simplexa dengue - focus diagnosticspor flavivirus en función de los parámetros clínicos,...

SimplexaTM Dengue

REF MOL3100 Rev. C

Prueba de RT-PCR en tiempo real para la detección in vitro y tipificación del virus del dengue de los serotipos 1,

2, 3 y 4.

Para uso diagnóstico in vitro.

USO PREVISTO

La prueba SimplexaTM Dengue de Focus Diagnostics es un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) que está destinado a su uso en el equipo Integrated Cycler de 3M para la detección in vitro y tipificación de los serotipos 1, 2, 3 y 4 del virus del dengue en suero humano. RESUMEN Y EXPLICACIÓN El dengue (FD) es una enfermedad viral aguda, autolimitada, que se caracteriza por fiebre, cefalea, dolores generalizados, exantema, linfadenopatía y postración. En su forma más grave, la fiebre hemorrágica por dengue (FHD), los pacientes infectados presentan fiebre marcada e insuficiencia renal que conduce al síndrome de choque por dengue (SCD), frecuentemente mortal. Se calcula que aproximadamente 2 mil millones de personas están en riesgo de sufrir dengue en el mundo, y que anualmente adquieren la infección alrededor de 100 millones de personas. Estas cifras, sumadas a los cientos de miles de casos de SCD, hacen del dengue la enfermedad por arbovirus más importante en el mundo. La FHD se reconoció por primera vez en la década de 1950, durante la epidemia de dengue que azotó las Filipinas y Tailandia. Para 1970, nueve países habían sufrido de FHD epidémica y, en la actualidad, el número ha crecido más de cuatro veces y sigue en ascenso. La aparición de nuevos casos de FHD redundan en un aumento de las epidemias por dengue en el continente americano y en Asia, donde los cuatro virus de dengue son endémicos, y la FHD se ha convertido así en la principal causa de hospitalización y muerte infantil en varios países. El virus del dengue (VD) es un virus de ARN de cadena sencilla de la familia flavivirus, y se relaciona íntimamente con el virus de la fiebre amarilla, el virus de la encefalitis japonesa y otros arbovirus del grupo B. Existen cuatro cepas del virus del dengue, cada una de las cuales es serológicamente distinta. La infección por una cepa no protege al huésped de la infección por otra cepa. De hecho, un informe sugiere que la FHD y el SCD se producen con mayor frecuencia en personas que han sido infectadas previamente por otra cepa. La presencia de anticuerpos circulantes contra el VD, no neutralizantes, capaces de reacción cruzada, pueden actuar como un factor de aumento de la respuesta inmune. Sin embargo, los anticuerpos no neutralizantes capaces de reacción cruzada contra otros flavivirus, que no sean VD, no se asocian con un aumento de la

respuesta inmune. El virus del dengue puede transmitirse donde quiera que se encuentren sus vectores, los mosquitos Aedes aegypti y Aedes albopictus. A. aegypti se localiza principalmente en las zonas tropicales y subtropicales de América y es autóctono del sur de Estados Unidos. En Asia, el vector principal del VD es el mosquito A. albopictus. Recientemente se han documentado infecciones por dengue adquiridas localmente en Florida Key West y el condado de Miami-Dade, en Estados Unidos. Históricamente, los casos sospechados de FD se han diagnosticado mediante métodos serológicos. Tanto la inmunoglobulina G (IgG) específica del virus del dengue como los anticuerpos IgM se encuentran por lo general en el suero de los pacientes con infección primaria aguda, mientras que la respuesta de IgM puede ser baja o incluso inexistente,, en el dengue secundario. Además, existe una fuerte reactividad cruzada entre los virus de la familia flavivirus. Como consecuencia, puede resultar difícil interpretar la respuesta de los anticuerpos en un episodio de fiebre por dengue aguda, si no es posible excluir otras infecciones por flavivirus en función de los parámetros clínicos, bioquímicos o epidemiológicos. Más recientemente, se han desarrollado métodos de RT-PCR en tiempo real para detectar virus del dengue en la sangre de los pacientes. La detección del ARN del virus del dengue mediante PCR de transcriptasa inversa (RT-PCR) en muestras de suero humano es altamente indicativa de fiebre por dengue aguda. El virus del dengue puede detectarse en la sangre (suero) de los pacientes aproximadamente durante los cinco primeros días de síntomas. PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO La prueba es una RT-PCR en tiempo real que permite diferenciar los serotipos 1 y 4 en una reacción (pocillo), y los serotipos 2 y 3 en otra reacción (pocillo). La prueba se compone de dos pasos principales: 1) extracción del ARN de las muestras, y 2) amplificación del ARN extraído mediante sondas-cebadores fluorescentes bifuncionales y cebadores inversos. El ensayo permite amplificar cuatro regiones específicas de los serotipos: dengue 1 (gen NS5), dengue 2 (gen NS3), dengue 3 (gen NS5) y dengue

Simplexa™ Dengue

4 (gen de la cápside). Se emplea un control interno de ARN para seguir el proceso de extracción y detectar la inhibición de la RT-PCR. MATERIALES SUMINISTRADOS El kit Simplexa Dengue contiene reactivos suficientes para realizar la serotipificación de 100 muestras.

Descripción del kit

Nombre del compuesto REF. SÍMBOLO CE EN ETIQUETA

Nombre Abreviado

Color del tapón

Número de viales

Reacciones por vial/kit

Volumen por vial

Simplexa Dengue 1 & 4 Primer Mix MOL3101 REAG A PM Marrón 2 50/100 30 µl Simplexa Dengue 2 & 3 Primer Mix MOL3102 REAG B PM Púrpura 2 50/100 30 µl HS Master Mix MOL9060 REAG C MM Verde 4 50/200 200 µl RT Mix MOL9103 REAG D RT Amarillo 2 100/200 50 µl Simplexa RNA Internal Control MOL2004 CONTROL IC IC Azul 2 50/100 250 µl Simplexa Dengue Molecular Control MOL3103 CONTROL + MC Rojo 2 4/8 800 µl

Descripción de los componentes

Componente del kit Descripción

Simplexa Dengue 1 & 4 Primer Mix (PM, mezcla de cebadores 1 y 4 Simplexa Dengue)

Cebadores con marcación fluorescente específicos para la detección de ARN del dengue de serotipo 1, del ARN del dengue de serotipo 4 y del control interno.

Diana Fluoróforo de la sonda (colorante)

Excitación Emisión Gen diana

Dengue 1 (VD1) FAM 495 nm 520 nm Gen NS5

Dengue 4 (VD4) CFR610 590 nm 610 nm Gen de la

cápside

Internal Control (CI de ARN) <:hr> 644 nm 670 nm N/C

Simplexa Dengue 2 & 3 Primer Mix (PM, mezcla de cebadores 2 y 3 Simplexa Dengue)

Diana

Fluoróforo de la sonda (colorante)

Excitación Emisión Gen diana

Dengue 3 (VD3) FAM 495 nm 520 nm Gen NS5

Dengue 2 (VD2) CFR610 590 nm 610 nm Gen NS3

Internal Control (CI de ARN) <:hr> 644 nm 670 nm N/C

HS Master Mix (MM, mezcla maestra HS) ADN polimerasa, tampón y dNTPs

Simplexa™ RNA Internal Control (RNA IC, control interno de ARN Simplexa™)

Molde de ARN encapsulado.

Simplexa™ Dengue Molecular Control (MC, control molecular Simplexa™ Dengue)

Serotipos 1, 2, 3 y 4 del virus del dengue inactivados.

RT Mix (RT, mezcla de TI) Enzima transcriptasa inversa, tampón.

MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS 1. Equipo Integrated Cycler 3M con software Integrated Cycler Studio versión 4,2 o superior. 2. Discos Universal Disc para el equipo Integrated Cycler 3. Sellador de discos Universal Disc 4. Agua libre de nucleasas (se recomienda su uso como control sin molde (No Template Control [NTC]). 5. Micropipeta(s), de canal único, multicanal y/o de repetición, de una precisión comprendida en el rango de 1-10 µl, 10-100 µl y

100-1000 µl. 6. Equipo Roche MagNA Pure LC y elementos fungibles asociados. 7. Kit Roche MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation (N.º de cat. de Roche 3038505001) 8. Bloque de carga para discos Universal Disc 9. Congelador (eliminación de escarcha manual) de -10 a -30 ºC (para guardar los componentes del kit congelados).

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10. Congelador (eliminación de escarcha manual) de -10 a -30 ºC (para guardar congeladas las muestras, si es necesario) 11. Frigorífico de 2 °C a 8 °C (para los componentes del kit que han sido descongelados) 12. Cabina de bioseguridad (campana de flujo laminar) para las extracciones. 13. Microcentrífuga. 14. Mezclador vórtex. 15. Puntas de micropipetas, estériles, desechables, libres de ARNasa/ADNasa, con protección contra aerosoles. 16. Tubos para microcentrífuga de polipropileno de 1,5 ml y gradillas (se recomienda usar tubos libres de ARNasas/ADNasas,

pero no es obligatorio). 17. Guantes sin polvo desechables. 18. Gradillas frías para los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.

PERÍODO DE VALIDEZ Y MANIPULACIÓN 1. Conserve los reactivos a una temperatura de entre -10 ºC y -30 ºC (no use un congelador de tipo «no-frost»). 2. No use los kits ni los reactivos después de la fecha de caducidad. 3. Deje que las mezclas de cebadores, la mezcla maestra HS, el control positivo y el control interno de ARN se descongelen a

temperatura ambiente (entre 18 ºC y 25 ºC aproximadamente) antes de su uso. 4. Tras añadir la mezcla de TI, use la mezcla de reacción antes de que pase una hora. 5. Si la configuración de la PCR no se realiza inmediatamente después de preparar las mezclas de reacción, guarde las

mezclas de reacción entre 2 y 8 ºC hasta que esté listo para continuar con la configuración de la PCR (antes de una hora). 6. Después de cada uso, vuelva a poner la mezcla de TI en el congelador (entre -10 ºC y -30 ºC) hasta la fecha de caducidad. 7. Una vez descongelados, guarde las mezclas de cebadores, las mezclas maestras HD, el control molecular y el control

interno de ARN a una temperatura de entre 2 ºC y 8 ºC durante no más de 30 días. 8. No vuelva a congelar las mezclas de cebadores, la mezcla maestra HS, el control interno de ARN ni el control molecular. 9. No combine los reactivos de distintos lotes. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES 1. Siga las precauciones habituales. Todas las muestras en evaluación y todos los controles moleculares deben considerarse

potencialmente infecciosos y deben manipularse como tales. 2. Cuando manipule los reactivos del kit, use equipos de protección personal, como guantes y batas de laboratorio, entre otros.

Lávese las manos minuciosamente cuando termine de realizar la prueba. 3. No pipetee con la boca. 4. No debe fumar, beber, comer, manipular lentes de contacto ni aplicarse maquillaje en las zonas en las que se usan los

reactivos del kit o muestras de origen humano. 5. Deseche los kits de reactivos que no haya utilizado y las muestras analizadas según las normas locales, estatales y

federales. 6. El flujo de trabajo en el laboratorio debe proceder en una sola dirección, comenzando en las zonas de preamplificación y

prosiguiendo en la zona de amplificación/detección. A continuación se muestra la secuencia de acontecimientos desde la extracción de la muestra hasta la amplificación por PCR en tiempo real. • Empiece por la extracción de la muestra, continúe con la configuración del equipo de PCR en tiempo real, la preparación

del reactivo y finalice con la amplificación mediante PCR en tiempo real. • No use materiales fungibles ni equipos en las áreas destinadas a la extracción y preparación de muestras. No se

recomienda ningún tipo de movimiento cruzado entre las diferentes áreas. • Los materiales y el equipo usado para la preparación de las muestras no debe usarse para la preparación de reactivos ni

para procesar el ADN amplificado ni otras fuentes de ácido nucleico diana. • Los materiales fungibles de amplificación y los equipos correspondientes deben permanecer siempre en el área de

equipos de PCR en tiempo real. • El equipo de protección personal, como las batas de laboratorio o los guantes desechables, deben ser específicos de cada

zona. 7. La contaminación de las muestras en evaluación o de los reactivos puede dar lugar a resultados erróneos. Utilice técnicas

asépticas. 8. Pipetee y manipule los reactivos con cuidado para evitar que se mezclen con muestras de pocillos adyacentes. 9. Utilice técnicas de pipeteo adecuadas y mantenga las mismas condiciones de pipeteo durante todo el procedimiento para

garantizar valores óptimos y reproducibles. 10. No sustituya los reactivos ni los mezcle con reactivos procedentes de diferentes lotes de kits o de otros fabricantes. 11. No intercambie las tapas de los tubos de reactivos. Esto puede provocar su contaminación y alterar los resultados de la

prueba. 12. Las desviaciones del protocolo o el uso de temperaturas o tiempos distintos de los especificados pueden producir resultados

equívocos. 13. La preparación de la prueba debe realizarse a temperatura ambiente (aproximadamente en el rango de 18 a 25 ºC). Cuando

mezcle los reactivos, mantenga frías las enzimas usando un bloque refrigerador. 14. No reutilice los discos Universal Disc que ya han estado expuestos a muestras en evaluación o reactivos. 15. Deseche cada disco usado sin separar ni retirar la cinta de cubierta.

Simplexa™ Dengue

16. Si se preparan en el mismo disco diferentes kits o lotes SimplexaTM, se recomienda analizar los controles moleculares correspondientes a cada kit.

17. La mezcla maestra HS y la mezcla de TI contienen >1 % de glicerol, lo que puede causar irritación si se inhala o entra en contacto con la piel. En caso de inhalación o contacto cutáneo, deben tomarse medidas de primeros auxilios.

18. Se recomienda no conservar las muestras extraídas a temperaturas de entre 2 ºC y 8 ºC de forma prolongada, puesto que no se ha determinado el rendimiento en tales condiciones.

INSTRUCCIONES DE USO A. RECOGIDA DE MUESTRAS

El tipo de muestra aceptable es el suero. Extraiga las muestras de sangre asépticamente mediante técnicas de venopunción aprobadas y efectuadas por personal capacitado. Deje que las muestras de sangre se coagulen a temperatura ambiente antes de su centrifugación para separar el suero. Transfiera el suero asépticamente a un contenedor estéril de cierre ajustado para su almacenamiento. El suero separado debe permanecer a temperatura ambiente durante un tiempo no superior a las 8 horas. Si la prueba no se lleva a cabo en un plazo de 8 horas, refrigere la muestra a una temperatura de entre 2 ºC y 8 ºC. Si la prueba no se realiza en un plazo de 48 horas, o las muestras deben transportarse, congélelas a -20 ºC o temperatura inferior. Evite repetir el congelamiento y descongelamiento de las muestras. Descongele y mezcle las muestras antes de usarlas.

B. EXTRACCIÓN DE MUESTRAS Extracción mediante el método Roche MagNA Pure LC 1. Los ácidos nucleicos se extraen de las muestras de pacientes y de los controles de la prueba mediante el kit Roche

MagNA Pure Total Nucleic Acid y el equipo Roche MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor. Consulte las instrucciones de uso del fabricante sobre extracción de ácidos nucleicos con este kit.

2. En el menú desplegable «Protocol» (Protocolo) del sistema MagNA Pure LC, seleccione «Total NA» (Ácido nucleico total) y luego «Total NA Variable_elution_volume.blk» (Variable de ácido nucleico total_elución_volumen.blanco). Se cargarán los ajustes apropiados para el proceso.

3. El protocolo de la muestra debe ser «Total NA Variable_elution_volume» (Variable de ácido nucleico total_elución_volumen).

4. El volumen de la muestra debe ajustarse en 200 µl y el volumen de elución en 50 µl. 5. El volumen de dilución debe ajustarse en cero para todas las muestras. 6. Asegúrese de que el protocolo tras la elución se sitúa en «None» (Ninguno). 7. Asegúrese de que las muestras y los controles están en la posición correcta en el carrusel de muestras. 8. Mezcle cada muestra y el control molecular en el mezclador vórtex durante 2 a 4 segundos y centrifugue brevemente

para que el contenido precipite en el fondo del tubo. 9. Pipetee 200 µL de cada muestra, el control molecular (MC) o el control negativo (sin molde) en la posición

correspondiente en el carrusel de muestras. 10. Inspeccione visualmente el nivel de muestras y controles en el carrusel de muestras para asegurarse de que se haya(n)

agregado la muestra (o las muestras). 11. Déle un pulso en el agitador vórtex al control interno de ARN 2 veces y centrifugue brevemente para que el contenido

baje al fondo del tubo. 12. Pipetee 5 µl de control interno de ARN en cada muestra y en todos los pocillos de control. Cambie las puntas de las

pipetas entre las distintas muestras. 13. Transfiera el carrusel de muestras con las muestras al extractor MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid e inicie el

proceso de extracción. 14. Después de completar la extracción de ácido nucleico, se puede retirar el carrusel que contiene los controles extraídos y

las muestras de paciente del MagNA Pure y sellarse. Guarde el ARN extraído a una temperatura de entre 2 ºC a 8 ºC antes de usarlo. No se recomienda el almacenamiento prolongado de las muestras extraídas a esta temperatura. Mientras carga el disco, mantenga congeladas las muestras de ARN extraídas.

