profesor patrocinante: histología de gónada y glándula
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Universidad Austral de Chile
Facultad de Ciencias
Instituto de Ciencias Marinas y Limnológicas
Escuela de Biología Marina
PROFESOR PATROCINANTE:
Dr. Jorge Navarro Azócar
Instituto de Ciencias Marinas y Limnológicas
Facultad de Ciencias
Histología de gónada y glándula digestiva durante la gametogénesis de
Ostrea chilensis, Philippi, 1845 (Bivalvia, Ostreidae), expuesta a la Toxina
Paralizante del Molusco (TPM)
Tesis de grado presentada como parte de
los requisitos para optar
al título de Biólogo Marino
Camila Tatiana Oyarzún Ruiz VALDIVIA-CHILE
2015
2
COMISIÓN EVALUADORA
Profesor Patrocinante:
Dr. Jorge Navarro Azócar
Instituto de Ciencias Marinas y Limnológicas
Facultad de Ciencias
Universidad Austral de Chile
Profesor Co-patrocinante:
Dr. Juan Roberto Jaramillo
Instituto de Ciencias Marinas & Limnológicas
Facultad de Ciencias
Universidad Austral de Chile
Profesor Informante:
Dr. Orlando Garrido
Instituto de Ciencias Marinas & Limnológicas
Facultad de Ciencias
Universidad Austral de Chile
3
A mis abuelos, mis ángeles en el cielo
A mis magnánimos ejemplos de esfuerzo y superación;
mis padres…por y para Mónica y Camilo.
4
Agradecimientos
5
ÍNDICE GENERAL
1. RESUMEN 08-09
1.1. Summary 10-11
2. INTRODUCCIÓN 12-23
2.1. Antecedentes de la Ostra Chilena 12-14
2.2. Floraciones Algales Nocivas 14-17
2.2.1. Antecedentes Alexandrium catenella 16-17
2.3. Sistema Inmune en moluscos filtradores 17-22
2.3.1. La Respuesta Inmune 19
2.3.2. Hemocitos, las células inmuno-competentes 19-20
2.3.2.1. Función Inmune de Hemocitos 20-22
2.4. HIPOTESIS 22
2.5. OBJETIVOS 23
3. MATERIALES Y MÉTODOS 24-35
3.1. Obtención de ejemplares adultos de Ostrea chilensis 24-25
3.2. Diseño experimental 25-30
3.2.1. Protocolos de histología en Ostrea chilensis 27-30
I. Protocolo 1. Disección y medición 27
II. Protocolo 2. Deshidratación / inclusión de las muestras 28-29
III. Protocolo 3. Proceso histológico 29-30
3.3. Determinación de las longitudes en los ejes corporales 31
3.4. Proporción sexual en Ostrea chilensis 31
3.5. Análisis microscópico y fotográfico 31
3.6. Análisis en Sigma Scan Pro 5.0 32-35
3.6.1. Análisis de datos 33-35
3.6.1.1. Área de cobertura folicular 33-34
3.6.1.2. Porcentaje de cobertura de folículos 34-35
4. RESULTADOS 36-67
4.1. Análisis de datos 36-41
4.1.1. Longitud de los ejes corporales 36
6
4.1.2. Análisis estadístico aplicado a Ejes corporales 37-39
4.1.3. Proporción sexual en reproductores de Ostrea chilensis 40-41
4.2. Histología 42-49
4.2.1. Análisis microscópico y fotográfico 43-49
4.2.1.1. Intestino 43
4.2.1.2. Estómago 44
4.2.1.3. Glándula digestiva 45
4.2.1.4. Tejido gonadal 46-49
4.2.1.5. Células de la hemolinfa 49
4.3. Respuestas comparativas para tratamientos CTRL-TXC 50-62
4.3.1. Glándula digestiva 50-60
4.3.1.1 Respuesta inmune innata en glándula digestiva 51-59
i. Perdida del epitelio interno estrellado en túbulos digestivos 51
ii. Infiltración de hemocitos (diapédesis) 52-54
iii. Respuesta inflamatoria en intestino 54
iv. Agregación de hemocitos 55
v. Desestabilización de los epitelios de la glándula digestiva 56
vi. Túbulos digestivos e intestino con presencia de células caliciformes 57-58
vii. Constricción del epitelio en túbulos digestivos 58-59
viii. Evidencia de células de Alexandrium catenella en el intestino 59-60
4.3.2. En el tejido gonadal 60-62
4.3.2.1 Respuesta inmune innata en tejido gonadal 61
i. Proceso de reabsorción en restos de folículos 61-62
4.4. Área de cobertura folicular 63
4.5. Análisis de imágenes en Sigma ScanPro 5.0 64-67
4.5.1. Análisis de los datos calculados en la Σ de área de folículos 64-65
4.5.2. Análisis del % de cobertura folicular 65-67
5. DISCUSIÓN y CONCLUSIONES 68-74
6. BIBLIOGRAFÍA 75-86
7
LISTA DE ABREVIATURA
TPM; Toxina Paralizante del Molusco
CTRL; Control
TXC; Contaminado/Tóxico
FAN; Floraciones Algales Nocivas
8
1. RESUMEN
El cierre de valvas se describe como la primera línea de defensa física en los
bivalvos marinos frente al contacto con las microalgas nocivas. En adición a esto, se
han desarrollado otros mecanismos de alimentación para reducir el consumo de las
microalgas toxica (e.j. producción de pseudoheces). La siguiente línea de defensa es el
sistema inmune (Cheng, 1996), el cual es atribuido a las células denominadas
hemocitos. Estas son responsables del reconocimiento, fagocitosis, y eliminación de
partículas externas no deseadas (Janeway, 1994; Franchini et al., 1995; Chu, 2000).
El objetivo de este estudio fue determinar los efectos de la exposición de la ostra
chilena (Ostrea chilensis) a una dieta conteniendo al dinoflagelado toxico Alexandrium
catenella, productor de la Toxina Paralizante del Molusco (TPM), durante un periodo de
90 días, el cual incluye el periodo gametogénico. Se utilizaron técnicas de histología y
de análisis fotográfico para poder identificar y exponer los posibles mecanismos y/o
respuestas frente a la presencia de la Toxina Paralizante del Molusco sobre los tejidos
de la glándula digestiva y en el tejido gonadal de los individuos reproductores de O.
chilensis.
Los análisis histológicos realizados al grupo de ostras expuestas a la dieta toxica
mostraron daños en los túbulos de la glándula digestiva, en el epitelio interno del
estómago e intestino. La respuesta inflamatoria en el intestino se observó con una
pérdida de los cilios en el epitelio interno del surco intestinal. También se presentó una
agregación de hemocitos en el tejido conectivo que rodea el epitelio externo de los
túbulos digestivos, a lo que se adiciona una pérdida de la conformación estrellada del
epitelio interno digestivo. Por otro lado, en muestras del grupo control se observa una
9
baja agregación de hemocitos en el tejido conectivo y una clara conformación estrellada
del epitelio interno de los túbulos digestivos, la cual indica un activo proceso de
alimentación.
En el tejido gonadal, las ostras alimentadas con A. catenella presentaron procesos
de reabsorción de restos de gametos distribuidos en el lumen de los folículos, siendo
los ovocitos y los espermatozoides fagocitados por los hemocitos. Por otro lado se
observa una mayor proporción de folículos del tipo masculino durante todo el periodo
experimental.
El análisis entre tratamientos y la presencia de células de Alexandrium catenella en
el tracto digestivo, permite confirmar que Ostrea chilensis tiene la capacidad de ingerir
las células toxicas. El presente trabajo contribuye a entender a nivel histofisiológico los
mecanismos defensivos empleados por el bivalvo Ostrea chilensis para contrarrestar o
reducir la exposición a la Toxina Paralizante del Molusco.
10
1.1. SUMMARY
The valves closure is described as the first line of physical defence of marine
bivalve against the contact to the harmful algae. In addition, other feeding behaviors
have been developed by bivalves to minimize the consumption of the harmful algae (i.e.
pseudofaeces production). Next line of defense is the immune system (Cheng, 1996),
which is mainly attributed to cells called hemocytes. These are responsible for
recognition, phagocytosis and oxidative removal of foreign particles (Janeway, 1994;
Franchini et al, 1995; Chu, 2000).
This study aims to look the implications in Ostrea chilensis to the exposure to a
diet containing the toxic dinoflagellate Alexandrium catenella, a paralytic shellfish
poisoning (PSP) producer, for 90 days, which includes the period of gametogenesis. For
this purpose, histological techniques and analysis at the microscopic and photographic
level was used, with this was possible identify the effects on gonadal tissue and
digestive gland of breeding stock.
Histologycal analyses for the group of oysters exposed to toxic diet showed
damage in to the digestive gland. The inflammatory response in the intestine was
observed with a loss of cilia on the internal groove epithelium. Also, hemocytes
aggregation in the connective tissue surrounding the outer epithelium of digestive
tubules presented, with an addition of loss a starry internal conformation of the digestive
epithelium. On the other hand, in samples from the control group a low hemocyte
aggregation in connective tissue and a clear starry conformation of the internal digestive
tubule epithelium is observed, which indicates an active feeding process.
11
In the gonadal tissue, oysters feeded with A. catenella presented reabsorption
processes of gametes remains distributed in the lumen follicles, being oocytes and
sperm phagocytosed by hemocytes. Furthermore, a greater proportion of male follicles
were observed a long of the experimental period.
Analysis between treatments and the presence of Alexandrium catenella cells in the
digestive tract of O. chilensis confirms that has the ability to ingest the toxic cells. This
work contributes to understand to histo-physiological level the defensive mechanisms
employed by Ostrea chilensis to offset or reduce the exposure to the paralytic shellfish
poisoning (PSP).
12
2. INTRODUCCION
2.1. Antecedentes de la Ostra Chilena (Ostrea chilensis)
El Phylum Mollusca es uno de los más grandes y variado del reino animal.
Dentro de este se encuentra el grupo de los bivalvos, con alrededor de 7.500 especies,
siendo la segunda clase más diversa de los moluscos después de los gastrópodos.
Muchos de ellos son fuente importante de alimento dentro de las tramas tróficas y
también para la población humana, siendo cultivados y por tanto con una gran
importancia comercial. Las ostras del género Ostrea son de gran interés debido a su
alto valor comercial a lo largo de todo el mundo (Polanco y Corral, 2002).
