de 7
RlnK 33.404 cal/(°K*mol) delta H 135.7 a 149.9 Kcal/mol
deltaG 16 a 18.9 Kcal/mol deltaS 368.9 a 407.1 cal/(°K*mol)
1 Porcentaje de bases nitrogenadas en una molécula de ADN que son ya sea guanina o citosina
(Wiley Navarre, 2006). 2 Variación de la temperatura de fusión con la concentración de sal. 3 Método del vecino más cercano. Tiene en cuenta la entalpía durante la formación de la pareja entre 2
nucleótidos y el apilamiento o agrupación entre pares de nucleótidos más cercanos .
Propiedades Primer Reverse
Constantes físicas
Longitud: 20 bases
contenido GC: 35 a 55 %
Peso molecular 6045 a 6222.1
1 ml de una solución con una absorbancia de 1 a 260 nm
es 4.174 a 4.874 microMolar y contiene 25.2 a 30.3 microgramos
Temperatura de fusión
46 a 54 °C (Básica)
52 a 60 °C (Ajustada con sal)
39 a 49 °C (Interacción base más cercana)
50 nM Primer
50 mM Sal (Na+)
Constantes termodinámicas Condiciones: 1 M NaCl a 25 °C con pH de 7
RlnK 33.404 cal/(°K*mol) delta H 127.8 a 160.3 Kcal/mol
deltaG 17.2 a 24.1 Kcal/mol deltaS 339.9 a 423.5 cal/(°K*mol)
Anexo 2
Complementariedad Primers
Complementariedad Primer Forward
Complementariedad Primer Reverse
Anexo 3
Dilución de la muestra de ADN
Ya que se parte de una concentración de 30 ⁄ y se realizarán
diluciones 1/8 los volúmenes de las diluciones a partir de la segunda
punta hasta la quinta serán de:
es decir se debe utilizar 26,25 de agua para llegar a un volumen de 30
(el agua a utilizar debe ser libre de nucleasa y conservadas a – 20 °C).
Las concentraciones de las diluciones serán las siguientes:
estas concentraciones se sacan a partir del volumen de cada dilución.
Para la conocer el volumen de la primera dilución se parte de la
concentración inicial la cual puede ser hallada por un nanodrop, con la
cual se mira la eficiencia del ADN.
Con una concentración inicial de ADN = 133,3 ⁄ ,
se utiliza la ecuación de disolución para hallar el volumen inicial: