UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTÓBAL DE HUAMANGA

FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA Y METALURGIAE.F.P. Ingeniería en Industrias Alimentarías

NUTRICIÓN

DETERMINACIÓN DE EXTRACTO ETÉREO Y PROTEÍNA CRUDA

Profesor : Ing. PANIAGUA SEGOVIA, Jesús J.

AYACUCHO-PERÚ

2012

PRACTICA Nº 02

DETERMINACIÓN DE EXTRACTO ETÉREO Y PROTEÍNA CRUDA

I. OBJETIVOS.- Determinar el % Extracto Etéreo o grasa en la mezcla fortificada de

cereales y leguminosa.- Dar a conocer las técnicas para la determinación de proteína cruda en

un alimento.- Determinar la proteína cruda en un alimento.

II. REVISICIÓN BIBLIOGRÁFICA.

2.1 Proteína:La proteína son polímeros cuyas unidades básicas son amino o aminoácidos. En la molécula de una proteína cientos, a veces miles de aminos se encuentran unidos unos tras otros por el enlace peptídico .Las propiedades física, químicas y nutricionales de las diferentes proteínas varían con su composición cuantitativa de aminoácidos, la secuencia y enlazamiento transversal o cruzado de las unidades de aminoácidos en la molécula proteica y la disposición. (Osborne y Voogt; 1986)

Los alimentos con proteínas que aportan los aminoácidos en cantidades cercanas al óptimo de satisfacción de las necesidades, son alimentos con proteínas de “alta calidad”. En otras palabras la calidad de una proteína está dada en primera instancia por su contenido de aminoácidos, en relación a una determinada necesidad que puede ser considerada en condiciones prácticas como un patrón de requerimientos, según se trate de la especie y del objetivo; y por la disponibilidad efectiva de sus aminoácidos absorbidos. (Muñoz; 1990)

Determinación de las proteínasExisten diversos métodos de determinación de proteínas como:

Nitrógeno total y proteína bruta (método Kjeldahl)

Nitrógeno total y proteína bruta (método colorimétrico automático)

Composición de aminoácidos (método cromatográfico automático)

2.1.1 El método KjeldahlLas proteínas de los alimentos contienen aminoácidos que tienen varios grupos funcionales, por lo que muestran una amplia variedad de reacciones químicas. Debido a que los alimentos contienen mezclas de proteínas, los métodos directos para la estimación de proteínas deben ser calibrados contra un método estándar de referencia para nitrógeno, por ejemplo, el procedimiento de Kjeldahl; aquí se menciona los procesos secuenciales de este método. (KIRK, 1996).

a. DIGESTION:Este método se basa en la combustión en húmedo de la muestra por

ebullición con ácido sulfúrico concentrado y en presencia de catalizadores metálicos, la materia orgánica se oxida a CO2 y H2O, mientras que la parte de ácido se reduce a SO2

Muestra + H2SO4 -----------> CO2 +2 SO2 + H2O + NH3

Catalizador

El nitrógeno transformado en NH3 se combina con la parte restante del ácido sulfúrico para formar el sulfato de amonio

NH3 + H2SO4 SO4 (NH4)2

b. DESTILACIÓN:Mediante esta operación el nitrógeno que está en forma de sulfato de

amonio, se ataca con un álcali fuerte que es la soda cáustica (NaOH) para liberar el amoniaco y después de la condensación lograda con la parte del refrigerante, el hidrato de amonio se recibe en un vaso precipitado.

SO4(NH4)2 + 2NaOH 2NH3 + Na2SO4 2H2O

El vaso de precipitado contiene: ácido bórico, con los siguientes indicadores (Tashiro) de pH rojo de metilo y verde de bromo crisol, formándose borato de amonio en el vaso.

2NH3 + H3BO3 (NH4)H2BO3

c. TITULACIÓN:Se hace con ácido sulfúrico o clorhídrico de normalidad conocida, el

ácido clorhídrico reacciona con el borato de amonio. En le punto final ya no hay borato de amonio y un pequeño exceso de ácido clorhídrico provocará un cambio de pH y por consiguiente el viraje de la mezcla (verde a rosado).