La ostra chilena (Ostrea chilensis) carece de una fase larval pelágica extendida,
por lo cual su distribución se limita a dos poblaciones; una en Nueva Zelanda y otra en
Chile (Fig. 1), las que se encuentran separadas por una gran extensión de océano
(>7000 kilómetros). Se distribuye en aguas cercanas a la costa de Nueva Zelanda
(incluyendo las Islas Chatham), hasta profundidades de 550 metros y también se
encuentra en la zona submareal poco profunda del sur de Chile (Foighil et al., 1999). En
Chile esta especie tiene un rango de distribución que está limitado a la isla de Chiloé y
al sur de las islas Guaitecas (Winter et al., 1983).
La especie Ostrea chilensis presenta hermafroditismo protándrico, siendo
primeramente macho para luego alternar a hembra. Generalmente durante los primeros
dos años se comporta como macho. Solis (1967) indica que la coloración del tejido
gonadal macho se presenta blanquizco, con textura lisa o con finas granulaciones. La
madurez reproductiva se alcanzaría a una talla aproximada de 25 mm (Gleisner, 1981),
luego de esto, aparentemente la influencia de la temperatura de la columna de agua y
13
otros factores ambientales determinan la alternancia de sexo y el posterior inicio de la
ovogénesis para alternar a estadio hembra, este proceso se iniciaría de forma paralela,
el cual culminaría cuando los individuos alcanzan la talla de 37 mm de longitud de
valva, siendo la totalidad de los folículos hembra.
En la mayoría de los bivalvos, la madurez sexual depende del tamaño del
individuo más que de su edad, y el tamaño al que alcanzan la madurez sexual varía de
una especie a otra y según la distribución geográfica. En lo indicado por Chaparro y
Toro (1989) el tamaño en longitud de Ostrea chilensis se presentaría como un factor de
importancia, aún más importante que la edad, en relación a que los individuos
presenten alternancia de sexos y finalmente maduración sexual como hembra.
Fig. 1. Vista Polar del Pacífico Sur que muestra la distribución de Ostrea chilensis.
(Foighil et al., 1999, Carriker y Gaffney, 1996). Las flechas muestran los patrones
predominantes de la circulación superficial.
14
Gleisner (1981) señala que para el primer año la energía absorbida es utilizada
para el crecimiento y el desarrollo de los diversos procesos metabólicos, mientras que
hacia el segundo año de vida gran parte de la energía absorbida se destina para el
proceso de maduración gonadal. Por lo cual, bajo condiciones adversas, la disposición
de alimento tanto en cantidad como en calidad de lo ingerido juega un papel importante
para poder realizar normalmente los diferentes procesos fisiológicos y de desarrollo.
Debido a que la madurez sexual en O. chilensis es un evento complejo, ya que en ella
influyen muchos factores tales como: temperatura, salinidad y especialmente la
disponibilidad de alimento, es importante conocer los efectos de una dieta conteniendo
la toxina paralizante de molusco; toxina producida por el dinoflagelado Alexandrium
catenella, sobre el desarrollo gonadal de la especie.
2.2. Floraciones Algales Nocivas (FAN´ s)
En respuesta a cambios favorables en el medio ambiente, ciertas especies de
microalgas pueden presentar un rápido aumento poblacional, en donde su número
puede alcanzar millones de células por litro, llegando a formar parches visibles en la
superficie del mar (Cosper et al., 1987). Entre las especies que componen el gran
número de microorganismos fitoplanctónicos existe un grupo que puede ser tóxico. La
terminología Floraciones Algales Nocivas (FAN), fue asignada por la Comisión
oceanográfica intergubernamental de la UNESCO (COI-UNESCO) para agrupar a este
diverso grupo de microorganismos planctónicos, también denominados comúnmente
“marea roja” (Black, 2001; Masó, 2003; Backer et al., 2004).
15
Alrededor de 300 (7%) de las aproximadamente 3.400 - 4.100 especies de
fitoplancton se han descrito como causantes de mareas rojas, incluyendo diatomeas,
dinoflagelados, silicoflagelados, primnesiofíceas y raphidophytes (Sournia, 1995). Entre
60-80 especies (2%) de los 300 taxones son perjudiciales o tóxicas como resultado de
la producción de biotoxinas, generando daño físico, anoxia, reducción de la irradiación,
inadecuación nutricional, etc. (Anderson, 1989). Estas microalgas están clasificadas
bajo criterios que reflejan sus efectos y sintomatologías sobre los humanos; de esta
forma se ha descrito la toxina paralizante de molusco (TPM), veneno neurotóxico
(VNM), el veneno amnésico (VAM) y veneno diarreico (VDM) (Odebrecht et al., 2002;
Mafra et al., 2006).
Dentro de la macrofauna bentónica encontramos a los moluscos bivalvos, los
cuales juegan un papel importante en relación con los eventos de mareas rojas.
Pueden pasar a ser organismos vectores, pues por medio de su actividad de filtración
ingieren el fitoplancton toxico, que puede tener graves implicancias para el consumo por
parte de la población humana, debido a que potencian el efecto de las toxinas por su
condición de acumuladores.
Por otro lado, estas floraciones de microalgas tóxicas también pueden llegar a
provocar enfermedades y la muerte en peces, aves marinas, mamíferos marinos y otras
formas de vida oceánica (Anderson, 1994). Las floraciones de algas nocivas (FAN)
tienen profundos efectos sobre la ecología de las aguas costeras (Burkholder, 1998) y
sobre los aspectos económicos de la pesca y la acuicultura (Shumway, 1990; Anderson
et al., 2000).
16
También se han descrito floraciones de algas nocivas (FAN`s) no tóxicas que
pueden causar daños a los ecosistemas, los recursos pesqueros y las instalaciones
recreativas, a menudo debido a la gran biomasa acumulada.
2.2.1. Antecedentes del dinoflagelado tóxico Alexandrium catenella,
productor de la Toxina Paralizante de Molusco (TPM)
La TPM es también conocida como “Saxitoxínas”, con 57 análogos hasta ahora
identificados (GTX1, GTX4, neoSTX, entre otros), de los cuales 38 son producidas por
dinoflagelados (Rossini y Hess, 2010).
Dentro de las microalgas toxicas, el género Alexandrium se ha descrito como
productor de la Toxina Paralizante de Molusco (TPM), junto a otros géneros de
dinoflagelados como; Gymnodinium y Pyrodinium (Cembella et al., 1988).
La exposición de organismos filtradores a Alexandrium catenella
(Whedon yKofoid, 1936) Balech, 1985, es conocida por tener un impacto negativo,
afectando la actividad de filtración e ingestión de bivalvos (Bardouil et al., 1993; Wildish
et al., 1998; Lassus et al., 1999; Li et al., 2001; Navarro et al., 2008, 2014). El modo de
acción de TPM involucra un reversible y altamente especifico bloqueo del transporte de
iones por el canal sodio y por lo tanto del potencial de acción en las membranas
excitable (nunca en las fibras musculares) (Narahashi, 1988; Bricelj y Shumway, 1998).
En Chile se presentan tres grupos capaces de sintetizar estas biotoxinas que
pueden ser nocivas para la salud de la población humana, estas se agrupan como;
toxina paralizante de molusco (TPM), veneno diarreico de marisco (VDM); dos grupos
que han sido descritos como los más perjudiciales para la economía y salud en distintas
17
regiones del país. Como tercer grupo se encuentra el veneno amnésico de los mariscos
(VAM).
El primer registro de la existencia de la toxina paralizante de molusco (TPM) en
Chile ocurrió en 1972, en Magallanes (XII Región). Posteriormente se presentaron
nuevos episodios tóxicos en 1981, 1989 y 1991 (Guzmán et al., 2002). En 1994 se
detectó por primera vez en la XI Región y en 1998 fue reportado en dos localidades de
la X Región. En el año 2002, se registraron floraciones de Alexandrium catenella en la
zona norte de la XI región (Molinet et al., 2003), alcanzando la zona de Dalcahue, en la
Isla de Chiloé (X Región), en donde se ubica el área de mayor desarrollo de los cultivos
de los mitílidos.
Tabla. I. Distribución geográfica de las toxinas marinas presentes en Chile (Seguel, 2008).
2.3. Sistema Inmune en moluscos filtradores y su acción en presencia de la TPM
El término “inmunidad” tiene su raíz del latín inmunitas que tiene como
significado eximir, esta exención era otorgada como un privilegio y protección legal para
personajes de connotación política en la antigua Roma. Posteriormente la aplicabilidad
de este término fue acuñado para el área de la biología, para denotar protección contra
18
enfermedades infecciosas, en respuesta o reacción frente a sustancias, partículas
externas como microorganismos, macromoléculas vivas o inertes que podrían
presentarse como perjudiciales para la viabilidad del organismo.
Dentro de los ecosistemas marinos las microalgas toxicas al obtener las
condiciones adecuadas para crecer, pueden dividirse muy rápidamente y
potencialmente, crear un bloom o florecimiento algal nocivo (FAN´s). Estas
interacciones ocasionales dentro de las tramas tróficas entre las microalgas nocivas y
moluscos filtradores (ej. Ostras, Almejas, Pectínidos, Mitílidos) sugieren no solo la
posibilidad de una intensa exposición a las toxinas, sino también que los moluscos
puedan desarrollar mecanismos de tolerancia para hacer frente a las FAN´s
recurrentes, de lo contrario podrían enfrentarse a la extinción local (Bricelj et al., 2005).
Los organismo filtradores han tenido que aclimatarse a las apariciones
ocasionales de microalgas toxicas que pueden causar daños en los tejidos blandos o
impacto en sus funciones metabólicas. Estudios como los de Bardouil et al. (1993) y
Bricelj et al. (2005), han descrito procesos de adaptación, en donde se observa una
modificación en las conductas alimentarias y respiratorias para así minimizar el contacto
entre las células toxicas y los tejidos, mediante la reducción de las tasas de ingestión,
producción de pseudoheces o por la no digestión de las células ingeridas (Bricelj et al.,
1990; Bardouil et al., 1996). Un estudio realizado por Hégaret et al. (2007 a) demuestra
que los moluscos bivalvos expuestos a microalgas toxicas generalmente producen
depósitos fecales que incluyen células intactas de microalgas toxicas, como; A.
fundyense, H. akashiwo, y P. mínimum.