C. CONFIGURACIÓN DEL EQUIPO DE PCR EN TIEMPO REAL

1. Consulte en el manual del operador del equipo Integrated Cycler cómo configurar el software Integrated Cycler Studio

para añadir una definición de ensayo, configurar y analizar procesos en el equipo Integrated Cycler.

Nota: Las pruebas tienen dos códigos de barras distintos; uno de ellos incluye la definición de ensayo de los serotipos 1 y 4 del dengue y, el segundo, incluye la definición de ensayo de los serotipos 2 y 3 del dengue. Se necesitan dos segmentos de procesos para obtener los resultados de los cuatro serotipos.

Simplexa™ Dengue

Disposición sugerida en el disco; en esta prueba se necesitan dos segmentos Radio 1 Radio 2 Radio 3 Radio 4 Radio 5 Radio 6 Radio 7 Radio 8 Radio 9 Radio 10 Radio 11 Radio 12 A MC S8 S16 S24 S32 S40 MC S8 S16 S24 S32 S40 B S1 S9 S17 S25 S33 S41 S1 S9 S17 S25 S33 S41 C S2 S10 S18 S26 S34 S42 S2 S10 S18 S26 S34 S42 D S3 S11 S19 S27 S35 S43 S3 S11 S19 S27 S35 S43 E S4 S12 S20 S28 S36 S44 S4 S12 S20 S28 S36 S44

F S5 S13 S21 S29 S37 S45 S5 S13 S21 S29 S37 S45

G S6 S14 S22 S30 S38 S46 S6 S14 S22 S30 S38 S46

H S7 S15 S23 S31 S39 NTC S7 S15 S23 S31 S39 NTC

Legend:

= mezcla de reacción de dengue 1 y 4

= mezcla de reacción de dengue 2 y 3

D. ZONA DE PREPARACIÓN DE REACTIVOS Área específica para la preparación de la mezcla de reacción de la prueba para dengue. 1. Descongele la mezcla de cebadores y la mezcla maestra HS a temperatura ambiente (aproximadamente a una

temperatura entre 18 ºC y 25 ºC). Antes de cada uso, mezcle los componentes del kit, es decir, la mezcla de cebadores, la mezcla maestra HS y la mezcla de TI, pipeteándolos de 6 a 8 veces y centrifugándolos brevemente para que el contenido precipite en el fondo del tubo.

2. Prepare el volumen necesario de cada mezcla de reacción en un tubo de microcentrífuga de polipropileno de tamaño adecuado pipeteando el volumen de cada componente.

Volúmenes de la mezcla de reacción: mezcla de reacción para dengue 1 y 4

Reactivo Mezcla de reacción/ Volumen/1 reacción

Mezcla de reacción/ Volumen/10 reacciones

HS Master Mix 4,0 µl 40 µl Simplexa Dengue 1 & 4

Primer Mix 0,5 µl 5 µl

RT 0,5 µl 5 µl Volumen total 5,0 µl 50 µl

Volúmenes de la mezcla de reacción: mezcla de reacción para dengue 2 y 3

Reactivo Mezcla de reacción/ Volumen/1 reacción

Mezcla de reacción/ Volumen/10 reacciones

HS Master Mix 4,0 µl 40 µl Simplexa Dengue 2 & 3

Primer Mix 0,5 µl 5 µl

RT 0,5 µl 5 µl Volumen total 5,0 µl 50 µl

3. Mezcle suavemente cada mezcla de reacción pipeteando de 8 a 10 veces. 4. Centrifugue brevemente a baja velocidad para que el contenido precipite en el fondo del tubo. 5. Continúe con la preparación de la PCR. 6. Use las mezclas de reacción antes de que pase una hora desde su preparación. Si la configuración de la PCR no se

realiza inmediatamente después de preparar las mezclas de reacción, guarde las mezclas de reacción de 2 a 8 ºC hasta que esté listo para continuar con la configuración de la PCR (antes de una hora).

E. ZONA DE AMPLIFICACIÓN POR PCR EN TIEMPO REAL

Realice la preparación del Universal Disc de 96 pocillos para la prueba de dengue en un área habilitada exclusivamente para ello. Efectúe la preparación del disco usando un bloque de carga de discos Universal Disc. Consulte el ejemplo de disposición del disco de la sección C mientras realiza lo siguiente: 1. Añada 5,0 µl de mezcla de reacción que corresponda a cada pocillo. 2. Añada 5 µl del control molecular extraído a cada pocillo del disco "CM". 3. Añada 5 µl de la muestra en evaluación extraída al pocillo del disco "S" correspondiente. 4. Añada 5 µl del control negativo (sin molde) extraído a cada pocillo del disco "NTC". 5. Cubra el disco con cinta de cubierta para discos Universal Disc Tape. 6. Abra la tapa del equipo Integrated Cycler. 7. Coloque el Universal Disc sellado sobre el plato. 8. Cierre la tapa suavemente. 9. Pulse Run (Proceso). 10. Pulse Start (Iniciar).

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F. ANÁLISIS DE DATOS

1. Consulte el manual del operador del equipo Integrated Cycler para realizar análisis de datos y exportar procesos cuando sea necesario.

