profesor patrocinante instituto de bioquímica facultad de
TRANSCRIPT
Profesor Patrocinante
Dra. Claudia Quezada
Instituto de Bioquímica
Facultad de Ciencias
ESTUDIO DEL EFECTO DE HIPOXIA SOBRE LA RESISTENCIA MÚLTIPLE A
DROGAS EN STEM-LIKE CELLS DE GLIOBLASTOMA
Tesis de Grado presentada como parte de
los requisitos para optar al grado de
Licenciado en Bioquímica y Título
Profesional de Bioquímico
DANIEL ALEJANDRO URIBE BRANGE
VALDIVIA – CHILE
2015
Dedicado a mis Padres, Hermanos, abuelito Chicho, Amigos de Infancia y Génesis
AGRADECIMIENTOS
Quiero comenzar agradeciendo al proyecto Fondecyt 1121121 que hizo posible la
ejecución del presente estudio, y a la Dra. Claudia Quezada por haberme recibido en su
laboratorio, por su apoyo, comprensión y disponibilidad en todo momento. A Wallys por la
paciencia, amabilidad y confianza que me brindó durante mis inicios en el laboratorio. A mis
demás compañeros de investigación en CQ Dellis, Angelo, René, Jose (Yosselyn) y Vale, que
me ayudaron siempre que lo necesité, y sobretodo por nuestras juntas deportivas
extraprogramáticas, que desestrezaban nuestras tardes y noches. Al grupo de compañeros de
RSM, que sin su ayuda y diaria presencia, las jornadas laborales no hubiesen sido lo amenas que
fueron. No quiero dejar de agradecer a mis amigos Marco, Coni, Guayo, Alexis, Jose, Yogu y
Mati por su amistad incondicional durante toda la carrera, y obviamente por todas las reuniones
nocturnas en las que estuvieron conmigo, de las cuales tengo los mejores recuerdos. A mi familia
por apoyarme siempre, por sus consejos y enseñanzas, y por hacerme recordar cada vez que
viajaba a verlos, que no hay nada como el cariño y calor de hogar. Muy especialmente, quiero
agradecerle a mi tio Kuno por su apoyo, por ser un segundo papá no sólo para mi, sino que
también para todos mis hermanos, y porque sin él, todo hubiese sido más difícil.
Finalmente quiero agradecerle a Génesis (Cuodes), por ser un tremendo apoyo desde que
la conocí, por su excelente disposición a ayudarme cuando se lo pedí y cuando no, por ser mi
compañera durante largas noches de estudio y laboratorio, así como también durante largas
noches de comida y películas, por enseñarme sobre responsabilidad, perseverancia, por reír y
bailar en los momentos difíciles, y por muchas otras cosas vividas durante estos 6 años.
Asimismo, agradecerle a Cleito, que además de hacerme reir a diario, me hace ver lo valiosa y al
mismo tiempo lo sencilla que es la vida.
i
ÍNDICE GENERAL
1. RESUMEN
1.1. Summary
2. INTRODUCCIÓN
2.1. Glioblastoma y Resistencia Múltiple a Drogas (MDR)
2.2. Glioblastoma stem-like cells y su implicancia en el fenómeno de MDR
2.3. Hipoxia en GBM
2.4. Adenosina en cáncer
3. HIPÓTESIS
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivos generales
4.2. Objetivos específicos
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1. Materiales
5.1.1. Material Biológico
5.1.2. Reactivos Químicos
5.2. Equipos
5.3. Métodos
5.3.1. Obtención de muestras tumorales cerebrales
5.3.2. Cultivos primarios de glioblastoma multiforme
5.3.3. Cultivo de Gliomablastoma Stem-like Cells (GSCs).
5.3.4. Cultivo de líneas celulares
Página
1
2
3
3
8
14
18
25
26
26
27
28
28
28
28
30
31
31
31
32
32
ii
5.3.5. Incubación de células en condiciones de hipoxia
5.3.6. Drogas y tiempo de incubación
5.3.7. Cuantificación basal de adenosina extracelular
5.3.8. Actividad AMPasa de CD73 en células de Glioblastoma
5.3.9. Extracción de proteínas totales
5.3.10. Cuantificación de proteínas
5.3.11. Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones
denaturantes (SDS-PAGE)
5.3.12. Electrotransferencia de proteínas a membranas de PVDF.
5.3.13. Inmunoblot y stripping
5.3.14. Citometría de flujo
5.3.15. Silenciamiento de MRP-1
5.3.16. Ensayo de actividad de MRP3
5.3.17. Ensayo de viabilidad mediante MTT
5.3.18. Análisis estadístico
6. RESULTADOS
6.1. Validación de la condición de hipoxia en cultivos de GSCs
6.2. Estandarización de cultivos celulares bajo hipoxia
6.3. Cuantificación basal de adenosina extracelular en células gliales normales
y cultivos celulares de GBM bajo normoxia o hipoxia.
6.4. Determinación de la actividad AMPasa de CD73 bajo normoxia o hipoxia
33
33
34
35
35
35
36
37
37
39
40
40
41
42
43
43
43
47
51
iii
6.5. Efecto de hipoxia sobre la expresión de CD73 y el receptor de adenosina
A3
6.6. Efecto de hipoxia sobre la expresión de transportadores MDR en GSCs.
6.7. Efecto del antagonista del receptor de adenosina A3 y del inhibidor de la
actividad de CD73 sobre la expresión de MRP3 en condiciones de hipoxia
6.8. Efecto del antagonista del receptor de adenosina A3 y del inhibidor de la
actividad de CD73 sobre la actividad de MRP3 en condiciones de hipoxia
6.9. Efecto del antagonista del receptor de adenosina A3 y del inhibidor de la
actividad de CD73 sobre la viabilidad de GSCs en condiciones de hipoxia
7. DISCUSIÓN
8. REFERENCIAS
54
56
59
62
62
67
82
iv
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1.
Figura 2.
Figura 3.
Figura 4.
Figura 5.
Figura 6.
Figura 7.
Figura 8.
Figura 9
.
Figura 10.
Figura 11.
Figura 12
Glioblastoma stem-like cells y su implicancia en el fenómeno de MDR
Hipótesis sobre la recurrencia en GBM mediada por GSCs.
Rol de adenosina sobre el fenotipo de resistencia múltiple a drogas en
células de glioblastoma humano.
Validación de la condición de hipoxia en GSCs.
Seguimiento fotográfico de cultivos celulares incubados bajo diferentes
tiempos en normoxia.
Seguimiento fotográfico de cultivos celulares incubados bajo diferentes
tiempos en hipoxia.
Cuantificación basal de adenosina en células SVGp-12 y células de
glioblastoma multiforme bajo 6 horas de normoxia o hipoxia.
Cuantificación basal de adenosina en células SVGp-12 y células de
glioblastoma multiforme bajo 24 horas de normoxia o hipoxia.
Actividad AMPasa de CD73 en GSCs bajo 6 horas de normoxia o
hipoxia.
Actividad AMPasa de CD73 en GSCs bajo 24 horas de normoxia o
hipoxia.
Efecto de hipoxia sobre la expresión proteica de CD73 y A3AR en
GSCs.
Medición de la expresión de transportadores MDR en GSCs bajo
condiciones de normoxia o hipoxia mediante citometría de flujo.
Página
6
10
20
44
45
46
49
50
52
53
55
57
v
Figura 13.
Figura 14
Figura 15
Figura 16
Figura 17
Figura 18
Medición de la expresión de transportadores MDR en GSCs bajo
condiciones de normoxia o hipoxia mediante Western blot.
Influencia de MRS1220 sobre la expresión de Mrp3 bajo condiciones de
normoxia o hipoxia.
Influencia de AOPCP sobre la actividad de Mrp3 bajo condiciones de
normoxia o hipoxia.
Influencia de MRS1220 y AOPCP sobre la actividad de Mrp3 bajo
condiciones de normoxia o hipoxia.
Influencia de MRS1220 sobre la viabilidad de GSCs en condiciones de
normoxia o hipoxia.
Influencia de AOPCP sobre la viabilidad de GSCs en condiciones de
normoxia o hipoxia.
58
60
61
63
64
66
vi
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I
Anticuerpos primarios y secundarios con sus respectivas diluciones,
utilizados en ensayos de Western blot y citometría.
Página
38
vii
LISTA DE ABREVIATURAS
A3AR: Receptor de adenosina A3
ABC: ATP-Binding Cassette
ADA: Adenosina Desaminasa
ADP: Adenosina Difosfato
AK: Adenosina Quinasa
AOPCP: Inhibidor específico de CD73
AR: Receptor de Adenosina
bFGF: Factor de Crecimiento Fibroblástico básico
CFDA: 5(6)-carboxifluoresceína diacetato
CNT: Transportador de Nucleósido Concentrativo
CSCs: Cancer stem-like cells
DMEM: Dulbecco's Modified Eagle's Medium.
DMEM-F12: Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12.
DMSO: Dimetil Sulfóxido
EDTA: Ácido Etilendiaminotetraacético
EGF: Factor de Crecimiento Epidermal
ENT: Transportador de Nucleósido Equilibrativo
viii
FITC: Isotiocianato de Fluoresceína
GBM: Glioblastoma Multiforme
GFAP: Proteína Acídica Fibrilar Ácida
GSCs: Glioblastoma stem-like cells
HIF: Factor Inducible por Hipoxia
HPLC: Cromatografía Líquida de Alta Resolución
LIF: Factor Inhibitorio de Leucemia
MDR: Resistencia Múltiple a Drogas
Mrp1: Proteína 1 asociada a Resistencia Múltiple a Drogas
Mrp3: Proteína 3 asociada a Resistencia Múltiple a Drogas
MRS1220: Antagonista del receptor de adenosina A3
MTT: Bromuro de 3-[4,5-dimetilltiazol-2-yl]-2,5- difeniltetrazolio
NE: Neuroesferas
NSC: Stem cells Neuronales
PAP: Fosfatasa Ácida Prostática
P-gp: Glicoproteína-P
PHD: Dominio Prolil Hidroxilasa
PMSF: Fluoruro de Fenilmetilsulfonilo
ix
RT-PCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcriptasa Inversa
RT-qPCR: Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcriptasa Inversa cuantitativa
SAGE: Serial Analysis of Gene Expression
SDS: Dodecil Sulfato de Sodio
SFB: Suero Fetal Bovino
siRNA: ARN de interferencia pequeño
SP: Población Side
SVGp-12: Línea celular glial fetal humana
TMZ: Temozolomida
TRAIL: Ligando Inductor de Apoptósis Relacionado al Factor de Necrosis Tumoral (TNF)
U87MG: Línea celular de glioblastoma multiforme
UV: Ultravioleta
VEGF: Factor de Crecimiento Endotelial Vascular
VHL: Von Hippel-Lindau (Proteína)
1
1. RESUMEN
El Glioblastoma multiforme (GBM) es considerado el tumor más común y agresivo del SNC,
y se caracteriza por ser altamente quimioresistente. Esta propiedad se da principalmente por un
mecanismo de Resistencia Múltiple a Drogas (MDR), que se traduce en la sobreexpresión de
proteínas transportadoras capaces de eliminar fármacos desde la célula. Dentro del tumor, existe
una subpoblación celular denominada Glioblastoma Stem-like Cells (GSCs), a las cuales se les ha
atribuído una mayor capacidad de formar tumores in vivo, y resistir altamente la quimioterapia.
Estas células habitan zonas hipóxicas del tumor, nicho que se ha correlacionado con una mayor
quimioresistencia. Sin embargo se desconocen los mecanismos por los que el microambiente
hipóxico podría contribuir a esta resistencia. Se ha observado que adenosina se encuentra
aumentada en GBM, donde se observa además sobreexpresión de CD73 y el receptor de
adenosina A3 (A3AR). En este contexto, postulamos que hipoxia promovería la sobreexpresión de
transportadores MDR mediante la señalización dependiente de adenosina en las GSCs. Para ello,
nos propusimos evaluar el efecto de hipoxia sobre los niveles de adenosina extracelular y la
expresión de CD73, A3AR y transportadores MDR en GSCs, utilizando HPLC, Western blot y/o
citometría de flujo. Finalmente evaluamos su efecto sobre la viabilidad celular al utilizar un
antagonista del A3AR y un inhibidor de CD73 bajo hipoxia. Los resultados demostraron que en
GSCs el metabolismo de adenosina extracelular está altamente activo en condiciones de hipoxia.
Asimismo, observamos una sobreexpresión del transportador Mrp3, que a diferencia de lo
ocurrido en normoxia, no fue mediada por el A3AR. El uso de un antagonista del A3AR mostró
efectos prometedores sobre la viabilidad de las GSCs, incluso bajo hipoxia, y sugirió además la
presencia y activación de otros mecanismos de defensa celular mediados por este nucleósido.
2
1.1 SUMMARY
Glioblastoma multiforme (GBM) is considered the tumor most common and aggressive of
CNS, and is characterized by elevated chemoresistant. This property is mainly due to a
mechanism of multiple drug resistance (MDR), which results in overexpression of transporters
proteins capable of removing drugs from the cell. Within the tumor, there is a cell subpopulation
called Glioblastoma Stem-like Cells (GSCs), to which has been attributed them greater ability to
form tumors in vivo, and highly resistance to chemotherapy. These cells live hypoxic areas of the
tumor, niche that has been correlated with increased drug resistance. However the mechanisms by
which the hypoxic microenvironment could contribute to this resistance is unknown. It has been
observed that adenosine is increased in GBM, which also overexpression of CD73 and A3
adenosine receptor (A3AR) is observed. In this context, we postulate that hypoxia promote
overexpression of MDR transporters by adenosine dependent signaling in GSCs. To do this, we
set out to evaluate the effect of hypoxia on levels of extracellular adenosine and expression of
CD73, A3AR and MDR transporters in GSCs, using HPLC, Western blot and/or flow cytometry.
Finally we evaluated its effect on cell viability by using an A3AR antagonist and an inhibitor of
CD73 under hypoxia.The results showed that in GSCs extracellular adenosine metabolism is
highly active in hypoxic conditions. We also observed overexpression of Mrp3 transporter, unlike
what happened in normoxia, where was not mediated by the A3AR. Using an A3AR antagonist
showed promising effects on the viability of GSCs even under hypoxia, and also suggested the
presence and activation of other cellular defense mechanisms mediated by this nucleoside.
3
2. INTRODUCCIÓN
2.1. Glioblastoma y Resistencia Múltiple a Drogas (MDR)
Las neoplasias son una de las enfermedades más frecuentes en el mundo, y corresponden
a la segunda causa de muerte en Chile después de las enfermedades del sistema circulatorio según
el Instituto Nacional de Estadística de Chile (Quezada et al., 2011). Los tumores cerebrales
malignos se encuentran entre los tipos de cáncer más temidos, no sólo por su mal pronóstico, sino
también por las repercusiones directas que tiene sobre la calidad de vida y funciones cognitivas
de los pacientes (Omuro et al., 2013). Mundialmente, los tumores cerebrales primarios tienen una
incidencia de 7 por cada 100.000 personas al año (Furnari et al., 2007). En Estados Unidos la tasa
de incidencia de los tumores cerebrales malignos y benignos del sistema nervioso central (SNC)
es alrededor de 11,4 casos por 100.000 personas/año (4,2 por 100.000 persona/año para benigno
y 6,8 por 100.000 persona/año para malignos) (Quezada et al., 2011). La mortalidad por tumores
cerebrales representa el 2,4% de las muertes por cáncer en EEUU; en niños es la segunda causa
especifica de muerte, después de las neoplasias hematológicas (Jemal et al., 2008). En Chile, la
tasa de mortalidad por cáncer es de 119,4 por cada 100.000 representando el 23% de todas las
muertes; en tanto, la tasa de mortalidad por cáncer cerebral varía de 1 a 2 por cada 100.000 (Díaz
et al., 2006). Los gliomas malignos son el tipo más común entre los tumores cerebrales,
abarcando al 80% de los pacientes (Omuro et al., 2013), y aunque son relativamente poco
comunes, están asociados con una desproporcionada morbilidad y mortalidad (Patrick y Kesari,
2008). Son clasificados según la clasificación 2007 de la Organización Mundial de la Salud
(OMS) en astrocitomas, oligodendrogliomas o como tumores oligoastrocitomas mixtos, basado
en características histopatológicas (Louis, 2006). Los tumores de grado inferior (como tumores
4
de grado I-II) son bien diferenciados y presentan algunas anomalías celulares, pero en general se
parecen a los tejidos normales del cerebro. Los tumores de grado III son anaplásicos, con una
aumentada densidad y atipia celular, además de elevado número de vasos sanguíneos (Westphal
and Lamszus; 2011). Los gliomas de grado IV, llamados glioblastoma multiforme (GBM), son
los tumores primarios más malignos y agresivos del cerebro (Patrick y Kesari, 2008). Estos
últimos abarcan aproximadamente el 60-70%, y son responsables de una supervivencia media en
pacientes que bordea los 12 a 15 meses (Patrick y Kesari, 2008). EL GBM puede desarrollarse de
novo (GBM primario) o como resultado de una progresión maligna derivada de gliomas de grado
II y III (GBM secundario) (Dimov et al., 2011). En cuanto a sus características patológicas más
distintivas, se encuentran proliferación celular descontrolada, infiltración difusa, propensión a la
necrosis en áreas severamente hipóxicas, angiogénesis robusta, resistencia intensa a la apoptosis
y exuberante inestabilidad genómica. Asimismo, son altamente infiltrativos y reincidentes, pero
raramente producen metástasis fuera del SNC (Clarke et al., 2010). Esta complejidad, combinada
con el conjunto de lesiones (epi) genéticas que conducen a la patogénesis del GBM, han
conspirado para hacer de este tipo de tumor uno de los más difíciles de entender y tratar (Furnari
et al., 2007).
Los tratamientos actuales para el GBM se basan primeramente en la resección quirúrgica
del tumor, seguida de radio y quimioterapia con temozolomida (TMZ), agentes anti-
angiogénicos, y más recientemente tratamientos inmunoterapéuticos (Stupp et al., 2005 y Weller
2011). Sin embargo, este tumor es altamente infiltrativo, y las células cancerígenas a menudo
invaden el tejido cerebral normal, previniendo una resección quirúrgica completa, lo cual
conlleva inevitablemente a recurrencia (Quezada et al., 2013); de hecho, las células que bordean
la cavidad que queda luego de la cirugía, parecen repoblar el tumor generalmente 2 o 3
5
centímetros desde su posición original, con un fenotipo mucho más agresivo y resistente (Persano
et al., 2013). Junto a su recurrencia, otra de las características más notables del GBM es su
elevada quimioresistencia a un amplio espectro de drogas antitumorales, fenómeno conocido
como Resistencia Múltiple a Drogas o MDR, propiedad que lamentablemente limita de manera
significativa las alternativas terapéuticas no invasivas (Morjani y Madoulet, 2010).
La MDR describe un fenómeno por el cual la resistencia a un medicamento se acompaña
de resistencia a fármacos cuyas estructuras y mecanismos de acción pueden ser completamente
diferentes (Baguley, 2010). Clínicamente, la MDR puede ser intrínseca (al inicio de la terapia), o
adquirida (adquirida durante el período de tratamiento), siendo esta última atribuida a mutaciones
genéticas y a la selección de la terapia (Kroll, 1995).
La adquisición del fenotipo MDR ha sido estrechamente relacionada a la sobreexpresión
de transportadores de membrana ATP-Binding Cassette (ABC). Estos transportadores son
conocidos como bombas de eflujo dependientes de ATP, y conforman una de las más grandes
familias de proteínas (Lu y Shervington, 2008). Esta consiste de 48 genes ABC humanos que
pueden translocar un rango amplio de moléculas sustrato, tales como lípidos y compuestos
xenobióticos a través de las membranas celulares, utilizando la energía de la hidrólisis de ATP
(Figura 1). Estos genes están categorizados en 7 subfamilias que van desde ABCA hasta ABCG
de acuerdo a su secuencia de aminoácidos y dominios estructurales (Lu y Shervington, 2008). Un
transportador funcional usualmente contiene dos dominios transmembrana y dos pliegues de
unión a nucleótido. Los dominios transmembrana contienen 6-12 α-hélice que abarcan la
membrana, las cuales son típicamente responsables en la determinación de la especificidad de
sustrato. Los dos pliegues de unión a nucleótido unen e hidrolizan ATP, por lo tanto
6
Figura 1. Organización y función de transportadores ABC. (a) Organización estructural de un
transportador ABC (full). Un transportador full contiene dos TMDs y dos NBFs. (b) Los
transportadores ABC devuelven sus sustratos al espacio extracelular gracias a la energía
proporcionada por la hidrólisis de ATP. ABC, ATP-binding cassette; NBF, dominio de unión a
nucleótido; TMD, dominio transmembrana. (Moitra et al., 2011)
7
proporcionan el poder de la bomba. La glicoproteína-P (P-gp, MDR1 o ABCB1) fue el primer
transportador MDR identificado y el más extensamente estudiado. La sobreexpresión de P-gp ha
sido considerada como una causa de resistencia a drogas en varios tipos de tumores. Esta proteína
participa en la remoción de distintos agentes anticancerígenos, los cuales representan
aproximadamente el 50% de los usados actualmente en clínica (Morjani y Madoulet, 2010). De
hecho, la quimioresistencia a doxorubicina y vincristina, dos agentes anticancerígenos comunes,
se ha atribuido directamente a P-gp (Zhao et al., 2005). Sin embargo, estudios en líneas celulares
de gliomas o en gliomas humanos de alto grado, establecen un mayor contenido de los subtipos
de transportadores MRP1, MRP3 y MRP4 en estas células y baja expresión de P-gp (Bronger et
al., 2005; Calatozzolo et al., 2005; de Faria et al., 2008; Matsumoto et al., 2005). Sumado a esto,
otro estudio llevado a cabo en nuestro laboratorio, reveló que el transportador más expresado en
biopsias de GBM y en líneas celulares T98G y G44, fue MRP1 por sobre P-gp y ABCG2
(Peignan et al., 2011). A su vez, se observó que al inhibir la función de MRP1 utilizando las
moléculas MK571 o probenecid, ambos inhibidores de MRP1, aumenta la sensibilidad al efecto
citotóxico y anti-proliferativo de las drogas antineoplásicas vincristina, etopósido y taxol
(Peignan et al., 2011). Resultados similares obtenidos por nuestro grupo de trabajo, dieron cuenta
de la disminución de la actividad y expresión de MRP1 utilizando FK506 (tacrolimus) (Garrido
et al., 2011), un inmunosupresor ligado previamente a la inhibición de la actividad de P-gp y
ABCG2 en células de cáncer de ovario, laringe y leucemia (Mizuno et al., 1992; Naito et al.,
1992; Natazuka, 1992; Yamamoto et al., 1995). Por ello, el descubrimiento y diseño de
moléculas “quimiosensibilizadoras” capaces de inhibir la actividad de los transportadores de
resistencia y por lo tanto incrementar la efectividad de los agentes antitumorales, es actualmente
de gran relevancia clínica (Quezada et al., 2011).
