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Catálogo de hongos en semillas de frijol (Phaseolus vulgaris L.) en Nicaragua

Enero, 2013

Proyecto "Apoyo a la Producción de Semillas de Granos Básicos para la Seguridad Alimentaria de Nicaragua"PAPSSAN DCI-FOOD/2009/021-586

CATÁLOGO DE HONGOS EN SEMILLAS DE FRIJOL (Phaseolus vulgaris L.) EN NICARAGUA

Una Publicación del Gobierno de Reconciliación y Unidad Nacional a través del Instituto Nicaragüense de Tecnología Agropecuaria (INTA)

Fuente de � nanciamiento: UNIÓN EUROPEA, PROYECTO PAPSSAN«La presente publicación ha sido elaborada con la asistencia de la Unión Europea. El contenido de la misma es responsabilidad exclusiva del Instituto Nicaragüense de Tecnología Agropecuaria (INTA) y en ningún caso debe considerarse que re� eja los puntos de vista de la Unión Europea».

Fuente de Informacion: Universidad de Helsinki e INTA (PROGRAMA NIFAPRO)

Contenido técnico: MSc. Del� a Marcenaro Rodríguez

Fotografías: MSc. Del� a Marcenaro Rodríguez

Todos los derechos reservados © Universidad de Helsinki e INTA

Tiraje: 800 ejemplares


Managua - Nicaragua, Enero de 2013



ContenidoI. AGRADECIMIENTOS 1

II. ABREVIATURAS 2

III. RESUMEN 3

IV. INTRODUCCIÓN 4

Hongos 4

Daños que producen los patógenos de semillas 4

V. OBJETIVO DEL CATÁLOGO 5

VI. METODOLOGÍA 6

Muestreo de semillas en este estudio 6

Análisis 6

Incubación de las semillas 7

Aislamiento de hongos 10

Visualización fenotípica y microscópica 10

Pruebas de emergencia/germinación usando sustrato estéril (arena) 10

Pruebas de patogenicidad 14

Pruebas basadas en técnicas de la reacción en cadena de Polimerasa (PCR) 15

Secuenciación de ADN y análisis de secuencias 15

Catálogo de hongos en semillas de frijol (Phaseolus vulgaris L.) en Nicaragua Catálogo de hongos en semillas de frijol (Phaseolus vulgaris L.) en Nicaragua L.) en Nicaragua


VII. RESULTADOS 17

HONGOS PATOGÉNICOS TRANSMITIDOS POR SEMILLAS 17

Lasiodiplodia theobromae (Pat) teleomorfo (Botryosphaeria rhodina) 17

Collectotrichum gloesporiodes (Penz) teleomorfo (Glomerella cingulata) 20

Collectotrichum capsici (Syd) E.J. Butler & Bisby 22

Diaporthe spp (Nitschke 1980), Anamorfo (Phomopsis) (Sutton, 1980) (Webster & Weber, 2007) 24

Corynespora cassiicola (Berk. & M.A. Curtis) C.T. Wei, (1950) 27

Complejo de Fusarium spp (F. incarnatum (R.) Sacc, equiseti (Corda) Sacc. Sensu Gordon y Chlamydosporum (Wollenv) 30

Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid (Syn o anamorfo Rhizoctonia bataticola (Taub) 32

Hongos de almacenamiento 35

Penicillium citrinum (Link) y Aspergillus fl avus (Link) 35

Aspergillus niger (Link) 38

VIII. RECOMENDACIONES 41

IX. CONCLUSIONES 42

X. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 45



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I. AGRADECIMIENTOSGracias al Instituto Nicaragüense de Tecnología Agropecuaria (INTA), el Laboratorio de Biotecnología en el CNIA y al Proyecto Apoyo a la Producción de Semillas de granos básicos para la Seguridad Alimentaria de Nicaragua (PAPSSAN) auspiciado con fondos de la Unión Europea por la publicación de este primer Catálogo de hongos en semillas de frijol en Nicaragua, dirigido a profesionales y estudiantes de agricultura. Especial agradecimiento a la Universidad de Helsinki, Finlandia (Programa NIFAPRO) ya que parte de esta investigación fue realizada en sus instalaciones. De manera especial muchas gracias a todas las personas que de una u otra manera aportaron con sus sugerencias, comentarios, corrección y realización del mismo.