PAUTAS PARA LA REVISIÓN DE LOS RESULTADOS

El informe de los resultados es un proceso de tres pasos. 1. Examen de los controles para determinar si el segmento es válido. El software Integrated Cycler Studio suprimirá la

interpretación de los resultados del paciente si alguna de las muestras programadas como controles no es válida. 2. Examen de la validez de los resultados de las muestras del paciente. 3. Interpretación de los resultados del paciente. Si los controles no son válidos, los resultados del paciente no se

pueden interpretar.

1. Determine si el segmento es válido examinando el control molecular de dengue, el control sin molde y el control interno de ARN.

Criterios para un control válido (simplificados)* Segmento para dengue 1 y 4 Segmento para dengue 2 y 3 Control

VD1 VD4 Ct para el CI de ARN

VD2 VD3 Ct para el CI de ARN

Control sin molde 0 0 ≤40,0; ≠0 0 0 ≤40,0; ≠0

Control molecular ≤40,0; ≠0 ≤40,0; ≠0 No corresponde ≤40,0; ≠0 ≤40.0; ≠0 No corresponde

*Ver la descripción completa en las siguientes notas.

a. Control sin molde (NTC) (segmento para dengue 1 y 4)

i. Si el Ct=0 para VD1 y VD4, y Ct<40 para el control interno, el control es válido. b. Control sin molde (NTC) (segmento para dengue 2 y 3)

i. Si el Ct=0 para VD2 y VD3, y Ct<40 para el control interno, el control es válido. c. Control molecular (MC) (segmento para dengue 1 y 4)

i. Si el resultado del control molecular es Ct = 0 para VD1 o VD4, el segmento de la prueba se considera

inválido e inaceptable. Todas las muestras de pacientes deben volver a procesarse.

ii. Si los valores Ct para VD1 y VD4 son ≤40, pero ≠0, junto con un control sin molde válido, el segmento

de la prueba se considera válido y aceptable.

d. Control molecular (MC) (segmento para dengue 2 y 3)

i. Si el resultado del control molecular es Ct = 0 para VD2 o VD3, el segmento de la prueba se considera

inválido e inaceptable. Todas las muestras de pacientes deben volver a procesarse.

ii. Si los valores para VD2 y VD3 son ≤40, pero ≠0, junto con un control sin molde válido, el segmento de

la prueba se considera válido y aceptable.

2. Examen de los resultados de las muestras de pacientes El examen de los resultados de las muestras clínicas debe realizarse después de haber examinado los controles positivo y negativo (sin molde) y de haber determinado si son válidos y aceptables. Deben examinarse los resultados de VD1, VD4 y control interno de ARN, y de VD2, VD3 y control interno de ARN de todos los segmentos y de cada muestra de paciente en particular.

a. Se deben examinar las curvas de amplificación para cada resultado, en especial cuando se notifica un mensaje de «Calidad de datos» ("Data Quality"). Una curva de amplificación válida presenta un aumento exponencial progresivo. Consulte el manual del operador para obtener más recomendaciones.

Simplexa™ Dengue

Curva de amplificación válida Curva de amplificación válida Curva de amplificación inválida

b. Si la curva de amplificación es válida para la diana, no hace falta el control interno de ARN (RNA IC) para notificar un resultado positivo.

c.

3. Interpretación de los resultados.

Interpretación de los resultados

Segmento para dengue 1 y 4 Segmento para dengue 2 y 3

Ejemplo Valor de

Ct, VD1

Valor de Ct,

VD4

Valor de Ct,

RNA IC

Interpretación Valor de Ct,

VD2

Valor de Ct

VD3

Valor de Ct*,

RNA IC

Interpretación

1 0 0 ≤40,0; ≠0 VD1 y VD4 no detectados 0 0 ≤40,0, ≠0

VD2 y VD3 no detectados

2 ≤40,0; ≠0 0 N/C VD1 no detectado 0 0 ≤40,0; ≠0 VD2 y VD3

no detectados

3 0 ≤40,0; ≠0 N/C VD4 no detectado 0 0 ≤40,0; ≠0 VD2 y VD3

no detectados

4 ≤40,0; ≠0 ≤40,0; ≠0 N/C VD1 y VD4 detectados 0 0 ≤40,0; ≠0

VD2 y VD3 no detectados

5 0 0 ≤40,0; ≠0 VD1 y VD4

no detectados ≤40,0: ≠0 0 N/C VD2 detectado

6 0 0 ≤40,0; ≠0 VD1 y VD4

no detectados 0 ≤40,0; ≠0 N/C VD3 detectado

7 0 0 ≤40,0; ≠0 VD1 y VD4

no detectados ≤40,0; ≠0 ≤40,0; ≠0 N/C

VD2 y VD3 detectados

8 0 0 0 Inválido, vuelva a extraer y repita el

segmento. N/C N/C N/C N/C

9 N/C N/C N/C N/C 0 0 0 Inválido, vuelva a

extraer y repita el segmento.

Ct = umbral de ciclos. Detectado es un Ct ≤40,0, ≠0. No detectado es un Ct = 0 *Para informar de un resultado de “detectado(s)”, no es necesario detectar el control interno de ARN Simplexa™ (ARN CI). LIMITACIONES 1. Para utilización en el diagnóstico in vitro. 2. Para uso exclusivo de exportación. 3. Esta prueba tiene como objetivo su uso con muestras de suero y no se ha evaluado con otros tipos de muestra. 4. La detección del ácido nucleico viral depende de la correcta obtención, manipulación, transporte, conservación y preparación

de las muestras, incluida la extracción. Si no se cumplen los procedimientos correspondientes en alguno de estos pasos pueden producirse resultados incorrectos.