19
2.3.1. La Respuesta Inmune
Inmunidad innata en Ostrea
Las ostras, al igual que otros invertebrados marinos, se limitan a una respuesta
inmune innata (Janeway, 1994). Esta puede ser identificada de manera temprana, la
cual se acciona a las horas del contacto con la toxina, parasito, patógeno, etc., o
eventualmente puede ocurrir con una respuesta tardía, la cual podría ser medida en
días de exposición. La respuesta temprana constituye la inmunidad innata o natural, la
cual se constituye como la primera línea de defensa del hospedador contra un agente
patógeno (Medzhitov, 1997). El sistema inmune innato es descrito como el mecanismo
que actúa solo al instante de la exposición, no teniendo la facultad de mantener esta
inmunidad en el tiempo, por lo tanto este no podría proteger mejor al individuo de las
exposiciones posteriores (Wikfors y Smolowitz, 1993, 1995). Por lo tanto, la carencia de
especificidad en el reconocimiento, hace que la respuesta sea exactamente igual cada
vez que ocurre el contacto con un agente nocivo o con una partícula no propia. Las
barreras físico-químicas, las proteínas presentes en el suero y las células con actividad
fagocítica forman el conjunto de componentes de la inmunidad innata (Medzhitov y
Janeway, 1997).
2.3.2 Hemocitos, las células inmunocompetentes
Cheng (1996), describió que además del cierre de valvas y la alteración en la
conducta de alimentación, los bivalvos pueden minimizar el contacto con las algas
toxicas a través de mecanismos de defensa interna. Este proceso se atribuye
20
principalmente a las células llamadas “hemocitos”, que son similares a los leucocitos de
la sangre que circula en los vertebrados.
La función de los hemocitos es descrita con una amplia funcionalidad dentro de
los procesos fisiológicos (e.j. digestión, excreción, transporte, defensa, procesos de
reparación) (Cheng, 1981, 1984; Mount et al., 2004). Cheng (1981, 1984) clasificó los
hemocitos en dos grupos de células; aquellas que contienen gránulos citoplasmáticos o
“granulocitos o hemocitos granulares” y aquellos hemocitos con poco o casi nada de
granulaciones, denominados “hialinocitos”.
La respuesta inmune (Janeway, 1994), es realizada principalmente por
granulocitos para el caso de las Ostras (Foley y Cheng, 1975). Estos hemocitos pueden
fagocitar tanto microalgas toxicas, bacterias, levaduras y otras células (Canesi et al.,
2002), siendo la primera etapa de la fagocitosis el acoplamiento del fagocito a la
partícula objetivo (Janeway, 1994; Franchini et al., 1995; Chu, 2000).
2.3.2.1. Función Inmune de Hemocitos
a. Respuesta inflamatoria: Se observa la aglomeración o el reclutamiento de
hemocitos hacia el lugar afectado, aquí también se hacen presente proteínas
plasmáticas sintetizadas por el estímulo patógeno, las cuales se liberan a la hemolinfa
para ejercer su función (Abbas y Lichtman, 2000). Este proceso puede terminar con la
destrucción del tejido dañado, el aislamiento del organismo invasor o la completa
reparación del tejido (Feng, 1988).
b. Fagocitosis: El término fagocitosis corresponde al mecanismo por el cual los
hemocitos granulocitos poseen la capacidad de adhesión, ingestión, destrucción y
21
eliminación partículas exógenas y restos celulares, para luego dar lugar a la
reconstrucción del tejido epitelial (Ratcliffe et al., 1985; Fisher, 1986; Sparks y Morado,
1988). En este proceso las proteínas plasmáticas son intermediarias para la adhesión
de los granulocitos, la proteína aglutina y activa la unión de estos a la partícula
exógena, los hemocitos emiten pseudópodos englobando y atrapando a los
microorganismos (Ratcliffe et al., 1985). Durante la acción de destrucción y previo a la
eliminación de los restos del patógeno se forman gránulos de glucógeno los cuales
pueden pasar a ser destinados para los procesos metabólicos del hemocito o pasan a
formar parte de la hemolinfa (Fisher, 1986).
c. Agregación: Esta función se encuentra asociada al proceso de fagocitosis, en
donde ocurre una aglomeración de hemocitos ya sea en el tejido conectivo como en el
tejido epitelial en donde el elevado número de agentes extraños no son eliminados pues
supera la actividad de fagocitosis (Ratcliffe et al., 1985).
d. Encapsulación: Este mecanismo se activa cuando un agente exógeno es
capaz de superar las barreras de fagocitosis y agregación, este es descrito por Batista
et al. (2009) para invertebrados, en donde esta reacción inmuno-defensiva actúa sobre
cuerpos externos de mayor tamaño, los cuales son muy grandes para ser fagocitados.
Por lo general, en estos casos, una masiva aglomeración de hemocitos encapsula la
partícula externa (e.j., parasito multicelular) (Fisher, 1986; Feng, 1988).
e. Liberación de radicales de oxígeno y nitrógeno: En los procesos de fagocitosis
se produce una elevada producción de radicales de oxígeno y nitrógeno, los cuales a
través de la oxidación de estas moléculas dan lugar a proteínas que se presentan como
activadores de enzimas que controla la función de otras proteínas, radicales que
22
presentan una potente actividad bactericida, radicales nitrógeno con un elevado poder
oxidante así como una gran actividad citotóxica (Rosen et al., 1995), contra bacterias
parásitos y hongos. La liberación de estos radicales tóxicos produce un daño en las
membranas celulares, en las proteínas y acido nucleicos de los dinoflagelados (Burson
et al., 2014).
El presente estudio tiene como objetivo conocer los efectos y/o respuestas en la
exposición de Ostrea chilensis a una dieta conteniendo al dinoflagelado tóxico
Alexandrium catenella, productor de la Toxina Paralizante del Molusco (TPM), durante
un periodo de 90 días, que incluye la etapa de gametogénesis de este bivalvo. Para
este propósito se utilizaron técnicas histológicas y un análisis microscópico y
fotográfico, con lo que se identificaran los efectos y/o respuestas en los tejidos de la
glándula digestiva y en el tejido gonadal de ejemplares reproductores, además de los
posibles mecanismos defensivos que esta especie podría estar utilizando para
contrarrestar los efectos de esta dieta contaminada.
2.4. Sobre la base de los antecedentes mencionados se platean las
siguientes Hipótesis:
1. Ejemplares de O. chilensis expuestos a la toxina paralizante de molusco
(TPM), presentan efectos negativos sobre el proceso de gametogénesis, lo que
afectaría el posterior desove de gametos.
2. La exposición de O. chilensis a dietas conteniendo TPM produce
alteraciones sobre los tejidos digestivos, activando el mecanismo defensivo a cargo de
las células inmuno-competentes (hemocitos).
23
2.5. OBJETIVOS
2.5.1. General
Determinar los efectos de la dieta contaminada conteniendo A. catenella: (70%) +
I. galbana (30%), sobre el desarrollo gonadal y los tejidos de la glándula digestiva en
individuos adultos de Ostrea chilensis.
2.5.2. Objetivos específicos
1. Identificar posibles alteraciones o respuestas en los tejidos digestivos y
reproductivos por efecto de la dieta conteniendo al dinoflagelado toxico.
2. Identificar la actividad inmunológica de O. chilensis para contrarrestar los
efectos de la toxina.
3. Ilustrar la presencia de hemocitos en actividad inmune-innata sobre diferentes
tejidos de ejemplares de O. chilensis expuestos a TPM; como folículos en desarrollo,
tejido conectivo y glándula digestiva; correspondiente a túbulos digestivos, intestino y
estómago.
24
3. MATERIAL Y MÉTODOS
3.1. Obtención de ejemplares adultos de Ostrea chilensis
Los ejemplares experimentales de O. chilensis (adultos reproductores) fueron
colectados en el Estuario del rio Quempillén (41° 52’ S; 73°46’ W), Ancud, Chiloé,
previo al inicio de la gametogénesis, durante el mes de junio del 2013. En este estuario
el valor promedio anual de temperatura es de 13ºC con una fluctuación de 8º a 22ºC, el
rango de salinidad durante el año fluctúa de 14 a 30 UPS con un promedio de 24 UPS
(Toro et al., 1991). Los ejemplares colectados fueron trasladados al laboratorio de
Ecofisiología energética del instituto de Ciencias Marinas y Limnológicas, donde fueron
mantenido bajo condiciones controladas, hasta el inicio del estudio.
Fig. 2. Mapa ubicación Estuario del rio
Quempillén (41° 52’ S; 73°46’ W), Ancud,
Chiloé (Izquierda); Fotografía Estuario
(Derecha)
25
Los ejemplares experimentales fueron aclimatados en bateas por un periodo
de15 días, donde se mantuvieron a temperatura de 14ºC, con una salinidad de 30 UPS
y con un adicionamiento de dieta no toxica (Isochrysis galbana) con dos pulsos diarios,
mediante una bomba peristáltica. Las ostras fueron divididas en 10 acuarios, 5 de
estos correspondieron al grupo control y los otros 5 al grupo contaminado (5 réplicas
por tratamiento), cada uno comenzó con 10 individuos. La longitud de las ostras
experimentales fluctuó entre 45 y 50 mm. Se realizaron muestreos cada 15 días (días 0,
15, 30, 45, 60, 75 y 90), con 5 réplicas por grupo experimental (1 individuo por acuario).
3. 2. Diseño experimental
1.- Grupo control (CTRL): La estructura experimental desarrollada para los individuos
pertenecientes al grupo control (Fig. 3); estuvo compuesta por el cultivo de Isochrysis
galbana, el que se realizó en botellas de 5 L (Fig. 3 A). Posteriormente se llevó a cabo
un recuento de células para preparar la dieta control, utilizando un contador de
partículas Beckman Coulter-Z2, provisto con un tubo de recuento de 100 µm de
apertura. La dieta entregada (Fig. 3 B) a las ostras de cada grupo experimental
correspondió al 1% diario del peso seco de carne desde el día 0 a 30 y de 1.5%, desde
el día 31 al 90. Esta dieta era entregada mediante el sistema de goteo proporcionado
por una bomba peristáltica Masterflex L/S modelo 7519-05 (Fig. 3 C). Los 5 acuarios se
mantuvieron a temperatura de 14 °C, controlado por equipo Chiller marca Sunsun HYH
(Fig. 3 D).
26
Fig. 3. Estructura experimental para individuos pertenecientes al grupo control.
2.- Grupo contaminado (TXC): Se utilizó un cultivo de Alexandrium catenella, el que se
realizó en botellas de 5 L (Fig. 4 A) y se llevó a cabo un recuento de células por medio
del método de Utermohl para preparar la dieta contaminada. Esta dieta estuvo
compuesta por 30% Isochrysis galbana y 70% Alexandrium catenella (Fig. 4 B) y fue
suministrada por medio de una bomba peristáltica Masterflex L/S modelo 7519-05 (Fig.