II. ABREVIATURAS

BLAST Herramienta de Búsqueda de Alineamiento Local Básico

CNIA Centro Nacional de Investigación Agropecuaria y Biotecnología

CTAB Bromuro de hexadeciltrimetilamonio

INTA Instituto Nicaragüense de Tecnología Agropecuaria

NBCI Centro Nacional de Información de Biotecnología

PCR Reacción en cadena de polimerasa

PAPSSAN Proyecto de Apoyo a la Producción de Semillas de granos básicos para la Seguridad Alimentaria de Nicaragua

PDA Papa Dextrosa Agar

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III. RESUMEN Los hongos transmitidos por semillas son una gran limitación para la producción de frijol en Nicaragua y causa grandes pérdidas en el rendimiento. Sin embargo, la identifi cación de hongos trasmitidos por semillas ha ganado poca atención. Una de las prioridades del INTA es identifi car aquellos transmitidos por semillas en el cultivo del frijol en Nicaragua. Diferentes pruebas de análisis para la identifi cación de hongos fueron llevadas a cabo en treinta siete lotes de semillas de frijol en un periodo comprendido entre el 2008 y 2011 procedente de Boaco, Carazo, Estelí, Jinotega, Matagalpa, Nueva Guinea y El Rama. Estos análisis incluyeron pruebas de incubación, siembra de semillas en medio agar, uso de papel secante estéril; Aislamiento de hongos en medio PDA, caracterización morfológica (pruebas visuales: fenotípicas y microscópicas), pruebas de geminación/emergencia usando sustrato estéril, pruebas patogénicas y pruebas moleculares (extracción de ADN, PCR, secuenciación). Los hongos patogénicos fueron clasifi cados en seis grupos fenotípicamente distinguibles basados en las características de los aislados y de identifi caciones a través de análisis de secuencias de espacios internamente transcritos (ITS1 e ITS 4) de genes ribosomales. Para el efecto fueron usados marcadores moleculares universales capaces de amplifi car regiones de ITS de un largo rango de diferentes grupos de hongos los que son usados en reacciones de cadenas de polimerasas (conocido como PCR por sus siglas en inglés). Las secuencias de los aislados de hongos de Nicaragua fueron comparadas con aquellas disponibles en la base de datos del Centro Nacional de Información de Biotecnología (NBCI) usando el programa de herramienta de búsqueda de alineamiento básico local (Blast) el cual encuentra las regiones de similitud local entre las secuencias. Los hongos identifi cados mediante secuencias de espacios internamente transcritos fueron: Complejo de Fusarium (F. chlamydosporum, F. equiseti y F. incarnatum); Macrophomina phaseolina (anamorfo o sinónimo Rhizoctonia bataticola); Lasiodiplodia theobromae (teleomorfo Botrysphaeria rhodina) Corynespora cassiicola; Collectotrichum gloesporiodes (teleomorfo Glomerella cingulata); Colletotrichum capsici; Diaporthe sp/Phomopsis. Mediante identifi cación de prueba de incubación y prueba de germinación en sustrato esteril fue detectado la presencia de Rhizoctonia solani Kühn (teleomorfo Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk. Hongos de almacenamiento de semillas también fueron identifi cados como: Penicillium citrinum, Aspergillus fl avus y A. niger. Estos resultados podrían revelar que diferentes grupos de hongos trasmitidos por semillas están infectando el cultivo de frijol. Esto ha permitido identifi car marcadores moleculares para la identifi cación de cuatros grupos de hongos, considerados los de mayor importancia en este estudio. Estos marcadores específi cos pueden ser utilizados en inspecciones de semillas y en estudios de epidemiologia, ecología y control de patógenos de hongos en el cultivo del frijol en el campo.

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IV. INTRODUCCIÓNEl uso de métodos útiles y confi ables para la determinación de calidad de semillas es esencial para minimizar los riesgos productivos que implica el uso de semillas. La calidad de semillas se evalúa por su pureza, germinación, vigor y características fi tosanitarias. Esta última característica es una de las de mayor relevancia.

El presente catálogo presenta los hongos identifi cados en semillas recolectadas en diferente zonas de Nicaragua, incluyendo patógenos que antes no habían sido reportados en el país. También incorpora detalles sobre metodologías empleadas en el proceso de identifi cación.