5. Las personas que realizan los análisis deben tener formación y estar familiarizadas con los procedimientos de las pruebas y la interpretación de los resultados antes de realizar el ensayo.

6. Todos los resultados de esta prueba o de cualquier otra prueba deben correlacionarse con los antecedentes clínicos, los datos epidemiológicos y otros datos disponibles para el médico a cargo de la evaluación del paciente.

7. La prevalencia de la infección influirá en el valor diagnóstico de la prueba. 8. Como ocurre con otras pruebas, los resultados negativos no descartan una infección por dengue.

Simplexa™ Dengue

9. Pueden producirse resultados falsos negativos cuando el organismo causante de la infección tiene mutaciones genómicas, inserciones, deleciones o rearreglos o cuando las pruebas se realizan en una fase muy temprana de la enfermedad.

10. Pueden aparecer resultados falsos negativos si en la muestra hay un número inadecuado de microorganismos debido a una recogida, un transporte o una manipulación incorrectos.

11. Al igual que con cualquier otra prueba, pueden producirse resultados falsos positivos. En algunas circunstancias, podría estar indicada la repetición de la prueba o la realización de una prueba con un dispositivo diferente.

12. Esta prueba es de tipo cualitativo y no proporciona información sobre el valor cuantitativo del organismo detectado. 13. Esta prueba no permite descartar enfermedades causadas por otros agentes patógenos bacterianos o virales.

CARACTERÍSTICAS DE RENDIMIENTO

COMPARACIÓN DE MÉTODOS

Se obtuvo una serie de 179 muestras con resultados de PCR para dengue previamente caracterizados del Centro para el Control y Prevención de las Enfermedades (CDC) de Estados Unidos. Las muestras se analizaron en el ensayo Simplexa™ Dengue y se compararon con los resultados históricos facilitados por el CDC.

Tabla 1: Virus del dengue 1 en comparación con los resultados históricos Resultados históricos del

CDC VD1, Simplexa™ Dengue

n Detectado No detectado % de coincidencia (observado/esperado) IC del 95 %

Detectado 32 32 0 PCP: 100,0 % (32/32) IC 95 %: 15 a 100,0 %

No detectado 147 11a 136 PCN: 92,5 % (136/147) IC 95 %: 15 a 95,8%

PCP = porcentaje de coincidencia positiva; PCN = porcentaje de coincidencia negativa a Al repetir la prueba, 5 de 11 muestras fueron detectadas mediante el ensayo Simplexa Dengue y un ensayo propio del laboratorio basado en las publicaciones del CDC. Las 6 muestras restantes no fueron detectadas mediante el ensayo basado en las publicaciones del CDC.

Tabla 2: Virus del dengue 2 en comparación con los resultados históricos

Resultados históricos del CDC Simplexa™ Dengue DV2

N Detectado No detectado % de coincidencia (observado/esperado) IC del 95 %

Detectado 30 29 1b 96,7 % (29/30) IC 95 %: 15 a 99,4%

No detectado 149 1b 148 99,3 % (148/149) IC 95 %: 15 a 99,9%

PCP = porcentaje de coincidencia positiva; PCN = porcentaje de coincidencia negativa b Los resultados no cambiaron al repetir la prueba. Tabla 3: Virus del dengue 3 en comparación con los resultados históricos Resultados históricos del



Detectado 29 29 0 100,0 % (29/29) IC 95 %: 15 a 100,0%

No detectado 150 0 150 100,0 % (150/150) IC 95 %: 15 a 100,0%

PCP = porcentaje de coincidencia positiva; PCN = porcentaje de coincidencia negativa

Simplexa™ Dengue

Tabla 4: Virus del dengue 4 en comparación con los resultados históricos Resultados históricos del



Detectado 38 37 1c 97,4 % (37/38) IC 95 %: 15 a 99,5%

No detectado 141 8d 133 94,3 % (133/141) IC 95 %: 15 a 97,1%

PCP = porcentaje de coincidencia positiva; PCN = porcentaje de coincidencia negativa b Los resultados no cambiaron al repetir la prueba. a Al repetir la prueba, 2 de 8 muestras fueron detectadas como VD4 mediante el ensayo Simplexa Dengue y un ensayo propio del laboratorio basado en las publicaciones del CDC. Una muestras se detectó como VD1 y una muestra se detectó como VD2 en ambos ensayos. Las dos muestras restantes no fueron detectadas al repetir la prueba con ninguno de los dos ensayos.

REPRODUCIBILIDAD La reproducibilidad de la prueba Simplexa Dengue se evaluó usando tres equipos diferentes. Se analizó una serie de muestras y el control molecular por triplicado en cada equipo, dos veces al día durante cinco días en total. El control negativo se analizó una vez en cada proceso. Cada equipo fue evaluado por un técnico que analizó la serie completa de muestras dos veces al día, con un total de dos conjuntos de datos por día. En las tablas siguientes se presenta la reproducibilidad de la respuesta cualitativa de los equipos y una evaluación de los diferentes componentes de la variabilidad de los valores de Ct. Tabla 5: Reproducibilidad de la respuesta cualitativa

Mezcla de reacción 1 y 4 Mezcla de reacción 2 y 3 VD1 VD4

Nombre de muestra

Todos

No detectad

o

Detectado

No detectad

o

Detectado

Dengue 1 positivo bajo 90 0 90 90 0

Dengue 1 positivo medio

90 0 90 89 1



89 89 0 0 89

Negativo 90 90 0 90 0 Control negativo 30 30 0 30 0

Control molecular 90 0 90 0 90

VD2 VD3 Nombre de

muestra

Todos

No detectad

o

Detectado

No detectad

o

Detectado



88 0 88 88 0



89 89 0 0 89

Negativo 88 88 0 88 0 (Control negativo) 30 30 0 30 0

Control molecular 90 0 90 0 90

Tabla 6: Reproducibilidad de la respuesta de los equipos (valores de Ct)

