Medio de Keister modificado para el cultivo de Giardia lamblia in vitro.

INTRODUCCIONEl primer protozoo parásito fue visto en 1681 por Anthony van Leeuwenhoek en su rudimentario microscopio, en una muestra de sus propias materias fecales que correspondió al flagelado GiardiaBlanchard en 1885 observó parásitos similares en renacuajos y los llamo Giardia agulis, en honor al zoólogo Alfred giard que nada tuvo que ver con el parásito, Blanchard en el mismo año recoció a Lambl como sus descubridor y lo denominó Lablia intestinalis.

CLASIFICACIÓN GIARDIAHasta ahora, los estudios moleculares han identificado diversas especies y 7 - 8 tipos genéticos, Especies:G. duodenalis - principalmente en mamíferos; G. agilis - en anfibios; G. ardeae y G. psittaci - en aves; G. microti y G. muris - en roedores.Giardia duodenalis (Sín: G. lamblia; G. intestinalis) es el nombre del protozoo flagelado del phylum Sarcomastigophora, subphylum Mastigophora, protozoariso que presentan flagelos y membranas ondulantes. Tiene 4 pares de flagelos que nacen de estructuras denominadas blefaroblastos (anterior, posterior, neutral y caudal), es agente causal de la giardiasis. una parasitosis de intestino delgado proximal, cosmopolita, que puede manifestarse como un síndrome diarreico agudo, crónico o intermitente. También existe el estado de portador asintomático.Giardia lamblia presenta dos formas morfológica: el trofozoíto o forma móvil y el quiste, una forma pequeña que resiste las condiciones medio ambientales adversas. La forma móvil se encuentra como parásito en el tubo digestivo del hombre t la forma de resistencia es expulsada en la materia fecal y se encuentra en el medio ambiente.El trofozoíto tiene forma simétrica bilateral, es periforme (extremo anterior ancho y extremo posterior delgado, diámetro mayor 12 micras aproximadamente. En la parte anterior tienen una estructura llamada disco suctor, que le permite adherirse al epitelio intestinal, con una parte rígida llamada axolema o axostilo, con función de esqueleto. En la parte del núcleo sector presenta dos núcleos idénticos y ovalados con una enorme masa de cromatina central. En la parte media se encuentran los cuerpos parabasales y no contiene citosoma, por lo que tienen que absorber nutrientes mediante endocitosis.El quiste es una estructura ovalada más pequeña que puede medir desde 6 a 7micras hasta 10 o 12. Tiene como carácter fundamental ser la fase de resistencia que le permite vivir en el medio ambiente, esta característica es gracias a la pared gruesa llamada pared quística. En el interior del citoplasma contiene núcleos, los maduros tienen 4 y los inmaduros dos.

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICOFACULTAD DE QUÍMICAQUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGOParasitología

CICLO BIOLOGICO:Los trofozoítos se localizan ene l intestino delgado, fijados a la mucosa, principalmente en el duodeno. Allí se multiplican por división binaria aumentan el pH del estómago y el nivel de colesterol cae y los que caen a la luz intestinal dan origen a quistes, debido a que los trofozoítos no sobreviven fuera del huésped y comienzan a cambiar su forma con procesos de enquistación de vesículas específicas.Durante la fase de enquistación cuando las proteínas de la pared del quiste son excretadas al superficie del trofozoíto, algunas escapa y pueden ser identificadas mediante pruebas antígeno-anticuerpoLos quistes son eliminados con las materias fecales y pueden permanecer viables en el suelo húmedo o en el agua por varios meses. Infectan por vía oral y después de ingeridos resisen la acción del jugo gástrico y se rompen en el intestino delgado para dar origen a 4 trofozoítos por cada quiste. Los trofozoítos no son infectantes cuando entran por vía oral, La enquistación ocurre conforme el parásito es arrastrado por el tránsito intestinal hacia el colon. El quise es el estado que se encuentra más comúnmente en las heces formadas. Sale en forma de trofozoíto cuando no le da tiempo de transformase en quiste, esto por tránsito intestinal acelerado.

PATOLOGIA

El principal mecanismo de acción patógena en giardiasis se debe a la acción de los parásitos sobre la mucosa del intestino delgado, principalmente el duodeno y yeyuno. Esta acción se hace por fijación de los trofozoítos por

medio de la ventosa, permite penetrar un poco la mucosa, generando absorción deficiente de los nutrientes, se observa también la secreción de moco como producto de la irritación que produce la presencia de los trofozoítos en la pared del epitelio intestinal. Ese moco genera una doble obstrucción para la absorción y provoca además una reacción inflamatoria.En este casos las vellosidades intestinales se encuentran atrofiadas, hay inflamación de la lámina propia y alteraciones morfológicas de las células epiteliales. Las pruebas de absorción de vitaminas A, B12 y la D-xilosa están alteradasSe ha relacionado la patología de esta parasitosis con la presencia de hipogammaglobulemia, principalmente deficiencia de IgA secretora. Algunos casos de giardiasis grave se han asociado con la presencia de hiperplasia nodular linfoide en intestino delgado y grueso. No se acepta que haya invasión en vías biliares y por consiguiente no es correcto atribuirle patología hepato-billiar.

