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GCLATIH - Grupo Científico Latino-Americano de Trabajo Sobre Identificación Humana

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RESÚMENES/RESUMOS

POWERPLEX FUSION 6C: ESTUDIOS DE VALIDACIÓN. APLICACIÓN EN LA

RESOLUCIÓN DE CASOS FORENSES

PABLO MARTÍN MARTÍN

INSTITUTO NACIONAL DE TOXICOLOGÍA Y CIENCIAS FORENSES DE MADRID

Se comenzará con una pequeña introducción del Kit PowerPlex Fusion 6C.

En cuanto a los estudios de validación, en la charla se presentará un resumen de los

resultados de validación del kit Fusion 6C, se repasarán los parámetros de validación

estudiados en este centro, haciendo especial hincapié en los experimentos

realizados para establecer el umbral analítico, así como los estudios de sensibilidad

para establecer el umbral estocástico, se comentarán los experimentos de mezclas

con el objetivo de comprobar la sensibilidad del componente minoritario.

Como transición a la segunda parte de la charla se comentarán los métodos de

análisis empleados en nuestro laboratorio: extracción, cuantificación, detección y

análisis de datos.

Por último, en cuanto a la aplicación del kit en la casuística, se expondrá el

comportamiento del kit en la amplificación de muestras que presentan inhibición, en

muestras degradadas y en muestras con baja cantidad de ADN. Se mostrarán

algunos ejemplos de casuística forense con distintos fluidos (saliva, semen, restos

óseos) o soportes (ropas, tomas corporales, etc) en los que se valorarán aspectos de

interés forense como mezclas complejas, mezclas con contribuciones minoritarias,

muestras antiguas y deterioro de restos biológicos.

Por último, se recomendará el de uso un segundo kit complementario en caso de

que aparezcan productos inespecíficos, artefactos u otro tipo de resultados no

esperados.


2

TIPAGEM DE DNA A PARTIR DE IMPRESSÕES DIGITAIS PARA EMPREGO EM

PERÍCIA CRIMINAL NO ÂMBITO DA JUSTIÇA MILITAR BRASILEIRA

OLIVEIRA, THAÍS PATRÍCIO1; SILVA, DAYSE APARECIDA2; CARVALHO, ELIZEU

FAGUNDES2

1INSTITUTO DE BIOLOGIA DO EXÉRCITO (IBEX), MINISTÉRIO DA DEFESA, BRASIL.

2LABORATÓRIO DE DIAGNÓSTICOS POR DNA, IBRAG, UNIVERSIDADE DO ESTADO DO RIO DE

JANEIRO, RIO DE JANEIRO, BRASIL.

No âmbito da genética forense, o programa denominado de “Estudos

Estratégicos em Defesa Nacional, em Educação e Ensino Militar” tem como metas

principais a padronização e validação de metodologias para a análise forense de

DNA a partir de vestígios biológicos recolhidos de impressões digitais. Os estudos vêm

sendo realizados, há dois anos, a partir da parceria estabelecida entre o Instituto de

Biologia do Exército e o Laboratório de Diagnósticos por DNA da Universidade do

Estado do Rio de Janeiro. Além de contribuir para o aprimoramento técnico e

científico da Subdivisão de Genética e Repositório de Amostras do Exército Brasileiro,

a iniciativa tem possibilitado a formação de novos profissionais para atuação em

genética forense, bem como a melhoria da capacitação de recursos humanos

especializados, no âmbito das aplicações forenses do DNA, área estratégica do

Ministério da Defesa.

Impressões papilares latentes têm sido comumente usadas por especialistas

forenses do Exército Brasileiro como uma ferramenta eficaz para a identificação

humana em investigações criminais. Nos casos em que as impressões digitais são

consideradas inadequadas para a identificação individual através de datiloscopia,

a tipagem de regiões polimórficas do DNA de vestígios biológicos recolhidos das

impressões digitais se constitui como uma metodologia alternativa para a

continuidade da análise de evidência recolhida em local de crime. Nesse contexto,

estudos relacionados com diferentes metodologias de coleta e extração de DNA de

vestígios biológicos presentes em impressões digitais observadas em suportes de vidro

e de metal encontram-se em andamento. Para isto, através de suabes, foram

coletados vestígios de impressões digitais deixadas por voluntários militares em


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superfícies de vidro ou metal, com a utilização de duas soluções: NaCl a 0,9% ou SDS

a 2%. O DNA foi isolado por duas distintas metodologias: Solução de Lise (SDS a 0,05%