Así también vale mencionar que la destilación directa es recomendable debido a la presencia de los aminoácidos asparagina y glutamina que reaccionan también como amidas, los alimentos proteínicos desprenden amoníaco cuando se destilan con un exceso de solución concentrada de hidróxido de sodio. Ronalds (1974) usó esta técnica empleando el aparato de destilación de Kjeldahl para la determinación de proteínas en trigo y cebada (KIRK; 1996).

El contenido de nitrógeno, que se expresa como nitrógeno total o “proteína” (N x 6.25), se determina casi siempre por una combustión líquida en la que se convierte el nitrógeno y finalmente en amoníaco; el amoníaco se destila y se titula con una disolución ácida normalizada. Este método, ideado por J. Kjeldahl en 1883, ha sufrido numerosas modificaciones; las más aceptadas han sido incorporadas al método que ahora se conoce como Kjeldahl Gunning-Arnold (Hart y Fisher; 1986).

2.2 Extracto Etéreo:

- Lípidos.- Glicerol.- Ácidos grasos.- Vitamina A- Fosfolípidos.- Esteroles.- Gliceraldehido.- Triglicérido.- Etc.

Los lípidos, son un grupo general de sustancias orgánicas insolubles en solventes polares, como el agua, pero se disuelven fácilmente en solventes no polares, como el cloroformo, el éter y el benceno. Típicamente, los lípidos sirven como moléculas de almacenamiento de energía, usualmente en forma de grasa o aceite, y para propósitos estructurales, como el caso de los fosfolípidos, glucolípidos y cera. Algunos lípidos, sin embargo, sirven como “mensajero” químicos, tanto dentro como fuera de las células.La grasa o el lípido también es conocido como extracto etéreo, que se refiere al conjunto de las sustancias extraídas con éter etílico. Incluye además de los ésteres de los ácidos grasos con el glicerol a los fosfolípidos, las lecitinas, los esteroles, las ceras, los ácidos grasos libres, los carotenoides, la clorofila y otros pigmentos ( Hart y Fisher, 1994).

Los lípidos en términos generales se agrupan en simples, compuestos y derivados, de la siguiente manera:

- Lípidos simples:. Ácidos grasos o carboxilados. Grasas neutras (mono, di y triglicéridos). Ceras (ésteres de ácidos grasos con alcoholes superiores).

- Lípidos compuestos:. Fosfolípidos: lecitinas, cefalinas, esfingomielinas. Glucolípidos: lípidos + carbohidratos. Lipoproteínas: lípidos + proteínas

- Lípidos derivados:. Incluyendo esteroides (incluye los ésteres de esterol, como los del colesterol con ácidos de esteres no esterol, como los de la vitamina A) e hidrocarburos.

2.2.1 GRASAS:

El método a realizar en la determinación de la grasa de los alimentos depende del tipo de lípido presente, de los restantes componentes de los alimentos con que esta mezclado y del grado de exactitud e información requerido del análisis. Se necesita conocer el contenido de grasa total de un ingrediente o base cereal seco por ejemplo, cuya fracción lípidica esta compuesta principalmente por triglicéridos (KIRK, 1996).

El contenido de grasa (algunas veces llamado extracto etéreo, grasa neutra o grasa cruda), el cual puede ser considerado como formado de constituyentes lípido “libres” es aquel que puede ser extraído por los disolventes menores polares, como fracciones ligeras del petróleo o éter etílico, mientras que los lípidos enlazados requieren disolventes más polares para su extracción. Estos pueden separarse por hidrólisis u otros tratamientos químicos para obtener el lípido extraído de un producto alimenticio depende del método de análisis usado (KIRK, 1996).