8
Por otra parte, como lo refleja su antiguo apodo de "multiforme", el GBM presenta
significativa heterogeneidad intratumoral, citopatológica, transcripcional, genómica y,
aparentemente, a nivel de su quimioresistencia, lo que lo hace más difícil de entender (Furnari et
al., 2007). De hecho, estudios llevados a cabo en tejidos obtenidos de diferentes zonas de la masa
tumoral en GBM (periferia, zona intermedia y núcleo), demostraron perfiles de quimioresistencia
distintos, que se correlacionaban con perfiles de diferenciación celular, expresión génica y pO2
diferentes (Pistollato et al., 2010). En dicho trabajo además, las células que se encontraban en
regiones más hipóxicas del tumor, y que resultaron ser más resistentes al tratamiento con TMZ
que las células periféricas, mostraron elevados niveles de expresión de CD133, un marcador
ampliamente utilizado para la identificación de células madre (Pistollato et al., 2010). En este
contexto, se hace sumamente necesario indagar en aquellas poblaciones celulares que pudiesen
estar contribuyendo en mayor medida a la MDR, y dilucidar de qué manera su microambiente, en
caso de que así fuese, modula este mecanismo.
2.2. Glioblastoma stem-like cells y su implicancia en el fenómeno de MDR
Ha sido bien reconocido que la mayoría de los tumores sólidos están formados de células
cancerígenas heterogéneas, así como de elementos vasculares, estromales y células inflamatorias
(Hanahan y Weinberg, 2000). El GBM muestra notable heterogeneidad intratumoral y jerarquía
celular no sólo a nivel morfológico, sino también en el estado de diferenciación; de ahí a que
muchos tumores cerebrales agresivos posean el término “blastoma” (Dimov et al., 2011; Huang
et al., 2010). La heterogeneidad y la jerarquía celular en cáncer, pueden ser el resultado de causas
genéticas y/o epigenéticas. Incrementada evidencia en enfermedades hematopoyéticas malignas y
tumores sólidos (que incluyen cánceres de colon, cerebro y mama), apoyan fuertemente el
9
concepto de que una subpoblación de células cancerígenas en cada tumor tiene el potencial de
iniciarlo y repoblarlo (Al-Hajj et al., 2003; Bonnet y Dick, 1997; Galli et al., 2004; Hemmati et
al., 2003; Lapidot et al., 1994 y Ricci-Vitiani et al., 2007). Estas células fueron denominadas
cancer stem-like cells (CSCs) o células iniciadoras de tumor, debido a que comparten algunas
propiedades intrínsecas con la población de células madre normales, que incluyen capacidad de
auto-renovación, diferenciación en multi-linajes, y mantención de la proliferación (Crowder et
al., 2014; Huang et al., 2010). Sin embargo, en contraste a las células madre normales, en las
cuales la proliferación está estrechamente regulada y la integridad genómica es mantenida, las
CSCs carecen frecuentemente de algunos de estos mecanismos de control (Moitra et al., 2011).
Además, estas células han demostrado ser más resistentes a la radio y quimioterapia que las
células progenitoras normales y células tumorales diferenciadas (Reya et al., 2001); por ello, se
ha sugerido que esta subpoblación de CSCs sería la responsable de la recurrencia observada en
algunos tumores sólidos, incluido el GBM (Facchino et al., 2011). La hipótesis de las CSCs y su
persistencia después de la terapia, sugiere que el tratamiento apunta solamente a células
diferenciadas del tumor o bulks cells (distribuidas ampliamente en la superficie del tumor),
mientras que la pequeña subpoblación de CSCs (encontradas mayoritariamente en el centro),
escaparía del tratamiento multimodal, conllevando a la reconstitución de la masa tumoral (Beier
et al., 2010) (Figura 2).
En GBM, las CSCs reciben el nombre de glioblastoma stem-like cells (GSCs) y son
funcionalmente definidas por sus capacidades de auto-renovación, diferenciación celular in vitro,
y propagación del tumor in vivo (Huang et al., 2010). Varios estudios han demostrado que las
GSCs tienen el potencial de diferenciarse a astrocitos, oligodendrocitos y neuronas (Hemmati et
al., 2003; Galli et al., 2004; Singh et al., 2004; Bao et al., 2006; Calabrese et al., 2007), aunque
10
Figura 2. Hipótesis sobre la recurrencia en GBM mediada por GSCs. Las terapias
convencionales (cirugía, radioterapia y quimioterapia) tienen como objetivo la masa tumoral
(tumoral bulk), pero no han mostrado ser eficaces contra la subpoblación de GSCs. Los factores
microambientales y la activación de vías de señalización específicas son capaces de sostener y
preservar a las GSCs, permitiendo la recurrencia del tumor. Estudios recientes han sido dirigidos
a generar terapias capaces de diferenciar o eliminar a las GSCs y/o a las señales de su
microambiente que promueven su mantención. GSCs, stem-like cells de glioblastoma (Persano et
al., 2013).
11
comúnmente exhiben señales de diferenciación aberrantes, con marcadores de diferentes linajes
expresados en una misma célula (Huang et al., 2010). Con respecto a su propiedad de formar
tumores, varios grupos de trabajo han demostrado que las GSCs poseen un potencial
tumorigénico mucho más grande que las células tumorales no stem-like cells cuando son
xenotransplantadas en cerebros de roedores inmunodeprimidos (Lee et al., 2006; Li et al., 2009;
Singh et al., 2004). Los tumores que se engendraron, mostraron una mayor similitud fenotípica a
los tumores de aquellos pacientes de los cuales derivaron, y pudieron iniciarse a partir de tan sólo
100 células implantadas (Lee et al., 2006). Aunque su origen no está claramente definido, las
GSCs comparten propiedades similares con las células madre neuronales normales (NSC), entre
las que se incluyen potencial para la proliferación, angiogénesis, invasión y modulación de la
respuesta inmune (Huang et al., 2010). El estudio de esta subpoblación celular in vitro, puede
llevarse a cabo mediante su cultivo como neuroesferas (NE) no adherentes obtenidas de líneas
celulares de glioblastoma como la U87, o bien de cultivos primarios de GBM, en condiciones
ausentes de SFB, medio neurobasal suplementado con bFGF (factor básico de crecimiento de
fibroblastos), EGF (factor de crecimiento epidérmico) y B27. Su identificación y aislamiento se
puede dar en base a marcadores de NSC tales como CD133, Bmi1, Sox2, CD44, CD15, Musachi
y Nestina (Ignatova et al., 2002; Hemmati et al., 2003), siendo uno de los más utilizados CD133,
una proteína de membrana de unión a colesterol, cuya función biológica es desconocida (Xu et
al., 2013; Zhao et al., 2010). No obstante, a pesar de que su existencia en GSCs parece ser bien
aceptada, el uso de CD133 como marcador universal para identificar y aislar células madre de
GBM sigue siendo controversial (Facchino et al., 2011). Otro de los métodos clásicamente
utilizados para la identificación de las GSCs, se basa en la capacidad que tienen estas células de
devolver hacia el espacio extracelular el colorante Hoechst 33342 a través del transportador
12
ABCG2; esto se llevó a cabo bajo la suposición de que las CSCs sobre-expresan transportadores
ABC dada su elevada quimioresistencia; las células que poseían esta propiedad fueron
inicialmente denominadas “side population” (SP) (Dean et al., 2005).
Dentro de la heterogeneidad celular del tumor, las GSCs parecen cumplir un rol en varios
comportamientos malignos asociados a la progresión del GBM (Huang et al., 2010). Se ha
demostrado por ejemplo que las GSCs expresan elevados niveles del factor de crecimiento
endotelial vascular (VEGF) para potenciar la angiogénesis, fenómeno definido como la
formación de nuevos vasos sanguíneos, y que es sumamente necesario para el crecimiento del
tumor (Bao et al., 2006). De hecho, importantes esfuerzos científicos han llevado a la confección
de un anticuerpo anti-VEGF llamado bevacizumab (Avastin), recientemente aprobado por la
FDA en EEUU para el tratamiento en conjunto con la terapia convencional del GBM
(Vredenburgh et al., 2007a, b; Friedman et al., 2009). Sin embargo, estudios clínicos han
demostrado que la mayoría de los pacientes genera resistencia a este tratamiento, debido
probablemente a una sobre-regulación de vías alternativas pro-angiogénicas e incrementado
crecimiento perivascular del tumor (Iwamoto et al., 2009). Además, también se ha encontrado
que las GSCs son relativamente resistentes a la radioterapia debido a la activación de “puntos de
control” en respuesta al daño del ADN, y a la potenciada capacidad de su reparación. Asimismo,
las GSCs son resistentes a la quimioterapia con TMZ (Liu et al., 2006; Bleau et al., 2009). Por lo
tanto, resulta prometedor dirigir las estrategias terapéuticas hacia las GSCs, ya sea para aumentar
la eficacia de los tratamientos anti-angiogénicos, o para promover su quimiosensibilización.
Como ya se mencionó anteriormente, los GBMs son tumores altamente infiltrativos y con
extrema resistencia a la radio y quimioterapia convencional (Furnari et al., 2007; Wen and
Kesari, 2008). A su vez, se ha demostrado que las GSCs tendrían un papel crucial en el desarrollo
13
de este fenotipo resistente (Bleau et al., 2009; Liu et al., 2006; Rich y Bao, 2007). Con respecto a
los mecanismos que pudiesen estar promoviendo la quimioresistencia en este tipo de células, se
ha encontrado evidencia de que CSCs exhiben elevados niveles de expresión de genes asociados
a MDR, entre ellos ABCB1 y ABCG2. Trabajos llevados a cabo en células madre
hematopoyéticas demostraron que estas células expresan altos niveles de ABCG2, no así en
células sanguíneas maduras y progenitoras, donde dicho gen no se expresa (Scharenberg et al.,
2002). Los dos genes que codifican transportadores ABC más estudiados en células madre son
ABCB1 y ABCG2, y junto a ABCC1, representan los 3 genes principales de MDR que han sido
identificados en células tumorales (Cheng et al., 2012; Doyle et al., 1998; Kim et al., 2002;
Scharenberg et al., 2002). Otro trabajo mostró que enriquecidos de células SP (o “CSCs” según
estipula este método de identificación) obtenidos de muestras de tejido de neuroblastoma,
presentaron elevados niveles de ARNm de los transportadores ABCG2 y Pgp-1, sin embargo este
último también fue encontrado en células no SP (Platet et al., 2007). En cuanto al GBM, se
identificó una sub-población de neuroesferas SP positivas para CD133; de aquí se desprendió la
idea de que ABCG2 podría tener un rol importante en la quimioresistencia de estas células (Li et
al., 2009). Sin embargo, varios autores señalan que en GSCs se estarían expresando otros
transportadores, tales como Mrp1, Mrp3 o Pgp-1 (Angelastro y Lame, 2010; Nakai et al., 2009).
De hecho, en un estudio donde se utilizó GSCs obtenidas de la línea celular U87MG, se observó
mediante RT-PCR elevada expresión del marcador CD133, que se correlacionó con un aumento
en la expresión de ABCB1 cuando fueron comparadas con células U87MG (Nakai et al., 2009).
Dos años más tarde, Broadley et al (2011) en ensayos realizados en la subpoblación SP de GSCs,
que fueron expuestas a doxorubicina (sustrato de ABCG2), no observaron expresión de ABCG2,
lo que apoya la idea de que serían otros los transportadores implicados en conferir resistencia a
14
estas células. No obstante, hasta la fecha son muy pocos los antecedentes que se tienen sobre
transportadores ABC en GSCs, y dada la importancia de estas células como principales
candidatas para promover la recurrencia del tumor, y como potenciales contribuyentes a la
quimioresistencia, urge realizar nuevas investigaciones que apunten a los mecanismos que
gobiernan el perfil resistente de las GSCs.
Un enfoque que resulta interesante, es el estudio de todos aquellos factores que regulan la
expresión y actividad de los transportadores MDR. En este sentido, ha sido bien documentado
que hipoxia, condición que se da en varios tumores sólidos, incluido el GBM, estaría
promoviendo la resistencia a fármacos, y con ello el fracaso de los tratamientos (Harris, 2002)
(Figura 2). Por ello, y considerando que las GSCs parecen subsistir en condiciones de baja pO2,
la comprensión de cómo el microambiente tumoral podría influenciar sobre su actividad MDR,
emerge como un camino muy atractivo de abordar.
2.3. Hipoxia en GBM
El rol clave que desempeña el microambiente tumoral en la iniciación y progresión del
cáncer es cada vez más claro. Uno de los elementos del medio celular que modula el
comportamiento del tumor es el oxígeno. Niveles localmente reducidos de oxígeno (o
fisiológicamente llamado hipoxia), es una característica de muchos tumores, particularmente de
los que crecen rápidamente (Bar, 2010). Es conocido que la hipoxia controla la transcripción de
muchos genes que son cruciales en muchos aspectos de la biología del cáncer: angiogénesis,
supervivencia celular, resistencia a la radio y quimioterapia, inestabilidad genómica, invasión y
metástasis, metabolismo de la glucosa y más (Semanza, 2010). El GBM es un cáncer en el cual la
neovascularización y la necrosis inducida por hipoxia, son centrales para su diagnóstico
15
patológico (Bar, 2010). Las regiones hipóxicas son frecuentes en este tipo de tumor, y su
incrementada presencia ha sido asociada a pronósticos clínicos desfavorables (Jensen et al., 2009;
Sathornsumetee et al., 2008; Vaupel y Mayer, 2007). Las extensas áreas hipóxicas en el GBM
pueden parecer paradójicas, especialmente si las observaciones histológicas sugieren que este
tumor es altamente vascularizado. Sin embargo, la vasculatura procedente de un tumor que
prolifera rápidamente es a menudo tortuosa y mal organizada, mostrando anomalías graves en la
formación de vasos, que incluyen la oclusión de los mismos y la presencia de un flujo sanguíneo
lento e ineficiente (Dewhirst et al., 1996; Vaupel et al., 1989).
La respuesta celular a hipoxia es controlada por factores inducibles por hipoxia 1α, 2α y
3α (HIF-1-3α), los cuales heterodimerizan con HIF-1β (Translocador Nuclear del Receptor de
Aril Hidrocarbono o ARNT), que está expresado constitutivamente. Bajo concentraciones de
oxígeno atmosférico, HIF-1α es hidroxilado sobre residuos específicos de prolina (Pro-402, Pro-
564) por proteínas con dominio prolil hidroxilasa (PHD). Esta modificación es una etapa pre-
requisito para su unión al supresor tumoral Von Hippel-Lindau (VHL) y la subsecuente
ubiquitinación por un complejo ligasa ubiquitina que contiene elonguina C. Seguido a la
ubiquitinación, HIF-1α es rápidamente degradado por el proteosoma 26S (Huang et al., 1998;
Kallio et al., 1999). Bajo condiciones de hipoxia, la actividad de las PHDs es inhibida, y la
afinidad de VHL a HIF-1α es reducida, resultando en la rápida acumulación de la proteína HIF-
1α (Semenza, 2003).
Es bien sabido que el crecimiento bajo concentraciones bajas de oxígeno, mantiene la
pluripotencia e inhibe la diferenciación de células madre embrionarias (ESC) (Ezashi et al.,
2005). En el cerebro sano, se ha sugerido que la regulación de los niveles de oxígeno está
integrada en las vías de señalización normales que controlan la proliferación y la elección del
16
destino celular de las células madre neuronales (Panchision, 2009). Por lo tanto, la hipoxia es
probablemente un componente funcional del nicho normal de las células madres normales. De
hecho, células madre hematopoyéticas son mantenidas en la médula ósea, la cual contiene nichos
hipóxicos (Parmar et al., 2007). Sin embargo, la importancia de los nichos hipóxicos en CSCs
permanece poco esclarecido (Heddleston et al., 2009).
Se han propuesto varios posibles nichos para las GSCs, que incluyen regiones
perivasculares, en las que se tiene alcance a un suministro de oxígeno relativamente constante, e
hipóxicas (Bar, 2010). Un estudio demostró mayor expresión de marcadores de células madre en
células CD133+ ubicadas en nichos vasculares, que aquellas CD133+ localizadas en zonas al
azar del tumor (Christensen et al., 2011). Por otra parte, un cuerpo aparte de científicos sugiere
que las GSCs sobreviven y proliferan preferencialmente en microambientes hipóxicos por
mecanismos dependientes de HIFs (Keith y Simon, 2007; Tuettenberg et al., 2006). No queda
claro entonces si estos dos nichos podrían proporcionar señales similares de la presencia de
células madre, o si diferentes poblaciones de GSCs están presentes en cada uno de estos nichos,
influenciando diferencialmente a estas células (Nduom et al., 2012). Una hipótesis que resulta
bastante lógica, es que estos microambientes pueden de hecho ser complementarios,
considerando que VEGF, cuya producción es incrementada en áreas hipóxicas de manera
dependiente de HIF (Brat et al., 2001), estimula la producción de vasos glomeruloides aberrantes
con células endoteliales hiperplásicas, las cuales a su vez podrían potenciar el nicho vascular
(Nduom et al., 2012).
Independiente de las disyuntivas con respecto al microambiente exacto en el que se
localizan las GSCs, es importante destacar que el rol que cumple la hipoxia sobre varios aspectos
fenotípicos y funcionales de estas células es crucial. Un estudio reciente reveló por ejemplo que
17
el microambiente hipóxico promueve la expresión de CD133 y nestina en GSCs, al mismo
tiempo que disminuye la expresión de la proteína acídica fibrilar glial (GFAP), un marcador de
diferenciación celular. Otro grupo también encontró que condiciones restringidas de oxígeno
incrementaron la expresión de marcadores de GSCs e indicadores de auto-renovación, sugiriendo
que el estado de célula madre cancerígena puede ser plástico, y que las condiciones
microambientales pueden promover la adquisición de un fenotipo “stem” (Heddleston et al.,
2009, 2010).
No obstante, uno de los aspectos más importantes a tomar en cuenta en las GSCs dada su
relevancia clínica, es la relación entre su insensibilidad a la quimioterapia y la hipoxia (Persano et
al., 2013). Se ha documentado que la hipoxia tendría un rol fundamental en la inducción del
fenotipo MDR en células cancerígenas a través de la actividad transcripcional de HIFs, los cuales
activarían proteínas y mecanismos MDR. En células cancerígenas de ovario A2780, se ha visto
que el silenciamiento de HIF-1α provoca la disminución de la expresión de P-gp, y con ello el
aumento en la quimiosensibilidad a paclitaxel (taxol), sustrato de esta proteína (Huang et al.,
2007). Un estudio similar en células de glioma humano T98G, demostró que la transfección de
las mismas con un siRNA para HIF-1α, disminuyó la expresión de MRP1 y aumentó su
sensibilidad a doxorubicina y etopósido (Chen et al., 2009). Por otra parte, Kolenda et al. (2011)
observaron en neuroesferas hipóxicas derivadas de cultivos primarios y líneas celulares de GBM,
una correlación entre los aumentos de expresión de marcadores stem y marcadores relacionados a
quimioresistencia, entre los que destacaban MRP1 y P-gp. Más recientemente, otro grupo de
trabajo determinó mayor expresión y función de P-gp en células derivadas de xenoinjertos de
glioblastoma en condiciones de hipoxia comparadas a normoxia (Chou et al., 2012).
18
Sin duda, estos antecedentes subrayan la estrecha relación existente entre el
microambiente hipóxico y el fenómeno MDR mediado por transportadores ABC en células
cancerígenas. No obstante, hasta el día de hoy existe muy poca información acerca los
transportadores MDR expresados en GSCs, y es más escasa si consideramos la influencia que
ejerce su nicho sobre este mecanismo de resistencia. En este aspecto, comprender aquellos
factores que pudiesen estar modulando la relación hipoxia-MDR en GSCs, nos daría una visión
mucho más integral de lo que ocurre dentro del tumor, y abriría nuevos caminos a los cuales
apuntar futuras estrategias terapéuticas.
Se ha descrito que las células de glioma presentan elevada actividad de desfosforilación
del AMP cuando son comparadas con astrocitos normales. Por otra parte, un estudio correlacionó
una elevada sobreexpresión de la ecto-5’-nucleatidasa/CD73 con quimioresistencia en células de
cáncer de mama. Esta enzima cataliza la desfosforilación del AMP para formar adenosina, un
nucleósido que parece estar involucrado en varios aspectos del cáncer. Interesantemente, se ha
descrito que adenosina aumenta extracelularmente bajo hipoxia (Longhi et al., 2013), por lo que
resulta atractivo postular a adenosina como un posible modulador endógeno de la MDR.
2.4. Adenosina en cáncer
Adenosina es un nucleósido de purina que cumple importantes roles en varios órganos
blanco del sistema. Entre sus funciones destacan inhibición de la agregación plaquetaria,
cardioprotección posterior a isquemia, vasodilatación, activación de mastocitos, modulación de la
neurotransmisión, neuroprotección, sobrevida y muerte celular (Bavaresco et al., 2008; Wang et
al., 2008). Bajo condiciones fisiológicas normales, los niveles de adenosina en el microambiente
del tejido son relativamente bajos, encontrándose constante en muchos tejidos (30-200 nM)
19
(Fredholm, 2010; Stagg et al., 2010), y no sobrepasan el umbral de sensibilidad de las células
inmunes (Longhi et al., 2013). Sin embargo, durante hipoxia, isquemia, inflamación, infección,
estrés metabólico y cáncer, los niveles de adenosina extracelular aumentan rápidamente (Longhi
et al., 2013). Luego de su liberación desde el espacio intracelular al medio extracelular en
respuesta a perturbaciones en el tejido, adenosina se comporta como una “alarma” o señal del
daño. Esto conlleva a la activación de receptores de adenosina sobre las células blanco, las cuales
generan varias respuestas celulares que tienen como objetivo restaurar la homeostasis del tejido
(Hasko et al., 2008; Antonioli et al., 2008). De hecho, la acumulación extracelular de adenosina
durante un daño agudo por ejemplo, ha demostrado tener efectos inmunosupresores, protegiendo
a las células y tejido de una respuesta inflamatoria excesiva y daño mediado por inmunidad,
contribuyendo de esta manera a una respuesta inmune auto-limitada (Hasko et al., 2008; Himer et
al., 2010; Longhi et al., 2013).
La vía dominante que conduce a la producción de adenosina extracelular, es la
desfosforilación de ATP por ectonucleotidasas. Esta degradación requiere dos enzimas
denominadas CD-39 (ectonucleósido trifosfato difosfohidrolasa) y CD-73 (ecto-5’-nucleotidasa).