Componente de la varianza

Interequipo/interoperador

Entre distintos días

Entre distintos procesos

Intraensayo (repetibilidad) Total Diana Muestra N

Media de Ct

DE % CV DE % CV DE % CV DE % CV DE % CV

Dengue-1 Positivo bajo

90 35,2 0,44 1,3 0,16 0,4 0,10 0,3 0,46 1,3 0,66 1,9

Dengue-1 Positivo medio

90 33,5 0,54 1,6 0,22 0,7 0,00 0,0 0,29 0,9 0,65 1,9 VD1

Control Molecular 90 34,3 0,49 1,4 0,26 0,8 0,00 0,0 0,38 1,1 0,67 2,0


88 33,5 0,33 1,0 0,19 0,6 0,19 0,6 0,37 1,1 0,57 1,7


88 31,9 0,45 1,4 0,48 1,5 0,00 0,0 0,23 0,7 0,70 2,2 VD2


VD3 Dengue-3 Positivo bajo

90 38,2 0,51 1,3 0,22 0,6 0,62 1,6 0,87 2,3 1,21 3,2

Simplexa™ Dengue

Componente de la varianza

Interequipo/interoperador

Entre distintos días

Entre distintos procesos

Intraensayo (repetibilidad) Total Diana Muestra N

Media de Ct

DE % CV DE % CV DE % CV DE % CV DE % CV


89 33,0 0,58 1,7 0,63 1,9 0,00 0,0 0,26 0,8 0,89 2,7



90 36,4 0,00 0,0 0,24 0,7 0,00 0,0 0,79 2,2 0,82 2,3


89 32,0 0,27 0,8 0,10 0,3 0,00 0,0 0,17 0,5 0,33 1,0 VD4


A los resultados de “no detectado(s)” se les asigna un valor de Ct de 40,1 con el objetivo de lograr la reproducibilidad del análisis.

SENSIBILIDAD ANALÍTICA/LÍMITE DE DETECCIÓN Se determinó el límite de detección (LDD) de la prueba Simplexa™ Dengue usando una serie de diluciones en suero humano de una reserva cuantificada de cepas del virus del dengue. Se estableció que el límite de detección de cada ensayo es la menor concentración con detección ≥ 95 % (por lo menos 19 de 20 réplicas). Tabla 7: Resumen del límite de detección

Serotipo del dengue Cepa del virus Concentración (en ufp/ml) en el límite de detección (LDD)

Dengue 1 WHO WEST PAC 74 0,16

Dengue 2 WHO-S16803 2,0

Dengue 3 WHO-CH53489 0,2

Dengue 4 TVP-360 0,2

REACTIVIDAD ANALÍTICA Además de las cepas evaluadas respecto al LDD, se evaluó una cepa adicional del serotipo del virus del dengue para determinar la reactividad adecuada en el ensayo. Se añadió material viral cuantificado a suero humano negativo en una sola dilución de una concentración indicada en la tabla siguiente y se efectuó el análisis por triplicado. Todas las cepas que se analizaron fueron detectadas de forma adecuada por la mezcla de reacción correcta. Tabla 8: Resumen de la reactividad analítica

Detectado/total Mezcla de reacción 1 y 4 Mezcla de reacción 2 y 3 Cepa vírica Concentración analizada

VD1 VD4 VD2 VD3

Dengue 1, Hawaii no disponible 3/3 0/3 0/3 0/3

Dengue 2, New Guinea C 1,00 × 104 DICT50/ml 0/3 0/3 3/3 0/3

Dengue 3, H87 1,00 × 104 DICT50/ml 0/3 0/3 0/3 3/3

Dengue 4, H241 Sm14 1,00 × 104 DICT50/ml 0/3 3/3 0/3 0/3

REACTIVIDAD CRUZADA La especificidad analítica de la prueba Simplexa™ se evaluó poniendo a prueba su capacidad para identificar exclusivamente el virus del dengue sin reactividad cruzada con microorganismos estrechamente emparentados o que ocasionan síntomas clínicos similares o bien están presentes como parte de la microflora normal en los tipos de muestras de interés.

Se inocularon individualmente veintiocho (28) reactantes con posible reactividad cruzada en suero humano negativo en concentraciones clínicamente pertinentes. La matriz sin inocular también se analizó para que sirviera como valor basal. Las muestras se analizaron por triplicado para detectar la reactividad cruzada. Cuando se detectaba una señal en cualquier canal de detección (DV1, DV2, DV3, DV4) en cualquiera de las tres réplicas, se analizaban 5 réplicas adicionales como confirmación. No se detectó reactividad cruzada. Tabla 9: Resumen de la reactividad cruzada

Detectado/total Mezcla de reacción 1 y 4 Mezcla de reacción 2 y 3 Reactantes cruzados Concentración analizada

VD1 VD4 VD2 VD3

Líquido de cultivo de adenovirus (tipo 1,00 × 105 DICT50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3

Simplexa™ Dengue

Detectado/total Mezcla de reacción 1 y 4 Mezcla de reacción 2 y 3 Reactantes cruzados Concentración analizada

VD1 VD4 VD2 VD3 1)

Líquido de cultivo de adenovirus (tipo 7A) 1,00 × 105 DICT50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3

Aspergilo se desconoce 0/3 0/3 0/3 0/3

Virus BK 1,00 × 105 copias/ml 0/3 0/3 0/3 0/3

Virus de la fiebre chikungunya 1,00 × 105 DICT50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3

