universidad austral de chile profesor patrocinante: prof
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Universidad Austral de Chile Facultad de Ciencias
Escuela de Química y Farmacia
PROFESOR PATROCINANTE: Prof. Juan Carlos Paredes G. INSTITUTO: Química FACULTAD: Ciencias
PROFESOR CO-PATROCINANTE: Dr. Eduardo Valenzuela F. INSTITUTO: Microbiología FACULTAD: Ciencias
“EXTRACCION, AISLAMIENTO Y ANALISIS CUALITATIVO DE POLISACÁRIDOS, TERPENOS Y PROTEINAS PRESENTES EN Flammulina
velutipes”
PERLA JANNELA PILLANCARI VARGAS
VALDIVIA – CHILE 2010
Tesis de Grado presentada como parte de los requisitos para optar al Título de Químico Farmacéutico
Esta tesis fue realizada en el Instituto de Química, Facultad de Ciencias,
Universidad Austral de Chile, y fue financiada por el fondo de fomento al
desarrollo científico tecnológico (Proyecto FONDEF DO5I10196).
AGRADECIMIENTOS
Quisiera agradecer en primer lugar, a mis queridos Padres Freddi y Elvira por su
amor incondicional, y por hacer posible mi formación en la Universidad como
también mi importante formación valórica.
Al profesor Juan Carlos Paredes por su excelente disposición y apoyo en esta
tesis, ya que aunque hubieron hartos obstaculos siempre estuvo presente
alentandome a seguir adelante.
A Marianela por apoyarme, y por su buena disposición durante todo el trancurso
de mi tesis, gracias nela.
A la profesora Monica Quiñones por su buena disposición y gran carisma.
A Joel Pardo por su ayuda desinteresada no solo en esta tesis sino durante todo
mi transcurso en la Universidad.
A mi querido hermano Fabián, por darme tu alegría y compañía cada día.
A mi pololo Marco Antonio y su familia, muchas gracias por todo el amor, apoyo y
alegría que me han brindado.
A mis amigos del alma, Natalia, Tiare y Adrian, gracias por estar presentes en
todo momento, en las buenas y en las malas, su amistad será eterna.
A la Universidad por entregarme la oportunidad de desarrollarme no solo en los
estudios sino en la música y artes plásticas.
A mis profesores de artes en general quienes permitieron que complemente mi
vida universitaria con mi pasión por la música y las artes plásticas.
A todas las personas que siempre me han estado apoyando durante todo el
transcurso de mi vida universitaria, quienes han dejado una huella en mi corazón.
i
INDICE DE CONTENIDOS
1. RESUMEN……………………………………………………………………….. 1
SUMMARY……………………………………………………………………….. 2
2. INTRODUCCION………………………………………………………………... 3
2.1. Generalidades de los Hongos………………………………………………..... 3
2.2. Hongos comestibles…………………………………………………………….. 3
2.3. Ultraestructura de los Hongos………………………………………………..... 4
a) Carbohidratos…………………………………………………………………. 4
b) Proteínas: Aminoácidos…………………………….................................... 10
c)Lípidos: Terpenos……………………………………………………………... 11
2.4. Análisis instrumental…………………………………………………………… 12
2.5. Flammulina velutipes…………………………………………………………… 12
3. MATERIALES Y METODOS…………………………………………………... 16
3.1. Materiales……………………………………………………………………….. 16
3.1.1. Material biológico……………………………………………………………….. 16
3.1.2. Reactivos…………………………………………………………………………. 16
3.1.3. Equipos…………………………………………………………………………… 17
3.1.4. Otros………………………………………………………………………………. 17
3.2. Métodos………………………………………………………………………….. 17
3.2.1. Obtención de Flammulina velutipes…………………………………………… 18
3.2.2. Tratamiento previo de micelio de Flammulina velutipes……………………. 18
3.2.3. Fraccionamiento de las paredes celulares y Aislamiento de β-D glucanos 18
ii
y quitina en micelio y cuerpo fructífero………………………………………...
3.2.4. Obtención de quitosano a partir de la fracción PF1………………………..... 20
3.2.5. Precipitación alcalina del quitosano soluble………………………………….. 20
3.2.6. Análisis instrumental…………………………………………………………….. 21
a) Espectroscopia infrarroja de las fracciones PF1, PF2 y PF3……………. 21
3.2.7. Obtención de hidratos de carbono a partir de las fracciones F1 y F2…….. 21
3.2.8. Estimación de pesos moleculares de los precipitados de las fracciones F1
y F2………………………………………………………………………………..
22
3.2.9. Obtención de monómeros……………………………………………………… 23
3.2.10. Análisis cualitativo de carbohidratos………………………………………….. 23
a) Reacciones de Identificación para carbohidratos presentes en
precipitados hidrolizados y no hidrolizados de micelio y cuerpo fructífero...
23
b) Cromatografía de capa fina (TLC)………………………………………….. 24
3.2.11. Obtención de terpenos de las fracciones FA1 y FA2 de micelio y cuerpo
fructífero…………………………………………………………………………..
25
3.2.12. Obtención de terpenos de cuerpo fructífero puro………………………….. 25
3.2.13. Cromatografía capa fina de terpenos de las fracciones FA1 y FA2 ( de
micelio y cuerpo fructífero), FA3,FA4………………………………………….
26
3.2.14. Cromatografía de gases (fracción FA1 de cuerpo
fructífero)…………………………………………………………………………
26
3.2.15. Obtención de la fracción proteica……………………………………………… 26
3.2.16. Análisis cualitativo de la fracción proteica…………………………………… 27
a) Reacciones de Identificación……………………………………………….. 27
iii
b) Cromatografía capa fina de aminoácidos………………………………..... 27
4. RESULTADOS………………………………………………………………….. 29
4.1. Aislamiento del complejo β-D- glucanos- quitina en micelio y cuerpo
fructífero…………………………………………………………………………..
29
4.2. Análisis instrumental…………………………………………………………….. 29
a) Espectroscopia infrarroja del complejo β-D- glucanos- quitina………….. 29
4.3. Obtención de quitosano a partir de la fracción PF1…………………………. 30
4.4. Análisis instrumental…………………………………………………………….. 31
a) Espectroscopia infrarroja de quitina (fracción PF2) y quitosano
(fracción PF3)…………………………………………………………………….
31
4.5. Obtención de hidratos de carbono a partir de las fracciones F1 y F2…….. 33
4.6. Estimación de pesos moleculares de los precipitados de las fracciones F1
y F2………………………………………………………………………………..
34
4.7. Análisis cualitativo de carbohidratos………………………………………….. 36
a) Reacciones de Identificación para carbohidratos presentes en
precipitados hidrolizados y no hidrolizados de micelio y cuerpo fructífero...
36
b) Cromatografía de capa fina (TLC)………………………………………….. 38
4.8. Identificación de proteínas en las fracciones F1 y F2 de micelio y cuerpo
fructífero…………………………………………………………………………..
42
a) Reacciones de identificación……………………………………………….. 42
b) Espectroscopia infrarroja de precipitados no hidrolizados de las
fracciones F2 de micelio y cuerpo fructífero…………………………………..
42
iv
4.9. Extracción de terpenos de cuerpo fructífero………………………………..... 44
4.10. Cromatografía capa fina de terpenos (fracciones FA1 y FA2 de micelio y
cuerpo fructífero, FA3,FA4)……………………………………………………..
44
4.11. Cromatografía de gases (fracción FA1 cuerpo fructífero)…………………... 45
4.12. Análisis cualitativo de la fracción proteica FF1 de cuerpo fructífero……..... 46
a) Reacciones de identificación……………………………………………….. 46
b) Cromatografía capa fina de aminoácidos………………………………..... 47
5. DISCUSION……………………………………………………………………… 49
6. CONCLUSION…………………………………………………………………… 55
7. BIBLIOGRAFIA………………………………………………………………..... 56
8. ANEXOS…………………………………………………………………………. 64
v
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estructura Beta- Glucano 6
Figura 2. Estructura quitina 6
Figura 3. Representación esquemática de las cadenas de a) quitina totalmente
acetilada y b) quitosano totalmente desacetilado
7
Figura 4. Galactomanano guaran 8
Figura 5. Una porción (GGMM) del glucomanano. La segunda glucosa tiene un
grupo acetato
9
Figura 6. Estructura del aminoácido alanina. 10
Figura 7. Flammulina velutipes (enokitake). 13
Figura 8. Esquema de fraccionamiento de las paredes celulares y aislamiento
de β-D- glucanos y quitina en micelio y cuerpo fructífero de
Flammulina velutipes.
19
Figura 9. Fracción PF1 (complejo quitina-β-D-glucanos) de: a) micelio b)
Cuerpo fructífero.
20
Figura 10. Esquema de estimación de pesos moleculares de los precipitados de
las fracciones F1 y F2.
22
Figura 11. Espectro infrarrojo fracción PF1 (complejo β-D-glucanos- quitina)
micelio
29
Figura 12. Espectro infrarrojo fracción PF1 (complejo β-D-glucanos- quitina)
cuerpo fructífero
30
vi
Figura 13. a) precipitado F1 de cuerpo fructífero. b) precipitado F2 de cuerpo
fructífero.
34
Figura 14. Cromatoplaca de celulosa revelada con Ftalato de anilina para
comparar la presencia azucares simples entre los precipitados no
hidrolizados de las fracciones F1 y F2 de micelio (F1 m, F2 m) y
cuerpo fructífero (F1 c, F2 c) versus los precipitados hidrolizados de
las fracciones F1 y F2 de micelio (F1 mH, F2 mH) y cuerpo fructífero
(F1 cH, F2 cH)
39
Figura 15. Cromatoplaca de celulosa revelada con Ftalato de Anilina usada para
identificar azucares en muestras de precipitados hidrolizados de las
fracciones F1 y F2 de micelio (PF1h M, PF2h M) y cuerpo fructífero
(PF1h C, PF2h C), comparada con patrones puros
41
Figura 16. Cromatoplaca de silica gel revelada con el revelador MnCl2/ MeOH/
H2SO4, para identificar terpenos en las fracciones apolares: a)
Solubles en Cloroformo (FA1 y FA2 de micelio y cuerpo fructífero). b)
solubles en Diclorometano (FA3 de cuerpo fructífero) y Acetato de
Etilo (FA4 de cuerpo fructífero)
45
Figura 17. a) Cromatograma de la fracción FA1 de cuerpo fructífero, por
cromatografía gas-masas. b) Espectro de Masas de la fracción FA1
de cuerpo fructífero a un tiempo de retención 26,13 minutos.
46
vii
Figura 18. Cromatoplaca de celulosa revelada con ninhidrina usada para
identificar aminoácidos presentes en la fracción proteica FF1 de
cuerpo fructífero comparada con patrones puros.
47
Figura 19. TLC Paralela en placa de celulosa revelada con ninhidrina usada
para identificar la presencia de aminoácidos superpuestos en la
fracción FF1 de cuerpo fructífero.