CD-39 hidroliza ATP y ADP a AMP, el cual es además hidrolizado a adenosina por CD-73
(Ghiringhelli et al., 2012) (Figura 3). Alternativamente, adenosina puede ser generada a partir
de la hidrólisis de adenosilhomocisteína por la S-adenosilhomocisteína hidrolasa (Tabrizchi y
Bedi, 2001). Por otra parte, adenosina desaminasa (ADA), distribuida ampliamente en muchos
tipos celulares, convierte adenosina en inosina, mientras que adenosina quinasa (AK) cataliza la
formación de AMP a partir de adenosina (Tabrizchi y Bedi, 2001). Los efectos intracelulares de
adenosina son mediados por subtipos de receptores de adenosina (AR) acoplados a proteína G
(A1, A2A, A2B, y A3), los cuales difieren en sus perfiles de expresión en definidos tipos celulares,
20
Figura 3. Rol de adenosina sobre el fenotipo de resistencia múltiple a drogas en células de
glioblastoma humano. El ambiente tumoral es caracterizado por baja presión de oxígeno e
incrementados niveles de adenosina. La producción elevada de adenosina podría deberse a la
hidrólisis de precursores nucleotídicos de adenosina por la actividad concertada de CD39 y
CD73. Mediadores no reconocidos tales como cAMP podrían contribuir al incremento de estos
precursores nucleotídicos hacia el espacio extracelular. Adenosina media los efectos celulares a
través del receptor A3 (A3R), que señaliza el incremento de la expresión del gen ABCC1 que
codifica para la proteína 1 asociada a la resistencia múltiple a drogas (Mrp1). Consecuentemente,
las drogas antineoplásicas son activamente expulsadas fuera de la célula por Mrp1, a través de un
co-transporte con glutatión. La disminución en los niveles de drogas antitumorales confiere
quimioresistencia a las células de glioblastoma. (Garrido et al., 2014)
21
en el tipo de proteína G a la cual se acoplan, y a su sensibilidad al control por fosforilación del
receptor (Sitkovsky et al., 2004). Los receptores A1 y A3 inducen una disminución del AMPc
intracelular, mientras que los receptores A2A y A2B inducen la activación de adenilato ciclasa,
resultando en el incremento en los niveles de AMPc.
Los receptores A1 y A3 también inducen la activación de fosfatidil-inositol 3-quinasa (PI3K) y de
proteína quinasa C (PKC). Por otro lado, los receptores presentan diferentes afinidades por su
ligando, siendo los subtipos A1 y A2A activados a concentraciones nM de adenosina, a diferencia
de los subtipos A2B y A3, los cuales necesitan niveles en el rango μM (Fredholm et al., 2001).
Si bien adenosina cumple funciones protectoras frente al daño en los tejidos, la
persistencia de aumentos en las concentraciones de adenosina más allá de la fase aguda de la
lesión, puede llegar a ser perjudicial para los mismos, esto mediante la activación de vías que
desencadenan la supresión inmune o que promueven un proceso de restauración tisular incesante,
lo que conduce finalmente a remodelación fibrótica (Chan y Cronstein, 2010; Karmouty-
Quintana, 2013). Adenosina puede acumularse crónicamente en el microambiente tumoral,
aumentando su concentración extracelular más de 100 veces (Fredholm, 2010; Stagg et al.,
2010), un proceso que se ha asociado con la generación de un nicho inmunosuprimido que
favorece el comienzo de la neoplasia (Sitkovsky et al., 2008). Múltiples mecanismos contribuyen
a la generación de este nicho, que incluyen inhibición de la producción de citoquinas por las
células T helper, desregulación de la maduración y diferenciación de fagocitos mononucleares, y
supresión de células T efectoras (Longhi et al., 2013; Ryzhov et al., 2008). Adicionalmente, el
incremento crónico de los niveles de adenosina, puede contribuir a la generación de un
microambiente angiogénico, que es adecuado para el crecimiento tumoral (Hasko y Pacher, 2012;
Spychala, 2000). Además de modular el sistema inmune y la angiogénesis, adenosina se ha visto
22
involucrada en varios aspectos cruciales del cáncer, tales como metástasis, desarrollo y
progresión tumoral (Longhi et al., 2013).
Hipoxia es una de las mayores causas por la cual la producción de adenosina aumenta, por
ello este nucleósido es encontrado en altas concentraciones en zonas hipóxicas asociadas a
tumores (Kumar, 2013). Particularmente, se ha reconocido que niveles significativos de
adenosina se encuentran acumulados en fluidos extracelulares de tumores sólidos (Blay et al.,
1997). Por lo tanto, se ha sugerido que este nucleósido estaría involucrado en vías activadas en
respuesta a bajas presiones de oxígeno. La producción de adenosina en hipoxia se ha relacionado
a HIF-1α en diferentes líneas celulares de cáncer (Merighi et al., 2005). De hecho, hipoxia causa
la acumulación de adenosina extracelular a través de la regulación de enzimas involucradas en el
metabolismo de este nucleósido, fenómeno en el que HIF-1α parece cumplir un rol preponderante
(Synnestvedt et al., 2002). Dentro del microambiente tumoral, se ha evidenciado por ejemplo que
bajo condiciones de hipoxia, CD73 aumenta su expresión de manera dependiente de HIF-1α
(Ledoux et al., 2003; Merighi et al., 2006; Synnestvedt et al., 2002). Adicionalmente, la
concentración de adenosina extracelular puede ser además potenciada por la prevención de su
reutilización a través de la inhibición inducida por hipoxia de ADA y AK (Kobayashi et al.,
2000; Sitkovsky et al., 2004). La expresión de CD73 ha sido observada en varios tipos de cáncer,
que incluyen melanoma, cáncer de mama, glioma, cáncer gástrico, leucemia y cáncer de colon,
sin embargo el rol de su expresión en células cancerígenas permanece poco claro (Beavis et al.,
2012). Lo que sí se ha demostrado, es que su sobreexpresión se relaciona con pronósticos más
desfavorables (Wu et al., 2012); en este aspecto, la inhibición de CD73 parece ser una estrategia
terapéutica esperanzadora.
23
Por otra parte, existe evidencia de que adenosina ejerce sus efectos sobre la proliferación
celular, capacidad de formar clones, resistencia a UV, y muerte celular principalmente a través
del A3AR, el cual se ha encontrado sobre-expresado en varias líneas celulares cancerígenas, que
incluyen astrocitoma y GBM (Gessi et al., 2001, 2004, 2008; Quezada et al., 2103). En líneas
celulares de cáncer de próstata, melanoma, linfoma y en xenoinjertos de ratón, los altos niveles
de expresión del A3AR se han relacionado a efectos pro-apopóticos (Fishman et al., 2002); sin
embargo, en células de GBM parece ocurrir lo contrario. De hecho, el antagonista selectivo de
A3AR, MRS1220, bloqueó la proliferación del glioma mediada por adenosina (Morrone et al.,
2003). Asimismo, se ha observado que la activación de A3AR conlleva a un incremento en la
migración tumoral en células U87MG de GBM. Bajo condiciones de hipoxia, A3AR se activa, y
puede promover la transcripción de HIF-1α, conduciendo a un incremento en la producción de
VEGF y subsecuente angiogénesis (Merighi et al., 2006).
Además de los efectos sobre la proliferación y angiogénesis, la señalización mediada por
adenosina ha demostrado regular la quimioresistencia en células de GBM. Un estudio por
ejemplo encontró que la activación del A3AR inducida por hipoxia, inhibe la apoptosis
promovida por paclitaxel a través de la fosforilación e inactivación de la proteína pro-apoptótica
bad en células de glioblastoma (Merighi et al., 2007). Un trabajo reciente realizado en nuestro
laboratorio, evidenció que la inhibición de la actividad o supresión de la expresión de CD73 en
una línea celular y cultivo primario de glioblastoma, quimiosensibilizó a las mismas a las drogas
vincristina, etopósido y taxol, lo que se correlacionó con una disminución en la expresión y
actividad de MRP1 (Quezada et al., 2013), principal transportador MDR descrito en estas células
(Peigñan et al., 2011). Un estudio similar, pero en células de cáncer de mama, mostró que la
sobre-expresión de CD73 en células tumorales, confirió quimioresistencia a doxorubicina (Loi et
24
al., 2013). Ujhazy et al. (1994) demostró que la expresión de P-gp en células resistentes a
doxorubicina, tratadas con un inhibidor específico de CD73, fue disminuida y la resistencia
revertida. Dos años más tarde, el mismo equipo de trabajo al adicionar 0,5 µM de adenosina a
células tratadas con el inhibidor, revirtió otra vez el fenotipo de resistencia, sugiriendo que la
producción de adenosina mediada por CD73 es necesaria para la función de Pgp en estas células
(Ujhazy et al. 1996). En este aspecto, la inhibición ya sea de CD73 o del A3AR en células de
glioblastoma, asoma como una nueva e interesante alternativa para el tratamiento del GBM.
Finalmente, estos antecedentes dan cuenta del importante rol que cumple el
microambiente tumoral sobre la quimioresistencia en células de GBM, y como moduladores
endógenos pueden regular los mecanismos que la subyacen. En este contexto, el presente trabajo
busca extrapolar el potencial nexo entre MDR y la influencia de la señalización por adenosina
mediada por hipoxia en GSCs, dado su importancia como las principales candidatas de la
recurrencia y quimioresistencia del GBM.
25
3. HIPÓTESIS
“La condición de hipoxia en relación a normoxia, aumenta mayormente la expresión y
actividad de trasportadores MDR y el efecto de adenosina sobre la quimioresistencia en stem-like
cells de glioblastoma multiforme humano”.
26
4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general
Demostrar que bajo condiciones de hipoxia en stem-like cells de glioblastoma, están
aumentados los niveles de adenosina extracelular y la expresión de transportadores de resistencia
múltiple a drogas en relación a normoxia.
27
4.2. Objetivos específicos
1. Cuantificar los niveles de adenosina extracelular en células de GBM y determinar el
efecto de hipoxia sobre la actividad AMPasa de CD73.
2. Determinar el efecto de hipoxia sobre la expresión de Transportadores MDR, CD73 y el
receptor de adenosina A3 en GSCs.
3. Evaluar el efecto de hipoxia sobre la quimiosensibilización de GSCs a fármacos
antitumorales, al inhibidor de CD73 y al antagonista del receptor de adenosina A3 en
ensayos de viabilidad celular MTT.
28
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1. Materiales
5.1.1. Material biológico
En este trabajo se utilizaron células de cultivo primario de tejido de glioblastoma
multiforme humano proveniente de tumores donados por el Instituto de Neurocirugía Dr. Alfonso
Asenjo (INCA), Santiago, la línea celular de glioblastoma humano U87MG, y la línea normal de
células gliales fetales humano SVGp-12.
5.1.2. Reactivos químicos
ABCAM: Anticuerpo secundario anti-goat (ab6741)
Fermentas: Marcador preteñido de proteínas para geles de poliacrilamida (PageRuler™ plus
prestainedproteinladder).
FLUKA: 2-cloroacetaldehído
Gibco: Medio DMEM-F12, suero fetal bovino, tripsina 1X, MEM-NEAS, MEM-VIT,
Penicilina/estreptomicina 100X (10.000 unidades de penicilina, 10.000 gr de estreptomicina, 29.2
mg de L-glutamina por ml de solución salina), colagenasa tipo I (205 unidades/ mg); persulfato
de amonio, buffer DBPS, Bicarbonato de sodio.
Indura: Tanque de 8.5 m3 con mezcla de gases 5% CO2 y 95% N2.
Invitrogen: Reactivo de transfecciónLipofectamineTM2000, anticuerpo secundario Alexa Fluor
488 goat anti-mouse IgG (A11029), anticuerpo secundario Alexa Fluor 488 goat anti-rabbitIgG
29
(A11034), anticuerpo secundario Alexa Fluor 488 rabbit anti-goatIgG (A11078), anticuerpo
secundario anti-goat Alexa Fluor 647 (A21447), anticuerpo secundario anti-rabbit HRP (656120).
J.T. Baker: Ácido clorhídrico, acetato de potasio, cloruro de sodio.
Merck & Co., Inc.: Ácido Acético, ácido clorhídrico, azul de bromofenol, isopropanol,
formaldehído, metanol, cloroformo, alcohol isoamílico, Tritón X-100, N,N,N',N'-
tetrametiletilendiamina (temed), hidróxido de sodio, isopropanol, etanol, fosfato monoácido de
sodio, fosfato diácido de sodio, tritón X-100, Dimetil sulfóxido (DMSO), acido fórmico, fosfato
monoácido de sodio, fosfato diácido de sodio.
Milipore: Membrana de durapore hidrófobo Immobilon-P de PVDF.
Novus Biologicals: HIF-1α (610958).
Santa Cruz Biotechnologies: Anticuerpos primarios monoclonales anti-MRP1 (sc-18836), anti-
MRP3 (sc-5776), anti-β-actina-HRP (sc-47778), anti-CD73 (sc-14682), anti-RA A3 (sc-13938),
Reactivo quimioluminiscente (Western blotting luminol reagent).
Sigma Chemical Co.: 2-mercaptoetanol, glicina, azul de Coomassie G-250, Tritón X100,
albúmina de suero de bovino (BSA), 5- carboxifluoresceína diacetato (CFDA), MTT Formazan,
AOPCP.
Thermo Scientific: ECL Western Blotting Substrate, BCATM Protein Assay Kit, Anticuerpos
secundarios anti-mouse IgG-HPR (31450).
Tocris bioscience: MRS1220
Winkler: Solución de Chomczysky con fenol, Acrilamida: bisacrilamida 29:1, PBS10X (NaCl
1.36 M, KCl 0.007 M, NaHPO4-7H2O 0.199 M, KH2PO4 0.066 M, pH 7.4), Alcohol Metílico y
Etílico, Buffer de carga 6X azul-celeste (Glicina 30%, azul de Bromofenol 0.25%, Xilen-Cianol
30
FF 0.25%), TEMED, Dodecil Sulfato de Sodio (SDS), Tris HCl pH 9,0 Buffer Fosfato pH 7,5,
Borato de sodio 10-Hidrato, membrana PVDF.
5.2. Equipos
Termociclador MJ Research (Mini Cycler), termociclador Eppendorff (mastercycler
personal), Balanza analítica Shimadzu (Libror AEX-120 G), pHmetro radiometer Copenhagen
(PHM 83 autocal pH meter), estufa 37ºC Bluem (drytypebacteriologicalincubator), cámara de
hipoxia BioSpherix C-274 de dos bandejas, sensor de oxígeno BioSpherix ProOx P110, balanza
Shimadzu (Libror EB-3200 S), micropipetas Gilson, incubadora baño seco Valquim (MK2000-
2), horno microondas Somela (E 70 TF-7), fuente de poder Life Technologies (model 500),
fuente de poder Bio-Rad (PowerPac Basic 300 V, 400.A, 75 W), agitador termorregulado lab-line
instruments (Lab-Line Orbit Environ-Shaker), Omega autoclave de Orthman, centrífuga
Eppendorf (5417 R), centrífuga Fisher Scientific (Micro V), centrífuga Heraus Sepatech
(Megafuge 1.0 R), baño termorregulado Kottermann, vortex Fisher (Genie 2), cámara digital para
geles de agarosa Spectroline (model CA1000/F) con monitor, unidad archivadora digital
Spectroline (model AU-1000/F) e impresora Sony (UP- 860), sistema de transferencia Bio-Rad
(semy-dry transfer cell TRANS-BLOT SD), centrifuga Hettich (MIKRO 22R), Fluorímetro
Perkin Elmer modelo, LS-50; espectrofotómetro UV-VIS Hewlett Packar modelo 8453,
Microscopio invertido Olympus, citómetro BD C6 Accuri, centrífuga refrigerada Hettich, Cámara
de flujo laminar Nuair, Estufa de Cultivo Nuaire, baño termo Regulado, Lector de microplacas
(Awareness, Technology Inc.), Nanodrop 2000spetrophotometer (Thermoscientific), lector multi-
modal de microplacas Synergy 2 (Biotek), Light Cycler (Roche), Cytospin4 (Thermoscientific).
31
5.3. Métodos
5.3.1. Obtención de muestras tumorales cerebrales
Las muestras histopatológicas fueron obtenidas por procedimientos quirúrgicos desde
pacientes con glioblastoma multiforme, que no han recibido radio y/o quimioterapia. La
recolección de muestras fue realizada por los especialistas en condiciones de asepsia en el propio
quirófano del Instituto de Neurocirugía, Dr. Alfonso Asenjo, Santiago. Parte de la muestra se
introdujo inmediatamente en el medio de cultivo estéril a temperatura de hielo (DMEN-F12,
glutamina y 1% antibiótico). Posteriormente, los tejidos fueron conservados a 4°C, luego de 24 h
se procesó según lo descrito en la sección 3.2.2. Las muestras fueron tratadas de acuerdo a las
normas de Bioética y Bioseguridad de la Universidad Austral de Chile. En el Servicio de
Anatomía Patológica del Instituto de Neurocirugía Dr. Alfonso Asenjo fueron identificadas y
clasificadas histopatológicamente.
5.3.2. Cultivos primarios de glioblastoma multiforme
El tejido tumoral fue lavado con solución de D-Hanks en condiciones asépticas. Luego se
retiró el tejido necrótico visible y los vasos sanguíneos o glóbulos rojos presentes, se rompió y
trituró utilizando tijeras quirúrgicas. Posteriormente se sometió a digestión con 50 mg de
Colagenasa tipo I (205 unidades/ mg) durante 20 min con agitación constante a 37ºC, y fue
resuspendido por pipeteo. Para detener la digestión se agregó 10% de suero bovino fetal. Las
células recolectadas fueron sedimentadas por centrifugación a 1000xg durante 5 min y re-
suspendidas en 5 ml de medio DMEM-F12 suplementado con 20% de suero bovino fetal,
penicilina 100 U/ml y estreptomicina al 1% en condiciones constantes de normoxia a 37°C y 5%
de CO2, para posteriormente sembrarlas en un frasco de cultivo celular T75. Después de una
32
semana se realizó un lavado con PBS1X para eliminar los glóbulos rojos y restos celulares que no
fueron adheridos al frasco.
5.3.3. Cultivo de Gliomablastoma Stem-like Cells (GSCs)
Las células GSCs derivadas de la línea celular U87, fueron crecidas en placas Petri de 100
ml e incubadas en medio neurobasal (GIBCO) suplementado con EGF 20 ng/ml, bFGF 20 ng/ml,
LIF 10 ng/ml, B27 1X y penicilina/estreptomicina al 1%, L-glutamina 2 mM, bajo condiciones de
normoxia o hipoxia 1% (mezcla 5% CO2 y 95% N2) a 5 % de CO2 y a 37ºC. Para la realización
de cambio de medio o su traspaso a otro tipo de placas, las neuroesferas no adherentes fueron
recolectadas en un tubo falcón de 15 ml y centrifugadas a 500xg por 5 min, descartando luego el
sobrenadante. El pellet fue re-suspendido en medio neurobasal suplementado con factores de
crecimiento. Una vez transcurrido 10 días de cultivo, las neuroesferas fueron sembradas en placas
para llevar a cabo los diferentes ensayos, ya que en este periodo presentan marcadores de GSCs.
5.3.4. Cultivo de líneas celulares
Las células U87 y SVGp12 fueron crecidas a confluencia en frascos de cultivo celular
T75, en medio DMEM-F12 suplementado con suero bovino fetal 10%, penicilina/ estreptomicina
al 1 %, bajo condiciones de normoxia o hipoxia 1% (mezcla 5% CO2 y 95% N2) a 5 % de CO2 y
a 37ºC. Adicionalmente, las células SVGp12 fueron suplementadas con aminoácidos no
esenciales 1X y MEM vitamina 1X. Para traspasar las células a las placas en las que se realizaron
los ensayos, se les retiró el medio de cultivo por aspiración, y la mono capa se lavó tres veces con
PBS1X, para luego ser incubadas con 1 ml de tripsina 0,05 % en EDTA 0,1 % por 5 min a 37ºC.
Una vez transcurrido el tiempo de incubación, las células se despegaron de la pared del frasco, y
33
se traspasaron a un tubo falcón de 15 ml, donde se adicionó 3-5 ml de medio de cultivo completo
para neutralizar la tripsina. Las células fueron inmediatamente centrifugadas a 1500xg por 5 min,
y el sedimento celular fue re-suspendido en medio fresco para su sembrado en placas de 6
pocillos a una densidad de 5-8x105
células/ml por pocillo a condiciones estándares de
temperatura y CO2. Al cabo de 24 h se les cambió el medio, y se monitoreó su crecimiento hasta
el momento de su utilización.
5.3.5. Incubación de células en condiciones de hipoxia
Una vez alcanzada la densidad celular requerida para cada ensayo, las células fueron
incubadas en una cámara de hipoxia BioSpherix, la cual disminuye los niveles de oxígeno
mediante la inyección regulada por sensor, de una mezcla de gases constituida por 5% CO2 y
95% N2. El nivel de oxígeno escogido fue de 1% para todos los ensayos, porcentaje comúnmente
encontrado en tejidos de glioblastoma multiforme según estudios llevados a cabo por Evans et al
(2004a-b, 2008). Dicha cámara, fue ubicada dentro de un incubador para asegurar las condiciones
estándares de temperatura y humedad. Las células destinadas al tratamiento en hipoxia fueron
sometidas a esta condición durante 6 y/o 24 horas.
5.3.6. Drogas y tiempo de incubación
Para este estudio las células fueron incubadas durante 24 h con las siguientes drogas:
inhibidor de la actividad enzimática de CD73 AOPCP 50 μM (Stagg et al., 2010), antagonista del
receptor A2B MRS1754 50 nM (Fredholm et al., 2001), antagonista del receptor A3 MRS1220
10 μM (Fredholm et al., 2001), y las drogas anticancerígenas vincristina 100 nM y etopósido 2
µM (Garrido et al., 2011). Antes de tratar a las células con las distintas drogas, aquellas que se
34
destinaron a hipoxia fueron pre-incubadas 4 horas a 1% de O2; de esta manera nos aseguramos
que el tratamiento con las drogas se hiciera sobre células ya hipóxicas. Cabe señalar además que
en aquellos experimentos donde se incubó a las células con estas drogas, el co-tratamiento con
hipoxia se hizo siempre a 24 horas, esto con el fin de respetar el tiempo comúnmente utilizado en
nuestro laboratorio para dichos ensayos. Los demás experimentos que no involucraron el uso de
drogas, fueron desarrollados bajo 6 y/o 24 horas de hipoxia como se estableció previamente.