FISIOPATOLOGIALa sintomatología de la giardiasis, principalmente es diarrea, tiene mecanismos multifactoriales , podemos dividir en dos gruposa.- lesiones de la mucosa: la alteración de las vellosidades intestinales que pueden ser a su vez por atrofia e inflamación con aumento de linfocitos o por la presencia de productos secretorios y excretores de los parásitos que lesiones los enterocitosB.- Factores luminales: estos pueden dividirse en dos grupos : 1 aumento de la flora bacteriana, con capacidad de desdoblar sales biliares y dificultar absorción . 2 disminución de enzimas como disacaridas, tripsina y lipasa que aumentan la eliminación de grasa y contribuyen a la malabsorción de electrolitos, solutos y agua.

ESPECTRO CLÍNICO.Los cuadros clínicos oscilan entre el estado de portador asintomático y las enfermedades aguda y crónica.

El período de incubación es de 1 - 2 semanas. Un gran porcentaje de personas presenta infecciones asintomáticas, con malabsorción intestinal imperceptible..

Entre las manifestaciones de la enfermedad aguda se encuentran: diarrea acuosa o pastosa, esteatorrea (evacuaciones grasosas, generalmente explosivas y fétidas), dolor epigástrico postprandial, anorexia, distensión abdominal, flatulencia y ocasionalmente, cefalea, febrícula, manifestaciones alérgicas (artralgias, mialgias, urticaria). La enfermedad aguda puede resolverse en unas semanas, aún sin tratamiento, pero un porcentaje importante de pacientes desarrolla una parasitosis crónica, con diarrea recurrente, esteatorrea, evidencia bioquímica de malabsorción de grasas, lactosa y otros disacáridos, vitamina A y vitamina B12, disminución de peso y deficiencias en el crecimiento y desarrollo infantil.También se ha asociado a Giardia y a otros protozoos con el síndrome de intestino irritable.

Diagnóstico diferencial: Deben contemplarse rotavirus, adenovirus, Campylobacter, E. histolytica, Cryptosporidium, Escherichia coli enteropatógena, Strongyloides stercoralis, enfermedad celiaca, úlcera duodenal.

DIAGNÓSTICO.- Antecedentes epidemiológicos y cuadro clínico.- Observación microscópica de trofozoítos (en materia fecal acuosa - mediante el examen directo en fresco, con solución salina y lugol) y quistes (en materia fecal sólida o semisólida - se utilizan exámenes coproparasitoscópicos de concentración por flotación), estudios de baja sensibilidad y alta especificidad.- ELISA para captura de coproantígenos e inmunoelectrotransferencia.

- Técnicas basadas en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). - Procedimientos seguros cuando son realizados por profesionales, y que constituyen un recurso más en el diagnóstico de giardiasis son la endoscopía con examen de contenido duodenal y biopsia intestinal.

EPIDEMIOLOGIASegún publicaciones de la OMS, más de la quinta parte de la población mundial está infectada por uno o varios parásitos intestinales y en muchos países de América Central y Sudamérica el promedio de infecciones parasitarias es del 45%. Se estima en 1000 millones las personas infectadas por Ascaris lumbricoides, 500 millones con Trichuris trichiura, 480 millones con Entamoeba histolytica y 200 millones con Giardia lamblia.Se estima que alrededor de 200 millones personas presentan la enfermedad en Asia, África, Latinoamérica, con 500 000 casos nuevos/año. (Thompson RCA. 2008)desde 1960 la giardiasis se ha asociado a brotes epidémicos importantes en países altamente industrializados, por ingesta de agua contaminada y en guarderías. Actualmente, se reporta un aumento en el número de casos.Afecta a diversos mamíferos, anfibios, reptiles y aves. Los animales domésticos y el ganado representan reservorios potenciales importantes de Giardia (se ha hecho mención de brotes zoonóticos aislados).Cabe resaltar que en México, la prevalencia (7.4 - 68.5%) e incidencia más altas se encuentran entre lactantes, preescolares y escolares.La prevalencia en zonas endémicas es dos a tres veces mayor en niños que en adultos, atribuible a la adquisición de anticuerpos protectores, por infecciones repetidasLa prevalencia y sintomatología son mayores en adultos extranjeros que visitan zonas endémicas, comparadas con adultos nativos de la región.3.- Pacientes con hipogammaglubulinemia presentan mayor frecuencia de diardiasis y mayor sintomatología.