48
ANEXOS
Figura 1. Espectro infrarrojo de la fracción PF2 de micelio. 66
Figura 2. Espectro infrarrojo de la fracción PF2 de cuerpo fructífero 66
Figura 3. Espectro infrarrojo de la fracción PF3 de micelio 67
Figura 4. Espectro infrarrojo de la fracción PF3 de cuerpo fructífero 67
Figura 5. Espectro infrarrojo de la fracción F2 de micelio 68
Figura 6. Espectro Infrarrojo de la fracción F2 de cuerpo fructífero 68
viii
INDICE DE TABLAS Tabla 1. Porcentaje de rendimiento del quitosano obtenido a partir de la
fracción PF1 de micelio y de cuerpo fructífero
31
Tabla 2. Número de bandas de absorción y posición en el espectro infrarrojo de
la fracción PF2 (quitina libre de β-D-glucanos) de micelio
32
Tabla 3. Número de bandas de absorción y posición en el espectro infrarrojo de
la fracción PF2 (quitina libre de β-D-glucanos) de cuerpo fructífero
32
Tabla 4. Número de bandas de absorción y posición en el espectro infrarrojo de
la fracción PF3 (quitosano) de micelio
32
Tabla 5. Número de bandas de absorción y posición en el espectro infrarrojo de
la fracción PF3 (quitosano) de cuerpo fructífero
33
Tabla 6. Cantidad de precipitados de hidratos de carbono obtenidos de las
fracciones F1 y F2 de micelio y cuerpo fructífero
34
Tabla 7. Cantidad de muestra retenida y filtrada de micelio y cuerpo fructífero
utilizando una membrana cuyo tamaño de poro correspondía a 10 KD.
35
Tabla 8. Cantidad de muestra retenida y filtrada de micelio y cuerpo fructífero
utilizando una membrana cuyo tamaño de poro correspondía a 3 KD
35
Tabla 9. Resultados de las reacciones de identificación de hidratos de carbonos
para precipitados no hidrolizados de las fracciones F1 y F2 de micelio
y cuerpo fructífero.
37
ix
Tabla 10. Resultados de las reacciones de identificación de hidratos de
carbonos para precipitados hidrolizados de las fracciones F1 y F2 de
micelio y cuerpo fructífero
38
Tabla 11. Distancia de migración (Rf) de estándares puros de glúcidos y de
precipitados hidrolizados de las fracciones F1 y F2 de micelio y
cuerpo fructífero
40
Tabla 12 Número de bandas de absorción y posición en el espectro infrarrojo
de la fracción F2 de micelio
43
Tabla 13. Número de bandas de absorción y posición en el espectro infrarrojo
de la fracción F2 de cuerpo fructífero
43
1
RESUMEN
Desde tiempos ancestrales se han usado los hongos comestibles no tan sólo con un
fin alimenticio, sino también para mantener la salud y promover la longevidad. La gran
diversidad de propiedades medicinales que se le han atribuido a Flammulina velutipes
hacen necesario la identificación clara y precisa de sus compuestos biológicamente
activos, entre los que se encuentran: polisacáridos, lípidos y proteínas. En el presente
trabajo de tesis se aislaron y analizaron cualitativamente quitina, quitosano,
polisacáridos, proteínas y terpenos extraídos desde micelio y cuerpo fructífero de F.
velutipes. La extracción fue a través de tratamiento químico con solventes de diferente
polaridad permitiendo, de esta manera, separar compuestos apolares (terpenos) de
compuestos polares (polisacáridos y proteínas). Se obtuvo quitosano mediante
tratamiento de quitina en medio alcalino (NaOH). El análisis cualitativo consistió en la
identificación de biomoléculas por TLC y espectroscopia. La TLC permitió identificar la
presencia de carbohidratos, proteínas y terpenos utilizando reveladores y estándares.
Respecto al análisis espectroscópico, se identificaron bandas características de quitina
y quitosano utilizando FTIR, y también se identificó la presencia de una molécula
monoterpénica utilizando GC-MS.
2
SUMMARY.
Edible mushrooms have, since ancient times, been consumed with the goals of
maintaining health and promotion of longevity. The diversity of medicinal properties that
has been attributed to Flammulina velutipes, requires the clear and precise identification
of its biological active compounds, which include: polysaccharides, lipids and proteins.In
current thesis work, chitin, chitosan, polysaccharides, proteins and terpenes were
extracted from micelio and fruit body of F. velutipes, then isolated and analized
qualitatively. The extraction was across chemical treatment with solvents of different
polarity allowing separation of apolar compounds (terpenes and chitin) from polar
compounds (polysaccharides and proteins). The chitosan was obtained through alkaline
treatment of chitin (NaOH). The qualitative analysis consisted of the biomolecules
identification through the use of TLC and spectroscopy methods. The TLC allowed the
identification of the presence of carbohydrates, proteins and terpenes using visualizing
reagents and standards. With regard to the spectroscopic analysis, typical bands were
identified of chitin and chitosan using FTIR, and the presence of a monoterpenic
molecule through the use of GC-MS.
3
2. INTRODUCCION
2.1. Generalidades de los Hongos.
Los hongos son microorganismos terrestres y acuáticos que forman un reino viviente
totalmente independiente de los vegetales y no muy relacionado con los animales, por
lo que actualmente se les incluye en el Reino llamado “Fungi” o “Mycota” (Valenzuela,
1998). Se diferencian del resto de los organismos vivos en su estructura microscópica a
base de hifas, en su carácter perenne y en sus procesos de reproducción a través de
esporas sexuales y asexuales (Alexopoulos, et al., 1996; Guzmán, 2003).Este
amplísimo filum tiene representantes prácticamente en todos los hábitats de la tierra y
muchos hongos son de gran importancia médica o económica para el hombre.
Se han estimado que podrían existir 1,5 millones de especies en este reino (Hawsworth,
1991, 2001), muchas de las cuales se cultivan o recolectan para alimento (Chang &
Miles, 2004).
2.2. Hongos comestibles.
Desde tiempos ancestrales se han usado los hongos con un fin alimenticio. Se estima
que cerca de 7,000 especies poseen varios grados de comestibilidad, y más de 3,000
especies de 31 géneros se consideran como las principales comestibles (Chang &
Miles, 2004).
En Chile existen aproximadamente 53 especies de hongos comestibles (autóctonos y
alóctonos), que pertenecen a la División Basidiomycota, dentro de los cuales se
encuentra Flammulina velutipes (Valenzuela, 2003).
4
2.3. Ultraestructura de los Hongos.
En su estructura microscópica, los hongos presentan muchos aspectos comunes a
pesar de su variedad morfológica. La pared celular es el principal componente
estructural y ocupa el primer lugar, ya que constituye una cubierta rígida que protege al
citoplasma de las variaciones osmóticas del medio y proporciona protección frente a
factores ambientales adversos (Mahadevan & Tatum, 1965; Villanueva, 1966).
La pared celular de los hongos está compuesta por carbohidratos, proteínas, lípidos,
pigmentos y sales minerales en orden decreciente, siendo los carbohidratos los que
constituyen, por si solos, más del 80% del peso seco de la pared celular (Prieto, 1992).
a) Carbohidratos.
Los carbohidratos constituyen la forma principal de almacenamiento de energía y son
elementos estructurales de las células. (Lehninger, 1985).
Clasificación de los carbohidratos.
Los carbohidratos se clasifican por lo general en dos grupos: simples y complejos. Los
azúcares simples, o monosacáridos, son aquellos carbohidratos que no se pueden
convertir por hidrólisis en azúcares más pequeños, estos pueden a su vez clasificarse
en aldosas o cetosas dependiendo de la naturaleza del grupo carbonilo (Mc Murry
2000). Dentro de los monosacáridos el que se encuentra en mayor proporción en los
hongos es la glucosa, acompañada de galactosa y manosa. Pueden encontrarse
también cantidades variables de otros monosacáridos menos abundantes y restringidos
a determinados grupos taxonómicos, como ramnosa, xilosa, arabinosa, ribosa y fucosa.
5
Los carbohidratos complejos están formados por dos o más azúcares simples
enlazados; pueden ser, disacáridos, oligosacáridos y polisacáridos. Entre los
polisacáridos más comunes en los hongos se encuentran los beta-glucanos, la quitina y
los galactomananos.
Beta-Glucano.
Los beta-glucanos son polisacáridos formados por monómeros de β-D-Glucosa como la
celulosa, pero con un enlace 1β→3 por cada tres o cuatro enlaces 1β→4 (Figura 1).
Posiblemente es el tipo de polímero más ampliamente distribuido en las paredes
celulares fúngicas, y cuando está presente representa entre un 15 y un 30% de los
polisacáridos de la pared. Es insoluble en álcali y parece estar íntimamente ligado a la
quitina (Wessels & Sietsma, 1981).
Tanto sus propiedades fisicoquímicas como sus propiedades biológicas dependen de
su estructura, la longitud de sus cadenas, y su organización tridimensional.
Dentro de los Beta-glucanos, los homopolímeros pertenecientes al grupo de los D-
glucano conforman mayoritariamente la pared celular de los hongos, principalmente los
(1→3) y (1→6)-β-glucanos (Klis et al., 2006; Lesage & Bussey 2006). Estos
polisacáridos pueden existir también en forma libre como exopolisácaridos, y unidos
estructuralmente a proteínas, lípidos y otros polisacáridos presentes en la pared
celular de los hongos (Williams, 1997; Klis et al., 2006,).
Se considera que los beta-glucanos poseen propiedades revitalizantes, actúan como
antiinflamatorios, protegen contra la radiación UV y contra el envejecimiento, poseen
efectos anti-acné y antiarrugas (Gautier et al., 2008).
6
Figura 1. Estructura Beta-Glucano.
Quitina.
La quitina fue aislada por primera vez por Braconnot en 1811, a partir de hongos
superiores, y por su origen la denominó “fungina” (Braconnot, 1811). Es uno de los
biopolímeros mas abundantes y se encuentra mayoritariamente como polisacárido
estructural en conchas de crustáceos y muchos hongos (Heux et al., 2000).
Este polímero está compuesto por aminoazúcares unidos entre sí por enlaces
glicosídicos β (1→4) formando una cadena lineal de unidades de N-acetil-2-amino-2-
desoxi-D-glucosa (Figura 2) algunas de las cuales se encuentran desacetiladas (Prieto,
1992).
Figura 2. Estructura Quitina.
La quitina en su forma natural es insoluble en solventes acuosos diluidos y en la
mayoría de los disolventes comunes.
7
Se argumenta que la quitina natural posee un grado de acetilación, DA (fracción del
total de unidades glucosídicas que están acetiladas), de 0.66, es decir, que una de cada
tres de sus unidades se encuentran desacetiladas (Peniche, 2006). Cuando la quitina
es parcialmente desacetiliada (DA<50%), se convierte soluble en agua bajo condiciones
acídicas, y pasa a llamarse quitosano. (Heux et al., 2000).
Quitosano.
Está compuesto por dos tipos de unidades estructurales distribuidas de manera
aleatoria a lo largo de la cadena, la N-acetil-D-glucosamina y la D-glucosamina, las
cuales se encuentran unidas entre sí por enlaces del tipo β(1→4) glicosídicos. En la
Figura 3 se muestra la estructura del quitosano totalmente desacetilado. Sin embargo,
resulta muy difícil desacetilar totalmente la quitina, y lo que usualmente se conoce como
quitosano es una familia de quitinas con diferente grado de desacetilación,
generalmente superior a 0.45. (Prieto, 1992).
Figura 3. Representación esquemática de las cadenas de a) quitina totalmente
acetilada y b) quitosano totalmente desacetilado.
8
Existen alrededor de 200 aplicaciones habituales y potenciales tanto como para la
quitina como para el Quitosano (Sandford, 1989; Ravi Kumar, 2000). Este extenso
rango de aplicaciones incluye, cosméticos, agricultura, aditivos en alimentos, materiales
biomédicos, antimicrobianos, agentes quelantes y efluentes de refinamiento industrial
(Rathke & Hodson, 1994; Kawahara et al., 2003; Chassarya et al., 2005).