Hongos

Los hongos son considerados como organismos Eucariotas (Carlile & Watkinson, 1994). Muchos hongos son fi lamentosos y su reproducción es por esporas. Ellos tienen paredes celulares y en su mayoría contienen quitina y glucanos. Sin embargo, muchos miembros de un grupo de hongos (Imperfectos) son Deuteromycetes, que no forman esporas. Estos hongos se multiplican por el crecimiento de fragmento de hifas. Los hongos pueden clasifi carse como parásitos obligados (biotrofos) y no obligados (necrotrofos y hemibiotrofos) o pueden ser saprofi tos facultativos o parásitos facultativos. Hay más de 100 000 especies de hongos que son saprofi tos pero solo 10 000 de ellos son conocidos como causar enfermedades en las plantas (Agrios, 1997).

Los síntomas de enfermedades causadas por hongos en las plantas incluyen necrosis en los tejidos de las plantas, reducción del crecimiento de órganos de la planta o un crecimiento excesivo y anormal en algunas partes. Síntomas necróticos consisten en manchas foliares, tizones pudrición de raíces, úlceras, ahogamiento (conocido en inglés como damping-off), pudrición de tallo suave y antracnosis. Otros síntomas como marchitez también son observadas en plantas (Agrios, 1997).

Daños que producen los patógenos de semillas

Enfermedades trasmitidas por semillas causadas por virus, hongos y bacterias son frecuentemente perjudiciales en la producción de frijol y otros cultivos en Nicaragua. Los patógenos en semillas se transmiten como contaminantes adheridos a la cubierta de la semilla o internamente que se considera como el principal mecanismo de transmisión por semilla (Waller et al., 2002).

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En las últimas décadas, los rendimientos se han reducido por cambios climáticos pero sobre todo el principal factor limitante han sido las enfermedades trasmitidas por semillas.

Más del 50% de las enfermedades más importantes son aquellas trasmitidas por semillas. Las enfermedades fúngicas han provocado grandes pérdidas en la producción de frijol (Hall 1991; Agrios, 1997; PROMESA 2000).

Muchos patógenos son causantes de fallas en la germinación y producción de plántulas enfermas que con el tiempo mueren o no prosperan en el campo.

Una cantidad de hongos se encuentran presentes en las semillas de frijol, promoviendo a las simientes del frijol, en vehículos de inóculo que permiten la introducción de los hongos a otros lotes de producción. De esta forma, muchos hongos causantes de enfermedades de cultivo en algunas regiones del país son diseminados a otras regiones a través de las semillas, dispersando de esta manera las enfermedades por las regiones de mayor producción de frijol del país.

La siembra de semillas infectadas con determinados hongos no solo reduce el número inicial de plántulas durante la emergencia del cultivo, sino que es una forma de incrementar la cantidad del inóculo del hongo en el suelo y rastrojos, aumentando de esta manera la presencia de este en los lotes de producción de semillas y granos. Además, es importante mencionar que a los problemas que pueden ocasionar los patógenos presentes en las semillas de frijol, tanto en la germinación y/o emergencia en campo, se suman los hongos que se encuentran en el almacenamiento de semillas y que producen micotoxinas las cuales son dañinas para la salud humana y animal. Dentro de este grupo de hongos se encuentran aquellos como: Aspergillus sp y Penicillium sp lo que tienen además la facilidad de deteriorar las semillas y reducir la capacidad de germinación durante el periodo que dura la postcosecha.

V. OBJETIVO DEL CATÁLOGOEste catálogo informativo esta dirigido principalmente a profesionales y estudiantes del sector agrícola. Describe hongos encontrados en semillas de frijol en Nicaragua y la metodología usada para su identifi cación. Algunos de ellos son patogénicos bajo condiciones controladas de laboratorio y reportados por primera vez en Nicaragua.

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VI. METODOLOGÍA

Muestreo de semillas

Las semillas de frijol se obtuvieron de pequeños y medianos productores de frijol en diferentes regiones, periodos de cosecha y años. Durante el año 2008 se colectaron semillas de frijol de la cosecha de primera con procedencia de Boaco, Carazo, Estelí y Matagalpa.

Durante el periodo 2010 se colectaron semillas de frijol de cosecha de primera procedente de Carazo (Masatepe), Chinandega, Jinotega y Nueva Guinea. En 2011 se obtuvieron semillas de frijol de la cosecha de postrera 2010 y apante 2011 procedente de Carazo, Jinotega, Nueva Guinea y El Rama.

El muestreo de semillas fue realizado como se describe en ISTA, 1996 & AOSA, 1997. Básicamente, cada muestra elemental o primaria fue tomada aleatoriamente en cada lote y en las zonas antes mencionadas se mezclo para obtener una muestra compuesta homogenizada y de un peso mínimo y se envió al laboratorio (muestra sometida). El tamaño de la muestra sometida se mezcló nuevamente y se dividió para asegurar una muestra homogenizada que es como se le conoce como muestra de trabajo (400 semillas por lote).

