UNIVERSIDAD DE PAMPLONAFACULTAD DE CIENCIAS BASICASPROGRAMA DE MICROBIOLOGIA

PRACTICA 9.LABORATORIO DE CITOLOGIA MICROBIANA.AISLAMIENTO E IDENTIFICACION BACTERIANA.

INTRODUCCIONCon el fin de reconocer aun ms la diversidad de las formas de vida que poblaban la tierra, facilitando los sistemas de clasificacin en 1969, R. H. Whittaker propuso un sistema de clasificacin de cinco reinos, donde los microorganismos ms simples estara incluidos en el reino Mnera, posteriormente, en 1978 Carl R. Woese propuso elevar los tres tipos de clulas en los que existe y se fundamenta la vida a un nivel por encima del reino llamado dominio y de ah surgi el sistema de clasificacin de los tres dominios que se conocen en la actualidad donde los procariotas unicelulares cuya pared contiene peptidoglicano se encuentran en el dominio Eubacteria.

AISLAMIENTOS BACTERIANOS.Todo aquel que desee realizar procesos de identificacin debe inicialmente separar el objeto de inters a partir de un grupo heterogneo de poblaciones bacterianas que pueden comportarse como interferentes o dificultar actividades posteriores. Para el aislamiento de microorganismos especficos han sido utilizadas tcnicas selectivas que facilitan la purificacin del organismo, empleando medios que permiten a dichos organismos crecer suprimiendo el crecimiento de otros microorganismos que no sean parte del estudio. La composicin de tales medios son determinados, por regla general, modificando los niveles de pH, la concentracin de agua y la adicin de sustancias con actividad inhibitoria.

CARACTERISTICAS DE CLASIFICACION.Dentro del grupo de las Eubacterias existe a su vez una amplia diversidad de especies en las cuales se pueden apreciar mltiples diferencias que permiten organizarlas de acuerdo a lneas y parentescos, dicho proceso en la actualidad puede realizarse en tres categoras, morfologa (Forma) Fisiologa (Funcionamiento y Expresin gentica (Informacin molecular). De un modo ideal, las especies debera caracterizarse basndose en la descripcin completa de sus fenotipos y genotipos, pero, la prctica taxonmica no llega a estos ideales ya que en la mayor parte de los grupos de seres vivos la descripcin del fenotipo es fragmentaria y la caracterizacin del genotipo es incompleta.

Los caracteres fenotpicos de ms fcil determinacin son los estructuales y anatmicos que pueden observarse directamente. La clasificacin de las bacterias constituye una excepcin dada su extrema simplicidad estructural, esto hace que se disponga de un rasgo demasiado reducido de caracteres para poder hacer una caracterizacin adecuada; Por ello, los taxnomos bacterianos se vieron forzados a buscar otros tipos de propiedades, bioqumicas, fisiolgicas, ecolgicas, para aadir a las propiedades estructurales.

Existen diferentes sistemas de clasificacin de bacterias, pero el ms comnmente utilizado es el Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. La identificacin de una bacteria es su asignacin a un taxn segn una clasificacin dada. Consiste en la determinacin de las caractersticas fenotpicas y/o genotpicas y la comparacin de estas caractersticas con los diferentes taxones de la clasificacin considerada. Las caractersticas a determinar y su nmero depende principalmente del tipo de bacteria y del fin que se persigue en la identificacin.

MORFOLOGIALos morfotipos bacterianos se determinan en cuanto a la forma, ya sea esta de tipo microscpico o unicelular y la macroscpica que se desarrolla en los medios de cultivo. Para tales fines ya estn establecidos una serie de criterios que pueden ser consultados en las prcticas de laboratorio de Microbiologa general (Morfologa Macroscpica y Microscpica de bacterias)

FISIOLOGIA.La fisiologa est determinada por todos los comportamientos celulares, las funciones a partir de rganos o estructuras presentes y finalmente el conjunto de reacciones metablicas de un ser vivo. Para los organismos bacterianos, el estudio fisiolgico est limitado pues ya conocemos que estos seres carecen de organelos en la mayora de sus especies.

ENSAYOS BIOQUIMICOSLa identificacin de un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes combinaciones de caractersticas y diferentes criterios en la evaluacin de similitudes. Los ensayos bioqumicos tradicionalmente utilizados, llamadas pruebas bioqumicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una va metablica (conjunto de reacciones qumicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no.

Las pruebas o ensayos bioqumicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada caracterstica bioqumica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimtica, grupo de enzimas o determinada va metablica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano. Para llevarlas a cabo, se pueden utilizar diferentes sistemas de trabajo (medio de cultivo, indicador, revelador, etc.) que puede ser diferente an para el mismo ensayo si se trata de diferentes microorganismos.