e 20 mg/ml de proteinase K) + fenol-clorofórmio ou Kit QIAmp® Investigator® DNA

(Qiagen). A amplificação por PCR de regiões STR do DNA foi realizada com o

multiplex AmpFLSTR® MiniFiler ™ PCR Kit (Life Technologies). Os produtos de

amplificação foram submetidos à eletroforese no equipamento ABI PRISM® 3500

Genetic Analyzer (Applied Biosystems) e os dados analisados com o Software ID

GeneMapper® v1.2 (Applied Biosystems). As duas soluções de coleta de vestígios

biológicos bem como as preparações de DNA obtidas pelas duas metodologias de

extração de DNA se correlacionaram com eficientes tipagens de loci STR dos

vestígios biológicos recolhidos de impressões digitais obtidas em suportes de vidro ou

de metal, possibilitando a obtenção de perfis genéticos inquestionáveis.

Palavras-chave: DNA, Forense, Impressões Digitais, Exército Brasileiro

DIVERSIDADE DE TIPOS DE MARCADORES: UMA CHAVE PARA SOLUCIONAR

CASOS COM AMOSTRAS DE DNA DEGRADADO

POLVERARI, FERNANDA SILVA1,2; AMBROSIO, ISABELA BRUNELLI1,2; BRAGANHOLI,

DANILO FAUSTINO1; MARTINEZ, JULIANA1; CICARELLI, REGINA MARIA BARRETTO1

1LABORATÓRIO DE INVESTIGAÇÃO DE PATERNIDADE – NAC, FACULDADE DE CIÊNCIAS

FARMACÊUTICAS, 2INSTITUTO DE QUÍMICA, UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA, ARARAQUARA,

SP, BRASIL.

Na rotina de análises forense e de parentesco pode existir uma diversidade de tipos

de casos sendo necessária a combinação de diferentes métodos de análise para

obtenção de um resultado conclusivo, especialmente com amostras de DNA

degradado. Aqui nós apresentamos dois casos de análise de parentesco com DNA

degradado, onde além de STRs autossômicos foi também necessária a análise de

marcadores sexuais e sequenciamento do mtDNA. O primeiro caso foi uma

investigação de paternidade com amostra de sangue proveniente da suposta mãe

e uma amostra de osso exumada de um recém nascido do sexo masculino que


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morreu logo após o nascimento. Talvez devido à fragilidade do osso e das condições

do enterramento, a análise de marcadores autossômicos não gerou um resultado

conclusivo, sendo necessária a análise do mtDNA que indicou uma exclusão de

maternidade. O segundo caso é uma investigação de paternidade com amostras

de sangue de dois irmãos (um homem e uma mulher), da mãe biológica e amostra

de osso do suposto pai. A análise de STRs e INDELs autossômicos indicaram a inclusão

de paternidade para a filha mulher, mas houve exclusão de paternidade para o filho

homem. Esta exclusão de paternidade foi confirmada pela análise de Y-STRs. Ambos

os casos, usando STRs e INDELs autossômicos, Y-STRs e/ou mt DNA mostram a

importância da combinação de marcadores para obtenção de resultados robustos,

especialmente quando o DNA esta degradado.

Palavras-chave: A-STRs; INDELs; mtDNA; Y-STRs; Teste de paternidade; Ossos.

Financiamento: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

(CAPES); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

IDENTIFICACIÓN DE UNA VÍCTIMA DE UN CASO DE LESA HUMANIDAD DURANTE

EL CONFLICTO ARMADO ENTRE LOS AÑOS 1980 AL 2000

LORENA G. BANDA DE LA CRUZ, SUSAN I. POLO SANTILLÁN

LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y GENÉTICA DEL INSTITUTO DE MEDICINA LEGAL –

MINISTERIO PÚBLICO DEL PERÚ

Introducción

El presente caso trata de restos de osamentas humanas exhumados en abril del año

2013 de un lugar de entierro en el distrito de Morcolla a 3452 msnm en la provincia de

Sucre departamento de Ayacucho en la región centro sur del Perú. Es en esta región

donde se registra la mayor cantidad de víctimas y desaparecidas durante el conflicto

interno desatado entre la agrupación política PCP-Sendero Luminoso y las fuerzas del

orden del país durante los años 1980 al 2000. Las características del suelo de la zona


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de exhumación tienen una formación litológica del tipo sedimentario formado por

arenas, gravas y arcillas y de tipo volcánico. Las osamentas recuperadas estaban

esqueletizadas, posterior al estudio antropológico respectivo para su

individualización se recolecto fragmentos de fémur. Con fines de identificación de

los restos hallados se obtuvo muestras de dos grupos familiares directos de dos

individuos desaparecidos durante los años 1983 y 1984 que consistieron en muestras

de sangre con los cuales se realizó el cotejo correspondiente.