2.2.2 MÉTODO DE SOXHET

Es un método directo para alimentos en general, aunque con excepción de aquellos en los que la grasa esta recubierta.El contenido en grasa libre se determina por extracción directa con éter dietílico o éter de petróleo. Este método no es igualmente apropiado para todos los grupos de alimentos, por que existen casos en los que no se puede determinar la cantidad de lípidos totales. Los lípidos se encuentran con frecuencia rodeados por carbohidratos o proteínas.Tiene una importancia esencial el que la muestra sea anhidra (es decir esta seca) por que el éter dietílico se disuelve parcialmente en agua a su vez extraerá azucares, entre otros compuestos durante la extracción de la grasa (MATISSEK, 1992).

III. MATERIALES Y METODOS.

3.1 MATERIALES 3.1.1DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA CRUDA

- Ácido Sulfúrico concentrado.- Catalizador (Sulfato de Potasio (15g) + sulfato de cobre (0.5g)- Solución de NaOH al 40%.- Solución de NaH 0.1N- Solución de HCl 0.1N- Ácido bórico al 4%- Sol. Indicador de rojo metilo 0.1%- Balones de digestión.- Erlenmeyer.- Digestor.- Micro Kjeldahl- Bureta- Balanza analítica y otros.- Pipetas volumétricas de 2.5 mL- Pipetas de 5.0 mL.- Pisceta con agua destilada.

3.1.2 DETERMINACIÓN DE EXTRACTO ETÉREO

- Solvente orgánico (n-hexano o éter)- Extracto Soxhlet.- Papel filtro.- Balón.- Pinzas.- Estufa.- Muestra.

3.2 MÉTODOS:

3.2.1 DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA CRUDA.

- Pesar 0.2 – 0.3g de muestra, luego agregar 1g. de catalizador de oxidación (mezcla de sulfato de potasio y sulfato de cobre) para acelerar la reacción. Limpiar con un poco de agua el cuello del balón de digestión, agregar 2.5 ml de ácido sulfúrico concentrado y colocar el balón en la digestota. La digestión termina cuando el contenido del balón es completamente cristalino ( si es necesario añadir peroxido) esto es cuando la digestión es muy lenta y difícil. El tiempo de digestión total no debe ser inferior a 2 horas. Luego dejar enfriar con 5 ml de agua destilada.

- Colocar la muestra digerida en el aparato de destilación, enjuagar con agua destilada un máximo de 5 ml, agregar 5 ml de NaOH concentrado e inmediatamente conectar el vapor para que se produzca la digestión.

- Conectar el refrigerante y recibir el destilado en un erlenmeyer de 300 ml conteniendo 5 ml de solución de ácido bórico al 4% mas

indicadores, hasta obtener 250 – 300 ml de destilado color azul – verde.

- Se titula con una solución de HCl 0.1N, la titulación se termina en el momento de que el color cambie a naranja – rojo. Anotar el gasto.

- Ácido bórico al 4%: pesar 40g de ácido bórico en fila de 1 L + verde de cromocresol al 1% (20ml) + rojo de metilo al 0.1 % (8ml).

- Realice el siguiente cálculo:

ml de HCL x N x meq. Nitrog. % de Nitrógeno = ---------------------------------------- x 100%

Gramos de muestra

Para obtener la cantidad de proteína bruta, se multiplica por el factor 6.25.

% Proteínas = % Nitrógeno x 6.25

3.2.2 DETERMINACIÓN DE EXTRACTO ETÉREO.

Para la determinación de extracto etéreo por este método se deben usar muestras deshidratadas por cualquier método, pero en lo posible, la muestra debe ser previamente secada a peso constante a 95 – 100 ºC en una estufa a vacío a una presión de 25 psia por un periodo de 5 horas y enfriadas posteriormente en una campana de extracción que contenga una sustancia deshidratante.- Poner a secar en una estufa a 110 ºC en Nº de balones que se va a

usar.- Luego de una hora, sacar los balones de la estufa y ponerlos a enfriar

en una campana que contenga una sustancia deshidratante.- Pesar los balones fríos.- Pesar de 3 – 5g de muestra secada como se indica mas arriba,

empaquetarla en un pedazo de papel filtro whatman nº 02.- Colocar el paquete en e cuerpo del aparato soxhlet y luego agregar n-

hexano destilado hasta que una parte de mismo sea sifoneado hacia el balón.