Galactomanano.
Los galactomananos son polisacáridos que consisten de una cadena de manosa con
grupos laterales de galactosa. Las unidades de manopiranosa están unidas por enlaces
1β→4, y las unidades laterales de galactopiranosa se unen a la cadena central con
enlaces 1α→6. Los galactomananos se encuentran en varias gomas vegetales que se
usan para aumentar la viscosidad de productos alimenticios, un ejemplo de estas es la
goma guar cuyo polisacáridos mayoritario es el galactomanano guaran (Figura 4).
Figura 4. Galactomanano guaran.
9
Glucomanano.
Consiste de glucosa (G) y manosa (M) en una proporción 5:8 con enlaces 1β→4 (Figura
5). La unidad polimérica tiene el patrón molecular: GGMMGMMMMMGGM. Cadenas
cortas laterales de 11 a 16 monosacáridos ocurren a intervalos de 50 a 60 unidades de
la cadena principal unidas por enlaces 1β→3. Grupos de acetato en el carbono 6 se
encuentran en cada 9 a 19 unidades de la cadena principal. La hidrólisis de los grupos
acetatos favorece la formación de enlaces de hidrógeno intermoleculares que son
responsables por la acción gelificante.
El glucomanano es una fibra dietética utilizada en las dietas para reducir el hambre
porque produce una sensación de plenitud y crea soluciones muy viscosas que retardan
la absorción de los nutrientes de los alimentos. Un gramo de este polisacárido soluble
puede absorber hasta 200 mL de agua, por esto el glucomanano también se usa para
artículos absorbentes como pañales desechables y toallas higiénicas femeninas.
Figura 5. Una porción (GGMM) del glucomanano. La segunda glucosa tiene un grupo
acetato.
10
La información de glucomananos y galactomananos conformando paredes celulares de
hongos es, muy escasa. En algunos Ascomicetes se sugirió que galactosa y manosa
están en un heteropolimero con glucosa (Ruiz, 1967; Zonneveld, 1971). En las paredes
de varias especies de Penicillium, Talaromyces y Eupenicillium (Leal et al., 1984;
Gómez – Miranda et al, 1984 y 1986; Rupérez & Leal, 1986; Rupérez et al., 1986) se ha
encontrado un B- glucogalactano soluble en álcali. En Gliocladium viride se han descrito
galactomanoglucanos extraídos de la pared con NaOH (Gómez – Miranda et al., 1990).
Dentro de los hongos comestibles en Morchella esculenta se extrajo a partir del extracto
polar, un galactomanano de alto peso molecular (Duncan et al., 2002).
b) Proteínas: Aminoácidos.
Las proteínas son biomoléculas de alto peso molecular que se encuentran en todo
organismo viviente. Existen muchos tipos y tienen funciones biológicas diferentes. Sea
cual sea su función, todas las proteínas están construidas de muchas unidades de
aminoácidos enlazados en una cadena larga (Mc Murry, 2000).
Los aminoácidos como su nombre lo dice son bifuncionales. Contienen un grupo amino
básico, y un grupo carboxilo ácido (Figura 6):
Figura 6: Estructura del aminoácido alanina.
11
En los hongos las proteínas representan el 30-50% del peso seco de la pared fúngica
en hongos levaduriformes y el 20-30% del peso seco de la pared de los hongos
filamentosos. La mayoría de las proteínas están asociadas a glúcidos por enlaces O o
N, formando glicoproteínas. Las proteínas de la pared tienen diversas funciones,
participando en el mantenimiento de la forma celular, interviniendo en los procesos de
adhesión (Als y Hwp1), protegiendo a la célula de sustancias extrañas, participando en
la absorción de moléculas, transmitiendo señales al citoplasma y sintetizando y
remodelando los componentes de la pared ( Bowman & Free, 2006).
c) Lípidos: Terpenos.
Los lípidos son moléculas orgánicas que se encuentran en la naturaleza, aisladas de las
células y tejidos por extracción con disolventes orgánicos no polares. (Mc Murry, 2000).
Dentro de los lípidos se encuentran los terpenos, estos se caracterizan por ser
hidrocarburos derivados de una unidad simple de cinco carbonos llamada isopreno.
Los terpenos se clasifican de acuerdo con el número de unidades de isopreno que
contienen. Así, los monoterpenos son sustancias de 10 carbonos biosintetizadas a partir
de dos unidades de isoprenos; los sesquiterpenos son moléculas de 15 carbonos a
partir de tres unidades de isopreno, etc. (Mc Murry, 2000)
En los hongos, específicamente en Basidiomicetes los terpenos que más abundan son
los sesquiterpenos, aunque también se encuentran en menor medida, monoterpenos,
diterpenos y triterpenos, muchos de los cuales poseen estructuras que, hasta ahora,
sólo han sido detectadas en esta clase de microorganismos, mientras que otras están
estrechamente ligadas a un cierto número de plantas (Brizuela et al., 1998).
12
2.4. Análisis Instrumental.
La identificación de terpenos carbohidratos y proteínas se puede realizar mediante
técnicas de instrumentación (Skoog et al., 2005) que van desde las más simples hasta
las más sofisticadas, entre las cuales se encuentran:
1. Cromatografía :
i. De capa fina (TLC).
ii. Liquida de alta resolución (HPLC).
iii.De gases (GC).
2. Espectroscopia:
i. Infrarroja (IR).
ii. De Masas (MS).
Los estudios realizados en la presente tesis se centran en el hongo Flammulina
velutipes.
2.5. Flammulina velutipes.
Taxonómicamente F. velutipes (Figura 7) es un hongo q pertenece al Reino Fungi;
División Basidiomycota; Clase basidiomicetes; Orden Agaricales; Familia
Marasmiaceae; Género Flammulina. Este hongo es popularmente conocido por su
nombre japonés “enokitake” el cual, sin embargo, fue primariamente cultivado en
China durante el siglo VIII. Hoy en día su consumo es mundial, ubicándose en cuarto
lugar de los ranking de producción y consumo de hongos comestibles (Leifa et al.,
2001).
13
Figura 7: Flammulina velutipes (enokitake).
Estudios de polisacáridos de F. velutipes han demostrado fuertes actividades
inmunomoduladoras y antitumorales para sus glucanos y heteropolisacáridos (Yoshioka
et al., 1973; Otagiri et al., 1983). Por su parte Ikekawa et al. (1982) reportó un beta-
(1→3) glucano y 2 heteropolisacáridos que poseen actividad antitumoral. Esto fue
seguido por un reporte de Otagiri et al. (1983), quien halló una intensificación de las
propiedades antitumorales e inmunitarias cuando los polisacáridos que contenían
glucosa, galactosa, manosa, xilosa y arabinosa formaban enlaces con proteínas.
Aparte de los estudios enfocados en las propiedades biológicas de F. velutipes,
existen muy pocos estudios respectos a la estructura de sus polisacáridos. Uno de
estos estudios corresponde al realizado por Mukumoto & Yamaguchi (1997) el cual
14
reveló la estructura de un manofucogalactano proveniente del cuerpo fructífero de F.
velutipes.
No existen estudios hasta la fecha de las propiedades biológicas ni estructura química
de quitina y quitosano obtenidos de F. velutipes.
Existen algunos estudios que demuestran la presencia de importantes proteínas con
actividad biológica en F. velutipes, como es el caso del estudio realizado por Jiunn
Lang et al. (1995) el cual demostró la presencia de una proteína con actividad
inmunomoduladora, o el estudio realizado por Zhou, et al. (2003), en el cual purifican y
cristalizan una proteína básica con actividad antitumoral.
Respecto al estudio de terpenos también son muy pocos, uno de ellos, realizado por
Hirai et al. (1998) demostró la presencial de un monoterpentriol que podría jugar un
importante rol en la elongación del pie; referente a sus propiedades biológicas, no
existen estudios.
No existiendo una información completa de los componentes de la pared celular, como
también, la estructura de quitina y posible quitosano obtenidos a partir de F. velutipes la
hipótesis de trabajo es la siguiente:
HIPÓTESIS
Flammulina velutipes presenta en su composición polisacáridos: Glucanos, Quitina;
Terpenos, y Péptidos.
Para aceptar o rechazar la hipótesis, se plantean los siguientes objetivos específicos:
15
• Aislamiento, purificación y análisis químico del complejo quitina y B- D glucano
presentes en extracto micelial y cuerpo fructífero de Flammulina velutipes.
• Aislamiento e identificación química y física de carbohidratos, terpenos,
aminoácidos y quitina presentes en extracto micelial y cuerpo fructífero de
Flammulina velutipes.
• Obtención de quitosano a partir de quitina presente en extracto micelial y cuerpo
fructífero de Flammulina velutipes y posterior identificación química.
16
3. MATERIALES Y METODOS
3.1. Materiales.
3.1.1. Material biológico.
Para el desarrollo del presente estudio se utilizaron cuerpos fructíferos y micelio del
hongo comestible Flammulina velutipes (Curt.: Fries) Singer.
3.1.2. Reactivos.
Los reactivos que se señalan a continuación son reactivos para análisis del laboratorio
Merck, citados en orden alfabético y entre paréntesis se indican las respectivas siglas
utilizadas en el texto:
acetato de etilo (AcEt), ácido acético (HAc) ácido clorhídrico (HCl), ácido ftalico, ácido
sulfúrico (H2SO4), amoniaco (NH3), α- naftol, anilina, cloroformo (TCM), cloruro de
manganeso (MnCl2), diclorometano (DCLM), dimetilsulfoxido (DMSO), etanol (EtOH),
hidróxido de sodio (NaOH), isopropanol, metanol (CH3OH), ninhidrina, nitrato de plata
amoniacal, orcinol, sulfato de cobre, resorcinol, estándares carbohidratos: arabinosa
(Ara), galactosa (Gal), glucosa (Glu), lactosa (Lac), maltosa (Mal), manosa (Man),
rafinosa (Raf), ramnosa (Ram), xilosa (Xil), estándares aminoácidos: ácido glutámico (A.
Gl), asparragina (Asp), cisteína (Cis), glicina (Gli), histidina (His), metionina (Met),
tirosina (Tyr).
17
3.1.3. Equipos.
Agitador magnético Bausch & Lomb, balanza gravimétrica AND modelo GF - 400,
balanza analítica Shimadzu AUX220, equipo FT/IR Jasco 4200, destilador digital Eyela
modelo sb -1000, estufa LDO-150F Lab.Tech, equipo GC-MS Thermo Scientific
(Cromatógrafo de gas: Focus GC, Detector masa: DSQ II), manto calefactor, centrifuga
refrigerada de alta velocidad Himac CR21GII.
3.1.4. Otros.
Agua destilada, cámara cromatográfica de vidrio, espátula, embudo buchner porcelana,
embudo de decantación, embudo, frascos reactivo, matraz Erlenmayer 250 y 500mL,
matraz Kitasato, mangueras de goma, mortero porcelana, mortero ágata, lápiz gráfito,
papel filtro, parafilm, cromatoplaca SILG/UV 254, cromatoplaca de celulosa, pipeta
aforada 5 y 25 mL, micropipeta aforada 100 – 1000 µl, pinza para sostén, probetas 10 y
100 mL, pipeta Pasteur, refrigerante, regla, secador, tubos de ensayo, vaso precipitado
250, 500 y 1000 mL, varilla agitadora, atomizador, soporte universal mariposa, vidrio
reloj.
