Iquique N° 14-285 y YaguachiTeléfono: 022568041 - 022552715 – 0984103688www.investigacionsalud.gob.ecJulio del 2017

1ER CONGRESO INTERNACIONAL DE GENETICA MÉDICA y 1ER

CONGRESO DE BIOTECNOLOGÍA APLICADA A LA SALUD

Estandarización y validación de la técnica de Multiplex PCR para la

investigación de Ascaris lumbricoides, Strongyloides stercoralis y

Giardia lamblia en muestras biológicas de población infantil en

Pichincha, Ecuador.

• El diagnóstico molecular por Multiplex PCR permitió detectar tres parásitos simultáneamente Giardia lamblia,Strongyloides stercoralis/venezuelensis y Ascaris lumbricoides/suum.

• El análisis de muestras biológicas validó la técnica y mostró su reproducibilidad en el diagnóstico molecular.• La implementación de pruebas moleculares representa un gran avance en el diagnóstico de las parasitosis

desatendidas en el Ecuador.

METODOLOGÍA

BIBLIOGRAFÍA1. Haque, R. (2007). Human Intestinal Parasites. Journal of Health, Population, and Nutrition, 25(4), 387–391.Solano RL, Acuña GI, Barón MA, Morón de SA, Sánchez JA. Asociación entre pobreza e infestación parasitaria intestinal en preescolares, escolares y adolescentes del sur de Valencia estado Carabobo-Venezuela.

Kasmera. 2008; 36(2):137-47. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2754014/2. Shiferaw, M. B., & Mengistu, A. D. (2015). Helminthiasis: Hookworm Infection Remains a Public Health Problem in Dera District, South Gondar, Ethiopia. PLoS ONE, 10(12), e0144588. http://doi.org/10.1371/journal.pone.01445883. Abdel-aziz, M. A., Afifi, A. A., Malik, E. M., & Adam, I. (2010). Intestinal protozoa and intestinal helminthic infections among schoolchildren in Central Sudan. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, 3(4), 292-293. https://doi.org/10.1016/S1995-7645(10)60071-54. Hathi, P., Haque, S., Pant, L., Coffey, D., & Spears, D. (2017). Place and Child Health: The Interaction of Population Density and Sanitation in Developing Countries. Demography, 54(1), 337–360. http://doi.org/10.1007/s13524-016-0538-y5. Solano, L., Acuña, I., Barón, M., de Salim, A. M., & Sánchez, A. (2012). Asociación entre pobreza e infestación parasitaria intestinal en preescolares, escolares y adolescentes del sur de Valencia estado Carabobo-Venezuela. Kasmera, 36(2).6. Pearson, R. D. (2002). An update on the geohelminths: Ascaris lumbricoides, Hookworms, Trichuris trichiura, and Strongyloides stercoralis. Current infectious disease reports, 4(1), 59. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/118536587. Betson, M., Bendall,R., Deb.,R ., Nejsum,P ., y Stothard, R. (2014 ) Molecular Epidemiology of Ascariasis: A Global Perspective on the Transmission Dynamics of Ascaris in People and Pigs. Oxford Journals; 210(6): 932–941. http://doi.org/10.1093/infdis/jiu193.8. Thompson, R. C., & Monis, P. (2012). Giardia-from genome to proteome. Adv Parasitol, 78(78), 57-95. . http://10.1016/B978-0-12-394303-3.00003-79. Stefańskiego, H.(2004). Wiad Parazytol. Usability of PCR-based techniques for diagnosis of parasitic infections in ruminants; 46(3), pp295-304. http://doi.org: 1688368410. Bolivar, A. M., Rojas, A., & Garcia Lugo, P. (2014). PCR y PCR-Múltiple: parámetros críticos y protocolo de estandarización. Avances en biomedicina, 3(1).11. Henegariu, O., Heerema, N. A., Dlouhy, S. R., Vance, G. H., & Vogt, P. H. (1997). Multiplex PCR: critical parameters and step-by-step protocol. Biotechniques, 23(3), 504-511.

1. Controles de Parásitos

2. Extracción de ADN

MagaZorb® DNA Mini-Prep Kit – Promegautiliza perlas magnéticas

3. Cuantificación por Espectrofotometría y Electroforesis

4. Multiplex PCR

El parasitismo intestinal es un problema de salud pública queafecta principalmente a la población infantil de estratos socio-económico bajos; causa deficiencia en el aprendizaje, falta decrecimiento y de desarrollo en los niños, quienes son los másvulnerables1,2,3. Las parasitosis que trasmiten los helmintos Ascarislumbricoides y Strongyloides stercoralis y el protozoario Giardialamblia, son de fácil difusión debido a malas condicioneshigiénicas4,5.Los inconvenientes en el diagnóstico correcto y oportuno de lasparasitosis ha hecho necesario el desarrollo de técnicas dediagnóstico molecular con mayor sensibilidad y especificidad enrelación a las técnicas microscópicas que siguen siendo las pruebasestándar para algunos parásitos7,8,9.

La PCR Múltiplex permite amplificar fragmentos de ADN diana dedistintos parásitos en una misma reacción de PCR, reduceconsiderablemente el esfuerzo y tiempo del diagnóstico y garantizaun elevado porcentaje de fiabilidad10. En este estudio seestandarizó y validó la técnica de Multiplex PCR para lainvestigación simultánea de estos tres parásitos en heces de niñosde educación básica, de la parroquia Quitumbe, Pichincha.