A la determinacin de la especie se puede llegar segn diversos sistemas (manuales de identificacin, comerciales, etc.). Si bien existen una gran variedad de pruebas bioqumicas empleadas con fines de identificacin, se enumerarn a continuacin solo las que se utilizan ms frecuentemente, agrupadas segn el tipo de ensayo y se denominan segn su nombre corriente.1) Enzimas vinculadas con la respiracin a)oxidasa b)catalasa

2) Descomposicin de azcares simples, cidos orgnicos y otros2.1) Requerimientos de oxgenoOF(xido-fermentacin)Crecimiento en caldo tioglicolato 2.2) Produccin de cido, o cido y gasFermentacin de carbohidratos 2.3) Deteccin de enzimas y vas metablicasa)RM-VP (rojo de metilo - Voges Proskauer)b) Gluconatoc) O.N.P.G. (orto nitro -D-galactopiransico)d) Esculinae) Hipurato

3) Fuente nica de carbonoa)citratob) malonatoc) hipurato para coliformes

4) Utilizacin de compuestos nitrogenados 4.1) Reduccin de nitrato a) asimilacin b) denitrificacin 4.2) Descomposicin de carbohidratos aminocidos y otrosa)indolb) H2Sc)Fenilalaninad)Lisina, arginina, ornitinae) Urea

5) Ensayos combinadosa)TSI (Triple Azcar Hierro)b) LIA (Agar Hierro Lisina)c)Bilis esculina

6) Deteccin de exoenzimasa) lecitinasab) proteasas,coagulasac) amilasasd) celulasase)desoxirribonucleasasf) accin de microorganismos sobre la sangre (hemolisinas)

7) Miscelneosa) KCNb) Bilisc)produccin de pigmentos

8) Test de crecimiento o inhibicin a) Temperaturab) NaCl c) Antibiticos

METODOLOGIA.

1. A partir de un pool de microorganismos contenidos en un caldo realice siembras por agotamiento en medios nutritivos (CASOY, TRIPTICAS O AGAR NUTRITIVO), llvelos a incubacin a 37C/24 Horas.

2. De acuerdo a los crecimientos establecidos realice separacin de gneros por morfotipos, (a partir de su morfologa macroscpica)

3. Purifique cada morfotipo por agotamiento realizando aislamientos en medios nutritivos por separado (un medio por cada morfotipo) lleve a incubacin a 37C/24 hrs

4. Realice respaldos o copias de los organismos obtenidos a partir del segundo o tercer aislamiento de la siguiente manera:

Transfiera una o dos asadas de las colonias puras en caldo BHI o peptona agregue 1 a 2 ml de crioconservante y lleve a congelacin (0C/30 60 das) Transfiera mediante siembra mixta una colonia a un tubo con agar nutritivo inclinado, incube por 12 horas a 37C, retire y lleve a refrigeracin, realice este mismo procedimiento cada 7 das. Realice agotamientos en agar nutritivo e incube a 37C/24 Hrs.

5. Tenga en cuenta que por cada respaldo las caractersticas morfolgicas se deben conservar, este criterio permite mantener la pureza del aislamiento.6. A partir de los aislamientos puros para cada morfotipo, realice la descripcin morfolgica de tipo microscpico y la respectiva deteccin de estructuras (Capsula, espora)

7. En funcin de la caracterstica de pared, cultive al organismo en un medio que contenga un determinado sustrato o inhibidor con el fin de visualizar el crecimiento y la degradacin de un sustrato, ya sea por viraje de un indicador o por agregado de un reactivo revelador de la presencia del sustrato, o de algn producto de su degradacin.

Emplee uno de los siguientes medios:Bacilo Gram Negativo: EMB VRB ENDO XLD HEKTOEN BISMUTO SULFITO Bacilo Gram Positivo: MYP PALCAM - OXFORD SPSCoco Gram Positivo: BAIRD PARKER SALADO MANITOL - KF

8. Una vez establecido el criterio principal de crecimiento, recupere el organismo a partir de uno de los respaldos, realice una nueva siembra en medio nutritivo y proceda a hacer la marcha analtica de acuerdo al anexo 1 (Identification flow charts). Empezando por la determinacin de los sistemas respiratorios continuando sucesivamente con las pruebas.

9. Entregue el reporte de los organismos identificados a partir de la muestra.

NOTA: Recuerde trabajar de la manera ms asptica posible, evitando la contaminacin de la muestra.

CONSULTE SOBRE:BBL, ENTEROTUBE II (Becton Dickinson)OXI/FERM TUBE IIAPI 20 E.Quintet 3H de Diagnostics Pasteur para Enterobacterias.API 10SAPI ListeriaAPI NH (Neisseria - Haemophilus)BBL CRYSTAL BD

REFERENCIAS.Madigan, M., Martinko, J. y Parker, J., Biologa de los microorganismos, Madrid, Brock, Pearson, 2009

Anonimo. IDENTIFICACIN DE UNA CEPA BACTERIANA. Disponible en: http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioPruebasBioquimicas.htm. Consultado en: Agosto 2013.

4Elaborado por : DOCUMENTO EN REVISION.DANNY PISCIOTTI ORTEGA. AGOSTO 2013.