3.2. Métodos.
3.2.1. Obtención de Flammulina velutipes.
Flammulina velutipes (cod: 4600-1MCU) fue proporcionada por el Instituto de
Microbiología en su fase vegetativa (micelio) y como cuerpo fructífero.
18
3.2.2. Tratamiento previo del micelio de Flammulina velutipes.
El micelio obtenido del cultivo en medio líquido se trató con una solución Etanol/Agua
(7/3) a 70ºC por 24 horas, la solución resultante se filtró al vacío; obteniéndose un
residuo sólido (micelio) el cual se llevo a sequedad en estufa a 50º C y se reservó para
posterior tratamiento (punto 3.2.3), el sobrenadante se descartó.
3.2.3. Fraccionamiento de las paredes celulares y aislamiento de β-D- glucanos y
quitina en micelio y cuerpo fructífero.
Se pesaron 6 Gramos de micelio seco y se trataron con 250 mL de NaOH 0,1 M,
luego se depositó en un agitador magnético a 25º C por 2 horas, obteniéndose 2
fracciones, un sobrenadante (F1) y un precipitado con el cual se continuó trabajando de
acuerdo al esquema de la Figura 8. Las respectivas suspensiones resultantes obtenidas
en cada tratamiento se filtraron al vacío y se obtuvieron los sobrenadantes F1, F2, FA1,
FA2 y F3, que se reservaron para análisis posteriores. El Precipitado final (PF1) se secó
por 2 días en estufa a 40º C y se reservó para análisis posteriores (Figura 9).
Para el cuerpo fructífero también se pesaron 6 gramos y se le sometió al mismo
tratamiento.
19
Figura 8. Esquema de fraccionamiento de las paredes celulares y aislamiento de β-D-
glucanos y quitina en micelio y cuerpo fructífero de Flammulina velutipes.
20
Figura 9. Fracción PF1 (complejo quitina-β-D-glucanos) de: a) micelio b) Cuerpo
fructífero.
3.2.4. Obtención de Quitosano a partir de la fracción PF1.
Para la obtención de quitosano se pesaron separadamente 0,8 g de fracción PF1 de
cuerpo fructífero y 1,2 g de fracción PF1 de micelio, de estos se guardó 0,1 g para
posterior análisis con espectroscopia infrarroja.
La obtención de quitosano se realizó mediante tratamiento de la fracción PF1 con 60
mL de Acido Acético 2% a 95º C en un sistema de reflujo por 5 horas, luego se separó
por filtración el sobrenadante del residuo, el residuo (fracción PF2) se lavó 3 veces con
agua destilada y se llevo a estufa a 50º C hasta sequedad.
3.2.5. Precipitación alcalina del quitosano soluble.
El sobrenadante obtenido en el punto anterior se trató con NaOH 2M hasta alcanzar un
pH de 9, posteriormente se dejó reposando por 5 días, obteniéndose un precipitado
21
(fracción PF3) que corresponde al quitosano, este fue lavado consecutivamente con
agua destilada hasta alcanzar un pH neutro y luego se llevo a estufa a 50º C hasta
sequedad.
3.2.6. Análisis instrumental.
a) Espectroscopia Infrarroja de las Fracciones PF1, PF2 Y PF3
Para el análisis FTIR inicialmente se molieron separadamente 0.1 g de las muestras
PF1, PF2 y PF3 en un mortero de ágata, posteriormente se colocó una punta de
espátula en el espectrofotómetro y se procedió a medir.
3.2.7. Obtención de hidratos de carbono a partir de las fracciones F1 Y F2.
Se utilizaron 50 ml de las fracciones F1 y F2 de micelio y cuerpo fructífero a las cuales
se les agregó Etanol 95% hasta saturación y se dejó reposar por 5 días, obteniéndose
un precipitado de color amarillento, el cual se separó mediante filtrado y se reservó
para análisis correspondientes, el sobrenadante obtenido se concentró en estufa a 50º
C hasta la mitad de su contenido inicial y se reprecipitó con Etanol de 95%, este
procedimiento fue repetido 4 veces hasta que ya no se obtuvo precipitado. Los
precipitados obtenidos fueron lavados 3 veces con etanol y fueron llevados a estufa a
50º C hasta sequedad.
22
3.2.8. Estimación de pesos moleculares de los precipitados de las fracciones F1 y
F2.
Para la estimación de pesos moleculares se utilizó la técnica de separación por
membrana, para esto, primero se prepararon las soluciones de las muestras a una
concentración al 2%. Posteriormente las muestras fueron puestas en tubos centrifuga
filter cuya membrana de filtración correspondía a 10 KD, luego se procedió a
centrifugar a una velocidad de 6,000 RPM por 5 min a 25º C.
Los filtrados (FC1) obtenidos se traspasaron a tubos centrifuga filter de 3 KD y la
fracción retenida (FR1) se reservó. Posteriormente FC1 se centrifugó a una velocidad
de 6,000 RPM por 6 min a 25º, obteniéndose una fracción retenida (FR2) y una fracción
filtrada (FC2) que se reservaron para análisis posteriores (Figura 10).
Figura 10. Esquema de estimación de pesos moleculares de los precipitados de las
fracciones F1 y F2.
23
3.2.9. Obtención de Monómeros.
Hidrólisis ácida de los precipitados obtenidos de las fracciones F1 Y F2 de
micelio y cuerpo fructífero.
Para la hidrólisis se utilizaron los precipitados más puros los cuales fueron hidrolizados
con HCl 3M en un sistema de reflujo por 5 horas a 100 º C .
3.2.10. Análisis Cualitativo de Carbohidratos.
a) Reacciones de identificación para carbohidratos presentes en precipitados
hidrolizados y no hidrolizados de micelio y cuerpo fructífero.
Para las reacciones de identificación de carbohidratos se disolvió una punta de
espátula de los precipitados no hidrolizados en 10 mL de agua destilada, y se midieron
10 ml de los precipitados hidrolizados.
Reacciones de Identificación.
• Reacción de Molish: Se colocó en un tubo de ensayo 1 mL de muestra y se
agregaron 0.2 mL de α- naftol al 10%, se mezcló bien y luego se adicionó 1 mL
de acido sulfúrico concentrado.
24
• Reacción de Seliwanoff: Se colocó en un tubo de ensayo 1 mL de muestra y
se agregó 1 mL de reactivo de Seliwanoff, luego se calentó en baño María a
ebullición por 2 min.
• Reacción de Bial: Se colocó en un tubo de ensayo 1 mL de muestra y se
agregaron 2 mL de reactivo de Bial, luego se calentará en Baño maría a
ebullición.
• Reacción de Fehling: Se colocó en un tubo de ensayo 1 mL de muestra y se
agregó 1mL de Fehling A y 1 mL de Fehling B, luego se calentó en baño maría
por 2 min.
• Reacción de Tollens: Se colocó en un tubo de ensayo 1 mL de muestra y se
agregó 1 mL de nitrato de plata amoniacal, luego se calentó en baño maría por 2
min.
b) Cromatografía de Capa fina (TLC).
Los monómeros obtenidos de la hidrólisis ácida fueron identificados mediante esta
sencilla técnica. Para realizar la cromatografía, primero fue necesario determinar la
mejor fase móvil, que separara mejor los monosacáridos y disacáridos respectivos.
Para ello se utilizó el eluente Acetato de etilo/Isopropanol/Acido Acético/Agua y la
mejor proporción fue 5:2:1:7.
Como fase estacionaria se uso una placa de celulosa soportada sobre vidrio.
Los patrones utilizados fueron arabinosa, xilosa, glucosa, galactosa, lactosa, maltosa,
rafinosa.
25
Para revelar la placa primero se dejó en estufa a 50 º C por media hora y
posteriormente se roció con el revelador Ftalato de Anilina, una vez rociada se secó en
estufa a una temperatura de 90º C por 1 hora o hasta que aparecieran manchas
evidentes.
3.2.11. Obtención de terpenos de las fracciones FA1 y FA2 de micelio y cuerpo
fructífero.
Los terpenos de la fracción FA1 fueron llevados a rotavapor a una temperatura de 65º
C para separarlos del cloroformo, para la fracción FA2 fue necesario previamente
separar el solvente metanol del cloroformo, esto se llevó acabo mediante destilación a
presión Reducida en rotavapor.
Las fracciones FA1 Y FA2 secas fueron almacenadas para su posterior análisis.
3.2.12. Obtención de terpenos de cuerpo fructífero puro.
Se realizo una extracción primeramente con Diclorometano y posteriormente con
Acetato de Etilo.
La extracción se efectuó tratando 2 g de cuerpo fructífero previamente triturado y
molido, con 50 mL de Diclorometano, la solución se agitó por 1 hora a temperatura
ambiente y se dejó reposando por un día. Posteriormente se filtró y el filtrado obtenido
se destiló en un sistema de presión reducida, esta extracción se realizó 2 veces,
obteniéndose la fracción FA3. El residuo obtenido se trató esta vez con Acetato de Etilo
y se realizo el mismo procedimiento que con el diclorometano obteniéndose la fracción
FA4; el residuo se guardó para análisis de otros metabolitos.
26
3.2.13. Cromatografía capa fina de terpenos a las fracciones FA1 y FA2 (micelio y
cuerpo fructífero), FA3, FA4.
Como prueba preliminar de identificación de terpenos se realizó una cromatografía capa
fina para las fracciones FA1, FA2, FA3, FA4, para ello se utilizaron placas de silica gel.
Como fase móvil se utilizó la solución Acetato de etilo/Metanol (3:7). Como revelador la
mezcla MnCl2/ MeOH/ H2SO4, la formación de una mancha morada o verdosa
demostró la presencia de terpenos.
3.2.14. Cromatografía de gases (fracción FA1 de cuerpo fructífero).
Para la cromatografía de gases se preparó una solución de la fracción FA1 a una
concentración de 43,3 µg/mL, y posteriormente se inyectó en el cromatógrafo de Gas-
Masa.
3.2.15. Obtención de la fracción proteica.
Para extraer la fracción proteica se utilizo el residuo R1, obtenido en el punto 3.3.12, el
cual fue tratado con solventes en polaridad creciente; primeramente se trató 2 veces
con 90 mL de la mezcla etanol/agua (2:1) por una hora con agitación constante y se
dejó reposar por un día, posteriormente se filtro y el residuo obtenido se trató 2 veces
con 90 mL de la mezcla etanol/agua (1:1) por una hora con agitación constante,
finalmente se filtro y el residuo obtenido se lavó con 90 mL de agua caliente, la solución
obtenida se filtro nuevamente, el residuo se descartó y el filtrado se reservó.
27
Todos los filtrados obtenidos se juntaron (fracción FF1), y la mezcla obtenida se destiló
en un sistema a presión reducida hasta sequedad, para de esta manera eliminar todo el
etanol presente.
3.2.16. Análisis cualitativo de la fracción proteica.
a) Reacciones de identificación.
Se realizaron reacciones de identificación de enlace peptídico y de aminoácidos a las
fracciones F1 y F2 (precipitados hidrolizados y no hidrolizados), y FF1, las reacciones
fueron las siguientes:
• Reacción de Biuret: A un tubo de ensayo seco se le agregó 1 mL de las
fracciones respectivas, y posteriormente se le agregó 1 mL de NaOH 5% y gotas
de sulfato cúprico. La formación de un color lila es prueba positiva de la
presencia de enlace peptídico.