4 C). Ambos cultivos fueron utilizados en su fase de crecimiento exponencial. Los 5
acuarios se mantuvieron a temperatura de 14 °C, controlado por equipo Chiller marca
Sunsun HYH (Fig. 4 D).
Fig. 4. Estructura experimental para individuos pertenecientes al grupo contaminado.
27
3.2.1. Protocolos de muestreo y tratamiento para histología gonadal y de glándula
digestiva
Protocolo N°1
Tabla II. Disección y medición
Día muestreo Número de individuos muestreados
Día 0 5 Ejemplares CTRL, 5 ejemplares TXC
Día 15 5 Ejemplares CTRL, 5 ejemplares TXC
Día 30 5 Ejemplares CTRL, 5 ejemplares TXC
Día 45 5 Ejemplares CTRL, 5 ejemplares TXC
Día 60 5 Ejemplares CTRL, 5 ejemplares TXC
Día 75 5 Ejemplares CTRL, 5 ejemplares TXC
Día 90 3 Ejemplares CTRL, 3 ejemplares TXC (*)
(*)Reducción del número de réplicas en grupo contaminado, debido a la alta mortalidad
para el periodo comprendido entre días 75 a 90. Se trabaja con el mismo número de réplicas
para individuos del grupo Control.
En cada muestreo los ejemplares de ambos tratamientos fueron medidos en
longitud de valvar y longitud antero-posterior/dorso-ventral de masa visceral fresca.
Posteriormente las muestras fueron fijadas en formalina al 5% por 7 días y una post-
fijación al 7% por 3 días.
28
Cumplido el tiempo de fijación, las muestras fueron disectadas en 3 segmentos
(anterior; medio; posterior), con el fin de lograr abarcar el trozo medio de la glándula
digestiva.
Protocolo N°2:
Tabla III. Deshidratación de las muestras fijadas.
Batería de Alcoholes Tiempo
Etanol 50° Las muestras fueron mantenidas en
Etanol 50°, con recambios hasta notar
el alcohol casi transparente.
Etanol 70º 48 h
Etanol 80º 24 h
Etanol 90º 12 h
Etanol 96º 30 min
Etanol 100º 30 min
Etanol 100º 30 min
Etanol 100º + Butanol (1:1) 15 min
Tabla IV. Inclusión de las muestras
Compuesto Tiempo
Butanol 10 min
Butanol + Paraplast 15 min (50º-56°C)
29
Paraplast I 1h(50º-56°C)
Paraplast II 30 min(50º-56°C)
Paraplast III 30 min(50º-56°C)
Inclusión en Paraplast Fin proceso(50º-56°C)
(*) 50 °C y 56°C – Ebullición parafina
Protocolo N°3 Histología
Tabla V. Proceso histológico
Proceso Descripción
Tallado
Separación del bloque para la obtención del
trozo medio de la muestra incluida en
paraplast. El tallado tiene como fin eliminar
el exceso de parafina que rodea a la pieza
incluida.
Corte en micrótomo
Una vez colocados en el brazo del
micrótomo, se orienta la pieza, de tal manera
que el filo de la hoja de cuchillo esté paralelo
a la superficie del bloque. Se selecciona el
espesor del corte (7 μm), para realizar cortes
y obtención de secciones.
Montaje Estirado de las secciones sobre portaobjeto
y confección de las preparaciones.
Secado En estufa a 40°C durante 24 horas
Tinción Hematoxilina/Eosina 1.- Desparafinado en Xilol (I,II,III,IV)
30 min en I y II; 15min en III y IV.
30
2.- Hidratación (Batería de Etanol 100º, 96º,
80º, 70º) 5min c/u
3.- Lavado en agua corriente por 5 min
4.- Tinción en Hematoxilina por 15 min
5.- Lavado en agua corriente por 20 min
6.-Tinción en Eosina por 10 min
7.- Lavado rápido en agua corriente
8.- Lavado rápido en Etanol 80º, 96º, y 96º
(relavado)
9.- Lavado en Etanol 100º y 100º (relavado)
por 5 min. Dejar estilar al finalizar el tiempo.
Transparencia:
10.- En Xilol fenicado (I y II) por 5 min c/u.
Dejando estilar al finalizar el tiempo.
11.- Traspaso a xilol puro por 5 min
Montaje Cubre-objeto en
Permount
En un cubre-objeto se unta una gota de
Permount y se monta sobre este la muestra
ya teñida, se extiende por todo el portaobjeto
de manera que se eviten la formación de
burbujas de aire.
Obtención de cortes histológicos Ya finalizado el proceso de histología, los
cortes se observan bajo microscopio óptico.
31
3.3. Determinación de las longitudes en los ejes corporales
Anterior/Posterior y Dorsal/Ventral.
Los ejes corporales dorsal/ventral (D/V) y anterior/posterior (A/P) en individuos
de O. chilensis fueron analizados separadamente mediante el Análisis de Varianza
(ANOVA) de dos vías, con el software Statistica 7. El análisis se realizó con los factores
dieta (control-contaminado) y tiempo de exposición (15 a 90 días). Los supuestos de
normalidad y homogeneidad de varianza fueron puestos a prueba por medio de los
análisis de kolmogorov-smirnov y Levene, respectivamente.
3.4. Proporción sexual en Ostrea chilensis
La determinación de la proporción sexual, según el estado de la gametogénesis,
de Ostrea chilensis, fue estimada visualmente y se calculó la proporción sexual para el
total de las muestras por tratamiento (Total de 56 réplicas). La metodología se basa en
la observación microscópica de los cortes utilizando los criterios previamente descritos
para bivalvos (Solis, 1967; Gleisner, 1981). También se calculó el porcentaje del tipo de
gametos para la totalidad del periodo experimental.
3.5. Análisis microscópico y fotográfico
Las secciones histológicas de tejido gonadal y de la glándula digestiva fueron
observadas mediante microscopio óptico “Zeiss” modelo “Axio Lab.A.1”, provisto con
cámara réflex “Nikon D 90”, con la cual fue posible capturar imágenes de las diferentes
secciones, a diferentes magnitudes de aumento microscópico; 50x, 100x, y 400x,
obteniéndose aproximaciones más precisas de los diferentes tejidos de interés. Con las
32
fotografías obtenidas de las secciones en estudio, se procedió a perfeccionar los
diferentes parámetros fotográficos a través del programa Adobe Photoshop CS6, con el
cual se logró enfocar, definir, contrastar, nivelar colores, entre otros retoques, con lo
que se pudo obtener fotografías de mejor calidad y mayor definición.
3.6. Análisis en Sigma ScanPro
Con el software de análisis de imágenes Sigma ScanPro 5.0, se determinó la
cobertura y área de los folículos en relación a la ocupación total en la masa visceral.
Para la medición del área correspondiente a folículos y masa visceral; se calibró el
programa estableciéndose un trazo lineal en las aristas del cuadrado, siendo esta una
medida métrica previamente conocida (0.1 mm), con el trazado, el software indica el
número de pixeles que es correspondiente al trazado lineal.
Con esta calibración se procede a determinar el área de un cuadrado de valores
conocidos (Fig. 5 área delimitada en color rojo) y ello permitirá determinar las áreas
correspondientes a la cobertura de folículos para los diferentes días de exposición y con
esto finalmente determinar el porcentaje de ocupación de estos.
Conocida el área de cada folículo se realiza la sumatoria total de estos para así
determinar el área de la cobertura folicular por tratamiento (control y contaminado), y
como ésta podría variar según el tiempo de exposición a la Toxina Paralizante del
Molusco. El porcentaje de ocupación de tejido gonadal, se calculó por tratamientos y en
la relación con la masa visceral (glándula digestiva). Para esto se calcula el área total
de la masa visceral que corresponde al 100% (color verde en Fig. 6) y así se obtuvo la
cobertura gonadal.
33
Fig. 5. Determinación del área total de folículos (rojo) en relación a su disposición en la
masa visceral.
Fig. 6 Ilustración de ocupación de la masa visceral total de O. chilensis (verde).
3.6.1. Análisis de datos
3.6.1.1. Área de cobertura folicular
Los datos obtenidos de las mediciones realizadas, con Sigma ScanPro 5.0, para
el total de réplicas por tratamiento fueron analizadas por separado con el software
estadístico Statistica 7. Para cada tratamiento se aplicó el Análisis de Varianza
(ANOVA) de dos vías, evaluándose los factores tiempo de exposición (15 a 90 días) y
dieta (control-contaminado), siendo la variable dependiente la Σ-Áreas (mm2) de los
34
folículos (Fig. 5). Los supuestos de normalidad y homogeneidad de varianza fueron
puestos a prueba por medio de los análisis de kolmogorov-smirnov & Lilliefors y
Levene´s, respectivamente.
Se buscó observar la variabilidad en el tamaño de los folículos en relación a los días de
exposición según el tipo de dieta entregada.
3.6.1.2. Porcentaje de cobertura de folículos en relación a su disposición en la
masa visceral
Con los datos de Σ-Áreas de folículos (mm2), y conociendo el área (mm2) de la
masa visceral (Fig. 6); se calculó con regla de tres, el porcentaje de cobertura de los
folículos en relación al porcentaje total de la masa visceral:
A; Área total de la masa visceral (mm2)
B; Porcentaje total masa visceral (100%), medido
X; Σ-Áreas de folículos (mm2)
Y; Porcentaje total de folículos, calculado
Los porcentajes obtenidos fueron puestos a prueba con el software estadístico
Statistica 7, se aplicó el Análisis de Varianza (ANOVA) de dos vías, evaluándose los
factores tiempo de exposición (15 a 90 días) y dieta (control-contaminado), siendo la
variable dependiente la Σ-Áreas (mm2) de los folículos (Fig. 5). Para poner a prueba las
presunciones de Normalidad de los datos se usó la prueba de Kolmogorov-Smirnov
35
corregido por Lilliefors, y para el supuesto de homogeneidad de las varianzas se aplicó
la prueba de Levene.
Se buscó observar la variabilidad en el % de cobertura de los folículos en
relación a su ocupación en la masa visceral, y como estos podían cambiar en los días
de exposición y según el tipo de dieta entregada.
36
4. RESULTADOS
4.1. Análisis de datos
4.1.1. Longitud de los ejes corporales Anterior/Posterior y Dorsal/Ventral
El diseño experimental fue de carácter ortogonal, por lo cual para el día 0 los
individuos pertenecientes al grupo contaminado (TXC) presentaron las mismas
condiciones experimentales que los individuos controles (CTRL), estableciéndose, para
ambos grupos, iguales valores de longitud en los ejes corporales de 20,16 mm (± 0.68)
y 17,64 mm (± 0,93) en los ejes anterior-posterior y dorsal-ventral respectivamente.