Citomegalovirus(CMV) 1,00 × 105 DICT50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3

Enterovirus 71 1,00 × 105 DICT50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3

Virus de Epstein Barr (VEB) 1,00 × 105 copias/ml 0/3 0/3 0/3 0/3

Control de virus de la hepatitis B 5,00 × 103 UI/ml 0/3 0/3 0/3 0/3

Control de virus de la hepatitis C 1,00 × 104 UI/ml 0/3 0/3 0/3 0/3

Virus de la hepatitis D se desconoce 0/3 0/3 0/3 0/3

VIH-1 1,00 × 105 copias/ml 0/3 0/3 0/3 0/3

VIH-2 se desconoce 0/3 0/3 0/3 0/3

VHS-1 1,00 × 105 DICT50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3

VHS-2 1,00 × 105 DICT50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3

VHTL-1 se desconoce 0/3 0/3 0/3 0/3

Herpervirus humano 6 1,00 × 105 DICT50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3



ADN de Mycobacterium tuberculosis 1,67 × 10-3 µg/ml 0/3 0/3 0/3 0/3

Parechovirus 1,00 × 105 DICT50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3

Control de parvovirus B19 1,00 × 107 UI/ml 0/3 0/3 0/3 0/3

Virus de la rubéola 1,00 × 105 DICT50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3

Virus de la encefalitis de San Luis 1,00 × 105 DICT50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3

Toxoplasma gondii 1,00 × 106 taquizoítos/ml 0/3 0/3 0/3 0/3

Virus varicela-zóster 1,00 × 105 copias/ml 0/3 0/3 0/3 0/3

Virus del Nilo Occidental se desconoce 0/3 0/3 0/3 0/3

Virus de la fiebre amarilla 1,00 × 105 DICT50/ml 0/3 0/3 0/3 0/3

INTERFERENCIAS

El rendimiento de este ensayo no ha sido evaluado con sustancias que puedan interferir potencialmente. El proceso automatizado de extracción de ácidos nucleicos elimina las impurezas de la muestra de una forma efectiva mientras aísla y lava los ácidos nucleicos durante el mismo proceso. Los controles internos alertan al usuario final de una potencial inhibición de la PCR; si ninguna de las dianas ni de los controles internos se detectan, el ensayo es inválido.

CONTAMINACION POR ARRASTRE Se evaluó la amplificación por arrastre para el equipo y el Universal Disc utilizando otros ensayos. Los estudios se centraron en la búsqueda de contaminación en muestras altamente negativas. El estudio se diseñó colocando de manera alterna muestras con resultado positivo alto y resultado negativo alto en cada disco. El efecto de arrastre se evaluó comparando la tasa de negativos observados en las muestras con resultado negativo alto con la tasa esperada en condiciones de reproducibilidad normales. No se observó contaminación por efecto de arrastre en pruebas anteriores.

CONTROL DE CALIDAD

Cada laboratorio debe establecer sus propios rangos de control de calidad y la frecuencia de la pruebas de control de calidad basándose en las leyes y normas locales aplicables y las buenas prácticas de laboratorio.

Simplexa™ Dengue

REFERENCIAS

1. Halstead, SB. 1980. Immunological parameters of togavirus disease syndromes. p.107-173. In RW Schlesinger (ed.), The Toga Viruses. Academic Press, Inc., New York.

2. WHO, Dengue Guidelines for Diagnosis, Treatment, Prevention and Control, New edition (2009) WHO/HTM/NTD/DEN/2009.1

3. CDC http://www.cdc.gov/dengue/epidemiology/index.html 4. Gubler, DJ. 1989. Aedes aegypti and Aedes aegypti-borne disease control in the 1990’s: top down or bottom up. Am. J. Trop.

Med. Hyg. 40:571-578. 5. WHO http://www.who.int/csr/disease/dengue/en/ 6. Halstead, SB. 1989. Antibody, Macrophages, Dengue Virus Infection, Shock, and Hemorrhage: A Pathogenic Cascade. Rev.

of Inf. Dis. 11:S830-S839 7. MMWR May 21, 2010 / 59(19);577-581 8. Laue T, Emmerich P, Schmitz H. Detection of dengue virus RNA in patients after primary or secondary dengue infection by

using the TaqMan automated amplification system. J Clin Microbiol. 1999 Aug; 37(8):2543–7 9. Chang GJ, Trent DW, Vorndam AV, Vergne E, Kinney RM, Mitchell CJ. An integrated target sequence and signal

amplification assay, reverse transcriptase-PCR-enzyme-linked immunosorbent assay, to detect and characterize flaviviruses. J. Clin. Microbiol. 1994 Feb; 32(2):477–83

10. Muñoz-Jordán J.L., Collins CS, Vergne E, et al. Highly sensitive detection of dengue virus nucleic acid in samples from clinically ill patients. J Clin Microbiol 2009; 47:927-931

11. CLSI H18-A4. Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guideline. 4th Ed. (2010). El uso de sondas Scorpions® para diagnósticos in vitro en seres humanos está protegido por una licencia de Focus Diagnostics, Inc. de DxS, Ltd. Los colorantes Black Hole QuencherTM, CAL Fluor™ y Quasar™ son marcas registradas de Biosearch Technologies, Inc. ('BTI'). La tecnología de los fluoróforos Black Hole Quencher, CAL Fluor y Quasar está autorizada según un acuerdo con BTI, y estos productos se venden exclusivamente con fines clínicos, diagnósticos o de investigación y desarrollo. REPRESENTANTE AUTORIZADO mdi Europa GmbH, Langenhagener Str. 71 30855, Langenhagen-Hannover, Alemania INFORMACIÓN PARA PEDIDOS

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