Materiales y Método

Los fragmentos de restos oseos una vez tratados y pulverizados pasaron por dos

procesos de descalcificación, la primera a base de un tampón de EDTA 0.5 M y SDS

10% el cual se incubo durante 24 h a 56 ° C, luego se añade un tampón Tris / HCl 10

mM, EDTA 50 mM, SDS 0.1%, DTT 39 mM y proteinasa K 20 mg/ml. Se aisló el ADN por

extracción con el método QIAamp® DNA Investigator Purification Kit (Qiagen). El

ADN aislado se concentró y se purificó adicionalmente por ultrafiltración en columnas

de Amicon Ultra 15 (Merck, Millipore). Las muestras de sangre de los familiares de los

individuos desaparecidos se recogieron en tarjetas FTA (Whatman FTA) y el ADN se

purificó por el sistema de Purificacion de FTA (Whatman® FTA® purification reagent).

El ADN purificado fue amplificado utilizando el sistema Power Plex 16® System (15

Marcadores Microsatélites STR Autosómicos más 01 marcador para la determinación

de sexo) (Promega Corporation) con las condiciones del fabricante. Para la

detección de Productos Amplificados se utilizó el Sistema de Electroforesis Capilar y

detección por Fluorescencia mediante el Analizador Genético Automatizado ABI HID

3500 (Applied Biosystems). La probabilidad de paternidad se calculó usando el

programa estadístico Familias 2.0 utilizando la Base de Datos de Frecuencias

Poblacionales Hispanoamericana.

Resultado y Discusión

En las muestras registradas con código B y C (fragmento de restos óseos) se

obtuvieron perfiles genéticos completos. Así mismo se obtuvo perfiles genéticos

completos en las muestras de sangre de ambos grupos familiares, como se detalla

en la Tabla N°1.


6

Tabla N°1 Perfiles Genéticos usando el sistema Power Plex16, B y C restos óseos, H1:

Hijo del primer grupo familiar, H2: Hijo del primer grupo familiar y H3: Hijo del segundo

grupo familiar.

MARCADOR B C H1 H2 H3

D3S1358 15 / 17 15 / 16 14 / 15 17 / 17 16

TH01 7 / 9.3 7 / 9.3 7 7 7 / 9.3

D21S11 31.2 / 31.2 31.2 / 32.2 28 / 31.2 28 / 31.2 31 / 31.2

D18S51 12 / 15 14 / 17 15 / 16 12 / 16 14

PENTA E 12 / 18 13 / 18 18 / 21 12 / 24 16 / 17

D5S818 7 / 11 11 11 7 / 12 7 / 12

D13S317 9 9 9 / 12 9 / 12 10 / 12

D7S820 8 / 10 10 / 11 8 / 11 10 / 11 11 / 12

D16S539 9 / 12 9 / 13 11 / 12 9 / 11 9

CSF1PO 12 12 12 12 12

PENTA D 10 / 11 9 / 12 10 / 13 11 10 / 11

VWA 16 / 17 17 / 18 17 / 18 16 / 18 15 / 16

D8S1179 12 / 14 10 / 14 12 / 14 12 13

TPOX 8 11 8 8 8 / 12

FGA 18 / 24 20 / 25 18 / 22 18 / 22 20 / 25

Amelogenina X / Y X / Y X X / Y X

Después de realizar el cotejo de los genotipos de los restos óseos con los genotipos

de los dos grupos familiares se obtuvo lo siguiente; el análisis entre el genotipo del

resto óseo B con respecto al del hijo 1 determino un índice de Identificación

combinado de 21804.5929132977 y una probabilidad de paternidad de 99.995414 %,

el análisis entre los genotipos del resto óseo B con respecto al hijo 2 determino un

índice de Identificación combinado de 142881.337089639 y una probabilidad de

paternidad de 99.999300 %. En el cotejo de los genotipos del hijo 3 y del resto óseo B

no se encontró coincidencia en siete marcadores (D3S1358, D18S51, PENTA E,

D13S317, D7S820, D8S1179 y FGA). En el cotejo de los genotipos del hijo 3 y el resto

óseo C no se encontró coincidencia en siete marcadores (PENTA E, D5S818, D13S317,

PENTA D, VWA, D8S1179 y TPOX).