• Reacción de Ninhidrina: A un tubo de ensayo seco se le agregó 1 mL de las
fracciones respectivas, posteriormente se le agregó 1 mL de ninhidrina y se
calentó por 2 minutos. La formación de un color morado es prueba positiva de la
presencia de aminoácidos.
b) Cromatografía capa fina de aminoácidos.
Para la identificación cualitativa de aminoácidos se realizó una cromatografía capa fina
de la fracción FF1; para ello se utilizó como fase móvil una solución metanol/amoniaco
(5:1).
Como fase estacionaria se uso una placa de celulosa soportada sobre vidrio.
28
Los patrones utilizados fueron tirosina, cisteína, glicina, metionina, histidina, ácido
glutámico y asparagina.
Para revelar la placa primero se le aplicó calor con secador por 5 minutos y
posteriormente fue rociada con el revelador ninhidrina, una vez rociada se secó con
secador hasta que aparecieran manchas evidentes.
También se realizo una TLC paralela de la fracción FF1.
29
4. RESULTADOS.
4.1. Aislamiento del complejo B-D glucanos-quitina en micelio y cuerpo fructífero.
El peso seco de la pared celular previo al tratamiento con solventes polares y apolares
(punto 3.3.3) fue de 6 g tanto para micelio como para cuerpo fructífero. Posterior al
tratamiento, el peso seco correspondió a 1,894 g para micelio y 0.860 g para cuerpo
fructífero. El porcentaje de rendimiento de la extracción fue de 31,56% para micelio y
de 14,33 % para cuerpo fructífero.
4.2. Análisis Instrumental.
a) Espectroscopia infrarroja del complejo β-D glucanos - quitina.
En las Figuras 11 y 12 se observa el número de bandas detectadas al realizar la
espectroscopia IR a las fracciones PF1 de micelio y cuerpo fructífero.
Figura 11. Espectro infrarrojo fracción PF1 (complejo β-D-glucanos- quitina) micelio.
30
Figura 12. Espectro infrarrojo fracción PF1 (complejo β-D-glucanos- quitina) cuerpo
fructífero.
Se puede observar en ambos espectros entre el rango 1500 a 1700 cm-1 dos bandas
correspondientes a el grupo funcional amidas I y II. En el caso de micelio las bandas de
absorción se presentaron en el 1648,84 cm-1 (amida I) y 1538 (amida II), para el cuerpo
fructífero las bandas de absorción fueron de 1648,84 cm-1 (amida I) y 1543, 74 cm-1
(amida II). Respecto a la banda característica de los β-D glucanos (892 cm-1) no se
observaron picos, pero se observó la presencia de una banda de absorción de 949,77
cm-1, banda que representa el enlace C-O-C presente en los polisacáridos.
4.3. Obtención de quitosano a partir de la fracción PF1.
Para la obtención de quitosano se utilizaron 1,224 gramos de fracción PF1 micelio y
0.780 g de fracción PF1 cuerpo fructífero. En la Tabla 1 se indica la cantidad de
quitosano obtenido y el rendimiento de la extracción.
31
Tabla 1. Porcentaje de rendimiento del quitosano obtenido a partir de la fracción PF1
de micelio y de cuerpo fructífero.
Peso inicial
(fracción PF1) (g)
Peso final (fracción
PF2) (g)
Peso Quitosano (fracción
PF3) (g)
Porcentaje de
rendimiento en relación a la quitina
Porcentaje de
rendimiento en relación
a la muestra total
Micelio 1,224 0,824 O,325 26,55% 5,42%
Cuerpo
Fructífero 0.780 0.501 0,265 33,97% 4,42%
PF1: Complejo quitina-β-D-glucanos, PF2: Quitina libre de β-D-glucanos, PF3:
Quitosano.
EL porcentaje de rendimiento de la fracción PF2 que corresponde a quitina libre de β-D
glucanos fue de 13,73% para micelio y 8,35% para cuerpo fructífero.
4.4. Análisis Instrumental.
a) Espectroscopia infrarroja de Quitina (Fracción PF2) y Quitosano (Fracción
PF3).
En las Tablas 2, 3, 4 y 5 se detallan el numero de bandas detectadas al realizar la
espectroscopia IR a las fracciones PF2 y PF3 de micelio y cuerpo fructífero. El gráfico
del espectro infrarrojo de cada fracción se adjunta en el Anexo 3 (Figura 1, 2, 3 y 4).
32
Tabla 2. Número de bandas de absorción y posición en el espectro infrarrojo de la
fracción PF2 (quitina libre de β-D-glucanos) de micelio.
Numero de Banda Posición cm-1 Numero de Banda Posición cm-1
1 3408,57 5 1552,42
2 3321,78 6 1332,57
3 2927,41 7 1019,19
4 1644,98 8 821,53
Tabla 3. Número de bandas de absorción y posición en el espectro infrarrojo de la
fracción PF2 (quitina libre de β-D-glucanos) de cuerpo fructífero.
Numero de Banda Posición cm-1 Numero de Banda Posición cm-1
1 3377,71 6 1029,8
2 2929,34 7 830,21
3 1646,91 8 763,67
4 1527,35 9 656,64
5 1375
Tabla 4. Número de bandas de absorción y posición en el espectro infrarrojo de la
fracción PF3 (quitosano) de micelio.
Numero de Banda Posición cm-1 Numero de Banda Posición cm-1
1 3334,32 7 1247,72
2 3000,69 8 1154,19
3 2980,45 9 1043,3
4 2930,31 10 1010,52
5 1566,88 11 921,81
6 1409,71 12 647
33
Tabla 5. Número de bandas de absorción y posición en el espectro infrarrojo de la
fracción PF3 (quitosano) de cuerpo fructífero.
Numero de Banda Posición cm-1 Numero de Banda Posición cm-1
1 3430,11 6 1044,26
2 2998,77 7 1010,52
3 2932,23 8 921,81
4 1561,09 9 645,07
5 1407,78
En las Tablas 2 y 3 correspondientes a los espectros de la fracción PF2 (quitina) de
micelio y cuerpo fructífero, se pueden observar definidas las bandas que caracterizan a
la quitina: 3300 – 3400 cm-1 (tensión del grupo OH), 3350 – 3400 cm-1 (grupo funcional
amina), 1644 – 1646 cm-1 (amida I), 1527 – 1552 cm-1 (amida II) y 1019 – 1030 cm-1
(enlace C-O-C).
En las tablas 4 y 5 correspondientes a los espectros de la fracción PF3 (quitosano) de
micelio y cuerpo fructífero, se observa claramente el cambio de las bandas producto de
la desacetilación, donde se produce un desplazamiento y deformación del grupo amino
en el rango 1400 – 1600 cm-1.
4.5. Obtención de hidratos de carbono a partir de las fracciones F1 Y F2.
A partir de las fracciones F1 de micelio y cuerpo fructífero se obtuvieron precipitados
de apariencia mucosa color amarillo translucido (Figura 13 a), y a partir de las
fracciones F2 los precipitados obtenidos fueron de apariencia cristalina de color blanco
(Figura 13 b). La Tabla 6 detalla la cantidad obtenida de cada precipitado.
34
Figura 13. a) precipitado F1 de cuerpo fructífero. b) precipitado F2 de cuerpo fructífero.
Tabla 6. Cantidad de precipitados de hidratos de carbono obtenidos de las fracciones
F1 y F2 de micelio y cuerpo fructífero.
Precipitado Cantidad Obtenida (g)
micelio 0,125 F1
cuerpo fructífero 0,270
micelio 1,985 F2
Cuerpo fructífero 3,070
4.6. Estimación de pesos moleculares de los precipitados de las fracciones F1 y
F2.
En las Tablas 7 y 8 se detalla la cantidad de muestra retenida y filtrada con las
diferentes membranas utilizadas y el `porcentaje filtrado y retenido en relación al total
de muestra.
35
Tabla 7. Cantidad de muestra retenida y filtrada de micelio y cuerpo fructífero utilizando
una membrana cuyo tamaño de poro correspondía a 10 KD.
Membrana tamaño de poro 10 KD
Muestra Cantidad retenida
(mL)
Cantidad filtrada (mL)
Porcentaje filtrado
Porcentaje retenido
F1 micelio 6,5 3,5 35,00% 65,00%
F1 cuerpo fructífero
6 4 40,00% 60,00%
F2 micelio 5,5 4,5 45,00% 55,00%
F2 cuerpo fructífero
0 10 100,00% 0,00%
Tabla 8. Cantidad de muestra retenida y filtrada de micelio y cuerpo fructífero utilizando
una membrana cuyo tamaño de poro correspondía a 3 KD.
Membrana tamaño de poro 3 KD
Muestra Cantidad retenida (mL)
Cantidad filtrada (mL)
Porcentaje filtrado
Porcentaje retenido
F1 micelio 1 2,5 25,00% 75,00%
F1 cuerpo fructífero
1,5 2,5 25,00% 75,00%
F2 micelio 3 1,5 15,00% 85,00%
F2 cuerpo fructífero
5,5 4,5 45,00% 55,00%
36
El mayor porcentaje de muestra retenida se obtuvo con la membrana cuyo tamaño de
poro correspondió a 10KD, a excepción de la muestra F2 de cuerpo fructífero, cuyo
porcentaje de retención fue de 0%, esto producto a una ruptura de la membrana, debido
al alto peso molecular de los polisacáridos presentes en la muestra.
4.7. Análisis cualitativo de carbohidratos.
a) Reacciones de identificación para carbohidratos presentes en precipitados
hidrolizados y no hidrolizados de las fracciones F1 Y F2.
1. Reacción de Molish: Con este ensayo se hizo un reconocimiento general de
carbohidratos, la formación de un anillo violeta en la interfase es prueba positiva.
2. Reacción de Seliwanoff: Con este ensayo se identificaron cetosas, la
formación de una coloración roja es prueba positiva.
3. Reacción de Bial: Con este ensayo se identificaron pentosas, la formación de
una coloración verdosa es prueba positiva.
4. Reacción de Fehling: Con este ensayo se reconocieron los azucares
reductores, la formación de un precipitado color rojo ladrillo es prueba positiva.
5. Reacción de Tollens: Con este ensayo se reconocieron los azucares
reductores, la formación de un precipitado gris o las paredes plateadas es prueba
positiva.
37
En las Tablas 9 y 10 se detallan los resultados de las reacciones anteriormente
descritas.
Como se observa en la Tabla 9, todas las muestras de precipitado no hidrolizado dieron
negativa para la reacción de Seliwanoff, lo cual indica la ausencia de cetosas. Respecto
a las pruebas de azucares reductores (Fehling y Tollens), sólo la muestra F1 de micelio
dio positiva, lo cual indica la presencia del grupo carbonilo libre.
En cuanto a los precipitados hidrolizados, como se observa en la Tabla 10, todas las
muestras al igual que los precipitados no hidrolizados, dieron negativa a la reacción de
cetosas (Seliwanoff). Respecto a las pruebas de azucares reductores a diferencia de los
precipitados no hidrolizados, dieron todas positivas, por lo tanto, el tratamiento con
acido clorhídrico permitió la hidrólisis de los enlaces glucosídicos, dejando libre el grupo
carbonilo.
Tabla 9. Resultados de las reacciones de identificación de hidratos de carbonos para
precipitados no hidrolizados de las fracciones F1 y F2 de micelio y cuerpo fructífero.