- Seguidamente conectar la fuente de calor.- El solvente (hexano o éter) a calentarse se evapora (69 – 34.6 ºC) y

asciende a parte superior del cuerpo. Allí se condensa por refrigeración con agua y cae sobre la muestra, regresando posteriormente al balón por sifón, arrastrando consigo el extracto etéreo. El ciclo es cerrado, la velocidad de goteo del n-hexano debe ser de 45 – 60 gotas por minuto.

- El proceso dura 3 horas. El matraz debe sacarse del aparato cuando contiene poco solvente (momentos antes de que esta sea sifoneada desde el cuerpo).

- Evaporar el n-hexano remanente en el balón en una estufa y enfriarla en una campana de desecación.

Peso balón con EE – Peso balón vacío % Extracto Etéreo = ----------------------------------------------------- x 100%

Gramos de muestra

IV. RESULTADO Y DISCUSIÓN.

4.1 RESULTADO

Cálculos para las soluciones:

- Solución de Ácido bórico al 4%:Para una solución de 100 ml Mac. bórico= 4x100 = 4 gr 100Se verterá los 4 gr de ac. Bórico a una fiola de 100 ml, y se enrasará con agua destilada.

- Solución de HCl 0.1 N:

VHCl = NxVxPM = 0.1x100x36,5 = 0,8221 ml %xDxθx1000 0.37x1.2x1000

4.1.1 Extracto Etéreo:

Cuadro Nº 01 Tabla de resultados de la extracción por Soxhlet

Peso balón con EE – Peso balón vacío % Extracto Etéreo = ----------------------------------------------------- x 100%

Gramos de muestra

Cálculo de extracto etéreo:

%EE1 = 108.1414 – 107.4369 x 100 % = 16,5516 4.2564

%EE2 = 113.4902 - 112.7536 x 100 % = 17,5473 4.1978

%EE3 = 100.4922 - 99.7902 x 100 % = 17,3090 4.0557%EEprom = 17,1360%

n Balón vacío (g)

Muestra (g)

Cartucho (g)

Balón con E.E. (g)

01 107.4369 4.2564 1.3155 108.141402 112.7536 4.1978 1.5202 113.490203 99.7902 4.0557 1.3329 100.4922

4.1.2 Proteína Cruda:

n Muestra (g)

Catalizador (g)

Volumen gastado HCl (ml)

01 0.2106 1.0016 2.4 02 0.2024 1.0028 1.503 0.2000 1.0038 1.1

Cuadro Nº02 Tabla de resultados por el método Kjeldahl

Cálculo del %N2 y %proteínas:Observación: Para el caso de la proteína solo trabajaremos con los datos 02 y 03:

%N2 (02) = 1,5 x 0,1N x 0,014 x 100 = 1,0376 % 0,2024

%proteína = 1,0376% x 6,25 = 6,4850

%N2 (03) = 1,1 x 0,1 x 0,014 x 100 = 0,77 % 0,2000

%proteína = 0,77% x 6,25 = 4,8125

%proteína prom = 5,6488%

4.2 DISCUSIONES:

- El cuadro Nº02 presenta los resultados experimentales obtenidos en la determinación de %N nitrógeno total la cual multiplicada con el factor 6.25, se determina % de proteína bruta en el caso de la mezcla fortificada es de 5.6488%. Por el método usado en la práctica de digestión completa (método kjeldahll) la cual también es recomendada por OSBORNE (1986), así como HART Y FISHER (1986).