Durante el muestreo, la muestra de semillas representan la composición del lote de semilla como un conjunto y que independientemente de la precisión de los análisis, los resultados en este estudio representan solo la calidad de la muestra sometida a análisis (AOSA, 1997).Posterior al muestreo, los análisis de detección e identifi cación de patógeno del lote de semillas solo representara el nivel de infección del lote siempre y cuando la muestra de semillas sea representativa del lote.

Análisis

Análisis de patología usando métodos convencionales y moleculares fueron realizados en muestras de semillas colectadas de la cosecha de primera 2008. Mientras que las semillas de frijol colectadas del 2010 fueron realizados análisis de patología usando métodos convencionales y pruebas PCR, con el uso de marcadores específi cos solo para cuatro tipos de hongos (Fusarium spp; M. phaseolina; Colletrotrichum spp y L. theobromae).

El análisis de semillas colectados en el 2008 se llevó a cabo en el Laboratorio de Biotecnología, del Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias y Biotecnología (CNIA) del Instituto Nicaragüense de Tecnología Agropecuaria (INTA) en Managua, Nicaragua y en el en el Laboratorio de Biología aplicada, del Departamento de Agricultura y Forestal, Universidad de Helsinki (Finlandia) como parte de estudios de maestría (Marcenaro et al., 2009).

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No obstante, los análisis de las semillas obtenidas durante el 2010 y 2011 se realizaron en el Laboratorio de Biotecnología, del Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias y Biotecnología (CNIA) del Instituto Nicaragüense de Tecnología Agropecuaria (INTA).

Estos análisis incluyeron pruebas de incubación en los medios de agar agua, papel secante estéril, aislamiento de hongos en medio de cultivo PDA, pruebas de germinación usando sustrato estéril (arena), pruebas visuales/microscópicas para todas las muestras de semillas colectadas durante el periodo del 2008 al 2011.

Pruebas de patogenicidad y pruebas de reacción en cadenas de polimerasas (PCR) y Secuenciación fueron realizadas para todas las muestras de semillas colectadas en el 2008.

Incubación de las semillas

Las pruebas de incubación son necesarias para detectar la presencia de microrganismos causantes de enfermedades en las semillas. Materiales contaminantes o adheridos a las semillas fueron removidos para todas las muestras colectadas desde del 2008 al 2011 usando etanol e hipoclorito y enjuagados con agua purifi cada. Seguidamente las semillas fueron dejadas en papel fi ltro para su secado y posterior uso en pruebas de incubación en papel secante (Figura 1 y 2) y agar agua. Se sembraron 400 semillas en agar agua a una proporción de 8 semillas por plato Petri (Figura 3). Luego de la siembra, se colocaron en una incubadora a una temperatura de 30 °C o bien en un cuarto a temperatura ambiente (25° C).

Aspergillus Flavus

Aspergillus Flavus

Exudado BacterianoA B

Fig. 1. Semillas de frijol variedad INTA-Cárdenas con conidióforos de Aspergillus flavus (A y B). Exudado bacteriano (B).

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Macrophomina phaseolina Fusarium spp

A

B C

Fig. 2. Semillas de frijol (INTA Rojo) con Macrophomina phaseolina y Fusarium spp (A). Semillas de frijol totalmente infectadas con diferentes grupos de hongos como: Lasiodiplodia theobromae, Diaporthe/Phomopsis spp, Macrophomina phaseolina y Fusarium spp en pruebas de papel secante estéril procedentes de Boaco, 2010 (B y C).

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A B

A

C

B

D

Fig. 3. Semillas de frijol cv INTA Rojo procedente de Boaco infectadas con micelio de hongos algodonoso Fusarium spp (A). Semillas de frijol cv INTA Rojo procedente de Matagalpa infectadas con micelio de hongo algodonoso Fusarium spp y Penicillium spp (C). Semillas de frijol cv INTA Rojo procedente de Matagalpa infectadas con esclerotio de Macrophomina phaseolina (B). Semillas de frijol cv INTA Rojo procedente de Matagalpa infectadas con conidioforos de Aspergillus flavus.