MEDIO DE CULTIVOEn el diagnóstico clínico, el cultivo de los protozoarios parásitos no juega un papel importante, la microscopia sigue siendo la técnica de elección hará identificación de la mayoría de ellos, aunque no es posible el cultivo in vitro de todos los protozoarios parásitos, algunos de se pueden aislar y cultivar en medio de cultivo.La importancia de medios de cultivo de protozoarios es principalmente por motivos de investigación de las especies de dichos organismos. Hay tres tipos básicos de sistemas de cultivosXENICO: En el cual el parasito es cultivado en presencia de una flora indefinidaMonoxenico: en el cual el parasito es cultivado en ausencia de cualquier organismo Polixenico: cultivos de los cuales es conocida la identidad de todas las especie presentes.

El cultivo in vitro de Giardia lamblia ha sido reportado de mucha importancia por los investigadores, ya que el estudio de varias cepas especialmente aquellas que parasitan al hombre, permite el aislamiento de rutina del organismo del hospedero, mejorado así el abordaje diagnóstico de esta enfermedad, además de que ayuda a adentrarse mejor en su clasificación y epidemiologia.Se ha cultivado Giardia lamblia con éxito, los medios de cultivo se han ido modificando adaptándolos a la cepa, con sus ventajas y limitaciones.

Hasta la fecha se ha utilizado 3 medios básicos de cultivo TPS-1 (Tripticase, panmede, serum), TYI-S-33 (trypticase, yeast extrac, irno-serum) y el medio libre de suero.En 159 Karepetyan logró cultivar Giardia lablia junto con hongo parecido a la levadura, utilizando un cultivo con fibroblastos de pollo. Un caldo hecho con extracto de embrión de pollo, suero humano, digerido de carne y solución de hanks. El cultivo duro 7 meses, y los parásitos continuaron su reproducción aun cuando los fibroblastos hubieran muerto.En cultivo axenico, el microorganismo moría en un intervalo de 1 a 2 días, el investigar supuso que para su crecimiento la guardia utilizaba substancias producto de las levaduras.En 1965 meyer intento cultivar guardia utilizando el método de karapetyan; sin embargo, los trofozoítos persistieron en el tubo de cultivo de cuatro a 7 días, ninguno sobrevivía más de 11 días. Atribuyo que S.cerevisiae de karapetyan se multiplicaba con más rapidez que la de ellos, proporcionando al cultivo más productos metabólicos. Meyer resolvió el problema agregando diariamente más levadura al medio. Mantuvo el cultivo de guardia por 18 meses.Más tarde Panmede y diamond encontraron que el extracto de levadura suplementado con hierro, vitamina b12, ácido táctico y tween 80 era el sustituto apropiado para incrementar la eficacia le llamaron TYI-33.En 1983, David Keister desarrollo un medio de cultivo en donde usa como base el medio TY-S-33 de Diamond, combinándolo con bilis bovina para axenizar y cultivar giardia lablia, tomando en cuenta que este parasito habita en la parte superior del intestino delgado, quiso comprobar si la bilis favorecía su crecimiento, encontrado que , efectivamente, al agregar bilis cruda aumentaba el crecimiento del parasito, se suprimió el uso de la mezcla de vitaminas y tween 80 del medio TYI-S-33 ya que este no favorecía el creciente de giardia. Este medio de cultivo se utiliza en el CDC (center of diease control).

Fundamento de medio de cultivo:Se hace una mezcla de fuente primaria para crecimiento, como el requerimiento de carbohidratos mediante el uso de glucosa, el requerimiento proteico con el uso de digerido pancreático de caseína una proteína usada como de almacenamiento fácil de degradar y por lo tanto poder permitir la ingesta de aminoácidos, hidrocloruro de cisteína, la cual ayuda también como fuente de Azufre, suplementos vitamínicos con el extracto de levadura ya además de que cuenta con un alto contenido proteico por lo tanto complementa la ingesta proteica junto con la caseína, cuenta con un gran número de vitaminas del complejo B, y cuenta también con algunos factores de crecimiento.El fosfato y di fosfato se utilizan para crear un ambiente amortiguador en el medio y mantener el pH entre 7 y 7.2 cloruro de sodio se utiliza para regular la presión osmótica de la solución y no crear lisis celular.El ácido ascórbico y el cloruro férrico de amonio son factores de crecimiento que se utilizan en menor cantidad, pero necesarios para el buen desarrollo de las células parasíticas. Como fuente de nitrógeno, vitamina C e Hierro.El sulfato de estreptomicina y la ampicilina al ser antibióticos de amplio espectro evitar crecimiento bacteriano principalmente gram (-) que habita de forma muy abundante en el colon y que por tener un crecimiento mucho más acelerado que los parásitos compiten por los nutrientes en el medio invadiéndolo en horas y no permiten el desarrollo de los parásitos.