Precipitados no hidrolizados
Reacciones de Identificación
Muestra Molish Seliwanoff Bial Fehling Tollens
F1 micelio
Positiva Negativa Positiva Positiva Positiva
F1 cuerpo fructífero
Positiva Negativa Positiva Negativa Negativa
F2 micelio
Positiva Negativa Positiva Negativa Negativa
F2 cuerpo fructífero
Positiva Negativa Positiva Negativa Negativa
38
Tabla 10. Resultados de las reacciones de identificación de hidratos de carbonos para
precipitados hidrolizados de las fracciones F1 y F2 de micelio y cuerpo fructífero.
Precipitados hidrolizados
Reacciones de Identificación
Muestra Molish Seliwanoff Bial Fehling Tollens
F1 micelio
Positiva Negativa Positiva Positiva Positiva
F1 cuerpo fructífero
Positiva Negativa Positiva Positiva Positiva
F2 micelio
Positiva Negativa Positiva Positiva Positiva
F2 cuerpo fructífero
Positiva Negativa Positiva Positiva Positiva
b) Cromatografía de capa fina (TLC).
Para comparar la presencia de azucares simples entre precipitados no hidrolizados y
hidrolizados se realizó una TLC en placa de celulosa, la Figura 14 muestra la ausencia
de migración para los precipitados no hidrolizados, a diferencia de los precipitados
hidrolizados quienes presentaron diferentes niveles de migración, y por ende, diferentes
azucares simples.
La identificación de azúcares se realizó mediante la determinación de Rf entre
estándares puros y precipitados hidrolizados, la Tabla 11 detalla los Rf obtenidos, y
en la Figura 15 se puede observar la distancia de migración de los estándares y
muestras y la coloración que indica que tipo de carbohidratos corresponde (coloración
roja= pentosas, coloración marrón= hexosas).
39
Figura 14. Cromatoplaca de celulosa revelada con Ftalato de anilina para comparar la
presencia azucares simples entre los precipitados no hidrolizados de las fracciones F1 y
F2 de micelio (F1 m, F2 m) y cuerpo fructífero (F1 c, F2 c) versus los precipitados
hidrolizados de las fracciones F1 y F2 de micelio (F1 mH, F2 mH) y cuerpo fructífero
(F1 cH, F2 cH).
40
Tabla 11. Distancia de migración (Rf) de estándares puros de glúcidos y de
precipitados hidrolizados de las fracciones F1 y F2 de micelio y cuerpo fructífero.
Estándares
Estándares Rf
Arabinosa 0.24
Galactosa 0.21
Glucosa 0.21
Lactosa ( no reveló)
Maltosa 0.24
Manosa (no reveló)
Ramnosa 0.46
Xilosa 0.30
Muestras
Muestras Rf
0.24 Precipitado hidrolizado F1 Micelio 0.35
0.21 Precipitado hidrolizado F1 Cuerpo Fructífero 0.35
0,24 Precipitado hidrolizado F2 Micelio 0.36
0,21 Precipitado hidrolizado F2 Cuerpo Fructífero 0.36
En las muestra F1 y F2 de micelio los ázucares simples presentes pueden ser glucosa o
galactosa, en el caso de las muestra F1 y F2 de cuerpo fructífero el azúcar simple
puede ser arabinosa o maltosa. En todas las muestras existe un Rf que no coincide con
41
ninguno de los estándares, este posiblemente puede ser manitol o fucosa, que según
bibliografía esta presente en F. velutipes.
Figura 15. Cromatoplaca de celulosa revelada con Ftalato de Anilina usada para
identificar azucares en muestras de precipitados hidrolizados de las fracciones F1 y F2
de micelio (PF1h M, PF2h M) y cuerpo fructífero (PF1h C, PF2h C), comparada con
patrones puros.
42
4.8. Identificación de Proteínas en las fracciones F1 y F2 de micelio y cuerpo
fructífero.
Para reconocer si existen proteínas unidas a los carbohidratos presentes en los
precipitados de las fracciones F1 y F2 se realizaron reacciones de identificación y
análisis espectroscópico de las respectivas muestras.
a) Reacciones de identificación.
Tanto las muestras F1 y F2 de micelio y cuerpo fructífero resultaron negativas a la
reacción de Biuret y de Ninhidrina.
b) Espectroscopia infrarroja de precipitados no hidrolizados de las fracciones F2
de micelio y cuerpo fructífero.
Se realizó un espectro infrarrojo de los precipitados de las fracciones F2 de micelio y
cuerpo fructífero para verificar la ausencia de proteínas en las muestras F2 de micelio y
cuerpo fructífero. Las tabla 12 y 13 detalla el número de bandas detectadas al realizar
la espectroscopia a ambas muestras. El gráfico del espectro infrarrojo se adjunta en el
Anexo 3 (Figura 5 y 6).
43
Tabla 12. Número de bandas de absorción y posición en el espectro infrarrojo de la
fracción F2 de micelio.
Numero de Banda Posición cm-1 Numero de Banda Posición cm-1
1 3457,74 7 976,77
2 3043,12 8 846,6
3 1685,48 9 793,56
4 1454,06 10 749,21
5 1167,69 11 657,61
6 1065,48 12 578,54
Tabla 13. Número de bandas de absorción y posición en el espectro infrarrojo de la
fracción F2 de cuerpo fructífero.
Numero de Banda Posición cm-1 Numero de Banda Posición cm-1
1 3618,77 7 883,24
2 3351,68 8 848,53
3 3169,44 9 657,61
4 3022,87 10 610,36
5 1647,88 11 595,9
6 1375,96 12 562,15
La banda de absorción ubicada entre el rango 3300 a 3500 cm.1 es característica del
grupo funcional amina. En el precipitado F2 de micelio la banda está ausente (tabla 12),
ya que la banda de absorción ubicada en 3457,74 cm-1 corresponde al grupo funcional
44
OH, por lo tanto no existirían proteínas unidas a la muestra de carbohidratos extraídos.
En el precipitado F2 de cuerpo fructífero (tabla 13) existe una banda en la posición
3169,44 cm-1, que corresponde al grupo funcional amina, por lo tanto podrían existir
proteínas o péptidos unido a esta muestra de carbohidratos.
4.9. Extracción de terpenos de cuerpo fructífero.
Las fracciones extraídas con diclorometano y acetato de etilo en las cuales se
encuentran los terpenos y otros tipos de lípidos, tenían una apariencia grasosa, de color
amarillo y aroma condimentado.
4.10. Cromatografía capa fina de terpenos (fracciones FA1, FA2 de micelio y
cuerpo fructífero, FA3, FA4).
Para identificar la presencia de terpenos se realizó una cromatografía capa fina en
placa silica gel, una vez corrida la placa esta se reveló con revelador para terpenos.
Como se observa en la Figura 16, todas las muestras (FA1 y FA2 de micelio y cuerpo
fructifero, FA3 y FA4) revelaron con el revelador MnCl2/ MeOH/ H2SO4, la formación de
una mancha verde indicó la presencia de terpenos.
45
Figura 16. Cromatoplaca de silica gel revelada con el revelador MnCl2/ MeOH/ H2SO4,
para identificar terpenos en las fracciones apolares: a) Solubles en Cloroformo (FA1 y
FA2 de micelio y cuerpo fructífero). b) solubles en Diclorometano (FA3 de cuerpo
fructífero) y Acetato de Etilo (FA4 de cuerpo fructífero).
4.11. Cromatografía de gases (Fracción FA1 cuerpo fructífero).
En la Figura 17 se observa el Cromatograma y espectro de masas obtenidos de la
fracción FA1 de cuerpo fructífero al realizarle cromatografía gas - masa.
En el cromatograma a un tiempo de retención de 26,13 minutos se observó una posible
molécula monoterpénica, cuyo ión correspondería a 183,29 m/z. Esta molécula
poseería 2 fragmentos, un ión de 70,13 m/z y otro de 113,21 m/z.
46
Figura 17. a) Cromatograma de la fracción FA1 de cuerpo fructífero, por cromatografía
gas-masas. b) Espectro de Masas de la fracción FA1 de cuerpo fructífero a un tiempo
de retención 26,13 minutos.
Proteínas
4.12 Análisis cualitativo de la fracción proteica FF1 de cuerpo fructífero.
a) Reacciones de identificación.
Para reconocer la presencia de aminoácidos se realizaron las reacciones de
identificación Biuret y Ninhidrina a la fracción Proteica FF1, los resultados en ambas
reacciones fueron positivos.
47
b) Cromatografía Capa Fina de Aminoácidos.
La identificación de los posibles aminoácidos presentes en la fracción proteica FF1 de
cuerpo fructífero se realizo mediante una TLC en celulosa (Figura 18), la comparación
con patrones puros indica la clara existencia de los aminoácidos histidina, tirosina y
acido glutámico.
Se realizo también una TLC paralela para ver si existían otros aminoácidos que se
encuentren superpuestos, la Figura 19 muestra la presencia de 9 aminoácidos de los
cuales 4 estaban superpuestos.
.
Figura 18. Cromatoplaca de celulosa revelada con ninhidrina usada para identificar
aminoácidos presentes en la fracción proteica FF1 de cuerpo fructífero comparada con
patrones puros.
48
Figura 19. TLC Paralela en placa de celulosa revelada con ninhidrina usada para
identificar la presencia de aminoácidos superpuestos en la fracción FF1 de cuerpo
fructífero.
49
5. DISCUSION
A pesar de que existen numerosos estudios sobre la actividad biológica de F. velutipes,
no son muchos los estudios respecto a su composición química, especialmente a los
relacionado con la quitina y β-D glucanos.
Los resultados obtenidos en el presente estudio respecto al aislamiento del complejo
quitina β-D glucanos, se consideran buenos, siendo un 31,56% de rendimiento para
micelio y un 14,33% para cuerpo fructífero. Respecto a la quitina propiamente tal, el
porcentaje de rendimiento de la extracción fue de un 13,73% para micelio y 8,35% para
cuerpo fructífero, un resultado satisfactorio considerando estudios realizados en otros
hongos cuyos resultados estuvieron entre los rangos 1,87 – 6,93% (Ofenbeher-Miletic
et al, 1984).
Referente a Los espectros FTIR del complejo quitina β–D glucanos y de quitina,
ambos dieron bandas características del grupo NH (1556 cm-1) de la molécula de
quitina. En el caso de micelio las bandas de absorción se presentaron en el 1648,84 cm-
1 (amida I) y 1538 cm-1 (amida II) para complejo quitina β - D glucanos y 1644,98 cm-1,
1552 cm-1 para quitina libre. En cuanto al cuerpo fructífero las bandas de absorción
fueron de 1648,84 cm-1 y 1543, 74 cm-1 para complejo quitina β –D glucanos, y para
quitina libre fue de 1646, 91 cm-1 y 1527,35 cm-1. Los FTIR fueron similares a los
realizados por González (2004) en el hongo comestible Lentinula edades, cuyo método
de extracción fue el mismo realizado en este estudio (Heux et al, 2000).
50
Respecto a la banda característica de los β-D glucanos (892 cm-1) no se observaron
picos, pero se observó la presencia de una banda de absorción de 949,77 cm-1, banda
que representa el enlace C-O-C presente en los polisacáridos.