- Cuadro Nº 03: Tabla de Comparación Muestra (100g) Dato Experimental Dato Teórico Proteínas (%) 5,6488%. 6,9 – 11,5 %

Extracto Etéreo (%) 17,1360% 12,78 – 15,34% (Grasa)

El % de proteína bruta obtenido experimentalmente es de 5, 6488% realizando una comparación con “La ficha Técnica de Especificaciones de la Mezcla Fortificada para Escolares” (2008), no concuerda con el dato teórico que es 6,9 – 11,5 % de proteína bruta en esta mezcla, pudiendo ser la lejanía de los resultados por otros factores como:

La mala manipulación de los materiales del laboratorio como: el pesado en la balanza analítica, no lo realizamos con exactitud; al preparar las soluciones, etc.

El % de Extracto Etéreo obtenido experimentalmente es de 17,1360% el cual es mayor al dato teórico de. “La ficha Técnica de Especificaciones de la Mezcla Fortificada para Escolares” (2008) que es de 12,78 - 15, 34%, el cual solo está referido a grasas y no al extracto etéreo como se realizo en la práctica. También influye diversos factores como:

La mala manipulación de los materiales del laboratorio como: el pesado en la balanza analítica, no lo realizamos con exactitud; al preparar las soluciones; etc.

V. CONCLUSIONES.

- Se determino él % Extracto Etéreo en la mezcla fortificada que es de 17,1360%.

- Se dio a conocer las técnicas para la determinación de proteína cruda en un alimento. (Método colorimétrico automático, Método cromatográfico automático, etc.)

- Determinamos la proteína cruda en la mezcla fortificada el cual obtuvimos 5,6488%.

VI. CUESTIONARIO.

6.1Métodos de determinación de proteínas

- Método de Macro – Kjeldahl

- Método colorimétrico automático (Nitrógeno total y proteína bruta)Aplicación: el método es aplicable a todos los tipos de productos alimenticios.Principio: El producto se digiere con acido sulfúrico concentrado utilizando peróxido de hidrogeno y mercurio como catalizadores para convertir el nitrógeno orgánico en iones de amonio. Empleando un sistema automático, el fenol y el hipoclorito sódico reaccionan con el amoniaco dando un color azul que se mide a 510 y 630 nm. Midiendo a las dos longitudes de onda es posible cubrir un factor de 100 en el contenido de nitrógeno.

- Proteína y nitrógeno no proteicoAplicación: este método es aplicable a todos los tipos de sustancias alimenticias e ingredientes.Principio: la muestra se digiere con agua. Las proteínas se precipitan con acetato de cobre y las sustancias nitrogenadas no proteicas quedan en solución. Después de filtrar el nitrógeno se determina sobre el precipitado y/o filtrado por el método Kjeldahl.

- Método cromatográfico automático(Composición en aminoácidos)Aplicación: la composición en aminoácidos de las proteínas de los alimentos.Principio:

a) Tratamiento de las proteínas para liberar los aminoácidos: las muestras se hidrolizan con acido clorhídrico, en ausencia de aire, para romper los enlaces peptídicos de la proteína. Este procedimiento da buenos resultados para los aminoácidos estales a los ácidos, es decir, todos los que comúnmente s presentan en las proteínas de los alimentos excepto la cistina, cisteína, metionina y triptófano, que son lábiles en condiciones de hidrolisis acidad, y requieren por tanto métodos de análisis separados.Los aminoácidos cistina, cisteína y metionina son oxidados por tanto primero con acido per fórmico, bajo condiciones controladas, para convertirlos en sus residuos de acido cisteico y metionina sulfona. Estos residuos acido-estables se liberan seguidamente de la proteína por hidrólisis con acido clorhídrico.La hidrólisis de la muestra con hidróxido bárico en solución, en ausencia de aire, libera el triptófano sin que se descomponga.