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Aislamiento de hongos

Parte del micelio (1 tip de hifa) fue transferido en platos Petri con PDA (agar de dextrosa de papa) conteniendo estreptomicina Lethonen et al. (2008). Cuando no se obtuvo un cultivo puro, fue necesario transferir micelio a nuevos platos hasta obtener cultivos puros. Los platos se mantuvieron boca abajo para evitar acumulación de agua sobre el micelio del hongo y fueron almacenados a 4 o 5°C.

Visualización fenotípica y microscópica

Los aislados de hongos fueron clasifi cados de acuerdo a sus características de crecimiento en el medio de cultivo tales como: color, textura, uniformidad y observación microscópica. Para la visualización de las estructuras de hongos e identifi cación se emplearon los colorantes azul de lactofenol y azul algodón acético.

Pruebas de emergencia/germinación usando sustrato estéril (arena)

Para cada uno de los lotes se sembraron 400 semillas en ocho bandejas plásticas conteniendo arena esterilizada (50 semillas por bandeja), por periodo de incubación de 10 a 14 días sin que la semilla haya recibido pretratamiento (Figura 4, 5 y 6).

Un diseño completamente al azar (DCA) fue realizado para análisis de los lotes de las semillas. Variables tales como: germinación, emergencia, síntomas en las plántulas y crecimiento anormal fueron evaluadas.

Análisis de varianza (ANDEVA) con un factor y comparación de medias basados en la prueba de Tukey (α =0.05) fue llevado a cabo.

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A

B

CFig 4. Plántulas de frijol cv INTA Rojo en pruebas de emergencia/germinación usando sustrato estéril con daños severos causados por un complejo de hongos : Pudrición de raíces, Lesiones en el tallo de color café-marrón, Necrosis (A y C), Anormal crecimiento (B).

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BA

C

Fig 5. Plántulas de frijol (INTA Rojo) procedente de Boaco 2010 en pruebas de emergencia/germinación usando sustrato estéril a los 13 días de la siembra. Pobre germinación, crecimiento anormal y pudrición de semillas causados por hongos (A, B y C).

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A

C

E

G

B

D

F

H

Fig 6. Plántulas de frijol INTA Rojo en pruebas de emergencia/germinación usando sustrato estéril a los 13 días de la siembra. Conidioforos de Aspergillus flavus (A). Semillas no germinadas con pudrición y con presencia de micelio de hongo algodonoso sobre la semilla Fusarium spp (B). Anormal crecimiento (C y D). Síntomas de tejido necrótico y pudrición de la plántula y raíz (E y F). Hojas con síntomas cloróticas (G y H).

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Pruebas de patogenicidad

Pruebas de patogenicidad (Lehtonen et al., 2008), de diferentes aislados de hongos obtenidoos de las muestras colectadas del 2008 fueron llevadas a cabo dos veces de manera independiente (dos tratamientos por separado, con cinco repeticiones por cada aislado incluyendo su control negativo).

Semillas certifi cadas de frijol blanco (Navy bean) libres de patógenos procedente del Ministerio de Agricultura y Forestal de Finlandia (MTT), fueron esterilizadas y puestas a germinar sobre papel fi ltro estéril. Semillas germinadas, fueron depositadas en tubos Falcón de 50 ml conteniendo aproximadamente 10 ml de arena estéril húmeda. En cada tubo se coloco una semilla. Luego, las semillas fueron cubiertas por otros 10 ml de arena estéril. Encima de esta capa de arena se depositó una pieza de PDA conteniendo hifas de los hongos aislados. Luego el tubo fue llenado casi completamente con arena y cerrado con una tapa (Figura 7). Cuatro tubos como repeticiones fueron inoculados con cada hongo aislado. Tubos con semillas de frijol esterilizadas, sanas y germinadas sin inoculante fueron usados como control.

Los tubos fueron incubados en un cuarto de crecimiento a 20°C con luz tenue. Las observaciones de síntomas fueron realizadas a los 20 días después de la inoculación. Postulados de Koch fueron aplicados para corroborar los resultados.

Arena estéril

Arena estéril

Arena estéril

Semilla de frijol germinada

Inóculo (Hongo en PDA)

A B

Fig. 7. Pruebas de patogenicidad de diferentes cepas de hongos aislados de semillas de frijol (A). Sintomas después de 20 días de inoculación. Lesiones y manchas de color oscuro marrón sobre el tallo de la plántula, hongo Macrophomina phaseolina (B).