Quitosano
El quitosano obtenido por tratamiento alcalino y posterior tratamiento ácido a partir de
quitina, descrito por los autores Rane & Hoover, 1993; Suntornsuk et al, 2002;
Chatterjee et al., 2005; Cai et al., 2006, alcanzó un rendimiento de 26,55% en micelio y
un 33,97% en cuerpo fructífero con respecto a la quitina, y de 5,42% en micelio y 4,42%
en cuerpo fructífero con respecto a la muestra total. El rendimiento total en relación
extracciones a partir de camarones u otros crustáceos (Mármol et al., 2004; Baltodano
& Yaipen, 2006) cuyos rendimientos estuvieron por sobre el 70%, fue bajo, a diferencia
del rendimiento con respecto a la quitina que fue similar al obtenido a partir de
crustáceos (Baltodano & Yaipen, 2006).
El FTIR de quitosano, demostró la desacetilación de quitina ya que se produjo un
desplazamiento y deformación del grupo amino en el rango 1400 – 1600 cm-1 propio de
la conversión de quitina a quitosano. Esta desplazamiento y deformación de banda se
debe a que la quitina por el hecho de poseer el grupo funcional amida, presenta una
banda en la región de 1650 cm-1 correspondiente a la vibración del grupo carbonilo, al
producirse la desacetilación, el grupo amino de la amida queda libre, observándose una
intensa banda en la región de 1560 cm-1.
La desacetilación de la quitina puede ser parcial o total, ya que varía según las
condiciones usadas, por lo tanto el termino quitosano cubre un amplio rango de
51
polímeros relacionados, que difieren entre si, en el contenido de grupos aminos libres
(Moore & Roberts, 1980; Marmol et al., 2004). Para lograr una desacetilación total es
necesario tratamiento prolongados con soluciones concentradas de NaOH o KOH, ya
que con un solo tratamiento no se suele sobrepasar el 75 a 85% de desacetilación. No
obstante tratamientos prolongados suelen provocar la degradación del polímero sin
traducirse en un aumento sensible del grado de desacetilación (Peniche, 2006). En
este estudio la desacetilación solo fue parcial ya que el tratamiento alcalino fue con
NaOH de baja concentración (0,1 y 0,5 M).
Hidratos De Carbono
La pared celular de F. velutipes posee un alto contenido de hidratos de carbono,
alcanzando el 58,0% del peso total (Ko et al., 2007). Los hidratos de carbono que
conforman las complejas redes de polisacáridos son principalmente la glucosa como
monosacárido mayoritaria, pero también existen otros monosacáridos tales como
galactosa, manosa, fucosa, xilosa y manitol (Smiderle et al, 2006, Pang et al, 2007; Yin
et al., 2010). En las fracciones analizadas en el presente estudio (F1 y F2) se encontró
glucosa, galactosa, maltosa u/o arabinosa. Para identificar los monosacáridos fue
necesario hidrolizar las muestras ya que las muestras F1 y F2 sin hidrolizar, dieron
negativas las pruebas de azúcares reductores y no revelaron en la cromatografía capa
fina. También se evidenció la ausencia de cetosas ya que la reacción de Seliwanoff dio
negativa tanto como para precipitados hidrolizados como para no hidrolizados.
Cabe destacar que la fracción F1 de micelio y cuerpo fructífero presentó características
viscosas y coagulables al alcohol, estas características son propias de los mucílagos,
52
los cuales en su mayoría están compuestos por unidades de glucosa, galactosa y
manosa. Smiderle et al. (2007) demostró la presencia de glucosa (50%) y manosa
(32%) en un extracto alcalino (KOH) de F. velutipes. El extracto alcalino (NaOH) del
presente estudio evidenció la presencia de glucosa y galactosa, manosa no fue
reconocida ya que el estándar no reveló. Respecto al peso molecular de los
polisacáridos presentes en las fracciones F1 y F2 de micelio y cuerpo fructífero, se
realizó una estimación de peso molecular a través de filtración por membrana. Los
porcentajes mayores obtenidos, fueron de muestra retenida (65 – 55%) cuya
membrana poseía un tamaño de poro de 10KD, esto indicaría que los pesos
moleculares de los polisacáridos que componen las muestras serian mayores o iguales
a 10 KD, Yin et al (2010) purificó un polisacárido en F. velutipes de peso molecular igual
27.3 KD que poseía unidades de glucosa, manosa y mucosa.
Referente a la identificación de proteínas unidas a los polisacáridos presentes en la
fracción F2 de micelio y cuerpo fructífero, las reacciones de identificación dieron
negativas para ambas muestras, pero el FTIR demostró la presencia de proteínas o
péptidos unidos a la muestra F2 de cuerpo fructífero, debido a la presencia de una
banda en la posición 3169,44 cm-1, característica del grupo funcional amina.
Terpenos
Los estudios sobre terpenos en F. velutipes son muy escasos, Hirai et al. (1998)
demostró la presencial de un monoterpentriol a partir del cuerpo fructífero de F.
velutipes. En el presente estudio se identificó la presencia de terpenos a través de TLC
revelada con MnCl2/ MeOH/ H2SO4 (Perotti, 2006), la formación de una mancha
53
morada o verde indicó la presencia de terpenos. Posteriormente se comprobó la posible
presencia de una molécula monoterpénica a partir de una cromatografía gas – masa.
El monoterpentriol descubierto por Hirai et al. (1998) posee la siguiente estructura
química:
Figura 21: Monoterpentriol (Hirai et al, 1998)
El peso molecular corresponde a 188 g/mol, en el presente estudio el ión molecular
más cercano a 188 fue de 183 g/mol, la diferencia de peso se puede deber a una
variación de algún radical debido a la cepa de F. velutipes utilizada o bien a las
condiciones de crecimiento. El carbono 8 de la molécula de monoterpentriol es el punto
más fácil de ruptura de molécula, por lo tanto deberían existir 2 fragmentos importantes
en el espectro de masas uno de 113 g/mol y otra de 75 g/mol. La fracción FA1 de
cuerpo fructífero, presentó una importante banda de 113 g/mol y otra de 70 g/mol con
54
un 100% de abundancia relativa, por lo tanto el ión masa de 183 g/mol podría
corresponder al monoterpentriol.
Proteínas
Las proteínas son el segundo constituyente más abundante en F. velutipes alcanzando
el 27,5% del peso seco (Ko et al, 2007). Respecto a los aminoácidos que componen
dichas proteínas, Smiderle et al. (2006) reportó que F. velutipes posee una gran
variedad de aminoácidos, entre los cuales se encuentran: glutamina, serina, glicina,
histidina, arginina, treonina, alanina, prolina, tirosina, valina, metionina, cisteina,
isoleucina, leucina, fenilalanina y lisina. Para reconocer la presencia de aminoácidos, en
el presente trabajo se realizaron las reacciones de identificación Biuret y Ninhidrina a la
fracción Proteica FF1, los resultados en ambas reacciones fueron positivos.
La identificación de aminoácidos mediante TLC demostró la presencia de: histidina,
tirosina y acido glutámico. La falta de aminoácidos control, no permitió determinar todos
los aminoácidos citados según bibliografía.
55
6. CONCLUSIÓN
De acuerdo a los resultados obtenidos en esta investigación y bajo las condiciones en
que se realizaron los experimentos se puede concluir lo siguiente:
Desde micelio y cuerpo fructífero de Flammulina velutipes se puede obtener un
complejo quitina – glucano, luego de tratamiento con solventes de diferente polaridad.
Desde micelio y cuerpo fructífero de Flammulina velutipes se puede obtener quitosano a
partir de tratamiento alcalino de quitina.
Mediante tratamiento alcalino leve (0.1 M) de micelio y cuerpo fructífero de Flammulina
velutipes se puede obtener un polisacárido con importante propiedad viscosante.
Desde micelio y cuerpo fructífero de Flammulina velutipes se puede obtener un
monoterpeno, mediante tratamiento con solventes apolares.
Desde micelio y cuerpo fructífero de Flammulina velutipes se pueden obtener péptidos.
De acuerdo a lo anterior se acepta la hipótesis planteada.
56
7. BIBLIOGRAFIA
• Alexopoulos, C., Mims, C. & Blackwell, M. (1996). Introductory Mycology. 4ª.
Ed. John Wiley & Sons, Inc. Estados Unidos de América; 880p.
• Baltodano, L. & Yaipen, J. (2006). Obtención, caracterización y diseño de una
forma farmacéutica semisólida (ungüento) a base de quitosano con efecto
cicatrizante. Tesis. Dpto. de Química básica aplicada. Facultad de Farmacia y
Bioquímica. Universidad Mayor de San Marcos.
http://www.cybertesis.edu.pe/sdx/sisbib/imprimer.xsp?id=sisbib.2006.yaipen_chj-
principal&partie=sisbib.2006.yaipen_chj|TH.back.1&base=documents. (pagina
revisada 01-2010).
• Braconnot, H. (1811). Sur la Nature des Champignons. Ann. Chi. Phys. 79: 265-
304.
• Brizuela, M., García, L., Pérez, L. & Mansur, M. (1998). Basidiomicetos: nueva
fuente de metabolitos secundarios. Rev. Iberoam. Micol., 15: 69-74.
• Bowman S. & Free S. (2006). The structure and synthesis of the fungal cell wall.
BioEssays, 28: 799-808.
• Cai, J., Yang, J., Du, Y., Fan, L., Qui, Y., Li, J. & Kennedy, J. (2006).
Enzymatic preparation of chitosan from the waste Aspergillu niger mycelium of
citric acid production plant. Carbohydrate Polymers, 64: 151–157.
• Chang, S. & Miles, P. (2004). Mushrooms: Cultivation, Nutritional Value,
Medicinal Effect and Environment Impact. 2nd ed. CRC press. 451p.
57
• Chatterjee, S., Adhya, M., Guha, A. & Chatterjee, B. (2005). Chitosan from
Mucor rouxii: production and physico-chemical characterization. Process
Biochemistry, 40: 395–400.
• Chassarya, P., Vincenta, T., Marcanob, J., Macaskiec, L. & Guibala, E.
(2005). Palladium and platinum recovery from bicomponent mixtures using
chitosan derivatives. Hydrometallurgy, 76: 131–147.
• Duncan, C., Pugh, N., Pasco, D. & Ross, S. (2002). Isolation of a
galactomannan that enhances macrophage activation from the edible fungus
Morchella esculenta. J. Agric.Food. Chem. 50(20): 5683-5.
• Gautier, S., Xhauflaire - Uhoda, E., Gonry, P. & Pierard, G. (2008). Chitin-
glucan, a natural cell scaffold for skin moisturization and rejuvenation.
Internacional Journal of Cosmetic Science, 30: 459-469.
• Gomez - Miranda, B., Guerrero, C. & Leal, J. (1984). Effect of culture age on
ceIl wall polysaccharides of Penicillium allahabadense. Experimental Mycology,
8: 298-303.
• Gomez - Miranda, B., Moya, A, & Leal, J. (1986). Hyphal polysaccharides as
potential phylogenetic markers for Eupenicillium species. Experimental Mycology,
10: 184-189.
• Gomez - Miranda, B., Prieto, A, & Leal, J. (1990). Chemical composition and
characterization of a galactomannoglucan from Gliocladium viride walt material.
FEMS Microbiology Letters, 70: 331-336.
58
• González, M. (2004). Evaluación espectroscópica de quitina y β−D- glucanos del
hongo comestible Lentinula edodes cultivado sobre madera de vid, manzano y
encino. Tesis de licenciatura en el Área de Tecnología de Alimentos de Origen
Animal, México. Resumen:http://www.ciad.mx/boletin/novdic04/evaluacion.pdf.