Conclusión

Numerosos estudios señalan que la densidad del hueso es un factor importante que

influye en la preservación del ADN en este tipo de muestras y normalmente se


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encontraría menos degradado en las piezas óseas más densas del esqueleto como

el fémur y la tibia. El éxito en la obtención de información genética a partir de restos

óseos está condicionado así mismo por el tipo de estructura ósea y el grado de

conservación que va a estar condicionado a la forma o tipo de enterramiento,

características del ambiente y suelos en el que se encuentra depositado el resto

óseo, temperatura, humedad, PH, agentes biológicos, físicos, presencia de ciertos

compuestos en el suelo y otros factores ambientales. Para nuestro caso los restos

óseos tienen más de 30 años de antigüedad por lo que se requirió que el proceso sea

más minucioso. Como resultado se obtuvo ADN que pudo ser amplificado por PCR.

Para la muestra de referencia se obtuvo de familiares más apropiados es decir de

primer grado para obtener una alta probabilidad de identificacion (DNA Commission

of the International Society for Forensic Genetics: Recommendations regarding the

role of forensic genetics for disaster victim identification), para el caso hijos de dos

grupos familiares, de los cuales se obtuvo una probabilidad de identificación de

99.995414% para el hijo1 y una probabilidad de paternidad de 99.999300% para el

hijo2 de un grupo familiar.

PROYECTO DE VALIDACIÓN DE EXTRACCIÓN DIFERENCIAL AUTOMATIZADA EN

EL EQUIPO BIOMEK® 3000 DE BECKMAN COULTER™ PARA PROCESAR MUESTRAS

FORENSES

OSCAR ANTONIO BARRERA VILLALOBOS

PROCURADURÍA GENERAL DE JUSTICIA DEL DISTRITO FEDERAL, MÉXICO

La extracción diferencial de muestras forenses en casos de violación, es una de las

múltiples actividades que se realizan en los laboratorios de análisis genéticos de

manera cotidiana. Así mismo, ésta es una de las principales peticiones que

cotidianamente son solicitadas en el laboratorio de Genética Forense de la

PGJCDMX, por lo cual es necesario dedicar tiempo y recursos materiales y humanos

para obtener resultados satisfactorios para la autoridad ministerial y la sociedad en

general.


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Debido a lo anterior y ante la necesidad de minimizar tiempos, carga de trabajo,

errores humanos y así mismo, con la implementación de sistemas de calidad; en

nuestro laboratorio hemos comenzado con un proyecto de validación de extracción

diferencial automatizada de muestras forenses producto de violación utilizando el

equipo automatizado Biomek 3000® de Beckman CoulterTM, que cuenta con las

plataformas instaladas para utilizar el kit de extracción Diferencial Differex, así como

la purificación de ADN de muestras forenses por medio del kit DNA-IQ de la casa

comercial Promega.

Material y Métodos

1. EXTRACCION DIFERENCIAL AUTOMATIZADA DE CELULAS ESPERMATICAS

MUESTRAS EMPLEADAS

Se utilizaron hisopos con muestras control de un individuo del sexo masculino (células

espermáticas) y un individuo de sexo femenino (células epiteliales vaginales). Una

alícuota por duplicado de las muestras fue extraída y purificada por medio del kit SV

isolation system, así como cuantificada por medio del kit Quantifiler Duo y

amplificada para obtener los perfiles genéticos de referencia por medio de los kits

Powerplex Fusion (PPF) y Powerplex Y23 (PPY23).

PREPARACION DE MUESTRAS

El estudio de extracción diferencial se realizó utilizando una cantidad constante de

células epiteliales por muestra y utilizando diluciones de la cantidad de células

espermáticas presentes en las mismas (1:1, 1:10, 1:100, 1:500 y 1:1000). A partir de las

alícuotas anteriores se obtuvieron series de repeticiones de: 5 controles de células

espermáticas puras, 5 controles de células epiteliales puras y 5 repeticiones de

mezclas de células epiteliales con cada una de las diluciones elaboradas. Se

tomaron alícuotas para realizar frotes y evaluar la cantidad de células espermáticas

y de células epiteliales en las muestras por observación al microscopio.

PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS EN EL EQUIPO AUTOMATIZADO BIOMEK 3000 (LISIS

Y SEPARACIÓN DIFERENCIAL POR DIFFEREX SYSTEM PROTOCOL Y PURIFICACIÓN POR

MEDIO DE DNA-IQ SYSTEM PROTOCOL)

La extracción diferencial se realizó por medio del protocolo Differex como lo indica

el proveedor, posteriormente, se realizó la purificación de ADN de las fracciones


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espermáticas y epiteliales de las muestras por medio del protocolo DNA IQ for Differex

en el equipo Biomek 3000.

