Muestreo y Convergencia en Muestreo y Convergencia en calculos de Energia Libre de calculos de Energia Libre de

Interacciones Proteina-Ligando:Interacciones Proteina-Ligando:El enlace de la tripenoxipiridina El enlace de la tripenoxipiridina derivado a factor Xa y tripsina derivado a factor Xa y tripsina

ResumenResumen Se estudia el muestreo y convergencia de los Se estudia el muestreo y convergencia de los

calculos de energia libre de un conjunto de 10 calculos de energia libre de un conjunto de 10 tripenoxipiridina derivados a dos serine tripenoxipiridina derivados a dos serine proteases, factor Xa y tripsinaproteases, factor Xa y tripsina

Las mutaciones de un compuesto a otro Las mutaciones de un compuesto a otro involucran alrededor de 19 atomos, la creacion y involucran alrededor de 19 atomos, la creacion y aniquilacion de carga neta y varios modos aniquilacion de carga neta y varios modos alternativos de enlace.alternativos de enlace.

Se obtiene alta convergencia en los resultados Se obtiene alta convergencia en los resultados (_+5-10 kJ/mol), se debe al uso de potenciales (_+5-10 kJ/mol), se debe al uso de potenciales soft-core que facilitan la creacion y supresion de soft-core que facilitan la creacion y supresion de atomos, por una adecuada eleccion del camino atomos, por una adecuada eleccion del camino de mutacion y por una escala de tiempo de un de mutacion y por una escala de tiempo de un nanosegundo. nanosegundo.

IntroduccionIntroduccion El calculo de EL es central porque todas las El calculo de EL es central porque todas las

propiedades de equilibrio, como la fase, cte. de propiedades de equilibrio, como la fase, cte. de asociación-disociación, solubilidad, etc asociación-disociación, solubilidad, etc dependen de la diferencia de EL.dependen de la diferencia de EL.

La diferencia de EL esta relacionada a la La diferencia de EL esta relacionada a la probabilidad de encontrar a un sistema en un probabilidad de encontrar a un sistema en un estado microscopico dado.estado microscopico dado.

El costo computacional es alto si se quiere El costo computacional es alto si se quiere calcular un promedio termico sobre las calcular un promedio termico sobre las configuraciones microscopicas a un nivel configuraciones microscopicas a un nivel atomico, para luego calcular la diferencia de EL atomico, para luego calcular la diferencia de EL entre dos estados.entre dos estados.

Pero esto cambia si se Pero esto cambia si se usa potenciales usa potenciales intermedios modificadosintermedios modificados

Se evaluara la afinidad Se evaluara la afinidad de enlace relativa de un de enlace relativa de un conjunto de 10 conjunto de 10 inhibidores a dos serine inhibidores a dos serine proteases, factor Xa y proteases, factor Xa y tripsina, que comparten tripsina, que comparten secuencia y estructura secuencia y estructura homologa.homologa.

Por este echo los sitios Por este echo los sitios activos de muchos serine activos de muchos serine proteases son muy proteases son muy similares, y es importante similares, y es importante que los inhibidores que los inhibidores enlacen selectivamente al enlacen selectivamente al factor Xa y no a otra factor Xa y no a otra serine proteases, como la serine proteases, como la tripsina o trombina.tripsina o trombina.

Los inhibidores Los inhibidores analizados en este analizados en este estudio tienen como estudio tienen como molde la tripenoxipiridina, molde la tripenoxipiridina, pero difieren en numero y pero difieren en numero y tipo de sustituyentes, R1 tipo de sustituyentes, R1 y R2.y R2.

Los inhibidores difieren Los inhibidores difieren unos de otros y para la unos de otros y para la transformacion de uno en transformacion de uno en otro involucran otro involucran mutaciones.mutaciones.

Entonces se requiere Entonces se requiere calculos adicionales y calculos adicionales y esto afecta la esto afecta la convergencia de los convergencia de los resultados. resultados.

Primero buscaremos la auto consistencia, Primero buscaremos la auto consistencia, explotando el echo que la EL es una explotando el echo que la EL es una funcion de estado asi que la diferencia de funcion de estado asi que la diferencia de EL entre dos estados es independiente del EL entre dos estados es independiente del camino escogido. Podemos escoger un camino escogido. Podemos escoger un camino reversible y evaluar le diferencia camino reversible y evaluar le diferencia de EL de ida y de regreso.de EL de ida y de regreso.

MetodosMetodos Estudiaremos los Estudiaremos los

complejos: factor Xa y complejos: factor Xa y tripsina con un conjunto tripsina con un conjunto de 10 inhibidores .de 10 inhibidores .