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Pruebas basadas en técnicas de la reacción en cadena de Polimerasa (PCR)

El Acido Dexorribonucleico (ADN) de los aislados de hongos fue extraído usando el método Bromuro de Hexadeciltrimetilamonio o Bromuro de Cetiltrimetilamonio (CTAB) descrito por Ausubel et al. (1995) y modifi cado por Marcenaro (2009). El buffer de CTAB fue preparado a una concentración fi nal de 2% w/v CTAB, 20 mM NaEDTA, 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, y 1.4 M NaCl).

El ADN fue extraído de micelio fresco, que es cultivo puro de 1-3 semanas de crecimiento sobre medio de cultivo PDA.

Marcadores moleculares de Espacios Internos Transcritos (ITS) ITS1 e ITS4 fueron usados para amplifi car regiones de genes de ribosomas (ITS1-ITS2), Lethonen et al., (2008).

Estos marcadores moleculares son capaces de amplifi car un amplio rango de hongos. Los productos de la reacción PCR fueron analizados mediante electroforesis usando gel de agarosa al 1%.

El tamaño esperado del fragmento amplifi cado por los marcadores moleculares ITS 1 e ITS 4 fue de aproximadamente de 600 pares de bases (White et al., 1990).

Secuenciación de ADN y análisis de secuencias

Los productos PCR positivos (Figura. 8), fueron purifi cados usando un kit de extracción de gel (E.Z.N.A, manual 09/2008, Omega Bio-Tek) y enzimas como exonucleasa I, (EXO I) fosfatasa alcalina de intestino de ternero (CIAP), o fosfatasa alcalina de camarón (SAP). Secuenciación directa de los productos PCR purifi cados fue llevado a cabo en laboratorio de secuenciación del Instituto Haartman, Universidad de Helsinki. Las secuencias de ocho grupos de aislado de hongos obtenidos de semillas de frijol se compararon con las secuencias obtenidas de la base de datos del Centro Nacional de Información de Biotecnología (NBCI), mediante la herramienta de Búsqueda de Alineamiento Local Básico (Blast). Las secuencias fueron alineadas utilizando el programa CLUSTAL X. Análisis fi logenéticos fueron realizados utilizando valores de arranque (bootstrap) de 1,000 réplicas y método Kimura two parameters basado en alineamiento CLUSTALW usando la versión de MEGA5 (Tamura et al. 2007).

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650 pb+ + ++ +

+----

+

+

+

+

+

+ +650 pb

A

B

Fig. 8. Productos PCR positivos (+) con muestras de hongos aislados de semillas de frijol en Nicaragua (A y B) amplificados con marcadores moleculares universales (ITS1 e ITS4). Tamaño del fragmento 650 pb (pares de bases). Marcador (ruler) ADN de 1000 pares de base.

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VII. RESULTADOS De las semillas colectadas en el 2008 en total se identifi caron ocho grupo diferentes hongos (Cuadro 1 y 1a, Páginas 38 y 39), identifi cados mediante pruebas PCR y microscópicas, cuatro de ellos reportados por primera vez infectando semillas de frijol en Nicaragua. De acuerdo a pruebas de patogenicidad son considerados además como hongos patogénicos.

Además los análisis estadísticos de pruebas de germinación/emergencia usando sustrato estéril mostró que el análisis de varianza con un factor para los seis lotes de semilla colectados en el 2008, cosecha de primera para evaluar variables como: germinación/emergencia, síntomas de las plántulas y la porción de semillas que dio lugar a plantas cualifi cadas o sanas, indicó que hay diferencias entre los lotes de semillas con respecto a la germinación/emergencia (p = 0.00006) y la porción o cantidad de semillas que dió lugar a plantas vigorosas y de aspecto saludable (p = 0.00006).

Sin embargo, no se observaron diferencias signifi cativas en la porción o cantidad de plántulas que dieron origen a síntomas de enfermedades (p = 0.12974).

Los resultados mostraron que hay diferencias estadísticamente signifi cativas entre los seis lotes de semillas estudiados en relación a la variable de germinación.

Los dos lotes procedente de Carazo mostraron diferencias entre si, pues el lote dos mostro una alta germinación, mientras que el otro lote (lote 3) fue uno de los más pobres en germinación. El lote uno procedente de Boaco también mostro una pobre germinación en relación al resto de lotes de semillas. Los resultados también indicaron que los lotes de semillas que exhibieron mejor germinación dieron surgimiento a una mayor cantidad de plántulas sanas y de buen crecimiento. En contraste, la aparición de una pobre germinación fue asociada con una porción/cantidad de plántulas que germinaron pero con un crecimiento anormal y pobre afectado aparentemente con síntomas de enfermedades causadas por hongos.