2. CUANTIFICACION Y NORMALIZACIÓN AUTOMATIZADA DE LAS MUESTRAS

Tras la extracción diferencial y purificación de las muestras, se realizó la

cuantificación de las fracciones espermáticas (M) y epiteliales (F) por medio del kit

de Promega Plexor HY, preparada por medio del protocolo automatizado para PCR

en tiempo real Plexor HY en el equipo Biomek 3000 y cuantificada en el equipo

Stratagene Mx3005P qPCR System de la marca Agilent.

La normalización de las muestras para el proceso de amplificación se obtuvo a través

de los datos obtenidos por medio del software Plexor Analysis Software de Promega.

3. AMPLIFICACION AUTOMATIZADA DE MUESTRAS DE EXTRACCION DIFERENCIAL

Para la amplificación automatizada las muestras, se realizó tomando solamente tres

réplicas al azar de los controles de células espermáticas, controles de células

vaginales, mezclas de células epiteliales con diluciones de células espermáticas y

blancos de reactivos. La amplificación se ajustó a 0.5ng/µL de ADN autosómico y/o

masculino y realizó por medio de los kits de amplificación de STRs Powerplex Fusion

(PPF) y Powerplex Y23 (PPY23) de Promega, preparados por medio del protocolo

automatizado para amplificación NormSTR en el equipo Biomek 3000 y amplificados

en el equipo GeneAmp PCR System 9700 de la marca Applied Biosystems.

cío).

4. ELECTROFORESIS DE LAS MUESTRAS DE EXTRACCION DIFERENCIAL

Para determinar los alelos de los diferentes marcadores de los sistemas Powerplex

Fusion (PPF) y Powerplex Y23 (PPY23), se realizó un corrimiento electroforético y

escaneo génico, utilizando el equipo Genétic Analyzer ABI PRISM 3130xl operado por

medio del software Data Collection y procesando los datos obtenidos a través del

software Gene Mapper ID v3.2.

Resultados

Hemos podido observar a través de éste procedimiento que la mínima cantidad de

células espermáticas necesarias para obtener un perfil genético autosómico

completo y diferenciado es a partir de 10 células espermáticas por campo, así mismo


10

a, a partir de esta concentración, hemos obtenido perfiles genéticos autosómicos y

haplotipos con una altura y balance adecuado.

CASO VILLATORO: “AL SILENCIO DEL MICRÓFONO, EL ADN GRITA”

ZINTIA MOYA

LABORATORIO SEROLOGÍA- GENÉTICA FORENSE, MINISTERIO PÚBLICO, HONDURAS

El caso del secuestro seguido de asesinato del periodista Ángel Alfredo Villatoro fue

un caso emblemático y de gran impacto social, hecho ocurrido entre el 9 al 15 de

mayo de 2012 en Tegucigalpa, Honduras con el hallazgo del cuerpo.

Haciendo especial hincapié en los análisis genéticos realizados a los indicios

encontrados en el allanamiento de la casa donde se pudo comprobar por medio

de la obtención del perfil genético del Sr. Villatoro que fue el lugar donde se mantuvo

en cautiverio.

DESCRIPCION DEL CASO

A partir del allanamiento de la casa en mención geolocalizada mediante

triangulación telefónica realizada por el cuerpo de investigación criminal de la

policía nacional y la ropa que vestía el día del hallazgo del cuerpo.

Se analizaron 22 diferentes indicios divididos en 2 dictámenes conforme al avance

cronológico de la investigación.

Cabe mencionar que los indicios consistentes en un vaso de vidrio y una botella

plástica eran de especial importancia para la vinculación de la escena (casa) con

el ofendido en cautiverio.

Estos indicios de cantidad mínima de muestra (saliva) fue posible procesarlos

mediante el kit de extracción y purificación DNA IQ SYSTEM.

Se realizó la amplificación por medio de PCR y posteriormente electroforesis capilar

en el ABI PRISM 310 ANALIZADOR GENETICO.

El perfil genético obtenido coincidió con el perfil genético del Sr. Villatoro

RESULTADOS


11

De los 14 indicios procesados provenientes de la casa, se obtuvo el perfil genético

del señor Ángel Alfredo Villatoro en una botella plástica y en un vaso de vidrio que

permitió al equipo de investigación confirmar el lugar de cautiverio procediendo con

la captura de 3 personas.

Las cuales orientaron para la detención de 3 personas más que conformaban la

banda de secuestradores “Los Osorio” desarticulando dicha banda con la sentencia

penal por este caso de sus líderes los hermanos Osorio.