Los sustituyentes R1 y Los sustituyentes R1 y R2 para cada inhibidor R2 para cada inhibidor son mostrados en la son mostrados en la tabla.tabla.

Debido a que no tenemos Debido a que no tenemos data estructural del data estructural del complejo, se uso como complejo, se uso como molde inicial la estructura molde inicial la estructura cristalográfica del cristalográfica del complejo: factor Xa y complejo: factor Xa y tripsina con 2,6-tripsina con 2,6-dipenoxipiridina.dipenoxipiridina.

La estructura de factor Xa es La estructura de factor Xa es comprendida por dos comprendida por dos cadenas polipeptidas. Sin cadenas polipeptidas. Sin embargo solamente se embargo solamente se incluyo la cadena primaria el incluyo la cadena primaria el cual contiene lo sitios de cual contiene lo sitios de enlace.enlace.

La inicial estructura del La inicial estructura del complejo: factor Xa y tripsina complejo: factor Xa y tripsina con el inhibidor I1 fue con el inhibidor I1 fue construido por superponer construido por superponer los atomos de nitrogeno del los atomos de nitrogeno del grupo amino-metyl y los grupo amino-metyl y los atomos de nitrogeno del atomos de nitrogeno del grupo amidazolil del inhibidor grupo amidazolil del inhibidor sobre los correspondientes sobre los correspondientes atomos en la apropiada atomos en la apropiada estructura del molde.estructura del molde.

La conformacion de I1 usado para este La conformacion de I1 usado para este procedimiento fue tomado de una procedimiento fue tomado de una simulacion del inhibidor aislado en agua.simulacion del inhibidor aislado en agua.

La estructura del complejo: factor Xa y La estructura del complejo: factor Xa y tripsina con los inhibidores I2-I10 fue tripsina con los inhibidores I2-I10 fue derivado del complejo I1 por mutar los derivado del complejo I1 por mutar los sustituyentes R1 y R2 durante el calculo sustituyentes R1 y R2 durante el calculo de energia libre.de energia libre.

MutacionesMutaciones

Las mutaciones fueron Las mutaciones fueron escogidas en orden a escogidas en orden a maximizar el numero de maximizar el numero de posibles ciclos cerrados posibles ciclos cerrados mientras se minimiza el mientras se minimiza el tamaño de la mutación tamaño de la mutación misma.misma.

Como la EL de cualquier Como la EL de cualquier ciclo cerrado es cero ciclo cerrado es cero entonces se puede entonces se puede comprobar la comprobar la convergencia de los convergencia de los cálculoscálculos

Force FieldForce Field La Gromos96 campo de La Gromos96 campo de

fuerza fue usado para fuerza fue usado para describir ambos: la proteína describir ambos: la proteína y el inhibidor.y el inhibidor.

Cuando los parámetros no Cuando los parámetros no fueron compatibles para fueron compatibles para describir cierto tipo de describir cierto tipo de interacción estos se interacción estos se obtuvieron por hacer un obtuvieron por hacer un calculo de ab initio.calculo de ab initio.

Los parametros que no Los parametros que no estaban disponibles incluido estaban disponibles incluido el potencial torsional entre el el potencial torsional entre el anillo penoxy y la piridina, y anillo penoxy y la piridina, y algunas cargas atomicas. algunas cargas atomicas. Los calculos se hicieron con Los calculos se hicieron con el metodo RHF con el el metodo RHF con el programa gaussian94.programa gaussian94.

Las cargas atómicas Las cargas atómicas fueron derivadas por fueron derivadas por hacer una escala de las hacer una escala de las cargas atómicas cargas atómicas obtenidas por montar el obtenidas por montar el potencial electrostático potencial electrostático molecular RHF/6-31G molecular RHF/6-31G de la correspondiente de la correspondiente pequeña molécula pequeña molécula orgánica, usando el orgánica, usando el metodo de Merz y metodo de Merz y Kollman. Los parametros Kollman. Los parametros adicionales derivados adicionales derivados para el uso en lo para el uso en lo calculos son calculos son presentados en la tabla.presentados en la tabla.

Detalles computacionalesDetalles computacionales Se utilizo el GROMACS para la simulación de MD en solvente Se utilizo el GROMACS para la simulación de MD en solvente

explicito y bajo condiciones de frontera periódicas .explicito y bajo condiciones de frontera periódicas . El complejo proteína-inhibidor fue colocado en una caja octaédrica El complejo proteína-inhibidor fue colocado en una caja octaédrica

truncada que contiene aproximadamente 6300 moléculas de agua. truncada que contiene aproximadamente 6300 moléculas de agua. Simulaciones del inhibidor libre en agua fue realizado en cajas que Simulaciones del inhibidor libre en agua fue realizado en cajas que contienen aprox. 850 moléculas de agua.contienen aprox. 850 moléculas de agua.