Dos componentes muy importantes son la bilis deshidratada y el suero desnaturalizado ambos de origen bovino, debido a que la bilis le genera la enquistación de Giardia intestinalis, regulando más el cultivo, y el suero bovino está altamente enriquecido con componentes proteicos y colesterol que son muy necesarios para el desarrollo del parasito, como en el suero se encuentran todos los componentes nutrimentales del animal, y Giardia lamblia, parasita estos animales se concluye que adicionando con suero bovino es cómo manejar un ambiente en nutrimentos más parecidos al del animal, por si algún componente que tiene el suero no se puede adicionar de forma sintética, porque se desconoce, pero que al adicionar el suero bovino se han visto resultados de incremento en producción de parásitos, que con suero humano, quizás por presencia de anticuerpos, y que en ausencia de suero.

En algunos casos se recomienda el uso de tejido viseral de pollo debido a que el parasito se alimenta de células epiteliales del intestino delgado.Detalles del medio de cultivo

AQUÍ LO DE PAGUINA 19

1.-MEDIO DE CULTIVO DE KEISTER

Materiales y reactivosSOLUCIÓN #1 - I g Fosfato dibásico de potasio (K2HPO4)- 600 mg Fosfato monobásico de potasio (KH2PO4)- 30.8 gramos de biosato (BBL)(preparado especial que contiene 65% de digerido pancreático de caseína y 35% de extracto de levadura, y fabricado especialmente para estos medios de cultivo)-2g de Cloruro de Sodio-22.8 mg citrato férrico de amonio (Sigma)-750 mg bilis bovina deshidratada (Sigma)SOLUCIÓN #2-10 g de glucosa-200 mg ácido ascórbico-2 g de Hidrocloruro de cisteína (Sigma)- 100 mL de agua destiladaSOLUCIÓN #3-Hidróxido de Sodio 2NAparte:100 mL de suero bovino inactivado (56oC por 30 min). (Sigma) Mantener congelado.-1g de Sulfato de estreptomicina-1millón de unidades de Penicilina G Potásica-Filtros Nalgene para esterilizar de 0.45 μm-tubos para cultivo de 16 x 100 mm- Erlenmeyer de 500 y 1000 mL- Probetas- Mezcaldor -Balanza analítica -Incubadora de Baja Temperatura -Refrigeradora-Agitador -Potenciómetro Procedimiento:1.- Para preparar la solución #1 se mezclaron uno a uno los reactivos, en el orden de aparecimiento, a 890 mL de agua destilada, Se ajustó el pH entre 7.0-7.2 con hidróxido de sodio, fue esterilizado en autoclave (121°C,15min) y se almacenó congelado en frascos estériles, hasta su utilización.

2.- Para la solución #2 se mezclaron los ingredientes. Se esterilizó por filtración y se almacenó congelado, hasta utilizarse.3.- La solución #3 se esterilizó en autoclave y fue almacenada en un frasco estéril, a temperatura ambiente.4.- Estreptomicina: se diluyó con agua destilada para obtener una solución 12mg por 0.2 mL.Penicilina G Potásica: se diluyó con agua destilada para preparar una solución de 12,000 unidades por 0.2 mL. Se esterilizaron ambas por filtración y se almacenaron congeladas en cantidades de 2mL, hasta su utilización. 5.- Unos minutos antes de inocular, se colocaban en baño María, a 37 grados Centígrados, la solución 1, 2 y 3, el suero y los antibióticos. Se pepararon los tubos con el medio, bajo condiciones estériles, de la siguiente forma:Solución A: 13mlSolución B: 1.5 mLSuero: 1.5 mLEstreptomicina: 0.2 mLPenicilina0.2 mLInoculación de los medios:Los medios se dispensan en tubos de vidrio de 13x100 mm, con tapa de rosca, llenándolos al 90% de su capacidad total, se inocularon con 0.5ml de suspensión de trofozoitos de G. lamblia 2.-DESNQUISTACION:

3.-METODO GENERALMaterialesMicroscopio de luzPortaobjetos CubreobjetosLugolPipetasIncubadoraProcedimiento:Después de verificar y comprobar que el proceso de desenquistacion ha sido efectivo examinando muestras en el microscopio de luz, y teniendo los tubos de ensayo preparados con el medio de cultivo a 37°C, el concentrado de quistes se inocula asépticamente, se tapan y se colocan en incubadora, a 37°C, en posición horizontal por una hora. Al cabo de este tiempo, se extrae el 50% del medio de cultivo y se sustituye por medio de cultivo fresco. Se colocan de nuevo en la incubadora, hasta el día siguiente, se evalúa crecimiento.

BIBLIOGRAFIA:

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ALEIXANDRE. ValenciaAlcaraz Soriano M.J. “Giardia Y GIARDIOSIS”