5.3.7. Cuantificación basal de adenosina extracelular
Las células SVGp-12, cultivos primarios de GBM, U87 y neuroesferas, fueron lavadas 3
veces con PBS 1X. Luego se adicionó a las células 1 ml de buffer tyrode por pocillo (calculado
para una placa de 6 pocillos), y se llevaron a incubar a 37°C durante 1 hora. Para el caso de los
tratamientos en hipoxia, esta incubación se efectuó dentro de la cámara correspondiente.
Transcurrido el tiempo, se retiró 200 µl del sobrenadante de buffer tyrode, a los que se les añadió
inmediatamente 100 µl de buffer citrato pH 4. Es importante señalar que el PBS 1X, buffers
tyrode y citrato, fueron precalentados a 37°C antes de su incorporación sobre las células.
Posteriormente, los 300 µl de cada muestra fueron derivatizados con 35 µl de 2-cloroacetaldheído
a 80°C durante 40 minutos. Terminado dicho tiempo, las muestras fueron filtradas con filtros de
0,2 µm y cargadas en el sistema automático de HPLC (Roa et al. 2009). Para determinar las
cantidades de los nucleósidos se utilizó un estándar de adenosina de concentración conocida,
disuelto en el medio y procesado en las mismas condiciones. Los valores de adenosina obtenidos
fueron normalizados con la concentración de proteínas totales.
35
5.3.8. Actividad AMPasa de CD-73 en células de glioblastoma
Las células U87 y neuroresferas fueron lavadas 3 veces con PBS 1X para luego
adicionarles 400 µM de AMP en 1 ml de buffer tyrode. Seguidamente las células fueron
incubadas a 37°C durante 15 minutos. Transcurrido el tiempo, se retiró 200 µl del sobrenadante
de buffer tyrode, a los que se les añadió inmediatamente 100 µl de buffer citrato pH 4. Antes de
ser filtradas, las muestras fueron diluidas 50 y 100 veces para el caso de los sobrenadantes de
células U87 y neuroesferas, respectivamente. Los pasos posteriores son descritos en sección
3.2.7.
5.3.9. Extracción de proteínas totales
Para preparar proteínas totales, fueron sembradas en cada placa, 1x106 células U87,
SVGp-12, cultivo primario o GSCs, las cuales se incubaron en medio DMEM/F12 o neurobasal
completo. Posteriormente fueron tratadas durante 24 o 6 h con los distintos tratamientos. Las
células fueron lavadas 3 veces con PBS1X, inmediatamente después se realizó la extracción. Para
ello, se dejó cada placa sobre hielo y se añadieron 150 μl de buffer Tris, 2% SDS y 10% glicerol
más los inhibidores de proteasas (1 mM PMSF, 2 μM aprotinina, 1μg/μl leupeptina y pestatina).
Con la ayuda de un raspador (scrapper) se rompieron las células y finalmente el extracto de
proteínas fue recolectado en un tubo Eppendorf. Las muestras se sonicaron tres veces por 5
segundos a una amplitud máxima de 50 y se congelaron a -80ºC hasta su utilización.
5.3.10. Cuantificación de proteínas
Para determinar la concentración de proteínas se utilizó el kit de Pierce ® BCA Protein
Assay, el cual se basa en la reducción de Cu2+
a Cu1+
por las proteínas presentes en un medio
36
alcalino. Se construyó una curva de calibración con albumina (2 mg/ml) entre 0 y 2 μg en un
volumen final de 225 μl. Para todas las lecturas de absorbancia de los valores que conforman la
curva de calibración se utilizó como blanco agua desionizada; por otro lado, para la lectura de
absorbancia de las muestras se utilizó como blanco una dilución de buffer de lisis. Para realizar la
cuantificación de los distintos valores de la curva de calibración, se tomó 25 μl de cada dilución
de la curva y se mezcló con 200 μl de solución de trabajo (reactivo A más reactivo B en relación
50:1 respectivamente, ambos reactivos son proporcionados por BCA Protein Assay Kit), luego
esta mezcla se incubó a 37ºC por 30 minutos y finalmente se realizó la lectura de absorbancia a
una longitud de onda de 570 nm (Synergy 2, Biotek). Las absorbancias de las muestras se
interpolaron en la curva de calibración para determinar cada una de las concentraciones.
5.3.11. Electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones denaturantes (SDS-
PAGE)
La separación electroforética de proteínas se realizó en geles de poliacrilamida al 10%, en
el sistema de electroforesis Mini Protean III de la compañía BIORAD. Los geles separador y
espaciador de 1,5 mm de espesor se prepararon a partir de una solución de
acrilamida:bisacrilamida al 30%. El gel separador se preparó a una concentración final de
poliacrilamida del 10% (Tris-HCl 375 mM pH8,8, SDS 0,1%, persulfato de amonio 0,05% y
TEMED 0,198%). El gel espaciador se preparó a una concentración final de poliacrilamida del
4% (Tris-HCl 125 mM pH6.8, SDS 0,1%, persulfato de amonio 0,05% y TEMED 0,198%). A 40
μg de proteínas se le agregó tampón de carga 5x. Las muestras fueron cargadas en el gel,
realizándose la electroforesis en tampón de corrida Tris-glicina-SDS (8mM Tris, 250mM glicina,
37
3mM SDS, pH 8.3) aplicándose 35 mA a la corrida. Se realizó la corrida electroforética durante
1,5 horas. Se utilizó el marcador de peso molecular de amplio rango para proteínas preteñido
PageRulerTM Plus de ThermoScientific.
5.3.12. Electrotransferencia de proteínas a membranas de PVDF
Una vez concluida la separación electroforética, las muestras de proteínas fueron
electrotransferidas a membranas de polivinilideno difluoruro (PVDF) de tamaño de poro de 0,45
μm y activadas en metanol por 5 minutos. La electrotransferencia se realizó utilizando el sistema
Mini Trans Blot, para lo cual, sobre una esponja embebida en buffer de transferencia (8 mM Tris,
250 mM glicina, 3 mM SDS, 20% metanol, pH8.3) se depositaron secuencialmente: un trozo de
papel filtro Whatman N°1, el gel a transferir, la membrana de PVDF y luego otro papel filtro, la
que fue cubierta con otra esponja embebida en la misma solución. El cassette se colocó en la
cámara de electrotransferencia conteniendo buffer de transferencia. Las condiciones de
transferencia fueron 2 horas a 400 mA. Transcurrido este tiempo, la membrana se sumergió 1
minuto en metanol y se dejó secar a 37°C por 30 minutos.
5.3.13. Inmunoblot y stripping
Para el análisis inmunoquímico, las membranas de PVDF se saturaron con solución de
bloqueo (PBS, 1% BSA, 0,05% Tween 20) por 30 minutos. Luego se incubó con anticuerpo
primario a sus respectivas diluciones, de acuerdo a como se indica en la Tabla I, con agitación
suave a 4°C por 16 horas. Finalizado este tiempo, las membranas se lavaron por 30 minutos con
PBS-Tween. Posteriormente se incubaron con el anticuerpo secundario correspondiente (anti-
38
Tabla I. Anticuerpos primarios y secundarios con sus respectivas diluciones, utilizados en
ensayos de Western blot y citometría.
Anticuerpo Dilución Marca y código
1ario
anti-Mrp-1 1:500 (Western blot)
1:100 (Citometría)
Santa Cruz (sc-18836)
1ario
anti-Mrp-3 1:500 (Western blot)
1:100 (Citometría)
Santa Cruz (sc-5776)
1ario
anti-CD73 1:800 Santa Cruz (sc-14682)
1ario
anti-A3AR 1:500 Santa Cruz (sc-13938)
1ario
anti-HIF-1α 1:500 Novus Biologicals (610958)
1ario
anti-β-actina 1:3000 Santa Cruz (sc-4778 HRP)
2ario
anti-mouse IgG-HPR 1:10000 ThermoScientific (31450)
2ario
anti- mouse Alexa Fluor 488 (H+L) 1:1000 Invitrogen (A11001)
2ario
anti-goat HRP 1:10000 ABCAM (ab6741)
2ario
anti-goat Alexa Fluor 488 (H+L) 1:1000 Invitrogen (A11078)
2ario
anti-goat Alexa Fluor 647 (H+L) 1:1000 Invitrogen (A21447)
2ario
anti-rabbit HRP 1:10000 Invitrogen (656120)
2ario
anti-rabbit Alexa Fluor 488 (H+L) 1:1000 Invitrogen (A11034)
39
goat 1:10000; anti-rabbit 1:10000; anti mouse 1:10000), por 45 minutos. Finalmente se lavaron
por 30 minutos con PBS-Tween. En este momento se utilizó el kit comercial Super Signal West
Dura Extended Duration Substrate, en el cual se mezclaron partes iguales de los dos reactivos
(Luminol: Enhancer) y se vertieron sobre la membrana, dejándolo actuar por 1 min a temperatura
ambiente. Se eliminó el exceso del reactivo y la captura de la imagen fue tomada en el equipo
ultralum (Ultralum Molecular Imaging System, Omega), el cual registró la emisión del Luminol.
Luego del revelado las membranas fueron lavadas y “strippeadas” para eliminar los anticuerpos
adheridos que puedan interferir con la nueva detección y así realizar la inmondetección del
control de carga, en este caso se utilizó el anticuerpo anti-β actina. El stripping consiste en
incubar la membrana de PVDF con la solución de stripping (2% SDS, 62,5 mM Tris-HCl pH 6.8,
β-mercaptoetanol 100 mM) por 30 minutos a 50°C con agitación suave. Luego las membranas se
lavan 3 veces con PBS-Tween y se procede a realizar la inmunodetección anteriormente descrita.
5.3.14. Citometría de flujo
Luego de los respectivos tratamientos, las GSCs fueron lavadas 3 veces con PBS 1X y se
fijaron con un 1 ml/pocillo (considerado para placas de 6 pocillos) de formaldehído 4% durante
20 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente las células fueron lavadas con PBS 1X (1-3
veces) para descartar el formaldehído, y se permeabilizaron con 1 ml de metanol 90% (diluido en
PBS 1X) durante 30 minutos a 4°C. Terminado dicho tiempo, las células fueron lavadas 2 veces
con 1 ml de solución de bloqueo consistente en BSA 0,5% en PBS 1X. Luego de los dos lavados,
se realizó un bloqueo de 10 minutos con la solución de BSA 0,5% en PBS 1X, se descartó el
sobrenadante, y se volvió a re-suspender en 200 µl de la misma solución. De los 200 µl, 100 µl
40
fueron destinados como control negativo, y los otros 100 µl para su respectivo marcaje con
anticuerpo primario anti-Mrp1/Mrp3 (dilución 1:10), cuya incubación se realizó durante toda la
noche. Al día siguiente, las células fueron lavadas con BSA 0,5% en PBS 1X 3 veces, y se
prosiguió a la incubación con el anticuerpo secundario (dilución 1:100) durante 1 hora.
Finalmente las células fueron lavadas 3 veces con PBS 1X, y se re-suspendieron en 200 µl de
PBS 1X para su posterior lectura en el citómetro BD C6 Accuri.
5.3.15. Silenciamiento de Mrp-1
Para realizar los ensayos de siRNA se utilizó la siguiente secuencia específica para Mrp1:
5´-TCGAGGATGACACCTCTCAACAAATTTTCAAGGAAA
TTGTTGAGAGGTGTCATCAGA -3’, contenida en el plásmido Shuttle Vector 1.0- CMV. Las
GSCs fueron sembradas en placas de 12 pocillos y se dejaron crecer hasta 80% de confluencia.
Una vez alcanzada la confluencia deseada, las células fueron transfectadas con el siRNA (1 μg)
específico contra Mrp1. Para esto el siRNA fue disuelto en 100 μl de medio neurobasal y 7 μl de
Lipofectamina 3000 (Invitrogen) e incubados por 5 minutos a temperatura ambiente. Esta mezcla
se agregó a la placa, la cual fue incubada por 48 h a 37ºC. Una vez cumplida las 48 h los
resultados fueron analizados por western blot utilizando anticuerpo específico anti-Mrp1 y por
ensayos de acumulación de sustrato fluorescente (CFDA) (descrito a continuación).
5.3.16. Ensayo de actividad de Mrp3
Las GSCs previamente transfectadas con el siRNA para Mrp1, además de las GSCs
controles (no transfectadas) fueron sometidas a normoxia o hipoxia 1% O2 durante 24 horas. Una
41
vez cumplido el tiempo de incubación las células fueron cargadas con 500 nM de 5-
carboxifluoresceína diacetato (CFDA) por 15 min. Se realizaron 3 lavados con PBS 1X e
incubadas con medio libre de suero por 30 min. Las células fueron lavadas 3 veces con PBS1X
frío y lisadas con PBS1X- 0,4% Tritón X-100. Las muestras se diluyeron 10 veces en PBS 1X a
temperatura ambiente, la solución resultante se traspasó a una cubeta de cuarzo de paso óptico de
1 cm. La fluorescencia en los extractos celulares fue medida en espectrofluorímetro (Perkin
Elmer LS-55) utilizando una longitud de onda de excitación y de emisión de 488 nm y 530 nm
respectivamente. Este ensayo fue normalizado con respecto a la concentración total de proteínas.
5.3.17. Ensayo de viabilidad mediante MTT
El método se basa en la reducción de la tinción amarilla tetrazólica MTT para formar
cristales violetas de formazan insolubles en agua. Esta reacción solo ocurre en células viables y
es catalizada por la enzima mitocondrial succinato deshidrogenasa. El formazan insoluble en
agua es solubilizado con DMSO y la densidad óptica de la materia resultante se mide por
espectrofotometría a 545 nm. La absorbancia determinada es proporcional al número de células
metabólicamente viables en el cultivo. Las GSCs fueron sembradas en placas de 96 pocillos a una
densidad de 5x104 células por pocillo e incubadas en condiciones de cultivo estándar por 24 h en
medio DMEM-F12 completo, luego se incubó 24 h con los respectivos tratamientos.
Transcurrido este lapso se agregó la solución de MTT (5 mg/ml) disuelta en medio de cultivo sin
suero bovino fetal en un volumen de 100 μl por pocillo. Los pocillos de los costados de la placa
se usaron como blanco conteniendo solo PBS 1X. Después se incubó por 1 hr a 37ºC y los
cristales de formazan formados fueron lisados con 100 μl de DMSO. La absorbancia se midió a
42
545 nm en un lector de microplaca (Awareness, Technology Inc.). Los valores de absorbancia se
expresaron en porcentaje relativos al control (células sin tratamiento).
5.3.18. Análisis estadístico
Los datos obtenidos fueron presentados como el promedio ± desviación estándar. Para los
análisis estadísticos la significancia fue evaluada utilizando la prueba t-student, considerando un
valor P< 0.05. Se utilizó el programa GraphPad para la obtención de los gráficos y para los
análisis estadísticos.
43
6. RESULTADOS
6.1. Validación de la condición de hipoxia en cultivos de GSCs
Para confirmar que los tratamientos se realizarían verdaderamente bajo condiciones de
hipoxia, medimos la expresión de HIF-1α en GSCs luego de incubarlas 24 horas a 1% de
oxígeno. Asimismo, considerando que los cultivos celulares durante hipoxia producen una mayor
cantidad de metabolitos ácidos, medimos el pH del sobrenadante de las GSCs, y se registró
fotográficamente su color. La figura 4A ilustra un Western blot en el que se observa un aumento
de más de 4 veces en la expresión de HIF-1α al cabo de 24 horas de hipoxia en relación a
normoxia. Por otra parte, se registró en el sobrenadante de las GSCs hipóxicas una disminución
en el pH que fue de 7.35 (células en normoxia) a 6.8, lo que se vio reflejado en un cambio de
color en el medio, que fue de rosado a un tono más amarillo (figura 4B).
6.2. Estandarización de cultivos celulares bajo hipoxia
Para comenzar, quisimos someter los cultivos celulares a diferentes tiempos de hipoxia, lo
cual nos daría una idea del tiempo óptimo de incubación en el que las células pueden resistir la
condición extrema que implica un microambiente disminuido en oxígeno. Para dicho fin, se
pusieron a disposición las líneas celulares adherentes SVGp-12 (línea celular glial normal) y
U87MG, así como también cultivos primarios de GBM y GSCs obtenidas de células U87MG.
Dichos cultivos fueron incubados durante 24, 48, 72 y 96 horas de hipoxia al 1%. Las figuras 5 y
6 muestran el seguimiento fotográfico que se le hizo a las células durantes los tiempos de
incubación ya mencionados, tomando como control las fotografías captadas a las mismas células
bajo normoxia. Se observa que en condiciones normales de oxígeno (Figura 5), todas las
44
Figura 4. Validación de la condición de hipoxia en GSCs. En (A) se muestra un Western blot
en el que se evalúa la expresión de HIF-1α en GSCs tras 24 horas de normoxia o hipoxia. Para
llevar a cabo la electroforesis se cargaron 100 µg de proteínas totales, y la separación
electroforética se realizó en un gel de poliacrilamida al 8%. HIF-1α fue detectado con una
dilución 1:500 del anticuerpo a la altura de 120 kDa. β-actina fue utilizada como control de carga,
y se detectó con una dilución 1:3000 del anticuerpo a la altura de 42 kDa. En (B) se muestra una
fotografía tomada a cultivos de GSCs tras 24 horas de normoxia (placa inferior) o hipoxia (placa
superior), cuyos pH detectados fueron de 7.35 y 6.8 para normoxia e hipoxia, respectivamente.
**, P < 0,01; n = 3.
A B
45
Figura 5. Seguimiento fotográfico de cultivos celulares incubados bajo diferentes tiempos en
normoxia. Las células SVGp-12, U87, cultivo primario (C.P.) de glioblastoma y GSCs fueron
crecidas durante 24, 48, 72 y 96 horas bajo condiciones de normoxia. Las imágenes fueron
tomadas desde un microscopio óptico invertido con un aumento de 10X.
46
Figura 6. Seguimiento fotográfico de cultivos celulares incubados bajo diferentes tiempos de
hipoxia. Las células SVGp-12, U87, cultivo primario (C.P.) de glioblastoma y GSCs fueron
crecidas durante 24, 48, 72 y 96 horas bajo condiciones hipoxia. Las imágenes fueron tomadas
desde un microscopio óptico invertido con un aumento de 10X.
47
células ensayadas proliferan sin problemas durante los 4 días, en los que se destaca un
crecimiento mucho más acelerado por parte de las células U87, las cuales alcanzaron un 100% de
confluencia a las 72 horas de incubación. De manera similar, la línea celular normal SVGp-12
alcanzó un máximo de confluencia a las 96 horas. En contraste, el cultivo primario tuvo un
crecimiento lento, logrando un porcentaje de confluencia de aproximadamente el 70% recién a
los 4 días. Por su parte, las GSCs proliferaron normalmente, notándose un aumento considerable
en el tamaño de las esferas luego de 72 horas. En condiciones de hipoxia (figura 6), las células
SVGp-12 y U87 se desprendieron de la placa una vez trancurridas 72 y 96 horas respectivamente,
diferente a lo observado con el cultivo primario, el cual no se vió afectado, exhibiendo incluso un
crecimiento progresivo. En el caso de las GSCs, no se mostraron normalmente proliferativas, sin
embargo, su tamaño aumentó, y se pudo observar un oscurecimiento de las zonas más internas de
las mismas, fenómeno que no se apreció con tal notoriedad bajo normoxia. Estos resultados
demuestran que las líneas celulares SVGp-12 y U87 son más sensibles a los cambios en la
presión de oxígeno que las células provenientes de cultivo primario y las GSCs. En este sentido,
y para el caso de las células aquí analizadas, tiempos de incubación que no sobrepasen las 24
horas de hipoxia, parecen ser adecuados para llevar a cabo ensayos en esta condición.
6.3 Cuantificación basal de adenosina extracelular en células gliales normales y cultivos
celulares de GBM bajo normoxia o hipoxia
Para estudiar el posible efecto que tiene adenosina sobre la quimioresistencia de las GSCs
bajo condiciones de hipoxia, comenzamos cuantificando los niveles basales de este nucleósido en
el espacio extracelular, y los comparamos con los de la línea celular U87MG y cultivo primario
de glioblastoma, utilizando además como control la línea celular normal SVGp-12 bajo
48
condiciones de normoxia e hipoxia. Asimismo, para determinar si los niveles de adenosina varían
solamente durante una condición aguda de hipoxia, incluimos además en el análisis un tiempo de
hipoxia menor a 24 horas (6 horas). La figura 7, ilustra la cuantificación de adenosina de las
células luego de 6 horas expuestas a normoxia o hipoxia. Dentro de las células ensayadas, las
GSCs fueron las únicas que presentaron una producción de adenosina significativamente alta
durante 6 horas de hipoxia en comparación a normoxia. A pesar de que las células de cultivo
primario exhibieron una tendencia al alza en la concentración de adenosina bajo condiciones de
oxígeno disminuidas, ésta no es significativa. Por otro lado, en cuanto a la comparación de los
niveles basales de adenosina entre células, se aprecia claramente que las GSCs son las mayores
productoras de adenosina, lo que se ve aún más acentuado cuando son expuestas a hipoxia. En
condiciones de normoxia, las GSCs produjeron más de 5 veces adenosina que las células
normales SVGp-12 y que incluso las células U87, de las cuales se obtuvieron las GSCs. Más
notoriamente, las GSCs hipóxicas llegaron a producir hasta casi 9 veces más adenosina que las
SVGp-12 bajo las mismas condiciones. Asimismo, las células de cultivo primario produjeron
significativamente más adenosina que las SVGp-12 y U87 durante hipoxia. Cuando las células
fueron expuestas a 24 horas de tratamiento (figura 8), la producción de adenosina por parte de las
GSCs se mantuvo significativamente alta bajo hipoxia en relación a normoxia, sin mostrar un
considerable aumento con respecto a las 6 horas de tratamiento. En cambio, las células de cultivo
primario presentaron un incremento en la concentración de adenosina que fue sobre dos veces
más alta a 24 horas de hipoxia en relación a las 6 horas de exposición a hipoxia. Al igual que lo
observado a un tiempo de exposición menor, tanto las GSCs como las células de cultivo primario
durante 24 horas de hipoxia, demostraron ser
49
Figura 7. Cuantificación basal de adenosina en células SVGp-12 y glioblastoma multiforme
a las 6 horas de normoxia e hipoxia. Los valores de adenosina se obtuvieron a partir de la
incubación de las células normóxicas o hipóxicas con buffer tyrode, y la posterior cuantificación
del sobrenadante mediante HPLC. (***) Normoxia vs hipoxia, P < 0,001; n = 5.