Estos datos no fueron graficados en los análisis posteriores pues al no estar sometidos
al factor dieta no tendría implicancias en los resultados.
Para el periodo final de exposición (día 90) se registraron longitudes de eje
anterior-posterior en el grupo control de 14,07 mm (± 0,91) y en el grupo contaminado
de 14,05 mm (± 1,41). Para el eje dorsal-ventral las longitudes para los tratamientos
control y contaminado fueron en promedio 11,07 mm (± 0,57) y 9,87 mm (± 1,02),
respectivamente.
Tablas VI. Mediciones de masa visceral en longitudes Anterior/Posterior (A/P) y Dorsal/Ventral
(D/V) para los grupos Control y Contaminado.
Grupo control Grupo contaminado
Periodo
Longitud
Error estándar
Longitud
Error estándar
Longitud
Error estándar
Longitud
Error estándar
(mm) (mm) (mm) (mm)
Gónada A/P
Gónada D/V
Gónada A/P
Gónada D/V
Día 0 20.16 0.68 17.64 0.93 20.16 0.68 17.64 0.93
Día 15 15.68 0.65 12.4 0.21 15.86 0.71 12.4 0.42
Día 30 17.57 1.35 14.02 1.07 17.90 0.58 14.10 0.41
Día 45 17.64 0.39 13.32 0.26 16.24 0.88 12.68 0.43
Día 60 17.52 0.55 13.32 0.44 16.04 0.41 11.48 0.48
Día 75 15.90 0.56 12.28 0.30 16.70 0.21 11.10 0.55
Día 90 14.07 0.91 11.07 0.57 14.50 1.41 9.86 1.02
37
4.1.2. Análisis estadístico de las longitudes de los ejes corporales
El ANOVA de 2 vías mostró un efecto significativo en el factor tiempo de exposición
(F5, 48,= 4.41, P<0.05), mientras que el factor dieta (F1, 48= 0.17, P>0.05) y la interacción
de ambos factores (F5, 48,= 0.77, P>0.05) no presentaron un efecto significativo para la
variable longitud del eje corporal Anterior/Posterior (Tabla VII, Fig. 7). En gran parte del
periodo experimental se observan tamaños corporales similares en ambos tratamientos
(control-contaminado). Los valores mas altos de longitud de masa visceral A/P para la
dieta control corresponden al periodo 30 a 60 días. Para la dieta contaminada se
observa un decrecimiento entre el periodo 45 a 60 días.
En el eje corporal Dorsal/Ventral el ANOVA de dos vías presentó efectos
significativos del tiempo de exposición (F5, 48= 8.92, P<0.01) y del factor dieta (F1, 48=
5.79, P<0.05). La interacción de ambos factores (F5, 48= 0.86, P>0.05), no mostró efecto
significativo sobre la longitud del eje corporal D/V (Tabla VIII, Fig. 8). En gran parte del
periodo experimental se observan tamaños corporales similares en ambas dietas
(Control-Contaminado). Se observa disminucion de los valores promedios de longitud
Dorsal/Ventral para ambos tratamientos desde el dia 30.
38
Tabla VII. ANOVA de dos vías para la longitud del eje corporal Anterior/Posterior de O. chilensis
para los dos factores, tiempo de exposición (15 a 90 días), dieta (Control-Contaminado) e
interacción de ambos. Los valores de probabilidad significativas se destacan en negrita
(P<0,05).
Fig.7. Los valores de las longitudes Anterior/Posterior (A/P) en relación a la interacción de los
factores tiempo*dieta. Barras verticales indican el 0.95 intervalo de confianza.
SS GL MS F p
Tiempo 70.42 5 14.08 4.412 0.002193
Dieta 0.54 1 0.54 0.168 0.683858
Tiempo*Dieta 12.27 5 2.45 0.769 0.577011
Error 153.23 48 3.19
39
Tabla VIII. ANOVA de dos vías realizado para la longitud del eje corporal Dorsal/Ventral de O.
chilensis para los dos factores tiempo de exposición (15 a 90), dieta (Control-Contaminado) y la
interacción entre ambos factores. Los valores de probabilidad significativa se destacan en
negrita (P<0,05).
Fig. 8. Los valores de las longitudes Dorsal/Ventral (D/V) en la interacción de los factores
tiempo*dieta. Barras verticales indican el 0.95 intervalo de confianza.
SS GL MS F p
Tiempo 73.455 5 14.691 8.923 0.000005
Dieta 9.547 1 9.547 5.798 0.019933
Tiempo*Dieta 7.078 5 1.416 0.860 0.514911
Error 79.032 48 1.646
40
4.1.3. Proporción sexual en reproductores de Ostrea chilensis
Para el periodo total de exposición a las dietas experimentales (control-
contaminado) fueron analizadas 56 muestras de O. chilensis, en donde se determinó
que un 41,07% de los ejemplares poseen gónada con desarrollo de gametos
masculinos, mientras que un 10,71% posee folículos del tipo femenino. También se
determinó la proporción de folículos hermafroditas, lo cual correspondió a un 14,28%
(Tabla IX). En la Fig. 9 se grafica el número de individuos con carácter “indiferenciado”,
estos resultados son asociados a folículos que se encontraron desovados o en estado
de completa reabsorción, correspondiendo a un 33,92% del total (Tabla IX).
Tabla IX. Porcentaje de individuos de carácter hembra, macho, hermafrodita e
indiferenciado para tratamientos control y contaminado.
Gametos
Tratamiento Macho Hembra Hermafrodita Indiferenciado
CTRL 53.57% 7.14% 10.71% 28.57%
TXC 28.57% 14.28% 17.85% 39.28%
P. experimental 41.07% 10.71% 14.28% 33.92%
41
Fig. 9. Proporción en número de individuos de carácter sexual hembra, macho y hermafrodita
en reproductores de O. chilensis. Se incluye el número de individuos con folículos indiferenciado
en donde no fue posible determinar el sexo debido a eventos de desove y reabsorción.
42
4.2. Histología
Corte transversal del eje corporal Dorsal/Ventral donde se presenta la disposición
de los folículos y órganos que componen la glándula digestiva de O. chilensis.
Fig. 10. Sección rotulada de un corte Dorsal/Ventral, en individuos de O. chilensis
pertenecientes al grupo control. Tinción Hematoxilina-Eosina.
A
Folículos
Intestino
Branquias
Túbulos
digestivos
Tejido
conectivo
Arteria
Estómago
DORSAL
VENTRAL
43
4.2.1. Análisis microscópico y fotográfico
Descripción Histológica
4.2.1.1. Intestino
Al realizar la observación de los cortes histológicos fue claramente diferenciable el
intestino medio (Fig. 11), el cual se observa en forma de media luna con un surco hacia
la zona media. Fue posible diferenciar el epitelio ciliado que recubre la pared intestinal
interna, la cual se compone de glándulas mucosas, asociadas a la presencia de células
caliciformes. La imagen ilustra el intestino medio el cual se ubica entre el estómago y el
recto. El epitelio intestinal está constituido por células de aspecto alargadas y
estrechas. En individuos expuestos al tratamiento contaminado fue posible observar la
presencia de células de Alexandrium catenella en el lumen intestinal, al cual se asocia
también la gran producción de mucus por parte de las células caliciformes.
Fig. 11. Corte transversal de intestino. (EC) Epitelio Ciliado; (EI) Epitelio Intestinal; (TC) Tejido
Conectivo. Fotografía con magnitud 100x. Tinción hematoxilina-eosina.
44
4.2.1.2. Estómago
El estómago no posee una forma característica y definida, se presenta de forma
irregular con numerosos pliegues (Fig. 12). El estómago se ubica en la zona central de
la masa visceral, ocupando allí un amplio espacio de esta. El epitelio del estómago es
cilíndrico ciliado, con numerosas ondulaciones; entre las células epiteliales se observan
células mucosas y eosinófilas.
Fig. 12. Corte transversal estómago. Cavidad Estomacal (CE); Epitelio Estomacal (EE); Epitelio
Ciliado (EC); Tejido conectivo (TC); Túbulos Digestivo (TD). Composición fotográfica, magnitud
50x. Tinción hematoxilina-eosina.
45
4.2.1.3. Glándula digestiva
La glándula digestiva rodea y se conecta mediante una serie de conductos
ciliados al estómago e intestino (Fig. 13). Estos conductos denominados túbulos
digestivos, se encuentran ramificados dentro de la masa visceral, los que se comunican
con el estómago por una red de túbulos primarios que van aumentando en tamaño
hasta conectarse con el intestino.
En cortes transversales es posible diferenciar los túbulos primarios de los
divertículos. Los túbulos primarios presentan una forma externa redondeada, con
entrantes y salientes de forma estrellada. Dentro de los túbulos primarios existe un
segmento ciliado y otro no ciliado. Los divertículos digestivos presentan células
mucosas y eosinófilas no ciliadas.
Fig. 13. Corte transversal de Glándula digestiva. Túbulos Digestivos (TD); Tejido Conectivo
(TC). Fotografía obtenida con magnitud 100x. Tinción hematoxilina-eosina.
46
4.2.1.4. Tejido gonadal
La gónada se compone de una serie de acinos foliculares (folículos) ramificados,
en cuyo interior se encuentra el epitelio germinal a partir del cual ocurre el desarrollo de
los gametos. La gametogénesis es un proceso continuo, en donde se identifican cinco
fases o procesos; en orden; reposo, desarrollo, madurez, desove parcial y desove
completo.
El tracto genital o gonoducto está formado por un epitelio ciliado el cual es una
extensión de los túbulos digestivos. En las hembras (Figs. 14. A y 14. B), los ovocitos
maduros son grandes y esféricos. Los espermatozoides maduros forman conjunto de
racimos o esferoides (Figs. 15. A y 15. B). En los folículos de carácter hermafrodita
protándrico se observan ovocitos y espermatozoides maduros en el epitelio germinal y
restos de estos cerca del gonoducto (Fig. 16).