INTRODUCCIÓN

RESULTADOS

Rodríguez M1, Morey G2,3, Aguilar F1, Salazar J1, Guerrero S4, Ruano AL1,5,.1 Programa PROPAD. Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública INSPI.

2 Instituto Nacional de Investigación en Salud Pública INSPI.3 Universidad de Guayaquil UG

4 Universidad De Las Américas UDLA

5 Consejo de Evaluación, Acreditación y Aseguramiento de la Calidad de la Educación Superior CEAACES

CONCLUSIONES

Pruebas Moleculares

mrodriguez@inspi.gob.ecgabrielmoreyl@ug.edu.ec

Fig.1 Electroforesis de productos de Multiplex PCR corridos en gel de agarosa al 2%teñido con SYBR SAFE (1uL/10uL Gel). MPM: Marcador de peso Molecular (100pb). GI:Control Positivo de Giardia lamblia (63 pb); ST: Control Positivo de Strongyloidesstercoralis/venezuelensis (101 pb); AS: Control Positivo de Ascaris lumbricoides/suum(192 pb). M: Control de la Multiplex. C-: Control negativo.

5. Validación de la técnica

Temperaturas y tiempos de ciclado para la amplificación de las regiones de ADN especificas de losparasitos: Ascaris lumbricoides/suum, Strongyloides stercoralis/venezuelenzis, Giardia lamblia.

Fuente: Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Disponible en: https://www.cdc.gov/parasites/whipworm/biology.html

Fig. 3 Electroforesis de productos de Multiplex PCR corridos en gel de agarosa al 2%teñido con SYBR SAFE (1uL/10uL Gel). MPM: Marcador de peso Molecular (100pb).M+: Control Positivo de Multiplex PCR de Giardia lamblia (63 pb), Strongyloidesstercoralis/venezuelensis (101 pb) y Ascaris lumbricoides/suum (192 pb). NTC: NoTemplate Control. C-: Control negativo de extracción de ADN. A. 1547-1582:Muestras biológicas. B. 1612-1626: Muestras biológicas.

• La estandarización de la multiplex PCR permitió la amplificación de los segmentos de ADN esperados: Giardialamblia (63 pb); Strongyloides stercoralis/venezuelensis (101 pb) y Ascaris lumbricoides/suum (192 pb).

• El límite de detección de la Multiplex PCR fue de 0,5 ng/µL de ADN.• La Multiplex PCR detectó dos muestras positivas para Giardia lamblia de un total de 30 muestras de heces

analizadas, que representan: Giardia lamblia (6%) Ascaris lumbricoides (0%) y Strongyloides stercoralis (0%).

Cuantificación por espectrofotometría de concentraciónde ADN utilizando equipo NanoDrop2000C

Electroforesis en geles de agarosa al 2%, utilizando Bluejuice loading buffer 10x

Strongyloides stercoralis Ascaris lumbricoides Giardia lamblia

Nombre Secuencia (5’-3’)Gen Blanco

pb

Temperatura

alineamientoCiclos MgCl2 Parasito

AsCoiF GGAGGTTTTTGGGTCTTTGG

Cox1

19258°C 40 3 mM Ascaris suum/lumbricoides

AsCoi CCAAACAAGGTAGCCAACCA

Stro 18S-1530F GAATTCCAAGTAAACGTAAGTCATTAGC

SSU rRNA

10160°C 30 2 mM

Strongyloides

venezuelensis/stercoralis

Stro 18S-1630R TGCCTCTGGATATTGCTCAGTTC

Gd-80F GACGGCTCAGGACAACGGTT

18S rRNA

6360°C 30 2,5 mM Giardia lamblia

Gd-127R TTGCCAGCGGTGTCCG

Temperatura Tiempo Ciclos

Denaturación inicial 95°C 5 min 1

Denaturación 95°C 45 sec

35Hibridación 58°C* 45 sec

Extensión 72°C 45 sec

Extensión Final 72°C 5 min 1

Almacenamiento 4°C ∞

Fig.2 Electroforesis de productos de Multiplex PCR corridos en gel de agarosa al 2%teñido con SYBR SAFE (1uL/10uL Gel). MM: Marcador de peso Molecular (100pb). C-:Control negativo. Gia+: Control Positivo de Giardia lamblia (63 pb); Str+: ControlPositivo de Strongyloides stercoralis/venezuelensis (101 pb); Asc+: Control Positivo deAscaris lumbricoides/suum (192 pb). S/D: Dilución Estándar de Multiplex PCR (50ng/µL ADN). 1/10: Dilución 1:10 del Estándar de Multiplex PCR (5 ng/µL ADN). 1/100:Dilución 1:100 del Estándar de Multiplex PCR (0,5 ng/µL ADN). 1/1000: Dilución1:1000 del Estándar de Multiplex PCR (0,05 ng/µL ADN). 1/10000: Dilución 1:10000del Estándar de Multiplex PCR (0,005 ng/µL ADN). 1/100000: Dilución 1:100000 delEstándar de Multiplex PCR (5 pg/µL ADN).

Muestras biológicas de heces recolectadas en Quitumbe y conservadas en etanol al 70%

B