50
Figura 8. Cuantificación basal de adenosina en células SVGp-12 y glioblastoma multiforme
a las 24 horas de normoxia e hipoxia. Los valores de adenosina se obtuvieron a partir de la
incubación de las células normóxicas o hipóxicas con buffer tyrode, y la posterior cuantificación
del sobrenadante mediante HPLC. (***) Normoxia vs hipoxia, P < 0,001; n = 5.
51
más productoras de adenosina que las células SVGp-12 y U87. En resumen, estos resultados nos
indicaron que las GSCs producen niveles basales de adenosina que son mayores a los
encontrados en células normales SVGp-12, línea celular U87 y cultivo primario de glioblastoma,
y que responden con un mayor incremento de adenosina cuando son expuestas a hipoxia.
6.4 Determinación de la actividad AMPasa de CD73 bajo normoxia o hipoxia
Una vez observado que las GSCs son las mayores productoras de adenosina extracelular,
nos enfocamos en medir la actividad hidrolítica de CD73 en estas células mediante su incubación
con el sustrato AMP, y se midió la generación de producto mediante HPLC bajo condiciones de
presión normales o bajas de oxígeno. Luego de 6 horas de incubación en normoxia o hipoxia
(figura 9), la generación de adenosina extracelular por parte de las GSCs fue significativamente
mayor en hipoxia con respecto a normoxia, fenómeno que se destacó aún más luego de que las
células fueran expuestas durante más tiempo a bajas presiones de oxígeno (figura 10).
Para determinar que la producción de adenosina es mediada principalmente por CD73, se
midió la concentración extracelular del nucleósido luego de incubar a las células con un inhibidor
específico de la actividad enzimática de esta ecto-nucleotidasa (AOPCP). Los resultados
mostraron una disminución altamente significativa de la actividad AMPasa de CD73 luego de 6 o
24 horas de hipoxia, en contraste a lo sucedido en normoxia, donde el uso del inhibidor no tuvo
un efecto significativo sobre la capacidad de generar adenosina de CD73 (figuras 9 y 10). Estos
datos por lo tanto, demuestran una correlación entre la disminución de oxígeno y la actividad
AMPasa de CD73 en GSCs.
52
Figura 9. Actividad AMPasa de CD73 en GSCs a las 6 horas de normoxia o hipoxia. Los
valores de adenosina se obtuvieron a partir de la incubación de las células normóxicas o
hipóxicas con el sustrato AMP en buffer tyrode, y la posterior cuantificación del sobrenadante
mediante HPLC. Para determinar si la generación de adenosina es llevada a cabo preferentemente
por CD73, las GSCs fueron además incubadas con AOPCP, un inhibidor específico de la
actividad enzimática de CD73. (***) Control vs AOPCP; n = 5.
53
Figura 10. Actividad AMPasa de CD73 en GSCs a las 24 horas de normoxia o hipoxia. Los
valores de adenosina se obtuvieron a partir de la incubación de las células normóxicas o
hipóxicas con el sustrato AMP en buffer tyrode, y la posterior cuantificación del sobrenadante
mediante HPLC. Para determinar si la generación de adenosina es llevada a cabo preferentemente
por CD73, las GSCs fueron además incubadas con AOPCP, un inhibidor específico de la
actividad enzimática de CD73. (***) Control vs AOPCP; n = 5.
54
6.5 Efecto de hipoxia sobre la expresión de CD73 y el receptor de adenosina A3
Luego de determinar que la baja presión de oxígeno influye sobre la actividad AMPasa de
CD73 y con ello sobre la concentración de adenosina extracelular en GSCs, estudiamos la
expresión de las dos proteínas que son claves para nuestro trabajo, la ecto-nucleotidasa CD73 y el
receptor de adenosina A3 (A3AR).
Dado que los resultados mostrados previamente se evidenciaron de mejor manera tras 24
horas de hipoxia, y que los cultivos celulares se mantuvieron viables durante dicho tiempo, se
decidió establecer 1 día de incubación para los resultados que se describirán de aquí en adelante.
Además, los ensayos que implican el uso de drogas, fueron anteriormente estandarizados en
nuestro laboratorio para incubaciones de 24 horas.
La figura 11 muestra un western blot donde se observa que la expresión proteica tanto del
A3AR como de CD73 aumenta sobre 3 veces cuando las GSCs son expuestas a 24 horas de
hipoxia en relación a normoxia. Estos resultados hacen inferir sobre un potencial rol de adenosina
sobre la activación de vías de señalización que son mediadas por A3AR dentro del microambiente
tumoral. Asimismo, el aumento en los niveles de expresión de CD73 se correlaciona con los
resultados de actividad previamente descritos (figuras 9 y 10).
55
Figura 11. Efecto de hipoxia sobre la expresión proteica de CD73 y A3AR en GSCs. Las
células fueron incubadas bajo normoxia o hipoxia durante 24 horas. Para llevar a cabo la
electroforesis se cargaron 50 µg de proteínas totales, y la separación electroforética se realizó en
un gel de poliacrilamida al 10%. La cantidad de CD73 y A3AR fue detectada utilizando los
anticuerpos primarios correspondientes en diluciones 1:800 y 1:500 respectivamente. La banda
para A3AR se registró a la altura de 43 kDa, y la de CD73 a los 71 kDa. β-actina fue utilizada
como control de carga, y se detectó con una dilución 1:3000 del anticuerpo a la altura de 42 kDa.
**, P < 0,01. n = 3.
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0
2 .5
A 3 A R C D 7 3
Niv
el
de
ex
pr
es
ión
(U
.A.)
**
**
NORMOXIA HIPOXIA
A3AR
CD73
β-actina
56
6.6 Efecto de hipoxia sobre la expresión de transportadores MDR en GSCs
Para evaluar la influencia que tiene el microambiente hipóxico sobre la MDR en GSCs,
medimos la expresión de Mrp1, el transportador que se ha visto más expresado en líneas celulares
y cultivos primarios de GBM. Además, quisimos evaluar la expresión de Mrp3, transportador que
aunque no se ha visto sobreexpresado en las células ensayadas para Mrp1, sí se expresa en GSCs,
según resultados preliminares de nuestro laboratorio.
Para dicho propósito se midió la expresión proteica de ambos transportadores en cultivos
de GSCs mediante Western blot y citometría. La figura 12 muestra el análisis en paralelo (doble
marcaje) e individual de Mrp1 y Mrp3 por citometría. Se observa que los niveles de expresión de
Mrp1 entre las condiciones normoxia e hipoxia 24 horas, no exhiben un cambio significativo. Sin
embargo, la expresión de Mrp3 aumentó considerablemente, desde un porcentaje en normoxia de
3.7% a 13.6% de expresión en hipoxia. Estos resultados fueron confirmados por Western blot
(figura 13), en el que no se observa diferencia en la cuantificación de bandas para Mrp1 entre
tratamientos, mientras que para Mrp3 los niveles de expresión aumentaron más de dos veces en
hipoxia con respecto a normoxia.
Estos hallazgos dejan al descubierto un potencial rol del microambiente hipóxico del
tumor sobre la MDR en GBM a través de la expresión preferencial del transportador Mrp3 en las
GSCs.
57
Figura 12. Medición de la expresión de transportadores MDR en GSCs bajo condiciones de
normoxia o hipoxia mediante citometría de flujo. En la figura se aprecia el análisis por
citometría de los niveles de expresión de Mrp1 y Mrp3 en GSCs. Las células fueron marcadas
con anticuerpos primarios para los dos transportadores en diluciones 1:100. La detección de
Mrp1 se llevó a cabo utilizando el anticuerpo anti mouse Alexa fluor 488, mientras que para
Mrp3 se utilizó un anticuerpo anti goat Alexa fluor 647. El histograma inferior resume el análisis
de expresión, donde se representa el porcentaje de células que expresa cada transportador (barra
roja para Mrp1 y barra azul para Mrp3). ***, P < 0,001; n = 3.
58
Figura 13. Medición de la expresión de transportadores MDR en GSCs bajo condiciones de
normoxia o hipoxia mediante Western blot. En la figura se aprecia un Western blot
confirmatorio del aumento de expresión de Mrp3 en hipoxia observado en la figura 12. Para la
electroforesis se cargaron 50 µg de proteínas totales, y la separación electroforética se realizó en
un gel de poliacrilamida al 8%. Ambas proteínas fueron detectadas a la altura de 200 kDa
aproximadamente. β-actina fue utilizada como control de carga, y se detectó con una dilución
1:3000 del anticuerpo a la altura de 42 kDa. **, P < 0,01; n = 3.
NORMOXIA HIPOXIA
MRP1
MRP3
β-Actina
59
6.7 Efecto del antagonista del receptor de adenosina A3 y del inhibidor de la actividad de
CD73 sobre la expresión de Mrp3 en condiciones de normoxia o hipoxia
En trabajos previos realizados por nuestro equipo de trabajo, demostramos que la
actividad de CD73 y A3AR son cruciales para mantener la expresión y actividad de Mrp1 en
células T98 y cultivo primario de GBM. Sin embargo, en el presente estudio hemos evidenciado
que en hipoxia, es Mrp3 y no Mrp1 el transportador más expresado en las GSCs. Asimismo, bajo
esta misma condición, los niveles de adenosina se vieron significativamente aumentados con
respecto a normoxia. Por esta razón, nos propusimos como objetivo evaluar el papel del A3AR y
CD73, proteínas claves en la señalización mediada por adenosina, sobre la expresión de Mrp3.
Para ello, incubamos a las GSCs con un antagonista del A3AR (MRS1220), y paralelamente con
un inhibidor de la actividad de CD73 (AOPCP). Las figuras 14 y 15 muestran los niveles de
expresión de Mrp3 evaluados por citometría de flujo en normoxia o hipoxia bajo tratamiento con
el antagonista del A3AR (figura 14) o con el inhibidor de CD73 (figura 15). La inhibición del
A3AR influyó negativa y significativamente sobre la expresión de Mrp3 bajo normoxia, y no así
en hipoxia, donde no tuvo efecto. AOPCP por otra parte, no influyó sobre la expresión de Mrp3
bajo ninguna condición. Estos resultados nos indican que bajo hipoxia, la señalización de
adenosina mediada por el A3AR, no media al menos la expresión de Mrp3, y dejan abierta la
posibilidad de que serían otras vías las que promoverían su sobreexpresión bajo hipoxia.
60
Figura 14. Influencia de MRS1220 sobre la expresión de Mrp3 bajo condiciones de
normoxia o hipoxia. Las GSCs normóxicas o hipóxicas fueron incubadas durante 24 horas con
MRS1220 10 μM. El nivel de expresión de Mrp3 fue evaluado por citometría de flujo. El análisis
estadístico se efectuó comparando cada tratamiento con su control en DMEM. ***, P < 0,001; n
= 3.
Ex
pr
es
ión
re
lativ
a
de
Mr
p3
(%
)
- + - +
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
N o r m o x ia
H ip o x ia 1 %
M R S 1 2 2 0 10 M
***
61
Figura 15. Influencia de AOPCP sobre la expresión de Mrp3 bajo condiciones de normoxia
o hipoxia. Las GSCs normóxicas o hipóxicas fueron incubadas durante 24 horas con AOPCP 50
μM. El nivel de expresión de Mrp3 fue evaluado por citometría de flujo. El análisis estadístico se
efectuó comparando cada tratamiento con su control en DMEM. n = 3.
Ex
pr
es
ión
re
lativ
a
de
Mr
p3
(%
)
- + - +
0
2 0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
A O P C P 5 0 M
N o r m o x ia
H ip o x ia 1 %
62
6.8 Efecto del antagonista del receptor de adenosina A3 y del inhibidor de la actividad de
CD73 sobre la actividad de Mrp3 en condiciones de hipoxia
Para determinar ahora si los inhibidores de A3AR y CD73 influyen sobre la actividad de
Mrp3, se realizó un ensayo de retención del sustrato fluorescente CFDA, el cual se acumula
dentro de la célula cuando la actividad del transportador disminuye. Por lo tanto, una mayor señal
fluorescente refleja una menor capacidad del transportador para expulsar el compuesto al espacio
extracelular. Sin embargo, CFDA además de ser sustrato para Mrp3, también lo es para Mrp1,
por lo que antes de realizar el ensayo fue necesario silenciar este último mediante siRNA. Los
resultados obtenidos mostraron que la condición de hipoxia no influyó sobre la actividad de
Mrp3, sin embargo, tanto la inhibición del A3AR como la de CD73 disminuyeron la actividad de
Mrp3 significativamente en normoxia e hipoxia (figura 16).
6.9 Efecto del antagonista del receptor de adenosina A3 y del inhibidor de la actividad de
CD73 sobre la viabilidad de GSCs en condiciones de hipoxia
Finalmente, dado que las bajas presiones de oxígeno gatillaron la sobreexpresión del
A3AR y CD73, fenómeno que se correlacionó con un aumento en los niveles de expresión de
Mrp3, quisimos determinar si esto traería consecuencias sobre la viabilidad de las GSCs. Para
dicho fin, las células normóxicas o hipóxicas fueron incubadas durante 24 horas con MRS1220 o
AOPCP en combinación con vincristina o etopósido, y se prosiguió a evaluar su viabilidad
porcentual mediante MTT. Como se muestra en la figura 17, el tratamiento de las células con
MRS1220, tuvo un efecto similar sobre la viabilidad entre condiciones de normoxia e hipoxia,
con una disminución de la misma por sobre el 40%. Sorprendentemente, tanto vincristina como
etopósido en combinación con MRS1220, no potenciaron la disminución en la viabilidad celular,
63
Figura 16. Influencia de MRS1220 y AOPCP sobre la actividad de Mrp3 bajo condiciones
de normoxia o hipoxia. Previo al ensayo de actividad, fue necesario realizar knockdown de
Mrp1 utilizando un siRNA específico para este transportador para poder medir específicamente la
actividad de Mrp3, como se observa en el Western blot de la parte inferior de la figura. Para
llevar a cabo el análisis de actividad se utilizó el sustrato fluorescente CFDA, y se midió su
retención dentro de las células mediante espectrofluorimetría utilizando una longitud de onda de
excitación y de emisión de 488 nm y 530 nm respectivamente. Los datos obtenidos fueron
normalizados usando la concentración de proteínas. *, P <0.05; **, P < 0,01. n = 3.
B
MR
S1220
AO
PC
P B
MR
S1220
AO
PC
P
0 .0
0 .5
1 .0
1 .5
2 .0
2 .5
***
N orm oxia H ipox ia
FU
/ g
pr
ote
ina
s
*
MRP1
β-actina
64
Figura 17. Influencia de MRS1220 sobre la viabilidad de GSCs en condiciones de normoxia
o hipoxia. Las GSCs normóxicas o hipóxicas fueron incubadas durante 24 horas con
combinaciones de las drogas MRS1220 10 μM, vincristina 100 nM y etopósido 2 µM. Los
ensayos de viabilidad se llevaron a cabo mediante MTT, y sus valores se representaron en
porcentajes. El análisis estadístico se efectuó comparando cada tratamiento con su control en
DMEM. *, P <0.05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001; P < 0,01. n = 3.
Via
bil
ida
d c
elu
lar
(%
)
D M E M M R S 1 2 2 0 D M E M M R S 1 2 2 0
0
3 0
6 0
9 0
1 2 0B la n c o
V in c r is t in a
E to p ó s id o
N o r m o x ia H ip o x ia
* **
* * * * * *
65
siendo de hecho casi equivalente al efecto provocado por MRS1220 individualmente. Resultado
contrario a lo que creíamos, ya que de acuerdo a lo observado en relación a la disminución de la
actividad de Mrp3 tras el tratamiento con MRS1220 (figura 16), esperábamos que la
combinación de fármacos tuviera un efecto sinérgico sobre la viabilidad de las GSCs. Por otra
parte, la disminución en la viabilidad inducida por AOPCP, sólo se dio cuando éste fue
combinado con vincristina (figura 18). Es importante señalar además, que las GSCs hipóxicas
fueron menos sensibles (o más quimioresistentes) a los tratamientos con vincristina utilizada
indivualmente y en combinación con AOPCP en comparación con las células normóxicas.
66
Figura 18. Influencia de AOPCP sobre la viabilidad de GSCs en condiciones de normoxia o
hipoxia. Las GSCs normóxicas o hipóxicas fueron incubadas durante 24 horas con
combinaciones de las drogas AOPCP 50 μM, vincristina 100 nM y etopósido 2 µM. Los ensayos
de viabilidad se llevaron a cabo mediante MTT, y sus valores se representaron en porcentajes. El
análisis estadístico se efectuó comparando cada tratamiento con su control en DMEM. *, P
<0.05; **, P < 0,01; n = 3.
Via
bil
ida
d c
elu
lar
(%
)
D M E M A O P C P D M E M A O P C P
0
3 0
6 0
9 0
1 2 0B la n c o
V in c r is t in a
E to p ó s id o
N o r m o x ia H ip o x ia
* **
* *
*
67
7. DISCUSIÓN
En este trabajo, nos propusimos estudiar el efecto que tiene hipoxia sobre la expresión y
actividad de transportadores de MDR en GSCs. Para ello, y considerando que por primera vez en
nuestro laboratorio emulamos las condiciones hipóxicas del GBM en cultivos celulares,
comenzamos validando y estandarizando los cultivos sometidos a bajas presiones de oxígeno.
Primeramente se midió la expresión de HIF-1α en GSCs luego de haber estado 24 horas bajo un
porcentaje de oxígeno del 1%, y se midió el pH del medio de cultivo. La sobreexpresión de HIF-
1α detectada por Western blot, confirma una respuesta celular típica a hipoxia, la estabilización y
consecuente aumento de este factor (Huang et al., 1998). Dentro de los genes que son blanco del
factor transcripcional HIF-1α, se encuentran aquellos íntimamente relacionados al metabolismo
glucolítico (Semanza, 2010). Es bien sabido que una de las características más reconocidas de las
células tumorales es su bajo pH intersticial (Boticario y Cascales, 2010). Las células tumorales
producen principalmente dos ácidos, el ácido láctico y el ácido carbónico, resultantes del
metabolismo de la glucosa. El piruvato producido en la glucólisis en células hipóxicas, en lugar
de entrar al ciclo de Krebs, se reduce a ácido láctico. Esta reacción está promovida también por el
HIF mediante la activación del gen que codifica la lactato deshidrogenasa y mediante la
restricción de la actividad piruvato deshidrogenasa. El número de H+ producidos por molécula de
ATP es seis veces mayor en la glucólisis anaerobia que en la glucólisis-ciclo de Krebs-
fosforilación oxidativa (Boticario y Cascales, 2010). Por ello, la disminución del pH de 7,35 a 6,8
observada en los cultivos de GSCs hipóxicas, fue reflejo de uno de los cambios fisiológicos más
comunes del espacio extracelular bajo condiciones anaeróbicas. Luego, tanto las GSCs como la
línea celular U87MG, cultivos primarios de GBM y la línea celular normal de glia fetal humana
68
SVGp-12, fueron sometidas a las mismas condiciones, pero durante 4 días, con el fin de observar
los cambios morfológicos de cada cultivo frente a microambientes limitados de oxígeno. Tanto la
línea celular U87MG como la línea celular SVGp-12, no soportaron los tiempos máximos de
incubación bajo hipoxia, y se desprendieron de las placas de cultivo a los 3 y 4 días de hipoxia,
respectivamente. Es bien sabido que el estado de hipoxia puede llevar a la muerte de las células
dependiendo del tiempo y el porcentaje de oxígeno al que se exponen (Thurnher et al., 2013). Sin
embargo, una de las grandes interrogantes actuales que aparece en nuestros ensayos es saber
mediante qué mecanismo hipoxia esta promoviendo la muerte celular. Experimentos de
viabilidad celular utilizando diferentes tipos de células y concentraciones de oxígeno, han dado
distintos resultados. La anoxia (ausencia total de oxígeno) o una condición cercana a la anoxia
(O2 < 0.1%), induce tanto necrosis como apoptosis en cultivos celulares (Papandreou et al., 2005;
Shimizu et al., 1996). Por otro lado, es notable lo bien que muchos tipos de células toleran
periodos prolongados de baja tensión de oxígeno (1% de O2), requiriendo a menudo la presencia
de factores de estrés adicionales, como la privación de suero o acidosis antes de que ocurra la
muerte celular (Leonard et al., 2003; Kim et al., 2004; Schmaltz et al., 1998). En miocitos
cardiacos por ejemplo, la acidosis es necesaria para inducir muerte celular bajo hipoxia (Webster
et al., 1999). En este sentido, se ha establecido que el cambio de pH es la mayor causa de muerte
celular en condiciones de hipoxia (Bacon y Harris, 2004). No es sorprendente entonces que luego
de 3 días de hipoxia, las líneas celulares U87MG y SVGp-12 colapsaran a causa de la
disminución del pH (reflejado por el color amarillento que adoptó el medio de cultivo desde las
24 horas de hipoxia). No obstante, además de comprender si la muerte celular ocurre ya sea por
apoptosis o necrosis, resulta necesario determinar en qué momento durante la exposición a
hipoxia decaen las funciones biológicas de las células, de manera de garantizar posteriormente la
69
veracidad de los ensayos bajo estas condiciones. Un estudio llevado a cabo por Steinbach et al
(2003) en líneas celulares de glioblastoma, entre ellas la línea celular U87MG, demostró que si
bien bajo hipoxia las células exhibían signos de apoptosis, como condensación de la cromatina y
conservación temprana de la integridad de la membrana plasmática, éstos se presentaban en
tiempos de exposición menores a 8 horas, y no así sobre las 8 y 12 horas, donde priorizaba la
muerte celular por necrosis. Esta diferencia en el mecanismo de muerte celular, fue atribuida
según los autores al contenido celular de ATP, molécula que es crucial para activar la muerte
celular programada, y que se agotó gradualmente conforme aumentaba el tiempo de exposición a
hipoxia. La observación de que finalmente la muerte celular por necrosis es la que predomina en
tiempos prolongados de hipoxia, se condice con las observaciones histopatológicas del GBM,
tumor en el que abundan las áreas necróticas, y que de hecho sirven como indicador de su grado
de malignidad (Clarke et al., 2010). Contradictoriamente, un estudio más reciente demostró que
la línea celular U87MG no sólo soportaba tiempos de exposición a hipoxia superior a 24 horas,
sino que además comenzaba a expresar marcadores stem tales como OCT4, nestina y SOX2 (Li
et al., 2013). Las diferencias en estos resultados podrían radicar en los porcentajes de oxígeno
utilizados en ambos estudios. En el trabajo de Steinbach et al. (2003), se utilizó un porcentaje de
oxígeno menor al 0.4%, mientras que los ensayos llevados a cabo por Li et al. (2013), se
realizaron al 1% de oxígeno. Esto podría explicar lo observado en este estudio, donde las células
soportaron más de 48 horas bajo un porcentaje de oxígeno del 1%. Por otra parte, tanto el cultivo
primario de GBM como las GSCs toleraron los tiempos de incubación máximos de hipoxia, sin
presentar mayores cambios en su morfología. En el caso del cultivo primario, la resistencia a
prolongados tiempos de hipoxia, pudo deberse a que gran parte de las células del tejido tumoral,
al provenir de un microambiente severamente hipóxico, como el del tumor in vivo, debieron
70
haberse adaptado y hecho resistentes a dicha condición. Según Thurnher et al. (2013), la
capacidad de las células para resistir la muerte celular bajo tensiones de oxígeno disminuidas, es
el resultado de una respuesta celular adaptativa muy bien desarrollada, fenómeno que es mediado
específicamente por los HIFs. Por su parte, Steinbach et al (2003) menciona que durante las
primeras etapas de la tumorigénesis, la hipoxia tumoral puede ser causada por la vasculatura
irregular e insuficiente del huésped, lo que resulta en la muerte de células tumorales hipóxicas, y
de este modo en la presión selectiva de clones resistentes a hipoxia. Cabe destacar además, que el
tejido tumoral de donde se obtiene el cultivo primario es celularmente heterogéneo, pudiendo
contener células con características de stem, de las cuales se sabe, presentan mayor resistencia a
hipoxia. Este último punto asimismo, podría explicar por qué las GSCs resistieron de igual forma
los tiempos prolongados de hipoxia. Un estudio realizado en GSCs obtenidas de biopsias de
pacientes, demostró que estas células, durante tiempos de exposición a hipoxia 1% de hasta 72
horas, permanecían en un estado quiescente e indiferenciado, con disminución en el crecimiento
y aumentada expresión de marcadores stem (Li et al., 2013). En un trabajo similar, se observó
que hipoxia promueve la capacidad de auto-renovación de las GSCs, así como también el
fenotipo stem en poblaciones no stem con incrementada formación de neuroesferas y sobre-
expresión de importantes marcadores de células madre (Heddleston et al., 2009). Por lo tanto, las
GSCs no solo soportan presiones de oxígeno disminuidas, sino que también parece ser un
microambiente propicio para mantener y promover las propiedades de células madres en el
contexto del cáncer. De hecho, Piccirillo et al. (2006) demostró que las neuroesferas obtenidas de
secciones más internas e hipóxicas del tumor de GBM, poseen mayor capacidad de iniciar el
tumor in vivo que las obtenidas desde la periferia, donde las presiones de oxígeno son más
cercanas a las normales.