ANÁLISIS DE MARCADORES UNI Y BI-PARENTALES EN MEZCLAS: RESULTADOS

DEL EJERCICIO DE INTER-COMPARACIÓN DEL GHEP

ULISES TOSCANINI

PRICAI-FUNDACIÓN FAVALORO. BUENOS AIRES, ARGENTINA

Desde 1992, el Grupo de Habla Española y Portuguesa de la Sociedad Internacional

de Genética Forense (GHEP-ISFG) organiza anualmente un Ejercicio de

Intercomparación denominado “Estudio de polimorfismos de ADN en manchas de

sangre y otras muestras biologicas”, destinado a laboratorios que realizan pruebas

de paternidad y de investigación forense con el objetivo de avanzar en la

estandarización de los métodos y proporcionar un punto de encuentro para discutir

las estrategias de análisis y diferentes metodologías empleadas por los participantes.

El Ejercicio es coordinado por el Servicio de Garantía de Calidad del Departamento

de Madrid del Instituto Nacional de Toxicología y Ciencias Forenses (Ministerio de

Justicia, España). Cada ejercicio anual comprende un Nivel Básico (acreditado bajo

ISO/IEC 17043:2010) y un Nivel Avanzado. En ambos niveles se incluye un Módulo de

Parentesco y un Módulo Forense. En este trabajo presentamos las características

generales del Ejercicio de Intercomparación del GHEP-ISFG y los resultados obtenidos

del análisis de marcadores STRs de cromosomas autosómicos y sexuales, y de ADN

mitocondrial en dos muestras incluidas en los módulos forenses del Ejercicio de

Intercomparación 2014: (a) una muestra constituida por una mezcla 2:1 (v/v)

saliva:sangre (M4), y (b) una mezcla 4:1 (v/v) saliva:semen (M8). Las discrepancias no

debidas a errores de nomenclatura o transcripción representaron un 6,5% (M4) y un


12

4,7% (M8) en STRs autosómicos, 15,4% (M4) y 7,8% (M8) para X-STRs, y 1,2% (M4) y 0,0%

(M8) para Y-STRs. La principal causa de error fue la presencia de “drop-out alleles” y

“drop-in alleles”, observándose diferentes criterios entre los laboratorios con relacion

a la inclusion de picos minoritarios y bandas “stutters”. Los kits comerciales de uso

común en marcadores autosómicos mostraron diferencias en la asignación de

microvariantes en el locus D12S391. Además, el análisis de electroferogramas

remitidos por los participantes permitió revelar que la proporción de los

contribuyentes detectada en las mezclas fue variable entre los laboratorios. Con

respecto a los resultados de ADN mitocondrial, además de las discrepancias

importantes para reportar heteroplasmías no hubo acuerdo en los resultados para la

muestra M4: mientras algunos laboratorios informaron solo un haplotipo para la región

control, otros reportaron perfiles inesperados, probablemente debido a problemas

de contaminación. Para la muestra M8, la mayoría de los laboratorios solo

detectaron el haplotipo correspondiente a la saliva. Aunque el GHEP-ISFG posee ya

una vasta experiencia en el Ejercicio de Intercomparación, el presente estudio

permitió revelar desafíos aún existentes en relación al análisis e interpretación de

mezclas de fluidos biológicos. En general, estos resultados ponen énfasis en la

necesidad de esfuerzos futuros guiados a acciones de capacitación con el fin de

mejorar el análisis de mezclas entre los genetistas forenses.

ANÁLISIS DE MTDNA MEDIANTE EL USO DE COMPONENTES DE SISTEMAS DE

IDENTIFICACIÓN GENÉTICA DE TIPO STRS COMERCIALES

YADIRA LIZETHE LÓPEZ RAMÍREZ1, MARIANA RUIZ HERNÁNDEZ1, MARÍA EUGENIA

AMBRIZ FRANCO ROMERO1, RAÚL FLORES LEÓN1, MAGNER ARMANDO RINCÓN

SOTO, MAURO LÓPEZ ARMENTA1

1 LABORATORIO DE GENÉTICA, INSTITUTO DE CIENCIAS FORENSES DEL TRIBUNAL SUPERIOR DE

JUSTICIA DE LA CIUDAD DE MÉXICO

La recuperación de muestras mínimas críticas en un escenario del delito representa

para los investigadores forenses uno de los mayores desafíos debido a las dificultades

inminentes que trae consigo este tipo de muestras. El hallazgo de pelos únicos sin raíz