HONGOS PATOGÉNICOS TRANSMITIDOS POR SEMILLAS

Lasiodiplodia theobromae (Pat) teleomorfo (Botryosphaeria rhodina)

Taxonomía: Reino Fungi; Phylum Ascomycota; Clase Dothideomycetes; Orden Botryosphaeriales; Familia Botryophaeriaceae; Género Lasiodiplodia.

Descripción: Las colonias en medio de cultivo PDA son de color sepia grisáceo a gris, suave y esponjoso con abundante micelio aéreo (Figura 9). Se observaron Conidios maduros bicelular de color marrón oscuro con estrías típicas de L. theobromae (Figura 10).

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A

Fig. 9. Crecimiento de Lasiodiplodia theobromae (teleomorfo Botryosphaeria rhodina) en PDA. Las colonias en medio de cultivo son de color sepia grisáceo a gris, suave y esponjoso con abundante micelio aéreo (A).

A B

Conidios

Conidios

Fig. 10. Conidios maduros bicelular de color marrón oscuro con estrías típicas de L. theobromae (A y B).

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Huéspedes: Especies de Botryophaeriaceae son cosmopolita y ocurren en una variedad de plantas hospederas. L. theobromae ha sido asociado con aproximadamente 500 plantas hospederas incluyendo cultivos de importancia como uva (Vitis vinífera), cítricos, cacao(Theobroma cacao L) Torrealba, C., Gonzalez, H., Milla, D & Sanabria, M. E (2009). Además, afecta el mango (Mangifera indica L), aguacate (Persea americana), maíz (Zea mays), Pino (Pinus sp), coco (Cocos nucifera), etc Alves et al. (2008).

Sintomatología: L. theobromae es un patógeno que causa enfermedades como pudriciones en plantas, chancros/lesiones y muerte regresiva en al menos 500 especies de plantas en las que destacan: mango, aguacate, cítricos, algodón, cacao (Punithalingan 1976, 1980). Esta enfermedad se manifi esta en ramas, tallos, raíces y frutos. En frutos puede ocasionar lesiones y pudriciones blandas las que empiezan con una mancha de color parda.

En las ramas y brotes causan necrosis empezando con un amarillamiento en las hojas más jóvenes, hasta que adquiere una coloración marrón-pardo, o rojizo y que con el tiempo se puede tornar de un color gris oscuro. Es un hongo fi topatógeno causando enfermedades de muerte regresiva y gangrenosa (Von Arx & Muller, 1954; Barr, 1897).

En estudio de pruebas de patogenicidad realizado por Khanzada, M.A et al. (2004) en el cultivo del mango en Pakistán reportó L. theobromae como un hongo patogénico causando síntomas de muerte regresiva.

En pruebas de patogenicidad síntomas de daños fueron observados en plántulas de frijol como las descritas en las fi guras (Figura 11).

A B C

Fig. 11. Pruebas de patogenicidad del hongo L. theobromae. Síntomas: Lesiones/chancros de color pardo y pudriciones blandas sobre plántulas de frijol (A, B y C). Crecimiento de micelio del hongo de color gris en el tejido infectado (C).

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Trasmisión: El hongo puede ser diseminado por la lluvia y el viento y penetrar a través de heridas en tejido de las plantas. Condiciones favorables como: altas precipitaciones, temperaturas (arriba de 23 º C) y humedad promueven la incidencia y desarrollo de la enfermedad (Arauz & Umaña, 1986).

Distribución geográfi ca: L. theobromae geográfi camente se encuentra disperso especialmente en países tropicales y subtropicales (Punithalingam, 1980). Fue encontrado en lotes de semillas procedentes de Boaco y Carazo.

Método de identifi cación: Morfológica y molecular. Basados en análisis de secuencias ITS, aislados de este grupo de hongos fueron 99-100% idéntico a Lasiodiplodia theobromae (teleomorfo Botryosphaeria rhodina). Analisis morfologicos indican que las estructuras microscopicas son conidias del hongo L. theobromae.

Reporte: Es un hongo patogénico reportado por primera vez en Nicaragua en semillas de frijol. No fueron encontradas referencias previas de este hongo en frijol común.

Collectotrichum gloesporiodes (Penz) teleomorfo (Glomerella cingulata)

Taxonomía: Reino Fungi: Phylum Ascomycota; Clase Sordariomycetes; Orden Incartae sedis; Familia: Glomellaceae; Genero: Glomerella.