71
Parte fundamental de este trabajo, fue determinar la influencia de adenosina sobre la
quimioresistencia mediada por transportadores MDR en GSCs bajo condiciones de hipoxia. La
hipótesis de que este nucleósido podría estar implicado en las vías de señalización que conllevan
finalmente a la sobre-expresión y aumento en la actividad de estos transportadores en GSCs, nace
de al menos 4 antecedentes importantes:
1. Tanto los niveles de adenosina como la expresión y actividad de CD73 (enzima
limitante en la producción de adenosina), se han visto aumentados en cultivos
primarios y líneas celulares de GBM en relación a células normales (Quezada et al.,
2013).
2. La inhibición de la actividad o supresión de la expresión de CD73 en cultivos
celulares de GBM, se correlaciona con aumentos en la quimiosensibilidad de las
células y disminuida expresión del transportador Mrp1 (Quezada et al., 2013).
3. La inhibición del receptor de adenosina A3 fue también correlacionada con
disminución de la expresión y actividad de Mrp1 en cultivos celulares de GBM
(Quezada et al., 2013).
4. Se ha reconocido que la mayor proporción de GSCs se encuentra en zonas más
internas del tumor, donde la presión de oxígeno es severamente baja (Pistollato et al.,
2010). Asimismo, es bien sabido que hipoxia es una de las mayores causas por la cual
la producción de adenosina aumenta (Kumar, 2013).
De acuerdo a estas observaciones, esperábamos encontrar aumentados niveles de
adenosina en GSCs hipóxicas, que se correlacionaran con aumentos en la expresión y actividad
de CD73, así como también con un incremento en la expresión de A3AR, el receptor de
adenosina más expresado en GBM (Quezada et al., 2013). Comenzamos cuantificando los
72
niveles de adenosina extracelular en cultivos celulares de SVGp-12, U87MG, cultivo primario
de GBM y GSCs, tras 6 y 24 horas de hipoxia. Si bien los niveles elevados de adenosina que
registramos en los cultivos primarios y GSCs en relación a normoxia, confirmaron nuestras
predicciones, fue sorprendente lo mucho que se diferenciaban las GSCs en cuanto a producción
de adenosina se refiere, con los demás cultivos (~2 veces con respecto al cultivo primario, y
sobre 5 veces con respecto a las líneas celulares SVGp-12 y U87MG). En relación a las
diferencias en los niveles de adenosina extracelular observadas entre los cultivos primarios y las
GSCs, puede deberse a la heterogeneidad celular que implica el cultivo primario, en el que
pueden crecer células tanto normales como cancerígenas. En este sentido, un enfoque
interesante sería realizar enriquecidos de GSCs obtenidas de cultivo primario, y comparar su
producción de adenosina con la de GSCs producidas a partir de líneas celulares. Otro aspecto no
menos importante, es que las líneas celulares U87MG y SVGp-12 en contraste con los demás
cultivos, no mostraron aumentos significativos en la producción de adenosina en hipoxia con
respecto a normoxia, haciéndonos pensar que no solo el microambiente influye sobre los niveles
de este nucleósido en el espacio extracelular, sino que también el tipo celular.
Posteriormente se midió la actividad AMPasa de CD73 en GSCs bajo 6 y 24 horas de
hipoxia utilizando el sustrato AMP y AOPCP, este último un inhibidor específico de la enzima
CD73. La capacidad de hidrolizar el AMP por parte de CD73 se vio significativamente
aumentada bajo los dos tiempos de exposición a hipoxia en relación a normoxia, e inhibida
notablemente con el uso de AOPCP. Sin embargo, los resultados obtenidos tanto en normoxia
como en hipoxia, demuestran que la adenosina generada no parece provenir en su totalidad de la
actividad de CD73, puesto que al utilizar el inhibidor, la generación de este nucleósido no se vio
completamente abolida, influyendo aproximadamente sobre el 50% de su producción bajo la
73
condición de hipoxia. Esta observación resalta aún más al analizar los niveles de adenosina bajo
normoxia, donde prácticamente no se ve contribución de la enzima. Estas diferencias en los
niveles de adenosina que no parecen provenir de actividad AMPAsa de CD73, tampoco son
suplidas por los niveles basales del nucleósido en las GSCs, puesto que éstos se dieron en el
orden de los nanomolar, una cantidad despreciable si la comparamos con la concentración en
unidades micromolares que se registró en el ensayo de actividad. Considerando que el ensayo
de actividad involucra el uso del sustrato AMP, es probable que otras enzimas estén siendo
partícipes de su hidrólisis para formar adenosina. La vía predominante que conduce a elevar los
niveles de adenosina extracelular es la fosfohidrólisis de ATP por ectonucleotidasas, de las
cuales fosfatasa ácida prostática (PAP) y CD73, tienen como sustrato al AMP (Pettengill et al.,
2013; Stagg y Smyth, 2010). Interesantemente, un estudio reciente demostró que es PAP y no
CD73, la ecto-nucleotidasa que más se expresa en GSCs tanto en condiciones de normoxia
como en hipoxia 24 horas (Liu et al., 2014). Este hallazgo podría explicar en parte los niveles
de adenosina producidos durante los ensayos de actividad que no dependieron de CD73,
sugiriéndonos que ambas enzimas podrían estar trabajando de manera concertada, por lo menos
durante tiempos de hipoxia que no exceden las 24 horas. Sin embargo, y dada la baja
abundancia de CD73 registrada por Liu et al. (2014) incluso a bajas presiones de oxígeno, sería
apropiado analizar la expresión y actividad de ambas ecto-nucleotidasas durante diferentes
tiempos de exposición a hipoxia, de manera de comprender hasta qué punto sus funciones se
correlacionan. Por otro lado, adenosina desaminasa (ADA), enzima que cataboliza adenosina a
inosina, también podría favorecer al aumento del nivel extracelular de adenosina. Un estudio
llevado a cabo en suero y cortes de tejido tumoral de pacientes con cáncer de mama, demostró
elevada actividad de ADA (Aghaei et al., 2005), aumento que de hecho, ha sido propuesto
74
como predictor del grado de malignidad en trabajos realizados en el mismo tipo de cáncer
(Mahajan et al., 2013). Por otra parte, se ha descrito en cultivos celulares de endotelio
microvascular (línea celular HMEC-1) y en modelos in vivo de hipoxia, incrementada actividad
de ADA bajo presiones de oxígeno disminuidas en relación a los controles en normoxia
(Eltzschig et al., 2006). A pesar de que pudiese parecer contradictoria la relación entre la
acumulación de adenosina fuera de la célula y el aumento en la actividad de ADA (involucrada
en el catabolismo de la misma), se ha propuesto que inosina aumentaría los niveles de
adenosina extracelular al competir con esta última por los transportadores de nucleósidos,
potenciando a su vez la señalización de adenosina con sus receptores (Barańska, 2013). A su
vez, es bien sabido que la concentración de adenosina extracelular es controlada por
transportadores de nucleósidos, los cuales se dividen principalmente en dos categorías, 1)
transportadores de nucleósidos equilibrativos (ENT), que transportan nucleósidos hacia fuera o
dentro de la célula dependiendo de la concentración de adenosina, y 2) transportadores de
nucleósidos concentrativos (CNT), que facilitan el ingreso de adenosina a la célula en contra de
su gradiente de concentración. Estudios en endotelio vascular confirmaron que los ENTs están
involucrados en la regulación de la señalización por adenosina durante condiciones adversas
tales como hipoxia e inflamación (Casanello et al., 2005; Eltzschig et al., 2005). El análisis de
los niveles de expresión de los subtipos ENT1 y ENT2, reveló una disminución en los niveles
de ARNm y de proteínas durante hipoxia, resultando en un incremento vascular de la vida
media de adenosina (Eltzschig et al., 2005). Interesantemente, otro estudio evidenció un
putativo sitio de unión para HIF-1α en el promotor de ENT1 (Eltzschig et al., 2005). En células
C6 de GBM, se ha demostrado que el principal transportador implicado en el transporte de
adenosina es ENT2 (Ohkubo et al., 2007; Sinclair et al., 2000). Otra de las proteínas
75
posiblemente involucradas en incrementar los niveles de adenosina es adenosina quinasa (AK),
enzima que cataliza la formación de AMP a partir de adenosina, y que bajo condiciones
hipóxicas, durante inflamación o en el microambiente tumoral, se encuentra con baja actividad,
llegando a causar aumentos de 15-20 veces en los niveles de adenosina tanto intra como
extracelularmente (Decking et al., 1997). En conjunto, estos antecedentes ponen de manifiesto
otras potenciales causas del incremento de adenosina, y que si son bien comprendidas dentro del
contexto de las GSCs, podríamos tener una visión mucho más acabada de nuestro estudio, o
bien nos permitiría sentar las bases para la búsqueda de nuevos blancos terapéuticos.
Así como ocurrió con la actividad AMPasa de CD73, los niveles de su expresión proteica
también se vieron significativamente aumentados bajo 24 horas de hipoxia en relación a
normoxia. De igual forma, los niveles de expresión proteica del A3AR también se mostraron
notoriamente incrementados bajo esa condición. Estos resultados refuerzan las observaciones
previamente descritas por nuestro grupo de trabajo en líneas celulares y cultivos primarios de
GBM, donde tanto la ecto-enzima como el receptor, se encontraban altamente expresados en
relación a células normales (Quezada et al., 2013). Según Castillo et al. (2007), en células C6
de glioma se expresan los 4 receptores de adenosina, pero en diferente proporción, siendo
A3AR el más abundante. A pesar de que los antecedentes le otorgan un papel protagónico al
A3AR en cuanto a sus niveles de expresión en GBM, no se puede dejar pasar por alto el hecho
de que las GSCs son una subpoblación dentro del tumor, por lo que no necesariamente este
receptor debe encontrarse en mayor proporción. En este sentido, es preciso realizar más estudios
de los demás receptores de adenosina, y ver qué posibles papeles pudiesen estar cumpliendo. Se
ha reportado que la concentración de adenosina en fluidos extracelulares de tejido de glioma
alcanza el rango micromolar (Fredholm et al., 2001), el cual es suficientemente alto para
76
estimular a los 4 subtipos de receptores de adenosina (Merighi et al., 2003). De hecho, se ha
demostrado que en las GSCs se expresan los 4 receptores de adenosina, y que sus niveles de
expresión son más altos que los registrados en las demás células del tumor (Daniele et al.,
2014). Cada uno de los receptores de adenosina tiene un rol primordial en el control del
crecimiento tumoral y la invasividad (Gessi et al., 2008; Gessi et al., 2011; Ledur et al., 2012),
pero hasta la fecha, existen muy pocos estudios sobre su rol en la biología de las GSCs. En uno
de ellos, llevado a cabo por Liu et al. (2014), se demostró mediante RT-qPCR, que los
receptores más expresados en GSCs hipóxicas son A2BAR y A3AR. En este trabajo, realizando
ensayos de knockdown de ambas proteinas, se determinó que el silenciamiento de A2BAR y no
de A3AR, se relacionó con una disminución en el número y volumen de las neuroesferas.
Asimismo, se evidenció que la activación de las vías Akt y Erk-1/2 fue dependiente de la
inducción del A2BAR (Liu et al., 2014). Estas observaciones más que limitar la función del
A3AR durante el crecimiento tumoral, invitan a la búsqueda de potenciales papeles de este
receptor en otros aspectos celulares del GBM.
Por otro lado, el objetivo principal de este trabajo fue estudiar el efecto de hipoxia sobre la
quimioresistencia mediada por transportadores de MDR en GSCs. Para tal caso, nos propusimos
evaluar la expresión de Mrp1 y Mrp3 luego de 24 horas de hipoxia. Los resultados obtenidos
mediante citometría y Western blot, mostraron que el transportador más expresado fue Mrp3,
aumentando dos veces sus niveles bajo hipoxia en relación a normoxia. Este hallazgo refuerza
ensayos preliminares realizados en nuestro laboratorio en GSCs obtenidas tanto de células
U87MG como de células C6 en normoxia, en los que predomina la expresión de Mrp3 sobre
Mrp1. Anteriormente, demostramos en cultivos primarios, líneas celulares y biopsias de
pacientes con GBM, que el transportador más expresado fue Mrp1 (Quezada et al., 2011). En
77
este aspecto, los resultados obtenidos en la presente investigación, no refuta lo observado
anteriormente, sino más bien recalca la importancia de estudiar a las GSCs como una población
completamente distinta a las demás células que conforman el tumor. En el año 2000, Loging et
al mediante el método de análisis serial de expresión de genes (SAGE), revelaron que ABCC3
(que codifica para Mrp3) fue uno de los genes más expresados en GBM, postulándolo como un
potencial blanco inmunoterapéutico. Kuan et al (2010) por su parte, confirmaron alta expresión
de Mrp3 a niveles de mensajero y proteína en muestras de biopsias de GBM, lo que se
correlacionó con alto riesgo de muerte. Un estudio reciente, en el que se recopilaron los
antecedentes obtenidos por Loging et al (2000) y Kuan et al (2010), demostró un potencial uso
inmunoterapéutico de Mrp3 para el GBM. En dicho trabajo, los autores crearon un anticuerpo
específico para Mrp3, el cual fue genéticamente fusionado al N-terminal del ligando inductor de
apoptosis relacionado a factor de necrosis tumoral (TRAIL). El anticuerpo denominado
scFvM58-sTRAIL, promovió apoptosis en líneas celulares de GBM positivas para Mrp3 (Wang
et al., 2014). Tomando en cuenta los resultados y estudios previamente discutidos con respecto
a la sobreexpresión de Mrp3, y el rol fundamental que cumplen las GSCs dentro del tumor
como promovedoras de la recurrencia y quimioresistencia, el uso de estrategias que apunten a
inhibir la actividad de Mrp3 o disminuir su expresión, emergen como opciones prometedoras
para el tratamiento del GBM. De acuerdo a esto, nos propusimos estudiar el efecto de
inhibidores de proteínas claves en la producción y señalización de adenosina sobre la expresión
y actividad de Mrp3, y así determinar si las vías reguladas por este nucleósido, están
involucradas en la quimioresistencia mediada por transportadores MDR.
Utilizando análisis de expresión por citometría de flujo y fluorimetría, buscamos
posteriormente determinar la influencia de AOPCP y MRS1220, un inhibidor de la actividad de
78
CD73 y el antagonista del A3AR, respectivamente, sobre la expresión y actividad de Mrp3. Para
el ensayo de expresión, las GSCs fueron tratadas con AOPCP y MRS1220. Bajo condiciones de
normoxia, la disminución significativa en los niveles de expresión de Mrp3, fue evidentemente
promovida por MRS1220, mientras que en condiciones de hipoxia, la expresión del
transportador no se vio afectada con este antagonista. Estos resultados demuestran que el
microambiente hipóxico promueve un aumento en los niveles de Mrp3, y que contrarresta
incluso el efecto individual de MRS1220 (observado paralelamente en normoxia), sobre su
expresión. El hecho de que la señalización de adenosina mediada por el A3AR tenga un efecto
sobre la expresión de Mrp3 solamente bajo normoxia, nos hace pensar en la presencia de otras
vías que son activadas a bajas presiones de O2, y que mantienen elevada la expresión de este
transportador. No obstante, tampoco podemos descartar por completo una potencial influencia
de la señalización de adenosina sobre la expresión de Mrp3 bajo hipoxia, ya que pueden ser
otros los receptores de adenosina que estén participando en la regulación de la MDR mediada
por transportadores ABC.
Posteriormente, nos propusimos medir la actividad de Mrp3 en GSCs utilizando el
sustrato fluorescente CFDA. Para dicho objetivo, se realizó primeramente un silenciamiento de
Mrp1, ya que ambos transportadores tienen como sustrato a CFDA (Lu et al., 2008). Los
resultados no mostraron influencia de la condición de hipoxia sobre la actividad de Mrp3,
contrario a lo observado con su expresión. El aumento bajo la condición de hipoxia de la
expresión de Mrp3 y no de su actividad, pudo deberse a que el incremento en la abundancia del
transportador no necesariamente se tradujo en un aumento de la biodisponibilidad de
transportadores en la membrana. Para comprender mejor este punto, sería necesario medir los
niveles de expresión de Mrp3 en fracciones celulares (en este caso en la membrana celular), y
79
compararlos con sus niveles de expresión totales (en toda la célula). Por otro lado, MRS1220
mostró un efecto inhibitorio de la actividad de Mrp3, fenómeno que podría involucrar una
sensibilización de las GSCs a sustratos anticancerígenos de este transportador (como vincristina
o etopósido). En cuanto al efecto de AOPCP sobre la expresión de Mrp3, no se observaron
cambios entre condiciones. En este aspecto, y como se discutió previamente, sería apresurado
excluir un efecto de adenosina sobre la expresión de Mrp3, ya que así como pueden estar
participando otros receptores de adenosina en su modulación, pueden estar funcionando otras
fuentes productoras de adenosina que sostengan el pool de este nucleosido necesario para
regular la expresión y actividad de Mrp3.
Finalmente, estudiamos el efecto de la señalización de adenosina sobre la viabilidad de las
GSCs bajo condiciones de hipoxia, utilizando nuevamente AOPCP y MRS1220 en combinación
con etopósido y vincristina. El efecto de las drogas antineoplásicas dependió en parte del
microambiente bajo el cual fueron incubadas. En condiciones de hipoxia, el efecto
específicamente de vincristina sobre la viabilidad, no fue tan notorio como en normoxia,
validando los muchos antecedentes que existen sobre el potenciamiento de la quimioresistencia
en hipoxia. Los resultados además mostraron disminución de la viabilidad celular de
aproximadamente el 40% tras el tratamiento con MRS1220 sólo o en combinación con etopósido
y vincristina, en ambas condiciones. Sin embargo, teniendo en cuenta el efecto negativo que tuvo
la inhibición del A3AR sobre la actividad de Mrp3, y que tanto vincristina como etopósido son
sustratos de este transportador (Gottesman et al., 2002), esperábamos que el uso combinado de
MRS1220 con las drogas antineoplásicas, tuviera un efecto sumatorio en contra de la viabilidad
celular. Esto puede deberse a la presencia de otros mecanismos de defensa en la célula que son
activados luego del tratamiento con drogas como vincristina y etopósido, y que logran amortiguar
80
los efectos adversos que implica la disminución de la actividad y expresión de Mrp3. Por
ejemplo, en un estudio realizado por Jin et al (2010), uno de los genes que más aumentó su
expresión luego de que GSCs fueran tratadas con etopósido, fue el gen que codifica para
livinbeta, una proteína que es miembro de la familia de proteínas inhibidoras de la apoptosis
(IAP), fenómeno que se correlacionó con incrementada supervivencia de las células. Otra
probable explicación a las discrepancias entre los resultados obtenidos de actividad de Mrp3 y
viabilidad celular, es que la disminución en la actividad de este transportador luego del
tratamiento con MRS1220, pudo ser debido a una disminución en la viabilidad más que a un
efecto directo del fármaco sobre la actividad. Los resultados mostrados anteriormente donde se
hizo uso de MRS1220, involucraron análisis en citometría de flujo, una técnica que tiene la
ventaja de que todos sus datos son normalizados en base a células vivas; sin embargo, la
medición de actividad mediante fluorimetría fue normalizada con la concentración de proteínas,
lo que no garantiza que se esté trabajando con células completamente viables. Por otra parte, el
hecho de que MRS1220 no haya quimiosensibilizado a las células frente a vincristina y
etopósido, y que incluso haya demostrado un efecto citotóxico por sí solo, nos hace pensar que la
señalización por adenosina a través del A3AR en GSCs, podría modular además mecanismos de
defensa que son independientes de la resistencia múltiple a drogas mediada por transportadores
ABC, o por lo menos independientes de Mrp3 en particular. En un trabajo llevado a cabo por
Merighi et al (2007), se evidenció que la señalización dependiente de la vía A3AR-Akt, media la
inactivación de la proteína pro-apoptótica Bad, y por lo tanto protege a las células hipóxicas de la
apoptosis inducida por paclitaxel en células de GBM humano. Dado todos estos antecedentes,
queda por determinar qué vía(s) mediada(s) por adenosina-A3AR, promueve(n) la sobreexpresión
de transportadores ABC, en este caso Mrp3, y hasta qué momento este mecanismo de
81
quimioresistencia protege la integridad celular. Para este último punto, sería interesante realizar
ensayos de expresión y actividad tanto de Mrp3 como de otros transportadores, durante tiempos
de exposición a hipoxia más prolongados, y dilucidar si la MDR mediada por transportadores
ABC, sigue siendo un recurso utilizado por la señalización dependiente de adenosina bajo
condiciones crónicas de hipoxia en GSCs.