b) Cromatografía y determinación de los aminoácidos: Los análisis cromatográficos se efectúan con un analizador automático de aminoácidos que se basa en el principio descrito por Spackman et al.(1958) por el que los aminoácidos se fraccionan sobre resinas de intercambio iónico por elución con un sistema tampón discreto. El eluido se mezcla con reactivo de ninhidrina y la mezcla se hace pasar a través de un serpentín de reacción sumergido en baño de agua hirviendo. Transcurridos 15 minutos, durante los cuales se produce la reacción coloreada, la corriente que sale pasa a través de colorímetros en los que se determinan continuamente las absorvancias a 570 y 440 nm. Las áreas de los picos registrados se miden bien con un integrador o por triangulación.La cantidad de aminoácidos de la muestra se determina por comparación de las áreas de las soluciones de la muestra problema con las áreas obtenidas a partir de soluciones patrón que contienen cantidades conocidas de aminoácidos.

- Método de Mitchell y Block(Determinación de la calidad de proteína por el “Chemical Score” )Aplicación: A todas las proteínas solo como guía semi-cuantitativa.Principio: Los niveles de aminoácidos esenciales de la proteína problema son comparados con los de una proteína de referencia. El aminoácido esencial cuyo nivel en la proteína problema sea mas bajo en comparación con los niveles de la muestra de referencia en base al porcentaje es identificado. La reducción del porcentaje de este aminoácido se utiliza seguidamente para calcular el “Chemical Score”.

6.2 Métodos de determinación de lípidos o grasas.

- Método de Soxhlet

- Método de Weibul (grasa total)Aplicación: El método es aplicable a casi todos los productos alimenticios excepto a determinados productos lácteos.

Principio: la muestra se hierve con acido clorhídrico diluido para liberar las fracciones de lípidos ocluidos y lípidos combinados a continuación la grasa se extrae con n-hexano o éter de petróleo

- Método de Roese-Gottlieb (grasa en productos lácteos)Aplicación: El método es aplicable a la leche, productos lácteos y helados.Principio: El contenido graso se determina gravimétricamente tras la extracción de la grasa con éter dietílico y éter de petróleo de una solución alcohólico amoniacal de la muestra.

- Método de extracción con Cloroformo – metanol (grasa total)Aplicación: El método es aplicable a todos los tipos de productos alimenticios cuando se necesita la ulterior caracterización de la grasa.Principio: La grasa se extrae de la muestra por agitación vigorosa con mezcla de cloroformo/metanol a temperatura ambiente. Se añade una cantidad calculada de agua para que se separen dos fases, de las que la capa inferior de cloroformo contiene la grasa. La capa de cloroformo se separa aparte, se lava con solución de cloruro sódico diluida para eliminar el material proteico extraído y se deseca con sulfato sódico anhidro. El extracto de cloroformo se evapora seguidamente a sequedad en un vial tarado y se pesa el residuo de grasa.

- Método de cromatografía gas-líquido (composición en ácidos grasos)Aplicación: El método es aplicable a todos los tipos de lípidos que contengan ácidos grasos dentro del rango C10:0 a C22:6 .Principio: La muestra de grasa es trasmetilada y los esteres metílicos, una vez purificados, se separan por cromatografía gas-liquido.

VII. BIBLIOGRAFÍA. EGAN HAROLD, KIRK RONAL S. Y SAWYER RONALD. Análisis

Químico de Alimentos de Pearson. Primera Edición. Compañía Editorial

Continental, S.A de CV. México. 1987.

HART, F.L. Y FISCHER, H.J. Análisis Moderno de los Alimentos.

Editorial Acribia. Zaragoza (España).1991

MATISSEK REINHARD, SHNEPEL FRANK-M Y STEINER GABRIEL.

Análisis de los Alimentos; fundamentos, métodos aplicaciones. Editorial

Acribia, S.A. Zaragoza (España) 1998.

Especificaciones técnicas 2008 Mezcla fortificada escolar "Programa

integral de nutrición Sub programa escolar", PRONAA, 2008.

OBSORNE, D. y VOOGT, P., Análisis de los nutrientes de los alimentos.

Editorial Acribia, España.