1. Folículos hembra, magnitud 50x
47
2. Folículo hembra en magnitud 100x
Fig.14. Folículos con gametos femeninos. A: Folículos (F) con gametos femeninos en diferentes
estadios de desarrollo. Se observan ovocitos inmaduros (OoP) asociados a la pared folicular en
proceso de maduración y ovocitos maduros (OM). Composición fotográfica obtenida con
magnitud 50x. Folículo (F); Tejido conectivo (TC). B: Ovocito maduro, el que se encuentra en
proceso de desprendimiento de la pared folicular, con una gran compactación de las plaquetas
vitelinas (PV). Se diferencia el núcleo (N) que se tiñe más claro. Fotografía obtenía con
magnitud 100x. Tinción hematoxilina-eosina.
48
1. Folículos macho, magnitud 50x
2. Foliculo macho en magnitud 100x
Fig. 15. Folículos con gametos masculinos. A: Folículos con desarrollo de gametos de tipo
masculino. Composición fotográfica con magnitud 50x. Folículos (F); Espermatozoides en
diferentes estados de espermatogénesis (EE); Espermatozoides Maduro (EM); Células de
soporte en la pared folicular (CS); Tejido conectivo (TC), Gonoducto (G), Manto (M). B: Folículo
con espermatozoides maduros (EM); los racimos de espermatozoides se encuentran en
proceso de separación del epitelio germinal (pared interna del folículo). Magnitud 100x. Tinción
hematoxilina-eosina.
49
3. Folículos hermafroditas
Fig. 16. Folículos hermafrodita con procesos simultáneos de espermiogénesis y ovogénesis.
Corte histológico de gónada en individuo hermafrodita, se observan simultáneamente en los
folículos (F) gametos del tipo femeninos (Ov) y Espermatozoides en diferentes estados de
espermatogénesis (EE), Manto (M). Serie fotográfica magnitud 50x. Tinción hematoxilina-
eosina.
4.2.1.5. Células de la hemolinfa
Fig.17. Sección transversal de un vaso con hemolinfa. A: Vaso de hemolinfa (VH), con
liberación de hemocitos hacia tejido conectivo (Círculos. magnitud 100x). B: Hemocitos del tipo
50
granulocitos (Flechas. magnitud 400x), los cuales en el género Ostrea han sido descritos como
responsables de la respuesta inmune-innata. Tinción hematoxilina-eosina.
4.3. Respuestas comparativas para tratamientos experimentales.
El análisis microscópico realizado en los tejidos de la glándula digestiva y en los
acinos foliculares permitió observar los efectos que estaría generando la exposición por
90 días a la microalga tóxica Alexandrium catenella. Estos tejidos se compararon entre
dietas (control-contaminado), en donde se determinó la presencia, ausencia y
abundancia relativa de los diferentes caracteres asociados a la expresión inmune-
innata.
4.3.1. Glándula digestiva:
En este caso se observó cambios estructurales, además de una respuesta
inmune durante los 90 días de exposición a la toxina paralizante de molusco (TPM). Se
presentó una respuesta inflamatoria en los túbulos digestivos y en el intestino, asociada
a una pérdida del epitelio interno ciliado. También se observó diapédesis de hemocitos
a través de los epitelios digestivos, junto con un aumento considerable de éstos, en el
tejido conectivo que rodea a la glándula digestiva. Por otro lado se presentó un mayor
desarrollo de células secretoras de mucus (caliciformes). Durante el periodo de
exposición a la dieta contaminada, entre los días 15 a 60, se observó un claro
desequilibrio del epitelio interno en los túbulos digestivos e intestino, debido a la gran
cantidad de hemocitos en diapédesis. En el periodo 75 a 90 días de exposición, se
evidenció una constricción considerable del epitelio interno de los túbulos digestivos.
En la glándula digestiva de las ostras alimentadas con la dieta control (I. galbana)
se observó la característica conformación estrellada del epitelio interno de los túbulos
51
digestivos, con lo cual se evidencia actividad de alimentación. Para el caso del epitelio
intestinal este no presentó alteraciones atribuibles a la toxina de A. catenella. La escasa
presencia de hemocitos se atribuye a los procesos de digestión, por lo cual no se
observó una agregación de estas células en el tejido conectivo.
4.3.1.1 Respuesta inmune innata en glándula digestiva frente a la exposición de A.
catenella.
i. Perdida del epitelio interno estrellado en túbulos digestivos del grupo
contaminado.
Fig.18.Espitelio estrellado en ejemplar del control (día 15), donde se observa el epitelio interno
estrellado (flechas). Composición fotografica con magnitud 50x. Tinción hematoxilina-eosina.
52
Fig. 19. Perdida de epitelio estrellado en ejemplar del grupo contaminado. Análisis comparativo
entre tratamientos (control-contaminado). A: Conformación estrellada (flecha) de los tubulos
digestivos correspondiente a un ejemplar alimentado con la dieta control durante 15 días.
B: Ejemplar expuesto a la TPM durante 15 días, aquí se evidenció la pérdida del revestimiento
interno estrellado (flechas), tambien se observó una respuesta inflamatoria con una clara
presencia de hemocitos en diapedesis, y en proceso de fagocitosis (Fg). Fotografias magnitud
100x. Tinción hematoxilina-eosina.
ii. Infiltración de hemocitos (diapédesis) a través de los tejidos epiteliales de la
glándula digestiva. En el tratamiento contaminado se observó un aumento
considerable de las células de hemocitos en el tejido conectivo que rodea a los
túbulos digestivos, intestino y al estómago. En las imágenes comparativas entre
tratamientos es posible observar la respuesta inmune-innata debido a la
presencia de la toxina liberada por la degradación de las células de A. catenella.
53
Fig.20. Infiltración de hemocitos (diapédesis) a través de túbulos digestivos. Análisis
comparativo entre tratamientos (control-contaminado). A: Ejemplar del día 15 alimentado con la
dieta control, en este se observó una conformación estrellada del epitelio interno de los tubulos
digestivos, las flechas rojas indican hemocitos asociados a la actividad digestiva. B: Ejemplar de
O. chilensis expuesto a la TPM en donde las flechas rojas indican una gran aglomeración de
hemocitos en el tejido conectivo y en proceso de diapédesis a través de los túbulos digestivos
(TD). Fotografías magnitud 50X. Tinción hematoxilina-eosina.
Fig.21. Infiltración de hemocitos (diapédesis) a través de epitelio estomacal. Fotografías
corresponde a un corte transversal de una porción de estómago en un ejemplar perteneciente al
grupo contaminado. A: Se evidencia la presencia de hemocitos (círculo, magnitud 100x) en el
tejido conectivo (TC), B: proceso de diapédesis (flechas), con magnitud 400x. Epitelio
estomacal (EE), Lumen estomacal (LC). Tinción hematoxilina-eosina.
54
Fig. 22. Diapédesis de hemocitos (H) a través de epitelio intestinal. Análisis comparativo
entre tratamientos (control-contaminado). A: Ejemplar con la dieta control, las flechas indican la
presencia de hemocitos en tejido conectivo. B: Correspondiente a ejemplar del grupo
contaminado, se aprecia una gran agregacion de hemocitos en el lumen intestinal (LI) con un
proceso de agregacion de hemocitos en el tejido conectivo (flechas rojas). Epitelio intestinal
(EI), (S) Surco intestinal. A y B con magnitud 50X. Tinción hematoxilina-eosina.
iii. Respuesta inflamatoria en intestino.
Fig.23. Respuesta inflamatoria con agregación de hemocitos del tipo granulocitos. Análisis
comparativo entre tratamientos (control-contaminado). A y C: Corresponden ejemplar
55
alimentado con dieta control, en estas imágenes se observan los pliegues del epitelio interno
intestinal (C, flechas). B y D corresponden al día 15 de exposición a la toxina, en donde se
observó una pérdida de los pliegues internos, se asocia a una respuesta inflamatoria. E:
Agregación de hemocitos (AH) en el lumen intestinal (LI), flechas rojas indican hemocitos en
diapédesis a través del epitelio intestinal (EI) y flechas negras indican la presencia de células
caliciformes. Figs. A, B y D magnitud 50x y C y E magnitud 100x. Tinción hematoxilina-eosina.
iv. Agregación de hemocitos. Se observó gran agregación de hemocitos en
ejemplares expuestos a TPM, lo cual provocó la desestabilización del epitelio
intestinal (Fig. 24. B, flecha rojas), debido al abundante paso de los hemocitos a
través de él. En el tejido conectivo los hemocitos se observaron rodeando las
paredes externas del intestino, con un proceso de diapédesis hacia el lumen
intestinal. También se observó la presencia de células caliciformes.
Fig.24. Agregación de hemocitos. Corte transversal de intestino medio. Muestra
correspondiente al día 15 de exposición a la toxina. A: Flechas indican la agregación de
hemocitos (AH). B: Flechas rojas indican la desestabilización del epitelio intestinal (EI), las
flechas negras indican procesos de diapédesis de los hemocitos (HD). Lumen intestinal (LI), A:
magnitud 50x; B: magnitud 400x.Tinción hematoxilina-eosina.
56
v. Desestabilización del epitelio de los túbulos digestivos, del epitelio estomacal e
intestinal.
Debido a la alta frecuencia de diapédesis realizada por los hemocitos a través
de los epitelios, se observaron surcos o espaciados alrededor de todos los
epitelios internos y externos de la glándula digestiva, provocando un cambio
estructural degenerativo.
Fig. 25. Desestabilización del epitelio de los túbulos digestivos, del epitelio estomacal e
intestinal. A y B: Flechas indican desestabilización de epitelio tisular en el Intestino. C y D:
Túbulos digestivo (TD) con gran desestabilización de los epitelios internos y externos. Los
círculos enmarcan paso de hemocitos en diapédesis a través de ambos epitelios. Epitelio
intestinal (EI), Lumen intestinal (LI), Túbulos digestivos (TD), Tejido conectivo (TC). A y C con
magnitud 50x, B magnitud 100x, D magnitud 400x. Tinción hematoxilina-eosina.
57
vi. Túbulos digestivos e intestino con presencia de células caliciformes (secreción
en epitelio interno).
Se observó la presencia y gran desarrollo de celulas caliciformes en ejemplares
del grupo expuesto a TPM (Fig. 26). Estas celulas son del tipo epitelial
secretoras de mucus y se encuentran en los epitelios internos de la glandula
digestiva. Las flechas indican la presencia de las células caliciformes en los
diferentes tejidos de la glándula digestiva. Fig. 27. Indica una comparación entre
ambos tratamientos, encontrándose en el grupo contaminado con mayor
presencia de células caliciformes y una evidente producción de secreción, en
contraste individuos del grupo control que no evidenciaron gran desarrollo de
estas células caliciformes.