13

es uno los ejemplos más frecuentes de muestras mínimas críticas, en tales

circunstancias el uso de marcadores de ADN mitocondrial o mtDNA puede significar

la diferencia entre un resultado exitoso y el fracaso si lo que se pretende es el análisis

de marcadores nucleares. Sin embargo, el análisis de mtDNA es una de las tareas

más laboriosas y de mayores cuidados en el ámbito de la genética forense. Aunque

novedosos métodos de extracción se han implementado para este fin, son los costos

en equipo e insumos una limitante en laboratorios emergentes que buscan

emplearse en la identificación humana. Nuestra investigación se centra en el análisis

de mtDNA procedente de muestras de pelo sin raíz mediante el uso de mezclas

maestras de sistemas de identificación genética de tipo STRs comerciales,

encontrando que el uso de sus químicas no sólo es una alternativa viable sino que es

rápida y efectiva, dejando abierto el espectro de sistemas de identificación no

convencionales necesarios en la resolución de caso complejos. A fin de evaluar su

factibilidad fueron empleados en la extracción y purificación de ADN los sistemas

Tissue and Hair Extraction y DNA IQ™ respectivamente, mientras que en amplificación

componentes de los sistemas de identificación genética PowerPlex 16, Y23 y Fusion

con uso de primers, marcaje y método de análisis estándar para mtDNA . Los

resultados observados dejan claro el potencial que dicho procedimiento de análisis

tiene en el manejo de muestras difíciles.

Palabras clave: Extracción, purificación, mtDNA, pelo, STRs.

VALIDACIÓN DE SOFTWARE PARA CÁLCULOS ESTADÍSTICOS UTILIZADOS EN LA

IDENTIFICACIÓN HUMANA BASADA EN ADN

MARCO DAVID GARCÍA KING, MISHEL MARIE STEPHENSON OJEA

FUNDACIÓN DE ANTROPOLOGÍA FORENSE DE GUATEMALA - FAFG

La Fundación de Antropología Forense de Guatemala estableció un laboratorio de

genética forense con el objetivo de poder utilizar el análisis de ADN en la

identificación de personas desaparecidas. Esto mediante la comparación del ADN

de los restos recuperados con el de los familiares que los están buscando. La


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comparación de ADN se ve fortalecida al incorporar un resultado estadístico que

indique la certeza y el poder de la evidencia genética para concretar la

identificación. Estos resultados pueden tornarse complicados, principalmente

cuando se tiene más de una víctima, o los parentescos son complicados. Asimismo,

la comparación de grandes volúmenes de muestras dificulta la obtención de

coincidencias de ADN de forma manual, por lo que la utilización de un software

diseñado para realizar estas comparaciones y cálculos facilita la identificación de

personas por ADN. El laboratorio, para los análisis de relaciones parentales y

familiares, cuenta con la acreditación ISO 17025:2005 para laboratorios de ensayo y

calibración, y por lo tanto debe validar que el software sea adecuado para el uso

de acuerdo a la configuración utilizada en el laboratorio. Por esta razón se validaron

los cálculos de relaciones de parentesco realizados utilizando dos software

comerciales: DNA-VIEW y M-FISys, así como la realización de cálculos de paternidad

de forma manual. Esto se hizo mediante la comparación de las fórmulas algebraicas

y resultados obtenidos en diferentes escenarios planteados, incluyendo mutaciones,

alelos nulos y posibles pérdidas de alelos. De esta forma se comprobó la forma en

que se obtienen los resultados para cada comparación y su validez para el fin

propuesto de identificación humana por ADN.

NUEVO MÉTODO Y KIT PARA LA IDENTIFICACIÓN FORENSE HUMANA: FÁCIL,

RÁPIDO, SIMPLE Y NO DESTRUYE LA MUESTRA. ENSAYO EN CONDICIONES

REALES

CARRASCO PATRICIO1, CAROLINA INOSTROZA1, GASTON BOCAZ 2, MANUEL WONG2.

1FACULTAD DE ODONTOLOGÍA, UNIVERSIDAD DE LOS ANDES, SANTIAGO, CHILE.

2SERVICIO MÉDICO LEGAL DE CHILE, UNIDAD DE REGISTRO NACIONAL DE ADN, SANTIAGO,

CHILE.

Antecedentes: No hay kits que permiten la determinación de la identificación forense

humano de los dientes de forma rápida, eficaz y sin destruir la muestra. En caso de

accidentes aéreos, desastres naturales o terrorismo la disponibilidad de tejido

susceptible de ser utilizado en el análisis forense podría limitarse a los huesos y los


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dientes. Los kits clásicos utilizan huesos y dientes y destruyen la muestra, son difíciles

de manejar lo que implica un alto riesgo de contaminación y un mayor tiempo en la

entrega del perfil genético. El nuevo kit es único porque ofrece resultados en horas,

no destruye la muestra y es más fácil de manipular con un bajo riesgo de

contaminación.

Objetivo: Probar la metodología y el kit en condiciones reales de uso.