En conclusión, este estudio demuestra que bajo hipoxia, las GSCs sobreexpresan el
transportador de resistencia múltiple a drogas Mrp3, respuesta que contrario a lo observado en
normoxia, no fue mediada por el A3AR. No obstante, las vías que involucran el metabolismo de
adenosina extracelular demostraron estar sumamente activas en GSCs hipóxicas, por lo que no se
descarta la participación de otros receptores de adenosina en la regulación de la expresión de
transportadores ABC. Asimismo, la inhibición del receptor de adenosina A3, no fue suficiente
para quimiosensibilizar a las células ante sustratos de Mrp3, sugiriendo la presencia y activación
de otros mecanismos de defensa celular mediados por adenosina, que son independientes de
algunos transportadores ABC. Interesantemente, el A3AR demostró ser un potencial blanco para
la elaboración de nuevas estrategias terapéuticas, dado que su inhibición promovió la muerte
celular incluso bajo hipoxia, una condición que es clave para mantener el fenotipo maligno de las
GSCs. Los resultados obtenidos en el presente trabajo, demuestran por primera vez la influencia
del microambiente hipóxico sobre la producción y señalización de adenosina en GSCs, la
subpoblación celular que ha sido propuesta como la mayor responsable de la elevada
quimioresistencia y recurrencia del GBM, y otorga nueva evidencia para el estudio de las vías de
señalización mediadas por adenosina que conlleven a la elaboración de nuevas estrategias
terapéuticas.
82
8. REFERENCIAS
Aghaei, M., Karami-Tehrani, F., Salami, S. y Atri, M. (2005). Adenosine deaminase activity in
the serum and malignant tumors of breast cancer: the assessment of isoenzyme ADA1 and
ADA2 activities. Clin Biochem; 38, 887-891.
Al-Hajj, M., Wicha, M.S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S.J., y Clarke, M.F. (2003).
Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA;
100, 3983–3988.
Angelastro, J.M., y Lame, M.W. (2010). Overexpression of CD133 promotes drug resistance in
C6 glioma cells. Mol Cancer Res; 8, 1105-1115.
Antonioli, L., Fornai, M., Colucci, R., Ghisu, N., Tuccori, M., Del Tacca, M. y Blandizzi, C.
(2008). Regulation of enteric functions by adenosine: pathophysiological and
pharmacological implications. Pharmacol. Ther; 120, 233–253.
Bacon, A.L. y Harris, A.L. (2004). Hypoxia-inducible factors and hypoxic cell death in tumour
physiology. Ann Med; 36, 530-539.
Baguley, B.C. (2010). Multiple drug resistance mechanisms in cancer. Mol. Biotechnol; 46, 308–
331.
Bao, S., Wu, Q., McLendon, R.E., Hao, Y., Shi, Q., Hjelmeland, A.B., Dewhirst, M.W., Bigner,
y Rich, J.N. (2006). Glioma stem cells promote radioresistance by preferential activation
of the DNA damage response. Nature. 444, 756-760.
Bar, E. (2010). Glioblastoma, Cancer Stem Cells and Hypoxia. Brain Pathology; 21, 119–129.
Barańska, J. (2013). Glioma Signaling. 2013th
Ed. Springer Dordrecht Heidelberg, New York,
London. p. 90.
83
Bavaresco, L., Bernardi, A., Braganhol, E., Cappellari, A.R., Rockenbach, L., Farias, P.F., Wink,
M.R. Delgado-Canedo, A. y Battastini, A.M. (2008). The role of ecto-5'-
nucleotidase/CD73 in glioma cell line proliferation. Mol Cell Biochem; 319, 61-68.
Beavis, P.A., Stagg, J., Darcy, P.K. y Smyth, M.J. (2012). CD73: a potent suppressor of
antitumor immune responses. Trends in Immunology; 33, 231–237.
Beier, D., Schulz, J. y Beier, B. (2011). Chemoresistance of glioblastoma cancer stem cells -
much more complex than expected. Molecular Cancer; 10, 1-11.
Blay, J., White, T.D. y Hoskin, D.W. (1997). The extracellular fluid of solid carcinomas contains
immunosuppressive concentrations of adenosine. Cancer Res; 57, 2602–2605.
Bleau, A.M., Hambardzumyan, D., Ozawa, T., Fomchenko, E.I., Huse, J.T., Brennan, C.W., and
Holland, E.C. (2009). PTEN/PI3K/Akt pathway regulates the side population phenotype
and ABCG2 activity in glioma tumor stem-like cells. Cell Stem Cell; 4, 226–235.
Bonnet, D., y Dick, J.E. (1997). Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that
originates from a primitive hematopoietic cell. Nat Med; 3, 730–737.
Boticario, C. y Cascales, M. (2010). Hipoxia y cáncer. An R Acad Nac Farm; 76, 379-408.
Brat, D.J. y Van Meir, E.G. (2001). Glomeruloid microvascular proliferation orchestrated by
VPF/VEGF: a new world of angiogenesis research. Am J Pathol; 158, 789–96.
Broadley, K.W., Hunn, M.K., Farrand, K.J., Price, K.M., Grasso, C., Miller, R.J., Hermans, I.F.
y McConnell, M.J. (2011). Side population is not necessary or sufficient for a cancer stem
cell phenotype in glioblastoma multiforme. Stem Cells; 29, 452-461.
Bronger, H., Konig, J., Kopplow, K., Steiner, H.H., Ahmadi, R., Herold-Mende, C., Keppler, D.
y Nies, A.T. (2005). ABCC drug efflux pumps and organic anion uptake transporters in
human gliomas and the blood-tumor barrier. Cancer Res; 65, 11419-11428.
84
Calabrese, C., Poppleton, H., Kocak, M., Hogg, T.L., Fuller, C., Hamner, B., Oh, E.Y., Gaber,
M.W., Finklestein, D., Allen, M., Frank, A., Bayazitov, I.T., Zakharenko, S.S., Gajjar, A.,
Davidoff, A. y Gilbertson, R. J. (2007). A perivascular niche for brain tumor stem cells.
Cancer Cell; 11, 69–82.
Calatozzolo, C., Gelati, M., Ciusani, E., Sciacca, F.L., Pollo, B., Cajola, L., Marras, C., Silvani,
A., Vitellaro-Zuccarello, L., Croci, D., Boiardi, A. y Salmaggi, A. (2005). Expression of
drug resistance proteins Pgp, MRP1, MRP3, MRP5 and GST-pi in human glioma. J
Neurooncol; 74, 113-121.
Casanello, P., Torres, A., Sanhueza, F., Gonzalez, M., Farias, M., Gallardo, V., Pastor-Anglada,
M., San Martin, R. y Sobrevia, L. (2005). Equilibrative nucleoside transporter 1
expression is downregulated by hypoxia in human umbilical vein endothelium. Circ Res;
97, 16-24.
Castillo, A.C., Albasanz, J.L., Fernández, M. y Martìn, M. (2007). Endogenous expression of
adenosine A1, A2 and A3 receptors in rat C6 glioma cells. Neurochem Res; 32, 1056–
1070.
Chan, E.S. y Cronstein, B.N. (2010). Adenosine in fibrosis. Mod. Rheumatol; 20, 114–122.
Chen, L., Feng, P., Li, S., Long, D., Cheng, J., Lu, Y. y Zhou, D. (2009). Effect of hypoxia-
inducible factor-1alpha silencing on the sensitivity of human brain glioma cells to
doxorubicin and etoposide. Neurochem Res; 34, 984-990.
Cheng, C., Liu, Z.G., Zhang, H., Xie, J.D., Chen, X.G., Zhao, X.Q., Wang, F., Liang, Y.J., Chen,
L.K., Singh, S., Chen, J.J., Talele, T.T., Chen, Z.S., Zhong, F.T. y Fu, L.W. (2012).
Enhancing chemosensitivity in ABCB1- and ABCG2-overexpressing cells and cancer
stem-like cells by an Aurora kinase inhibitor CCT129202. Mol Pharm; 9, 1971-1982.
85
Christensen, K., Schroder, H.D. y Kristensen, B.W. (2011). CD133+ niches and single cells in
glioblastoma have different phenotypes. J Neurooncol; 104, 129–43.
Clarke, J., N. Butowski, y S. Chang. (2010). Recent advances in therapy for glioblastoma. Arch
Neurol; 67, 279-283.
Crowder, S. W., Balikov, D. A., Hwang, Y. S. y Sung, H. J. (2014). Curr Pathobiol Rep; 2, 33-
40.
Daniele, S., Zappelli, E., Natali, L., Martini, C. y Trincavelli, M.L. (2014). Modulation of A1 and
A2B adenosine receptor activity: a new strategy to sensitise glioblastoma stem cells to
chemotherapy. Cell Death Dis; 5, e1539.
De Faria, G.P., de Oliveira, J.A., de Oliveira, J.G., Romano, O., Neto, V.M. y Maia, R.C. (2008).
Differences in the expression pattern of P-glycoprotein and MRP1 in low-grade and high-
grade gliomas. Cancer Invest; 26, 883-889.
Dean, M., Fojo, T. y Bates, S. Tumour stem cells and drug resistance. (2005). Nature; 5, 275-285.
Decking, U.K., Schlieper, G., Kroll, K. y Schrader, J. (1997). Hypoxiainduced inhibition of
adenosine kinase potentiates cardiac adenosine release. Circ Res; 81, 154–164.
Dewhirst, M.W., Kimura, H., Rehmus, S.W., Braun, R.D., Papahadjopoulos, D., Hong, K. y
Secomb, T.W. (1996). Microvascular studies on the origins of perfusion-limited hypoxia.
Br J Cancer; 27, S247–S251.
Diaz, V., Yanez, A., Ponce, C., Villegas y Pasten, J. (2006). Tendencia de la mortalidad por
tumores cerebrales malignos en Chile. Análisis de tasas. Rev Chil Neuro-Psiq; 44, 263-70.
Dimov, I., Tasic-Dimov, D., Conic, I. y Stefanovic, V. (2011). “Glioblastoma Multiforme Stem
Cells”. The Scientific World Journal; 11, 930–958.
86
Doyle, L.A., Yang, W., Abruzzo, L.V., Krogmann, T., Gao, Y., Rishi, A.K. y Ross, D.D. (1998).
A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc. Natl
Acad. Sci. USA; 95, 15665–15670.
Eltzschig, H.K., Abdulla, P., Hoffman, E., Hamilton, K.E., Daniels, D., Schonfeld, C., Loffler,
M., Reyes, G., Duszenko, M., Karhausen, J., Robinson, A., Westerman, K.A., Coe, I.R. y
Colgan, S.P. (2005). HIF-1-dependent repression of equilibrative nucleoside transporter
(ENT) in hypoxia. J Exp Med; 202, 1493-1505.
Eltzschig, H.K., Faigle, M., Knapp, S., Karhausen, J., Ibla, J., Rosenberger, P., Odegard, K.C.,
Laussen, P.C., Thompson, L.F. y Colgan, S.P. (2006). Endothelial catabolism of
extracellular adenosine during hypoxia: the role of surface adenosine deaminase and
CD26. Blood; 108, 1602-1608.
Evans, S.M., Jenkins, K.W., Jenkins, W.T., Dilling, T., Judy, K.D., Schrlau, A., Judkins, A.,
Hahn, S.M. y Koch, C. J. (2008). Imaging and analytical methods as applied to the
evaluation of vasculature and hypoxia in human brain tumors. Radiat Res; 170, 677–690.
Evans, S.M., Judy, K.D., Dunphy, I., Jenkins, W.T., Hwang, W.T., Nelson, P.T., Lustig, R.A.,
Jenkins, K., Magarelli, D.P., Hahn, S.M., Collins, R.A., Grady, M.S. y Koch, C.J.
(2004a). Hypoxia is important in the biology and aggression of human glial brain tumors.
Clin Cancer Res; 10, 8177–8184.
Evans, S.M., Judy, K.D., Dunphy, I., Jenkins, W.T., Nelson, P.T., Collins, R., Wileyto, E.P.,
Jenkins, K., Hahn, S.M., Stevens, C.W., Judkins, A.R., Phillips, P., Geoerger, B. y Koch,
C.J. (2004b). Comparative measurements of hypoxia in human brain tumors using needle
electrodes and EF5 binding. Cancer Res; 64, 1886–1892.
87
Ezashi, T., Das, P. y Roberts, R.M. (2005). Low O2 tensions and the prevention of differentiation
of hES cells. Proc Natl Acad Sci USA; 102, 4783–4788.
Facchino, S., Abdouh, M. y Bernier, G. (2011). Brain Cancer Stem Cells: Current Status on
Glioblastoma Multiforme. Cancers; 3, 1777-1797.
Fishman, P., Bar-Yehuda, S., Madi, L. y Cohn, I. (2002). A3 adenosine receptor as a target for
cancer therapy. Anti-Cancer Drugs; 13, 437–443.
Fredholm, B.B. (2010). Adenosine receptors as drug targets. Exp Cell Res; 316, 1284-1288.
Fredholm, B.B., Jzerman A.P., Jacobson, K.A., Klotz, K.N. y Linden, J. (2001). International
Union of Pharmacology. XXV. Nomenclature and classification of adenosine receptors.
Pharmacol Rev. 53:527-552.
Friedman, H.S., Prados, M.D., Wen, P.Y., Mikkelsen, T., Schiff, D., Abrey, L.E., Yung, W.K.,
Paleologos, N., Nicholas, M.K., Jensen, R., Vredenburgh, J., Huang, J., Zheng, M. y
Cloughesy, T. (2009). Bevacizumab alone and in combination with irinotecan in recurrent
glioblastoma. J Clin Oncol; 27, 4733–4740.
Furnari, F.B., Fenton, T., Bachoo, R.M., Mukasa, A., Stommel, J.M., Stegh, A., Hahn, W.C.,
Ligon, K.L., Louis, D.N., Brennan, C., et al. (2007). Malignant astrocytic glioma:
genetics, biology, and paths to treatment. Genes Dev; 21, 2683–2710.
Galli, R., Binda, E., Orfanelli, U., Cipelletti, B., Gritti, A., De Vitis, S., Fiocco, R., Foroni, C.,
Dimeco, F., y Vescovi, A. (2004). Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like
neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res; 64, 7011–7021.
Garrido, W., Muñoz, M., San Martin, R. y Quezada, C. (2011). FK506 confers chemosensitivity
to anticancer drugs in glioblastoma multiforme cells by decreasing the expression of the
multiple resistance-associated protein-1. Biochem Biophys Res Commun; 411, 62-68.
88
Garrido, W., Rocha, J.D., Jaramillo, C., Fernandez, K., Oyarzun, C., Martin, R.S. y Quezada, C.
(2014). Chemoresistance in high-grade gliomas: relevance of adenosine signalling in
stem-like cells of glioblastoma multiforme. Curr Drug Targets; 15, 931-942.
Gessi S, Cattabriga E, Avitabile A, Gafá R, Lanza G, Cavazzini L, Bianchi N, Gambari R, Feo C,
Liboni A., Gullini, S., Leung, E., Mac-Lennan, S. y Borea, P.A. (2004). Elevated
expression of A3 adenosine receptors in human colorectal cancer is reflected in peripheral
blood cells. Clin Cancer Res; 10, 5895–5901.
Gessi S, Varani K, Merighi S, Morelli A, Ferrari D, Leung E, Baraldi PG, Spalluto G. y Borea
PA. (2001). Pharmacological and biochemical characterization of A3 adenosine receptors
in Jurkat T cells. Br J Pharmacol; 134, 116–126.
Gessi, S., Merighi, S., Sacchetto, V., Simioni, C. y Borea, P.A. (2011). Adenosine receptors and
cancer. Biochim Biophys; 1, 1400–1412.
Gessi, S., Merighi, S., Varani, K., Leung, E., Mac Lennan, S. y Borea, P.A. (2008). The A3
adenosine receptor: an enigmatic player in cell biology. Pharmacol Ther; 117, 123–140.
Ghiringhelli, F., Bruchard, M., Chalmin, F. y Rebe, C. (2012). Production of adenosine by
ectonucleotidases: a key factor in tumor immunoescape. J Biomed Biotechnol; 2012,
473712.
Gottesman, M.M., Fojo, T. y Bates, S.E. (2002). Multidrug resistance in cancer: role of ATP-
dependent transporters. Nat Rev Cancer; 2, 48-58.
Hanahan, D. y Weinberg, R.A. (2000). The hallmarks of cancer. Cell; 100, 57–70.
Harris, A.L. (2002). Hypoxia - a key regulatory factor in tumour growth. Nat Rev Cancer; 2, 38–
47.
89
Hasko, G. y Pacher, P. (2012). Regulation of macrophage function by adenosine. Arterioscler
Thromb. Vasc Biol; 32, 865–869.
Hasko, G., Linden, J., Cronstein, B. y Pacher, P. (2008). Adenosine receptors: therapeutic aspects
for inflammatory and immune diseases. Nature Rev. Drug Discov; 7, 759–770.
Heddleston, J., Li, Z., Hjelmeland, A. y Rich, J. (2009). The hypoxic microenvironment
maintains glioblastoma stem cells and promotes reprogramming towards a cancer stem
cell phenotype. Cell Cycle; 15, 3274–3284.
Heddleston, J.M., Li, Z., Lathia, J.D., Bao, S., Hjelmeland, A.B., y Rich, J.N. (2010). Hypoxia
inducible factors in cancer stem cells. Br J Cancer; 102, 789–795.
Hemmati, H.D., Nakano, I., Lazareff, J.A., Masterman-Smith, M., Geschwind, D.H., Bronner-
Fraser, M., y Kornblum, H.I. (2003). Cancerous stem cells can arise from pediatric brain
tumors. Proc Natl Acad Sci USA; 100, 15178–15183.
Himer, L. Csoka, B., Selmeczy, Z., Koscso, B., Pocza, T., Pacher, P., Nemeth, Z.H., Deitch, E.
A., Vizi, E.S., Cronstein, B.N. y Hasko, G. (2010). Adenosine A2A receptor activation
protects CD4+ T lymphocytes against activation-induced cell death. FASEB J; 24, 2631–
2640.
Huang, L., Zhang, Q.H., Ao, Q.L., Xing, H., Lu, Y.P. y Ma, D. (2007). Effect of hypoxia on the
chemotherapeutic sensitivity of human ovarian cancer cells to paclitaxel and its
mechanism. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi; 29, 96-100.
Huang, L.E., Gu, J., Schau, M. y Bunn, H.F. (1998). Regulation of hypoxia-inducible factor
1alpha is mediated by an O2-dependent degradation domain via the ubiquitin-proteasome
pathway. Proc Natl Acad Sci USA; 95, 7987–7992.
90
Huang, Z., Cheng, L., Guryanova, O. A., Wu, Q. y Bao, S. (2010). Cancer stem cells in
glioblastoma-molecular signaling and therapeutic targeting. Protein cell; 7, 638-655.
Ignatova, T.N., Kukekov, V.G., Laywell, E.D., Suslov, O.N., Vrionis, F.D. y Steindler, D.A.
(2002). Human cortical glial tumors contain neural stem-like cells expressing astroglial
and neuronal markers in vitro. Glia; 39, 193–206.
Iwamoto, F.M., Abrey, L.E., Beal, K., Gutin, P.H., Rosenblum, M.K., Reuter, V.E., DeAngelis,
L.M. y Lassman, A.B. (2009). Patterns of relapse and prognosis after bevacizumab
failure in recurrent glioblastoma. Neurology; 73, 1200-1206.
Jemal, A., Siegel, R., Ward, E., Hao, Y., Xu, J., Murray, T. y Thun, M.J. (2008). Cancer
statistics. Cancer J Clin; 58, 71-96.
Jensen, R.L. (2009). Brain tumor hypoxia: tumorigenesis, angiogenesis, imaging,
pseudoprogression, and as a therapeutic target. J Neurooncol; 92, 317-335.
Jin, F., Zhao, L., Guo, Y.J., Zhao, W.J., Zhang, H., Wang, H.T., Shao, T., Zhang, S.L., Wei, Y.J.,
Feng, J., Jiang, X.B. y Zhao, H.Y. (2010). Influence of Etoposide on anti-apoptotic and
multidrug resistance-associated protein genes in CD133 positive U251 glioblastoma stem-
like cells. Brain Res; 1336, 103-111.
Kallio, P.J., Wilson, W.J., O’Brien, S., Makino, Y. y Poellinger, L. (1999). Regulation of the
hypoxia-inducible transcription factor 1alpha by the ubiquitin-proteasome pathway. J Biol
Chem; 274, 6519–6525.
Karmouty-Quintana, H., Xia, Y. y Blackburn, M.R. (2013). Adenosine signaling during acute and
chronic disease states. J. Mol. Med. (Berl.); 91, 173–181.
Keith, B. y Simon, M.C. (2007). Hypoxia-inducible factors, stem cells, and cancer. Cell; 129,
465–72.
91
Kim, J.Y., Ahn, H.J., Ryu, J.H., Suk, K. y Park, J.H. (2004). BH3-only protein Noxa is a
mediator of hypoxic cell death induced by hypoxia-inducible factor 1α. J. Exp. Med; 199,
113–124.
Kim, M., Turnquist, H., Jackson, J., Sgagias, M., Yan, Y., Gong, M., Dean, M., Sharp, J. G. y
Cowan, K. (2002). The multidrug resistance transporter ABCG2 (breast cancer resistance
protein 1) effluxes Hoechst 33342 and is overexpressed in hematopoietic stem cells. Clin
Cancer Res; 8, 22–28.
Kobayashi, S., Zimmermann, H. y Millhorn, D.E. (2000). Chronic hypoxia enhances adenosine
release in rat PC12 cells by altering adenosine metabolism and membrane transport. J
Neurochem; 74, 621– 632.
Kolenda, J., Jensen, S.S, Aaberg-Jessen, C., Christensen, K., Andersen, C., Brunner, N. y
Kristensen, B.W. (2011). Effects of hypoxia on expression of a panel of stem cell and
chemoresistance markers in glioblastoma-derived spheroids. J Neurooncol; 103, 43–58.
Kroll, D.J. (1995). Circumventing antineoplastic drug resistance: when tumor cells just say ‘‘no’’
to drugs. Am J Pharm Educ; 59, 184–191.