Fig.26. Presencia de células caliciformes en individuos del grupo contaminado. A y B: Flechas
indican su ubicación y proliferación en el tejido epitelial interno de túbulos digestivos (TD). C y
58
D: Células caliciforme en el epitelio interno del intestino (EI). Magnitud 100x en A, C y D, y C
con magnitud 400x. Tinción hematoxilina-eosina.
Fig. 27. Evidencia de células caliciformes. Serie fotográfica comparativa entre tratamientos. A:
muestra correspondiente a grupo control, flechas indican células caliciformes. B: Se evidencia el
gran desarrollo de las células caliciformes en ejemplar expuesto 15 días a la toxina. Fotografías
con magnitud 50x. Tinción hematoxilina-eosina.
vii. Constricción del epitelio en túbulos digestivos.
Durante el periodo de exposición 15 a 60 días se observó en el grupo
contaminado una clara respuesta inflamatoria asociada a la actividad inmune-
innata (Figs. 28. A y 28. C). Esta respuesta presentó un cambio estructural
durante el último periodo de exposición (75 a 90 días) en donde las muestras
presentaron una constricción y aparente reducción en el tamaño del epitelio
interno y externo de los túbulos digestivos (Figs. 28. B y 28. D).
59
Fig. 28. Constricción del epitelio ciliado en túbulos digestivos (TD). A y C: Evidencia de
respuesta inflamatoria durante el primer periodo de exposición a la toxina (15 a 60 días). B y D:
Constricción del epitelio interno y externo de los túbulos digestivos durante el último periodo de
exposición (75 a 90 días), las flechas negras indican el proceso de constricción con un aumento
en el espacio del lumen de los túbulos digestivos (flechas hacia afuera). A y B con magnitud
50x. C magnitud 100x y D magnitud 400x. Tinción hematoxilina-eosina.
viii. Evidencia de células de Alexandrium catenella en el intestino.
En la Fig. 29 se observa claramente el cíngulo y surco transversal que rodea a
toda la célula de este dinoflagelado (flechas). Se observó la presencia de
hemocitos en diapédesis a través del epitelio intestinal y una agregación de
estos en el tejido conectivo y en el lumen intestinal. Con la evidencia del
proceso de diapédesis se infiere la acción degradante y digestiva por parte de
los hemocitos sobre las células de A. catenella. Por otro lado es evidente el
60
desequilibrio causado por el paso de hemocitos en la totalidad del epitelio
interno del intestino (Fig. 25).
Fig.29. Células de Alexandrium catenella en el interior del intestino medio. Las flechas indican
cíngulo del dinoflagelado. Fotografía con magnitud 100x. Tinción hematoxilina-eosina.
4.3.2. En el tejido gonadal:
Los folículos de ejemplares macho de O. chilensis mostraron espermatozoides
cercanos al gonoducto y espermátidas en proceso de espermiogénesis, asociadas al
epitelio germinal (pared folicular). En lo que respecta a los folículos femeninos se
presentó gran abundancia de ovocitos en diferentes estados de la ovogénesis, siendo
los ovocitos maduros de gran tamaño y con un núcleo bien diferenciado.
Dentro de los análisis microscópicos se evidenció la formación de gonoductos
durante gran parte del periodo experimental. Posterior a los eventos de desove, los
folículos se observaron encogidos y estrechos, encontrándose la porción central de los
61
folículos generalmente vacía y con restos de gametos adosados aun al epitelio
germinal. También se detectó la presencia de hemocitos reabsorbiendo los restos de
gametos.
4.3.2.1 Respuesta inmune innata en tejido gonadal frente a la exposición de A.
catenella.
i. Proceso de reabsorción en restos de folículos.
Los folículos visiblemente estrechos y con una reducción de sus tamaños
presentaron una aglomeración de hemocitos en proceso de diapédesis hacia el
interior de estos. En el grupo de ostras con dieta control (Fig. 30) y expuesto a la
toxina (Fig. 31) se observó el proceso de reabsorción, el cual ocurriría posterior
al evento de desove.
En la Fig. 30. B se observaron folículos en proceso de reabsorción, en donde
posterior al desove los hemocitos del tipo fagocitos invaden el lumen folicular
para realizar la reabsorción de restos de gametos con lo cual ocurrió una
constricción de la pared folicular hacia la zona del manto.
Se distingue dentro de los folículos una gran aglomeración de hemocitos que
rodean los restos de ovocitos, racimos de espermátidas y espermatozoides (Fig.
31. A)
62
Fig. 30. Reabsorción de gametos en ejemplares del día 45 alimentados con dieta conteniendo
100% I. galbana. Las flechas indican la presencia de los hemocitos en actividad de degradación
sobre restos de gametos que no han alcanzado máxima maduración y no han sido desovados.
(AH) Agregación de hemocitos, (F) Folículos, (PF) Pared folicular, espermátidas libres en
lumen, (TC) Tejido conectivo, (M) Manto, (TD) Túbulos digestivos. Fig. 30. A magnitud 50x, Fig.
30. B serie fotográfica obtenida con magnitud 100x. Tinción hematoxilina-eosina.
Fig. 31. Reabsorción de gametos en ejemplares del día 15 de exposición a TPM. A: Proceso de
reabsorción en foliculos, por parte de hemocitos asociados a actividad digestiva. B: Respuesta
inmune presente en la glandula digestiva de ejemplare expuestos a TPM, se asocia a respuesta
inmune-innata. (EE) Espermatozoides en diferentes estados de espermatogénesis, (Ov)
Ovocitos, (H) Hemocitos, (Cc) Células caliciforme, (TC) Tejido conectivo. Fig. 31.A magnitud
100x, Fig. 31. B con magnitud 50x. Tinción hematoxilina-eosina.
63
4.4. Área de cobertura folicular
Para la determinación de la cobertura folicular se realizaron cortes transversales de la
zona media masa visceral de O. chilensis (32. A), así como de la zona posterior (32. B).
Estas secciones permiten observar la presencia de tejido conectivo y la distribución de
los folículos al interior de la glándula digestiva.
Fig. 32. Composición fotográfica de la masa visceral de Ostrea chilensis. (A) Corte transversal
de zona media de masa visceral, (B) zona posterior de masa visceral. Tinción Hematoxilina-
Eosina.
64
4.5. Análisis de imágenes en Sigma Scan Pro 5.0
4.5.1. Análisis de los datos calculados en la Σ de área de folículos
El ANOVA de 2 vías indicó que los factores; tiempo de exposición (F6, 28= 1.38,
P>0.05), tratamientos (F1, 28= 0.67, P>0.05) y en la interacción de ambos factores no se
observaron efectos significativos (F6, 28= 0.40, P>0.05) sobre la Σ de las Áreas
foliculares (mm2) de O. chilensis.
El ANOVA de las Σ-Áreas de los folículos mostró tamaños similares entre ambos
tratamientos, en la totalidad del periodo experimental. Durante el periodo 15 a 90 días,
los individuos controles (CTRL) mostraron una fluctuación de las áreas folicular con
medidas superior a 0.02 mm2, asociadas primeramente a eventos de maduración para
luego dar lugar a procesos de desove. En contaminados (TXC) se aprecia un
decrecimiento en la totalidad del periodo experimental, siendo esto atribuido a eventos
de maduración, desove y reabsorción (Fig. 33).
Tabla X. ANOVA de dos vías realizado para la Σ-Áreas folicular (mm2) de O. chilensis para los
factores tiempo de exposición (15 a 90 días) y dietas (Control-Contaminado).
SS GL MS F p
Día 0.004841 6 0.000807 1.38471 0.255253
Tratamiento 0.000394 1 0.000394 0.67677 0.417651
Tiempo*Dieta. 0.001409 6 0.000235 0.40314 0.870600
Error 0.016315 28 0.000583
65
Fig.33. Σ-Áreas de los folículos (mm2) por tratamiento experimental en individuos de Ostrea
chilensis. Barras verticales indican el 0.95 intervalo de confianza.
4.5.2. Análisis del % de cobertura folicular en relación a su ocupación en la masa
visceral
Los mayores porcentajes de cobertura folicular calculados fueron
correspondientes a los eventos de maduración. Se observó en el día 45 un máximo de
cobertura folicular de 23.16% (Tabla X), asociado a folículos en estado de máxima
maduración. El valor más bajo observado perteneció al ejemplar del día 90 del grupo
contaminado (TXC) con un valor de 2.01% de cobertura folicular (Tabla XI).
66
Tabla XI. Tabla resumen estadística descriptiva para el porcentaje de cobertura de
folículos por tratamiento en relación a la ocupación de estos en la totalidad de la masa visceral.
El ANOVA de dos vías mostró efectos significativos para el factor tiempo de exposición
(F5, 24= 3.06, P<0.05). Sin embargo no se observaron diferencias significativas para
factor dieta (F1, 24 = 0.74, P>0.05) y para la interacción de ambos factores,
tiempo*tratamiento (F5, 24= 0.44, P>0.05) como se muestra en la Tabla XI.
Se observó el decrecimiento de la ocupación de folículos, con una variación de
aproximadamente 10% en la totalidad del periodo experimental (Fig. 34).
Tabla XII.ANOVA de dos vías realizado para él % de cobertura de folículos en individuos de O.
chilensis para los factores tiempo de exposición (15 a 90 días) y dieta (Control-Contaminado).
Los valores de probabilidad significativas se destacan en negrita (P < 0,05).
SS GL MS F p
Tiempo 452.624 5 90.525 3.06548 0.028022
Dieta 22.060 1 22.060 0.74703 0.395974
Tiempo*Dieta 66.026 5 13.205 0.44717 0.811054
Error 708.729 24 29.530
Variable N Muestra Media Mínimo Máximo Dev. Std.
% Cobertura de folículos
36 8.966115 2.016076 23.16489 5.974803
67
Fig. 34. Porcentajes de cobertura de folículos al interior de la masa visceral de O. chilensis
durante 90 días. Barras verticales indican el 0.95 intervalo de confianza.
68
5. DISCUSIÓN
Las toxinas producidas por los dinoflagelados tienen efectos deletéreos sobre la
alimentación y el metabolismo de moluscos bivalvos, caracterizándose por ser especie-
específicos dependiendo de la localidad y el periodo del muestreo (Shumway y Cucci
1987; Shumway 1990; Bardouil et al., 1993; Lesser y Shumway 1993).