Métodos: En 5 cadáveres de 1 mes, 4 hombres y 1 mujer entre 47-83 años de edad,

se obtuvieron 6 dientes. 11 muestras para el ensayo y el ADN genómico se extrajo

con la nueva metodología forense y kit (Patente Alcance NºUS-20160123853).

También se obtuvieron muestras controles de sangre en filtros FTA y muestras de

mucosa oral. El ADN de los controles se obtuvo con el equipo y kit Maxwell 16

(Promega), los perfiles genéticos se obtuvieron con el kit GlobalFiler ™ STR Kits (Thermo

Fisher Sci.). Al final de la metodología, los dientes fueron devueltos a los cadáveres. El

éxito fue calculado en relación a los 24STRs obtenidos a partir de los controles de

sangre y muestras bucales los que fueron comparados a los resultados de las

dentales. El tiempo utilizado para generar el perfil genético fue calculado para la

pulpa dental y el cemento radicular.

Resultados: Las muestras de control dieron perfiles genéticos completos (24 STRs).

Análisis de los 5 cuerpos humanos permitió la identificación de 3 de ellos con 24 STRs,

los otros 2 cuerpos dieron perfiles genéticos incompletos entre los 7 y 16 STRs. Las 6

muestras dentales generaron 11 ADN genómico, dieron 7 perfiles genéticos

completos y 4 perfiles genéticos parciales, 64% de éxito. El tiempo utilizado para

obtener el perfil genético fue de 20 horas para la pulpa dental y 12 horas para el

cemento radicular.

Discusión: La puesta a prueba del kit y la metodología en condiciones reales

demostró la eficacia en la obtención de perfiles genéticos útiles para la identificación

forense, sin destruir la muestra dental. El tejido de la pulpa dental y el cemento

radicular han demostrado ser útiles en la obtención de perfiles genéticos completos,

sin embargo, la metodología aplicada al cemento radicular entrega resultados en

un tiempo más corto.


16

DESEMPENHO E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS NO ION PGM DOS KITS EA

24PLEX STR E MTDNA EM AMOSTRAS COMPLEXAS.

CAROLINA BOTTINO1,2, ROSANE SILVA3, RODRIGO MOURA-NETO4

1 INSTITUTO DE PESQUISA E PERICIAS EM GENÉTICA FORENSE, POLICIA CIVIL DO ESTADO DO

RIO DE JANEIRO

2 PROGRAMA DE DOUTORADO EM BIOTECNOLOGIA, INSTITUTO NACIONAL DE METROLOGIA,

QUALIDADE E TECNOLOGIA

3 INSTITUTO DE BIOFÍSICA CARLOS CHAGAS FILHO, UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE

JANEIRO

4 INSTITUTO DE BIOLOGIA, UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

Plataforma de Sequenciamento Paralelo Massivo (SPM) permite a análise simultânea

de milhares a milhões de fragmentos de DNA, gerando grandes quantidades de

dados em um prazo relativamente curto em comparação com o método de

Sequenciamento de Sanger. O objetivo deste estudo é analisar o desempenho e a

interpretação dos dados gerados (1) para genotipagem STR com um protótipo do

painel de 24 plex, e o (2) sequenciamento total do mtDNA com um protótipo de

painel de 162 amplicons, ambos gentilmente cedidos pela Thermo-Fisher Scientific,

usando a plataforma Ion Torrent PGM™. Amostras de Material de Referência

Certificado de DNA (NIST SRM 2391c e SRM 2392) foram amplificados com um painel

STR 24 plex e um painel de mtDNA e sequenciados no Ion PGM™. Usamos, também,

amostras de casos reais da Polícia Civil do Estado do Rio de Janeiro, com resultados

inconclusivos e previamente analisados na plataforma de ABI 3500. Considerou-se o

número de alelos discriminados e a percentagem de picos “stutters”, razão de

leituras (RR) e variantes de alélicas observadas. Foram observados perfis de DNA

completo com 37 pg. Sequenciamento com profundidade de leitura de 10.000

permitiu a observação de variação intra-alélicas em 5 loci. Este estudo mostra que

SPM aplicado a genotipagem de STR melhora a precisão e a deconvulação de

misturas.

Amostra de DNA quantificadas por qPCR foram analisadas quanto ao DNA

mitochondrial. Quantidades de DNA nuclear na ordem de 100 pg foram suficientes


17

para se obter o sequenciamento completo do NIST SRM 2392. Amostras complexas

também foram estudadas, mesmo com elevado index de degradação, obtendo-se

perfil compativel entre as amostras de referência e questionada.

Financiamento: CAPES Pro-Forense

resÚmenes/resumos powerplex fusion 6c: estudios …ºmenes.pdfde sexo) (promega corporation) con...

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