PCR Polymerase Chain Reaction

Es la amplificación de DNA in vitro por medio de la polimerización en cadena de DNA utilizando un termociclador.

El propósito del PCR es hacer muchas copias de un fragmento de DNA.

Se realiza la amplificación de un segmento específico de DNA, teniendo poco material disponible.

Polimerasa Chain Reaction: Reacción en Cadena de la Polimerasa

Fue diseñada por el Dr. Kary Mullis en 1987.

Ganó el premio Nóbel de Química en 1993 por su invento.

Utilizo el PCR para amplificación del gen de -hemoglobina humana, y el diagnostico prenatal de anemia falciforme.

Termociclador

Es una máquina que calienta y enfría la reacción en periodos cortos de tiempo.

Es el aparato que ciclifica las temperaturas necesarias para que se lleve a cabo la replicación del ADN requerido, por lo tanto, es programable.

1. Desnaturalización: Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra sencilla.

-Típicamente se usa una temperatura de 95˚C - 97˚C, por 15 a 40 segundos –el tiempo depende del tamaño del genoma-

El proceso de “PCR” incluye 3 pasos básicos que se repiten 25 veces o más:

2. Apareamiento o “anneling”: Los cebadores “primers” previamente

diseñados, reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en lugares específicos por complementariedad de bases. Para esto, se baja la temperatura -ej: 55˚C por 30 segundos-. La temperatura y el tiempo puede variar entre cebadores según sea el caso.

3. Polimerización o Extensión.

Una Polimerasa de DNA extiende los “primers”, en el espacio comprendido entre ambos “primers”, y coloca dinucleotidos trifosfatados (dNTP’s) de 5’a 3’ leyendo el DNA de 3’a 5’. De estas forma sintetiza la secuencia complementaria de las hebras de DNA molde

Se efectúa a 70˚C por 1½ minutos (puede variar según sea necesario)

Los pasos 1, 2 y 3 se repiten cuantas veces sea necesario.

En el PCR hay una amplificación exponencial

Reactivos necesarios para PCR:Amortiguador (Buffer): 50mM KCl, 10mM Tris.

Cl (pH 8.3 a temperatura ambiente) y 1.5 mM MgCl2.

MgCl2: Puede estar en forma de MgCl2, MgSO4. Se usa 25mM -Es un cofactor para la función de la polimerasa-

dNTP’s (Dinucleotidos trifosfatados): dATP, dGTP, dCTP, dTTP.

-La concentración de dNTPS, es proporcional al tamaño del fragmento que se desea amplificar. Ej: Si vamos a amplificar un fragmento de 500pb vs uno de 5500 pb, necesitamos más concentración de dNTPS para el de 5500pb.

-Generalmente, se usa una concentración de 200M de cada uno.

Reactivos necesarios para PCR:Cebadores “primers”: Son secuencias

cortas de nucleótidos 20-24 nucleótidos de longitud, complementarias a una región del DNA que se quiere amplificar. -Se usa a concentración de 1M-

DNA molde: El DNA a amplificar puede tener desde 50 a 2,000 nucleótidos de longitud.El mínimo va de 10-100 ng. y el máximo entre 400-500 ng.

Polimerasa: Generalmente se usa 2 unidades por reacción.

•En un principio, la polimerasa de DNA que se utilizaba era de la bacteria E. coli, pero esta es sensitiva a alta temperatura, por lo que había que añadir enzima fresca al comenzar el tercer ciclo.

•Se reemplazo la enzima por la de la bacteria “Thermus aquaticus” conocida como Taq pol

Polimerasa

Análisis de la MuestraLa detección del producto

de la PCR se realiza normalmente mediante corrido electroforético.

Dependiendo del tamaño de la amplificación y la resolución que deseemos utilizaremos diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones.

Análisis de la Muestra En algunos casos, los productos amplificados

poseen secuencias que son reconocidas por endonucleasas

Hibridación, Southern Blot

Ventajas del “PCR”A partir de una muestra pequeña de ADN se puede

obtener una cantidad considerable para el estudio que se vaya a realizar.

El producto se puede utilizar para clonar, secuenciar y análisis.

Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o muerto.

Sus aplicaciones son múltiples: medicina forense, diagnósticos, análisis prenatales, etc.

Desventajas del “PCR”Se puede reproducir solamente partes del genoma

en donde se conoce por lo menos una mínima secuencia de 20 – 40 pb.

Se necesitan “primers” específicos que sean complementarios al fragmento que se desea sintetizar.

La polimerización puede tener errores al sintetizar el ADN

Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo investigador o de cualquier otro)