(Pagina revisada 01-2010)
• Guzmán, G. (2003). Los hongos de El Edén, Quintana Roo. Introducción a la
micobiota tropical de México. INECOL y CONABIO, Xalapa, Veracruz, México;
p7.
• Hawksworth, D. (1991). The fungal dimension of biodiversity: magnitude,
significance, and conservation. Mycol. Res. 95: 641 – 655.
• Hawksworth, D. (2001). The magnitude of fangal Diversity: the 1.5 million
species estimate revisited. Mycol. Res. 105: 1422 -1432.
• Heux, L., Brugnerotto, J., Desbrieres, J., Versali, M. & Rinaudo, M. (2000).
Solid State NMR for Determination of Degree of Acetylation of Chitin and
Chitosan. Biomacromolecules, 1: 746 -751.
• Hirai, Y., Ikeda, M., Murayama, T. & Ohata, T. (1998). Monoterpentriols from the
Fruiting Body of Flammulina velutipes. Biosci. Biotechnol. Biochem. 62 (7): 1364-
1368.
• Ikekawa, T., Ikeda, Y., Yoshioka, Y., Nakanishi, K., Yokoyama, A. &
Yamasaki, E. (1982). Studies on antitumor polysaccharides of Flammulina
velutipes (Curt. Ex Fr) Sing. II. The structure of EA3 and further purification of
EA5. J.Pharm. Dyn. 5: 576-581.
59
• Jiunn-Liang, K., Chyong-Ing, H., Rong-Hwa, L., Chuan-Liang, K. & Jung-
Yaw, L. (1995). A new fungal inmunomodulatory protein, FIP-fve isolated from
the edible mushroom, Flammulina velutipes and its complete amino acid
sequence. Eur. J. Biochem. 228: 244-249.
• Kawahara, M., Yui, T., Oka, K., Zugenmaier, P., Suzuki, S., Okuyama, K. &
Ogawa, K. (2003). Fourth 3D Structure of the Chitosan Molecule: Conformation
of Chitosan in Its Salts with Medical Organic Acids Having a Phenyl Group.
Biosci, Biotechnol, Biochem. 67 (7): 1545-1550.
• Klis, F., Boorsma, A. & De Groot, P. (2006). Cell wall construction in
Saccharomyces cerevisiae. Yeast, 23: 185–202.
• Ko, W., Liu, W., Tsang, Y., & Hsieh, C. (2007). Kinetics of winter mushrooms
(Flammulina velutipes) microstructure and quality changes during thermal
processing. Journal of Food Engineering, 81: 587–598.
• Leal, J., Moya, A., Gomez-Miranda, E., Ruperez, P., & Guerrero, C. (1984).
Differences in cell wall polysaccharides in some species of Penicillium.
En:Microbial cell wall synthesis and autolysis. (FEMS Symp. 27) Pp. 149-155.
C.Nombela (Ed.).
• Lehninger, A. (1985). Bioquímica. Barcelona (España): Ediciones Omega, 1117
p.
• Leifa, F., Pandey, A. & Soccol, C. (2001). Production of Flammulina velutipes
on coffee husk and coffee spent-ground. Braz. Arch. Biol. Technol. 44: 205-212.
60
• Mahadevan, P. & Tatum, E. (1965). Relationship of the major constituents of the
Neurospora crassa cell wall to wild type and colonial morphology. Journal of
Bacteriology, 90: 1073-1081.
• Mármol, Z., Gutiérrez, E., Páez, G., Ferrer, J. & Rincón, M. (2004).
Desacetilación termoalcalina de quitina de conchas de camarón. Multiciencias,. 4
(002): 11.
• Mc Murry, J. (2000). Química Orgánica. México: Editorial: Ed. Thomson
Editores, 5ta Edición, 1284 p.
• Moore, G. & Roberts, G. (1980). Determination of negree of N-acetylation of
chitosan. Int. J. Biol. Macromol. 2: 115-116.
• Mukumoto, T. & Yamaguchi, H. (1997). The chemical structure of a
mannofucogalactan from the fruit bodies of Flammulina velutipes (Fr.) Sing.
Carbohydr. Res. 59: 614-621.
• Ofenbeher-Miletic, I., Stanimirovic, D. & Stanimirovic, S. (1984). On
determination of chitin content in mushrooms. Qual Plant Plant Foods Hum Nutr.
34: 197-201.
• Otagiri, K., Ohkuma, T., Ikekawa, T. & Tanaka, S. (1983).Intensification of
antitumor-inmunity by protein-bound polysacchride EA6, derived from Flammulina
velutipes (Curt. Ex Fr) Sing. Combined with murine leukemia L1210 vaccine in
animal experiments. J. Pharm. Dyn. 6: 96-1104.
• Pang, X., Yao, W., Yang, X., Xie, C., Liu, D., Zhang, J. & Gao X. (2007).
Purification, characterization and biological activity on hepatocytes of a
61
polysaccharide from Flammulina velutipes mycelium. Carbohydrate Polymers, 70:
291–297.
• Perotti, L. (2006). Lipids. Biochemistry Laboratory. University de Genevè,
Section de Chimie. Suiza. 2 p. http://www.asso-
etud.unige.ch/aecb/rapports/2eme/biochimie/lipides_2006.pdf.
• Peniche, C. (2006). Estudios de Quitina y Quitosana. Tesis doctoral. Facultad de
Química. Universidad de la Habana. 89 p.
• Prieto, A. (1992). Polisacáridos de Talaromyces: Su Aplicación En
Quimiotaxonomía. Tesis Doctoral. Facultad de Ciencias biológicas. Universidad
Complutence de Madrid. 149 p.
• Rane, K. & Hoover, D. (1993). An evaluation of alkali and acid treatment for
chitosan extraction from fungi. Processing Biochemistry, 28: 115–118.
• Rathke, T. & Hodson, S. (1994). Review of chitin and chitosan as fiber and film
formers. Journal of Macromolecular Science-Reviews in Macromolecular
Chemistry, C34: 375.
• Ravi - Kumar, M. (2000). A Review of chitin and chitosan applications. Reactive
and Functional Polymers, 46: 1–27.
• Ruiz Herrera, J. (1967). Chemical components of the celí wall of Aspergillus
species. Archives of Biochemistry and Biophysics, 122: 118-125.
• Rupérez, P., Moya, A. & Leal, J. (1986). CeIl wall polysaccharides from
Talaromyces species. Archives of Microbiology, 146: 250-255.
• Rupérez, P. & Leal, J. (1986). Age-related changes in Penicillium erythromellis
cell wall. Transactions of the British Myco]ogical Society, 86: 279—285
62
• Sandford, P. (1989). Chitosan: commercial uses and potential applications. In:
Skjak-Braek, G., Anthonsen, T., Sandford, P. (Eds.), Chitin and Chitosan.
Elsevier, London, 51–69.
• Skoog, D., West, D., Holler, F. & Crouch, S. (2005). México. Fundamentos de
Química Analítica. Editorial Thomson. 8va Edición, 1172p.
• Smiderle, F., Carbonero, E., Mellinger, C., Sassaki, G., Gorin, P. & Lacomini,
M. (2006). Structural characterization of a polysaccharide and β- glucan isolated
from the edible mushroom Flammulina velutipes. Phytochemistry, 67: 2189 –
2196..
• Suntornsuk, W., Pochanavanich, P. & Suntornsuk, L. (2002). Fungal chitosan
production on food processing by-products. Process Bio- chemistry, 37: 727–729.
• Valenzuela, E. (1998). Guía de Campo para setas (Agaricales) de Isla Teja.
Valdivia. Universidad Austral de Chile. Chile. 50 p.
• Valenzuela, E. (2003). Hongos comestibles silvestres colectados en la X Región
de Chile. Boletín Micológico, 18: 1-14.
• Villanueva, J. (1966). Protoplasts of fungi. En: The fungi. G.C. Ainsworth y A.S.
Sussman (Ed.). New York: Academic Press. 2: 2-62
• Wessels, J. & Sietsma, J. (1981) Fungal cell walls: a survey. In W. Tanner, FA
Loewus, eds, Encyclopedia of Plant Physiology, New Series Springer, New
York, 13B: 352-394.
• Williams, D. (1997). Overview of (1,3)-beta-D-glucan immunobiology . Mediat.
Inflamm. 6: 247–250.
63
• Yin, H., Wang, Y., Wang, Y., Chen, T., Tang, H. & Wang, M. (2010). Purification,
characterization and immuno-modulating properties of polysaccharides isolated
from Flammulina velutipes mycelium. Am. J. Chin. Med. 38(1):191-204.
• Yoshioka, Y., Sano, T. & Ikekawa, T. (1973). Studies on Antitumor
polysaccharides of Flammulina velutipes (Curt. Ex Fr) Sing. I. Chem. Pharm. Bull.
21: 1772-1776.
• Zhou, K., Peng, J., Chang, N., Zhang, H., Gong, F. & Zhang, C. (2003).
Purification and Crystallization of Flammulin, a Basic Protein with Anti-tumor
Activities from Flammulina Velutipes. Chinese Chemical Letters, 14, (7): 713 –
716.
• Zonneveld, B. (1971). Biochemical analysis of the cell wall of Aspergillus
nidulans. Biochimica et Biophysica Acta, 249: 506-514.
64
8. ANEXOS
ANEXO 1: Preparación Reactivos.
Preparación reactivo de Molish.
10 g de α-naftol se disuelven en 100 mL de alcohol etílico (95%).
Preparación reactivo de Seliwanoff.
0.5 g de resorcinol se disuelven en 330 mL de HCl concentrado y se diluye con agua
destilada hasta 1 litro.
Preparación reactivo de Bial.
Se disuelven 3 g de orcinol en 1 litro de HCl concentrado y posteriormente se añade
FeCl3 al 1%.
Preparación reactivo de Fehling.
Sol A: 30 g de sulfato cúprico se aforan con 1 litro de agua destilada.
Sol B: Se prepara un litro de NaOH al 5% y se le agrega 150 g de tartrato de Sodio y
Potasio.
Preparación reactivo de Tollens.
Se añade 2 gotas de disolución de NaOH al 5% a 1 mL de disolución acuosa de AgNO3
al 5%. Se agita el tubo y se añade gota a gota con agitación NH4OH 2N hasta que se
consiga disolver el precipitado de AgOH que se había formado.
65
ANEXO 2: Preparación reveladores.
Revelador de Carbohidratos (Ftalato de Anilina).
2 gramos de acido ftálico se disuelven en 50 mL de agua saturada con butanol. Luego
se agrega 2 mL de anilina.
Revelador de Terpenos.
0.3 gramos de MnCl2 se disuelven en 75 mL de metanol. Luego se agrega 3 mL de
H2SO4 concentrado.
66
ANEXO 3: ESPECTROS INFRARROJO.
Figura 1. Espectro infrarrojo de la fracción PF2 de micelio.
Figura 1. Espectro infrarrojo de la fracción PF2 de micelio.
Figura 2. Espectro infrarrojo de la fracción PF2 de cuerpo fructífero.
67
Figura 3. Espectro infrarrojo de la fracción PF3 de micelio.
Figura 4. Espectro infrarrojo de la fracción PF3 de cuerpo fructífero.
68
Figura 5. Espectro infrarrojo de la fracción F2 de micelio.
+
Figura 6. Espectro Infrarrojo de la fracción F2 de cuerpo fructífero.