En general, aquellas especies de bivalvos que son insensibles a la toxina
paralizante de molusco (e.j. Mytilus chilensis, Choromytilus chorus) son capaces de
aclimatarse en un corto periodo de tiempo y mantener su actividad de filtración sobre
las microalgas toxicas (Navarro, et. al., 2008; Ortiz, 2013), acumulando altos niveles de
toxinas en sus tejidos (Bricelj et al., 1990). En contraste, existen especies altamente
sensibles a TPM (e. g. ostras, ostiones) las cuales exhiben mecanismos fisiológicos
para contrarrestar o reducir la exposición a las células toxicas (Bricelj y Shumway.,
1998).
Las microalgas nocivas pueden tener el primer contacto con los sifones,
branquias y parte del manto de los bivalvos. En aquellos ejemplares que no cesan su
actividad de filtración, estas toxinas pasan a tener un efecto directo sobre algunos
procesos fisiológicos del bivalvo (Bricelj y Shumway, 1998). Durante el periodo de
exposición a TPM se evidenció la presencia de células de Alexandrium catenella dentro
del intestino, produciendo efectos deletéreos sobre los diferentes tejidos y epitelios de
la glándula digestiva. En el tejido gonadal la presencia de hemocitos estaría asociada
solo a procesos de reabsorción de los restos de gametos posterior a los eventos de
desove (Rao, 1956; da Silva et al., 2009).
69
Las alteraciones en la conformación estructural observadas en el epitelio
digestivo son indicadores de un daño, el cuales generaría un efecto negativo sobre la
salud del bivalvo. El epitelio de los túbulos de la glándula digestiva se presentó como el
indicador más sensible frente a condiciones desfavorables (Elston, 1999). Las
alteraciones más frecuentemente observadas sobre la glándula digestiva, durante el
periodo de exposición a la TPM, fueron: respuesta inflamatoria, pérdida de la
conformación estrellada en túbulos digestivos, ruptura y desequilibrio de los epitelios del
estómago, túbulos e intestino.
El desequilibrio o aplastamiento del epitelio estomacal e intestinal junto a la
pérdida del epitelio estrellado en túbulos digestivos observado durante el periodo de 30
a 90 días de exposición, podría asociarse a una disminución en la tasa de filtración en
adultos de Ostrea chilensis. Según Navarro et al. (2015), ejemplares incubantes de
Ostra chilensis expuestos durante 30 días a A. catenella, presentaron una tasa de
aclaramiento significativamente menor que los animales sometidos a la dieta control,
compuesta por la microalga no tóxica I. galbana.
Resultados similares han sido descritos para Crassostrea gigas, donde la
reducción en la tasa de aclaramiento se presenta durante la exposición a los
dinoflagelados tóxicos Alexandrium catenella, Alexandrium minutum y Alexandrium
tamarense (Bardouil et al., 1993; Lassus et al., 1999; Haberkorn et al., 2010 a, b).
Garcia-Lagunas et al. (2013), indica que C. gigas expuesta al dinoflagelado toxico
Gymnodinium catenatum presenta cambios inmediatos en el comportamiento
alimentario en donde la tasa de aclaramiento se reduce significativamente, ocurriendo
70
un cierre parcial de las valvas, con una retracción del manto y la producción de
pseudofecas después de 3h de exposición.
Durante el periodo experimental se observó que las ostras expuestas a TPM
producían pseudofecas con alta presencia de mucus, lo que sugiere que Ostrea
chilensis tendría la capacidad de reducir la ingestión de las células de A. catenella
mediante este mecanismo de alimentación. En estudios previos se han descrito
cambios en los hábitos de alimentación en especies de los géneros Ostrea y
Crassostrea, en donde se observa la capacidad de rechazo de partículas de A.
tamarense mediante una alta producción de pseudofecas (Bardouil et al., 1993). Este
rechazo y selección de partículas es variable según el tamaño de las microalgas
(Defossez y Hawkins, 1997), de la calidad nutritiva (Shumway et al., 1987; Arifin y
Bendell-Young, 1997) y también según su toxicidad (Teengarden, 1999).
La pérdida del epitelio del tracto digestivo provoca que células encargadas del
proceso de absorción migren hacia el lumen de los diferentes órganos. Esta afección a
menudo es fatal debido a la gran pérdida de epitelio del tracto digestivo (Goslin, 2003;
Elson, 1999) la cual se describió como un desequilibrio del epitelio de la glándula
digestiva. En un intento de reparación, las células caliciformes y los hemocitos se
extienden para cubrir los espacios dejados por las células de absorción que migran
hacia el lumen (exfoliación), observándose finalmente un desequilibrio del epitelio
digestivo en respuesta a la presencia de toxinas. Pearce et al. (2005), reportan el
aplanamiento y la disminución de la altura de las células del epitelio, así como un alto
grado de exfoliación epitelial en Crassostrea gigas expuesta al dinoflagelado toxico
Prorocentrum rhathymum.
71
Los resultados mostraron la respuesta inmune-innata de hemocitos frente a la
presencia de la toxina. La diapédesis de hemocitos en la masa visceral de O. chilensis
es la típica respuesta observada en los ejemplares de bivalvos expuestos al
dinoflagelado Alexandrium spp. (Haberkorn et al., 2010 a; Medhioub et al., 2012;
Lassudrie et al., 2014). Según algunos autores la diapédesis de hemocitos a través del
epitelio del tracto digestivo ocurre con el fin de eliminar las toxinas y así proteger los
tejidos, con una respuesta neutralizante a los daños por dichos compuestos, es decir
como una vía de desintoxicación (Zaroogian y Voyer, 1995; Hégaret et al. 2008, 2009;
Haberkorn et al. 2010 b, 2011).
La actividad de diapédesis a través de los diferentes tejidos, durante el último
periodo de exposición (60 a 90 días) mostró una notoria reducción, esto puede
atribuirse a un cese en la actividad de fagocitosis por la posible muerte de los
hemocitos. Hégaret (2007 a) realizó un análisis de citometría de flujo in-vitro en
Crassostrea virginica en donde determinó una reducción de la actividad de fagocitosis
de los hemocitos. Este estudio reflejó un aumento del porcentaje de hemocitos muertos,
el cual fue atribuido a la presencia de las toxinas producidas por el dinoflagelado A.
fundyense. La misma observación fue realizada durante la exposición al dinoflagelado
A. catenella, el cual causó un aumento en la mortalidad de hemocitos en Crassostrea
gigas al ser expuestos los hemocitos a un análisis de citometría de flujo in-vivo; sin
embargo estos efectos deletéreos solo se presentaron a temperaturas iguales o
superiores a 18ºC, no así a temperaturas inferiores Hégaret (2005 a, b, 2007 a).
Respecto a la gametogénesis de O. chilensis, durante el periodo experimental
fue posible observar eventos de multiplicación, crecimiento y maduración de las células
72
germinales, masculinas y femeninas, tanto en los individuos del grupo control, como de
los del grupo contaminado. En la totalidad del periodo experimental (CTRL-TXC) se
presentó mayor número de acinos foliculares en estadio masculino (41,07%) que se
encontraron en diferentes estados de espermatogénesis. La baja presencia de folículos
en estadio hembra (10,71%), en ambos tratamientos correspondería a los altos
requerimientos energéticos que demanda la transición de macho a hembra (Gleisner,
1981).
Según Gleisner (1981), el proceso de maduración de ovocitos demandaría un
periodo más largo y de mayor requerimiento energético que la maduración de
espermatozoides para llegar a completar el evento de desarrollo y posterior desove. En
este estudio la cohorte experimental presentó tallas superiores a 4,5 cms, donde se
esperaría, según lo indicado en la literatura, una mayor presencia de folículos del tipo
hembra. Esto es contradictorio a lo obtenido en este estudio, pues dentro del periodo
experimental un 41,07% corresponde a folículos en estadio masculino, lo que está
altamente asociado al complejo proceso de transición macho-hembra. Estudios previos
(Brown & Hartwick, 1988; Hofmann, et al. 1992) han demostrado que variaciones
mínimas en la temperatura y en la disponibilidad de alimento, tanto estacional como
anual, influyen notablemente sobre el desarrollo de gametos, crecimiento y
reproducción de las ostras.
Después de completado el desove, los hemocitos ingresan a los folículos
mediante el proceso de diapédesis, tanto en grupo control y contaminado, para iniciar
un procesos de agregación en el lumen para luego realizar la fagocitosis de los restos
de gametos que no alcanzaron a completar el proceso de gametogénesis. Este proceso
73
de reabsorción es llevado a cabo por hemocitos del tipo fagocitos (Rao, 1956; Hégaret
et al., 2007 a; da Silva et al., 2009).
La toxina paralizante de molusco interfiere específicamente en la función del
canal de sodio de las células nerviosas del organismo, lo cual no tendría implicancias
sobre el metabolismo y acción de hemocitos en ostras. Frente a esto se observó en O.
chilensis una respuesta inmune frente a la presencia de células de A. catenella, no así
un efecto de las toxinas sobre los hemocitos.
Para resumir, tanto la actividad inmune-innata y los procesos de reabsorción en
O. chilensis se redujeron después de 90 días de exposición al dinoflagelado tóxico A.
catenella. Se sugiere que los procesos degenerativos en la masa visceral
corresponderían a un proceso aditivo debido a la constante exposición a la dieta toxica,
observándose al final del periodo de exposición la atrofia en el epitelio de la glándula
digestiva. El tejido gonadal se presentó en estado de indiferenciación, siendo los
folículos casi imperceptibles en el día 90, con tamaños estrechos y separados unos de
otros por grandes masas de tejido conectivo.
CONCLUSIONES
- Los análisis histológicos realizados en las ostras expuestas a A. catenella
mostraron daños importantes a nivel de epitelio, principalmente en la glándula digestiva,
intestino y estómago.
- Se observó respuesta inflamatoria en ostras expuestas a TPM por agregación
de hemocitos en el epitelio de túbulos digestivos, no así en tratamiento control donde se
observó una conformación del epitelio estrellado, indicador de actividad de alimentación
normal.
74
- Células caliciformes, secretoras de gránulos y mucus, se presentaron en gran
abundancia en ostras contaminadas, atribuyéndose a una respuesta en conjunto con la
actividad de hemocitos, frente a la digestión y eliminación de células de A. catenella
desde el tracto digestivo.
- Los resultados de este estudio apoyan la hipótesis de que los hemocitos migran
al lúmen de los órganos digestivos para eliminar las células de A. catenella y/o para
proteger los tejidos de la toxina paralizante.
- Se confirma la hipótesis planteada al encontrar daño visible y comparativo entre
tratamientos, los resultados indican una respuesta inmune-innata por parte de
hemocitos frente a las toxinas producidas por A. catenella.
75
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