El rango limite de interacciones no enlazantes fue:El rango limite de interacciones no enlazantes fue: 0.9nm-1.4nm .0.9nm-1.4nm . Para la corrección del campo eléctrico mas allá del rango limite se Para la corrección del campo eléctrico mas allá del rango limite se

utilizo una cte. Dieléctrica de utilizo una cte. Dieléctrica de εεRFRF=78.0=78.0 El tiempo de paso usado para integrar la ecuación de movimiento El tiempo de paso usado para integrar la ecuación de movimiento

fue 0.002 ps . La longitud de enlace y el ángulo de las moléculas de fue 0.002 ps . La longitud de enlace y el ángulo de las moléculas de agua fueron restringidas usando el algoritmo de SETTLE mientras agua fueron restringidas usando el algoritmo de SETTLE mientras la longitud de enlace dentro la proteína fue restringido por el la longitud de enlace dentro la proteína fue restringido por el algoritmo de LINCS.algoritmo de LINCS.

El complejo Proteína-I1 fue equilibrado en 2 ns antes de calcular la El complejo Proteína-I1 fue equilibrado en 2 ns antes de calcular la EL. Para el caso del inhibidor libre en agua el tiempo de equilibrio EL. Para el caso del inhibidor libre en agua el tiempo de equilibrio fue 200 ps.fue 200 ps.

Cálculos de la Energía Libre Cálculos de la Energía Libre

La EL de enlace,La EL de enlace,ΔΔGGbb, es , es

el trabajo requerido para el trabajo requerido para transferir al inhibidor de transferir al inhibidor de un estado libre en agua un estado libre en agua a un estado enlazado a a un estado enlazado a la proteina. La relativa la proteina. La relativa EL de enlace, EL de enlace, Δ Δ Δ Δ GGbb

X-YX-Y , ,

representa la diferencia representa la diferencia en la EL de enlace entre en la EL de enlace entre el inhibidor X y el el inhibidor X y el inhibidor Y y fue inhibidor Y y fue evaluado usando el ciclo evaluado usando el ciclo termodinámico termodinámico mostrado.mostrado.

En el calculo de En el calculo de Δ Δ GGX-YX-Y un inhibidor fue un inhibidor fue gradualmente mutado en otro inhibidor. En el gradualmente mutado en otro inhibidor. En el caso donde no hubo directamente caso donde no hubo directamente correspondencia entre los atomos en las dos correspondencia entre los atomos en las dos moleculas se utilizo los atomos falsos.moleculas se utilizo los atomos falsos.

Solamente las interacciones enlazantes y no-Solamente las interacciones enlazantes y no-enlazantes fueron mutadas durante los calculos.enlazantes fueron mutadas durante los calculos.

Las interacciones no-enlazantes entre el estado Las interacciones no-enlazantes entre el estado inicial y el estado final fueron interpoladas inicial y el estado final fueron interpoladas usando un potencial soft-core.usando un potencial soft-core.

Todas las mutaciones indicadas en la figura 2 y Todas las mutaciones indicadas en la figura 2 y 3 fueron realizadas para los inhibidores en el 3 fueron realizadas para los inhibidores en el complejo y los inhibidores en agua. complejo y los inhibidores en agua.

La EL fue evaluada usando 18 La EL fue evaluada usando 18 λλ-puntos. El -puntos. El numero de numero de λλ-puntos fue incrementadas para -puntos fue incrementadas para casos donde la mutación genera una grande casos donde la mutación genera una grande perturbación en el sistema in regiones donde la perturbación en el sistema in regiones donde la ecuación 1 como una función de ecuación 1 como una función de λλ exhibe una exhibe una pronunciada discontinuidad .pronunciada discontinuidad .

Se muestra en la fig.6 el valor de ∂H(Se muestra en la fig.6 el valor de ∂H(λλ)/∂)/∂λλ de de dos mutaciones. Para el caso de la mutación I3-dos mutaciones. Para el caso de la mutación I3-I4 la curva es discontinua y para el caso de I3-I6 I4 la curva es discontinua y para el caso de I3-I6 la curva es suave.la curva es suave.

El valor promedio de la derivada fue calculada El valor promedio de la derivada fue calculada en cada en cada λλ-punto y el resultado fue integrado -punto y el resultado fue integrado usando el método del trapecio para obtener usando el método del trapecio para obtener Δ Δ GGX-YX-Y