Kuan, C.T., Wakiya, K., Herndon, J.E., 2nd Lipp, E.S., Pegram, C.N., Riggins, G.J., Rasheed, A.,
Szafranski, S.E., McLendon, R.E. Wikstrand, C.J. y Bigner, D.D. (2010). MRP3: a
molecular target for human glioblastoma multiforme immunotherapy. BMC Cancer; 10,
468.
Kumar, V. (2013). Adenosine as an endogenous immunoregulator in cáncer pathogenesis: where
to go? Purinergic Signal; 9, 145-165.
92
Lapidot, T., Sirard, C., Vormoor, J., Murdoch, B., Hoang, T., Cortes, J., Minden, M., Paterson,
B., Caligiuri, M.A., y Dick, J.E. (1994). A cell initiating human acute myeloid leukaemia
after transplantation into SCID mice. Nature; 367, 645–648.
Ledoux, S., Runembert, I., Koumanov, K., Michel, J.B., Trugnan, G. y Friedlander, G. (2003).
Hypoxia enhances Ecto-5_-nucleotidase activity and cell surface expression in endotelial
cells: role of membrane lipids. Circulation Research; 92, 848–855.
Ledur, P.F., Villodre, E.S., Paulus, R., Cruz, L.A., Flores, D.G. y Lenz, G. (2012). Extracellular
ATP reduces tumor sphere growth and cancer stem cell population in glioblastoma cells.
Purinergic Signal; 8, 39–48.
Lee, J., Kotliarova, S., Kotliarov, Y., Li, A., Su, Q., Donin, N.M., Pastorino, S., Purow, B.W.,
Christopher, N., Zhang, W., Park, J.K. y Fine, H. A. (2006). Tumor stem cells derived
from glioblastomas cultured in bFGF and EGF more closely mirror the phenotype and
genotype of primary tumors than do serum-cultured cell lines. Cancer Cell; 9, 391–403.
Leonard, M.O., Cottell, D.C., Godson, C., Brady, H.R. y Taylor, C.T. (2003). The role of HIF-1α
in transcriptional regulation of the proximal tubular epithelial cell response to hypoxia. J.
Biol. Chem; 278, 40296–40304.
Li, P., Zhou, C., Xu, L. y Xiao, H. (2013). Hypoxia enhances stemness of cancer stem cells in
glioblastoma: an in vitro study. Int J Med Sci; 10, 399-407.
Li, Z., Bao, S., Wu, Q., Wang, H., Eyler, C., Sathornsumetee, S., Shi, Q., Cao, Y., Lathia, J.,
McLendon, R.E., et al. (2009). Hypoxia inducible factors regulate tumorigenic capacity of
glioma stem cells. Cancer Cell; 15, 501–513.
93
Liu, G., Yuan, X., Zeng, Z., Tunici, P., Ng, H., Abdulkadir, I.R., Lu, L., Irvin, D., Black, K.L. y
Yu, J.S. (2006). Analysis of gene expression and chemoresistance of CD133+ cancer stem
cells in glioblastoma. Mol Cancer; 5, 67.
Liu, T.Z., Wang, X., Bai, Y.F., Liao, H.Z., Qiu, S.C., Yang, Y.Q., Yan, X.H., Chen, J., Guo, H.B.
y Zhang, S.Z. (2014). The HIF-2alpha dependent induction of PAP and adenosine
synthesis regulates glioblastoma stem cell function through the A2B adenosine receptor.
Int J Biochem Cell Biol; 49, 8-16.
Loging, W.T., Lal, A., Siu, I.M., Loney, T.L., Wikstrand, C.J., Marra, M.A., Prange, C., Bigner,
D.D., Strausberg, R.L. y Riggins, G.J. (2000). Identifying potential tumor markers and
antigens by database mining and rapid expression screening. Genome Res; 10, 1393-1402.
Loi, S., Pommey, S., Haibe-Kains, B., Beavis, P.A., Darcy, P.K., Smyth, M.J. y Stagg, J. (2013).
CD73 promotes anthracycline resistance and poor prognosis in triple negative breast
cancer. Proc Natl Acad Sci USA; 110, 11091-11096.
Longhi, M.S., Robson, S.C., Bernstein, S.H., Serra, S. y Deaglio, S. (2013). Biological functions
of ecto-enzymes in regulating extracellular adenosine levels in neoplastic and
inflammatory disease states. J Mol Med; 91, 165-172.
Louis D.N. Molecular pathology of malignant gliomas. (2006). Annu Rev Pathol; 1, 97–117.
Lu, C., y A. Shervington. (2008). Chemoresistance in gliomas. Mol Cell Biochem; 312, 71-80.
Lu, M.C., Lai, N.S., Li, K.J., Hsieh, S.C., Wu, C.H. y Yu, C.L. (2008). Increased multidrug
resistance-associated protein activity in mononuclear cells of patients with systemic lupus
erythematosus. Clin Exp Rheumatol; 26, 638-645.
94
Mahajan, M., Tiwari, N., Sharma, R., Kaur, S. y Singh, N. (2013). Oxidative stress and its
relationship with adenosine deaminase activity in various stages of breast cáncer. Indian J
Clin Biochem; 28, 51-54.
Matsumoto, Y., Tamiya, T. y Nagao, S. (2005). Resistance to topoisomerase II inhibitors in
human glioma cell lines overexpressing multidrug resistant associated protein (MRP) 2. J
Med Invest; 52, 41-48.
Merighi S, Mirandola P, Varani K, Gessi S, Leung E, Baraldi PG et al. (2003). A glance at
adenosine receptors: novel target for antitumor therapy. Pharmacol Ther; 100; 31–48.
Merighi, S., Benini, A., Mirandola, P., Gessi, S., Varani, K., Leung, E., MacLennan, S., Baraldi,
P.G. y Borea, P. A. (2005). A3 adenosine receptors modulate hypoxia-inducible factor 1a
expression in human A375 melanoma cells. Neoplasia; 7, 894–903.
Merighi, S., Benini, A., Mirandola, P., Gessi, S., Varani, K., Leung, E., Maclennan, S. y Borea,
P.A. (2006). Adenosine modulates vascular endothelial growth factor expression via
hypoxia-inducible factor-1 in human glioblastoma cells. Biochem Pharmacol; 72, 19-31.
Merighi, S., Benini, A., Mirandola, P., Gessi, S., Varani, K., Leung, E., Maclennan, S., Baraldi,
P.G. y Borea, P.A. (2007). Hypoxia inhibits paclitaxel-induced apoptosis through
adenosine-mediated phosphorylation of bad in glioblastoma cells. Mol Pharmacol; 72,
162–172.
Mizuno, K., Furuhashi, Y., Misawa, T., Iwata, M., Kawai, M., Kikkawa, F., Kano, T. y
Tomoda, Y. (1992). Modulation of multidrug resistance by immunosuppressive agents:
cyclosporin analogues, FK506 and mizoribine. Anticancer Res; 12, 21-25.
95
Moitra, K., Lou, H. y Dean, M. (2011). Multidrug Efflux pumps and Cancer Stem Cells: insights
into Multidrug Resistance and Therapeutic Development. Clin Pharmacol Ther; 89, 491-
502.
Morjani, H. y Madoulet, C. (2010). Immunosuppressors as multidrug resistance reversal agents.
Methods Mol Biol; 596, 433-446.
Morrone, F.B., Jacques-Silva, M.C., Horn, A.P., Bernardi, A., Schwartsmann, G., Rodnight, R. y
Lenz, G. (2003). Extracellular nucleotides and nucleosides induce proliferation and
increase nucleoside transport in human glioma cell lines. J Neurooncol; 64, 211–218.
Naito, M., Oh-hara, T., Yamazaki, A., Danki, T. y Tsuruo, T. (1992). Reversal of multidrug
resistance by an immunosuppressive agent FK-506. Cancer Chemother Pharmacol; 29,
195-200.
Nakai, E., Park, K., Yawata, T., Chihara, T., Kumazawa, A., Nakabayashi, H. y Shimizu, K.
(2009). Enhanced MDR1 expression and chemoresistance of cancer stem cells derived
from glioblastoma. Cancer Invest; 27, 901-908.
Natazuka, T. (1992). FK506 reverses adriamycin resistance in a multidrug-resistant human
leukemia cell line. Kobe J Med Sci; 38, 347-363.
Nduom, E.K., Hadjipanayis, C.G. y Van Meir, E.G. (2012). Glioblastoma cancer stem-like cells:
implications for pathogenesis and treatment. Cancer J; 18, 100-106.
Ohkubo, S., Nagata, K. y Nakahata, N. (2007). Adenosine uptake-dependent C6 cell growth
inhibition. Eur J Pharmacol; 577, 35-43.
Omuro, A., Lisa, M. y DeAngelis, M.D. (2013). Glioblastoma and Other Malignant Gliomas. A
Clinical Review. JAMA; 310, 1842-1850.
96
Panchision, D.M. (2009). The role of oxygen in regulating neural stem cells in development and
disease. J Cell Physiol; 220, 562–568.
Papandreou, I., Krishna, C., Kaper, F., Cai, D., Giaccia, A.J. y Denko, N.C. (2005). Anoxia is
necessary for tumor cell toxicity caused by a low-oxygen environment. Cancer Res; 65,
3171–3178.
Parmar, K., Mauch, P., Vergilio, J.A., Sackstein, R. y Down, J.D. Distribution of hematopoietic
stem cells in the bone marrow according to regional hypoxia. (2007). Proc Natl Acad Sci
USA; 104, 5431–5436.
Peigñan, L., Garrido, W., Segura, R., Melo, R., Rojas, D., Carcamo, J.G., San Martin, R. y
Quezada, C. (2011). Combined use of anticancer drugs and an inhibitor of multiple drug
resistance-associated protein-1 increases sensitivity and decreases survival of
glioblastoma multiforme cells in vitro. Neurochem Res; 36, 1397-1406.
Persano, L., Rampazzo, E., Basso, G. y Viola G. (2013). Glioblastoma cancer stem cells: Role of
the microenvironment and therapeutic targeting. Bio Phar; 85, 612–622.
Pettengill, M., Robson, S., Tresenriter, M., Millan, J.L., Usheva, A., Bingham, T., Belderbos, M.,
Bergelson, I., Burl, S., Kampmann, B., Gelinas, L., Kollmann, T., Bont, L. y Levy, O.
(2013). Soluble ecto-5'-nucleotidase (5'-NT), alkaline phosphatase, and adenosine
deaminase (ADA1) activities in neonatal blood favor elevated extracellular adenosine. J
Biol Chem; 288, 27315-27326.
Piccirillo, S.G., Reynolds, B.A., Zanetti, N., Lamorte, G., Binda, E., Broggi, G., Brem, H., Olivi,
A., Dimeco, F. y Vescovi, A.L. (2006). Bone morphogenetic proteins inhibit the
tumorigenic potential of human brain tumour-initiating cells. Nature, 444, 761–765.
97
Pistollato, F., Abbadi, S., Rampazzo, E., Persano, L., Della Puppa, A., Frasson, C., Sarto, E.,
Scienza, R., D’Avella, D. y Basso, G. (2010). Intratumoral Hypoxic Gradient Drives Stem
Cells Distribution and MGMT Expression in Glioblastoma. Stem cells; 28, 851–862.
Pistollato, F., Chen, H.L., Schwartz, P.H., Basso, G. y Panchision, D.M. (2007). Oxygen tensión
controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and
oligodendrocytes. Mol Cell Neurosci; 35, 424–435.
Platet, N., Mayo, J., Berger, F., He´rodin, F. y Wion, D. (2007). Fluctuation of the SP/non-SP
phenotype in the C6 glioma cell line. FEBS Lett; 581, 1435–1440.
Quezada, C., Garrido, W., Oyarzun, C., Fernandez, K., Segura, R., Melo, R., Casanello, P.,
Sobrevia, L. y San Martin, R. (2013). 5'-ectonucleotidase mediates multiple-drug
resistance in glioblastoma multiforme cells. J Cell Physiol; 228, 602-608.
Quezada, C., Peignan, L., Segura, R., Riquelme, F., Melo, R., Rojas, Z. D., Ayach, F., San Martin
y R., Carcamo, J. G. (2011). Study of resistance to chemotherapy mediated by ABC
transporters in biopsies of glioblastoma multiforme. Rev Med Chil; 139. 415-424.
Reya, T., Morrison, S.J., Clarke, M.F. y Weissman, I.L. (2001). Stem cells, cancer, and cancer
stem cells. Nature; 414, 105-111.
Ricci-Vitiani, L., Lombardi, D.G., Pilozzi, E., Biffoni, M., Todaro, M., Peschle, C. y De Maria,
R. (2007). Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature;
445, 111–115.
Rich, J. N. y S. Bao (2007). Chemotherapy and cancer stem cells. Cell Stem Cell; 1, 353-355.
Roa, H., et al. (2009) Adenosine mediates transforming growth factor-beta 1 release in kidney
glomeruli of diabetic rats. FEBS Lett; 583, 3192-3198.
98
Roy, S., Kenny, E., Kennedy, S., Larkin, A., Ballot, J., Perez De Villarreal, M., Crown, J. y
O'Driscoll, L. (2007). MDR1/P-glycoprotein and MRP-1 mRNA and protein expression
in non-small cell lung cáncer. Anticancer Res; 27, 1325-1330.
Ryzhov, S., Novitskiy, S.V., Zaynagetdinov, R., Goldstein, A.E., Carbone, D.P., Biaggioni, I.,
Dikov, M.M. y Feoktistov, I. (2008). Host A(2B) adenosine receptors promote carcinoma
Host A(2B) adenosine receptors promote carcinoma growth. Neoplasia; 10, 987–995.
Sathornsumetee, S., Cao, Y., Marcello, J.E., Herndon, J.E., McLendon, R.E., Desjardins, A.,
Friedman, H. S., Dewhirst, M.W., Vredenburgh, J.J. y Rich, J.N. (2008). Tumor
angiogenic and hypoxic profiles predict radiographic response and survival in malignant
astrocytoma patients treated with bevacizumab and irinotecan. J Clin Oncol; 26, 271–278.
Scharenberg, C.W., Harkey, M.A. y Torok-Storb, B. (2002). The ABCG2 transporter is an
efficient Hoechst 33342 efflux pump and is preferentially expressed by immature human
hematopoietic progenitors. Blood; 99, 507–512.
Schmaltz, C., Hardenbergh, P.H., Wells, A. y Fisher, D.E. (1998). Regulation of proliferation-
survival decisions during tumor cell hypoxia. Mol. Cell Biol; 18, 2845–2854.
Semenza, G.L. (2003). Targeting HIF-1 for cancer therapy. Nat Rev Cancer; 3, 721–732.
Semenza, G.L. (2010). Defining the role of hypoxia-inducible factor 1 in cancer biology and
therapeutics. Oncogene; 29, 625–634.
Shimizu, S., Eguchi, Y., Kamiike, W., Itoh, Y., Hasegawa, J., Yamabe, K., Otsuki, Y., Matsuda,
H. y Tsujimoto, Y. (1996). Induction of apoptosis as well as necrosis by hypoxia and
predominant prevention of apoptosis by Bcl-2 and Bcl-XL. Cancer Res; 56, 2161–2166.
99
Sinclair, C.J., LaRiviere, C.G., Young, J.D., Cass, C.E., Baldwin, S.A. y Parkinson, F.E. (2000).
Purine uptake and release in rat C6 glioma cells: nucleoside transport and purine
metabolism under ATP-depleting conditions. J Neurochem; 75, 1528-1538.
Singh, S.K., Hawkins, C., Clarke, I.D., Squire, J.A., Bayani, J., Hide, T., Henkelman, R.M.,
Cusimano, M.D., y Dirks, P.B. (2004). Identification of human brain tumour initiating
cells. Nature; 432, 396–401.
Sitkovsky, M.V., Kjaergaard, J., Lukashev, D. y Ohta, A. (2008). Hypoxia-adenosinergic
immunosuppression: tumor protection by T regulatory cells and cancerous tissue hypoxia.
Clin. Cancer Res; 14, 5947–5952.
Sitkovsky, M.V., Lukashev, D., Apasov, S., Kojima, H., Koshiba, M., Caldwell, C., Ohta, A. y
Thiel, M. (2004). Physiological control of immune response and inflammatory tissue
damage by hypoxia-inducible factors and adenosine A2A receptors. Annu Rev Immunol;
22, 657– 682.
Spychala, J. Tumor-promoting functions of adenosine. (2000). Pharmacol Ther; 87, 161–173.
Stagg, J. y Smyth, M.J. (2010). Extracellular adenosine triphosphate and adenosine in cancer.
Oncogene; 29, 5346-5358.
Steinbach, J.P., Wolburg, H., Klumpp, A., Probst, H. y Weller, M. (2003). Hypoxia-induced cell
death in human malignant glioma cells: energy deprivation promotes decoupling of
mitochondrial cytochrome c release from caspase processing and necrotic cell death. Cell
Death Differ; 10, 823-832.
Stupp, R., Mason, W.P., van den Bent, M.J., Weller, M., Fisher, B., Taphoorn, M.J., Belanger,
K., Brandes, A.A., Marosi, C., Bogdahn, U., et al, y the European Organisation for
Research and Treatment of Cancer Brain Tumor and Radiotherapy Groups, and the
100
National Cancer Institute of Canada Clinical Trials Group. (2005). Radiotherapy plus
concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med; 352, 987–996.
Synnestvedt, K., Furuta, G.T., Comerford, K.M., Louis, N., Karhausen, J., Eltzschig, H.K.,
Hansen, K.R., Thompson, L.F. y Colgan, S.P. (2002). Ecto-50-nucleotidase (CD73)
regulation by hypoxia-inducible factor-1 mediates permeability changes in intestinal
epithelia. J Clin Invest; 110, 993–1002.
Tabrizchi, R. y Bedi, S. (2001). Pharmacology of adenosine receptors in the vasculature.
Pharmacol Ther; 91, 133–147.
Thurnher, M., Gruenbacher, G. y Nussbaumer, O. (2013). Regulation of mevalonate metabolism
in cancer and immune cells. Biochim Biophys Acta; 1831, 1009-1015.
Tuettenberg, J., Friedel, C. y Vajkoczy, P. (2006). Angiogenesis in malignant glioma—a target
for antitumor therapy? Crit Rev Oncol Hematol; 59, 181–193.
Ujhazy, P., Berleth, E.S., Pietkiewicz, J.M., Kitano, H., Skaar, J.R., Ehrke, M.J. y Mihich, E.
(1996). Evidence for the involvement of ecto-5'-nucleotidase (CD73) in drug resistance.
Int J Cancer; 68, 493-500.
Ujhazy, P., Klobusicka, M., Babusikova, O., Strausbauch, P., Mihich, E. y Ehrke, M.J. (1994).
Ecto-5'-nucleotidase (CD73) in multidrug-resistant cell lines generated by doxorubicin.
Int J Cancer. 59:83-93.
Vaupel, P. y Mayer, A. (2007). Hypoxia in cancer: significance and impact on clinical outcome.
Cancer Metastasis Rev; 26, 225–239.
Vaupel, P., Kallinowski, F. y Okunieff, P. (1989). Blood flow, oxygen and nutrient supply, and
metabolic microenvironment of human tumors: a review. Cancer Res; 49, 6449–6465.
101
Vredenburgh, J.J., Desjardins, A., Herndon, J.E., Dowell, J.M., Reardon, D.A., Quinn, J.A., Rich,
J.N., Sathornsumetee, S., Gururangan, S., Wagner, M., Bigner, D.D., Friedman, A.H. y
Friedman, H.S. (2007a). Phase II trial of bevacizumab and irinotecan in recurrent
malignant glioma. Clin Cancer Res; 13, 1253–1259.
Vredenburgh, J.J., Desjardins, A., Herndon, J.E., Marcello, J., Reardon, D.A., Quinn, J.A., Rich,
J.N., Sathornsumetee, S., Gururangan, S., Sampson, J., Wagner, M., Bailey, L., Bigner,
D.D., Friedman, A.H. y Friedman, H.S. (2007b). Bevacizumab plus irinotecan in
recurrent glioblastoma multiforme. J Clin Oncol; 25, 4722–4729.
Wang, L., Zhou, X., Zhou, T., Ma, D., Chen, S., Zhi, X., Yin, L., Shao, Z., Ou, Z. y Zhou, P.
(2008). Ecto-5'-nucleotidase promotes invasion, migration and adhesion of human breast
cancer cells. J Cancer Res Clin Oncol; 134, 365-372.
Wang, L.H., Ni, C.W., Lin, Y.Z., Yin, L., Jiang, C.B., Lv, C.T., Le, Y., Lang, Y., Zhao, C.Y.,
Yang, K., Jiao, B.H. y Yin, J. (2014). Targeted induction of apoptosis in glioblastoma
multiforme cells by an MRP3-specific TRAIL fusion protein in vitro. Tumour Biol; 35,
1157-1168.
Webster, K.A., Discher, D.J., Kaiser, S., Hernandez, O., Sato, B. y Bishopric, N.H. (1999).
Hypoxia-activated apoptosis of cardiac myocytes requires reoxygenation or a pH shift and
is independent of p53. J Clin Invest; 104, 239-252.
Weller, M. (2011). Novel diagnostic and therapeutic approaches to malignant glioma. Swiss Med
Wkly 141:w13210.
Wen, P.Y. y Kesari, S. (2008). Malignant gliomas in adults. N Engl J Med; 359, 492–507.
Westphal M. y Lamszus K. (2011). The neurobiology of gliomas: from cell biology to the
development of therapeutic approaches. Nat Rev Neurosci; 12, 495–508.
102
Wu, X.R., He, X.S., Chen Y.F., Yuan, R.X., Zeng, Y., Lian, L., Zou, Y.F., Lan, N., Wu, X.J. y
Lan, P. (2012). High expression of CD73 as a poor prognostic biomarker in human
colorectal cáncer. Journal of Surgical Oncology; 106, 130–137.
Xu, C., Wu, X. y Zhu, J. (2013). VEGF promotes proliferation of human glioblastoma
multiforme stem-like cells through VEGF receptor 2. ScientificWorldJournal; 2013,
417413.
Yamamoto, M., Baba, H., Kusumoto, T., Sakaguchi, Y., Maehara, Y., Kuwano, M. y Sugimachi,
K. (1995). Cyclosporin A and FK506 reverse anthracycline resistance by altering the cell
cycle. Anticancer Drugs; 6, 570-577.
Zhao, P., Zhang, Y.Z. y Sun, M.Z. (2005). Regulatory effect of small interfering RNA targeting
multidrug resistant protein 1 on chemosensitivity of human multiforme glioblastoma cell
line BT325. Ai Zheng; 24, 1436–1441.
Zhao, Y., Dong, J., Huang, Q., Lou, M., Wang, A. y Lan, Q. (2010). Endothelial cell
transdifferentiation of human glioma stem progenitor cells in vitro. Brain Res Bull; 82,
308-312.