Descripción: Las colonias en PDA de C. gloesporiodes presentan micelio de color gris (Figura 12). Sin embargo, pueden ser de color blanco grisáceo al inicio de su crecimiento en PDA y que con el tiempo se puede tornar de color oscuro. Se observaron conidios ovoides u ovalados (Figura 13). En su mayoría presentan en el extremo redondeado y en el otro agudo.

A B

Fig. 12. Crecimiento de Collectotrichum gloesporiodes (Penz) (teleomorfo Glomerella cingulata) en medio de cultivo PDA aislado de semillas de frijol. Colonias del hongo en PDA micelio de color gris. Parte superior del cultivo puro del hongo en medio de cultivo PDA (A). Parte inferior del cultivo puro del hongo en medio PDA (B).

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A

Conidias

Fig. 13. Conidias de Collectotrichum gloesporiodes (Penz) (teleomorfo Glomerella cingulata).

Huéspedes: Cítricos, mangos, papaya, guayaba, banano, aguacate, tomate entre otros.

Sintomatología: Antracnosis causada por especies de Collectotrichum es una enfermedad que afecta a las hojas, ramas, vainas, tallos, las venas y los frutos y que presentan manchas de color oscuro o lesiones hundidas con anillo leve levantado. Puede afectar toda la planta. En cultivos tropicales, las ramas se marchitan lentamente y aparece una mancha gomosa entre la zona sana y enferma. Seguidamente las ramas mueren gradualmente y lentamente. En las hojas aparecen manchas circulares dispersas, sobre todo por los bordes. De acuerdo a pruebas de patogenicidad se comprueba que C. gloesporiodes es patogénico ya que al momento de la inoculación es capaz de enfermar semillas y plántulas.

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Trasmisión: Colletrotrichum gloesporiodes, pueden sobrevivir dentro y fuera de la semilla (Pernezny et. al 2003) y es considerado un hongo trasmitido por semillas. Altas temperaturas favorecen la infección y propagación del hongo. Semillas y desechos de los cultivos son consideradas como fuentes primarias de infección por Colletotrichum spp (Manandhar & Hartman, 1999).

Distribución geográfi ca: En regiones subtropicales y tropicales. Fue encontrado en Boaco.

Método de identifi cación: Basados en análisis de secuencias ITS, aislados de este grupo de hongos fueron 100 % idéntico a C. gloesporiodes. Analisis morfológico indicaron que las estructuras microscópicas son conidias pertenecientes a C. capsici.

Reporte: Con este trabajo de investigación se reporta por primera vez en el cultivo del frijol en Nicaragua (no existen reportes previos de este hongo infectando el frijol) y reportado como un hongo patogénico. Fue encontrado en la región Boaco.

Collectotrichum capsici (Syd) E.J. Butler & Bisby

Taxonomía: Reino Fungi: Phylum Ascomycota; Clase Sordariomycetes; Ordern Phyllacharales; Familia Phyllachoraceae (Von 1957). Género: Collectotrichum.

Descripción: Las colonias en PDA de C. capsici son de color café grisáceo (Figura 14). La observación microscópica muestra formación de conidias de forma alargadas (Figura 15).

Huéspedes: Chiltoma (Capsicu annuum, L), Chile.

A B

Fig. 14. Crecimiento de Collectotrichum capsici en medio de cultivo PDA aislado de semillas de frijol. Colonias dan un color café grisáceo. Parte superior del cultivo puro del hongo en medio de cultivo PDA (A). Parte inferior del cultivo puro del hongo en medio PDA (B).

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A B

Conidias

Conidias

Fig. 15. Conidias de Collectotrichum capsici (A y B).

Sintomatología: Antracnosis causada por especies de Collectotrichum es una enfermedad, que afecta a las hojas, ramas, vainas, tallos, venas y frutos que presentan manchas de color oscuro o lesiones hundidas con anillo leve levantado. Puede afectar toda la planta. En cultivos tropicales, las ramas se marchitan lentamente y aparece una mancha gomosa entre la zona sana y enferma. Posteriormente las ramas mueren gradual y lentamente. En las hojas aparecen manchas circulares dispersas, sobre todo por los bordes. De acuerdo a pruebas de patogenicidad (Figura 16), se comprueba que C. capsici es patogénico ya que al momento de la inoculación es capaz de enfermar semillas y plántulas.

Trasmisión: Ha sido considerado uno de los patógenos más devastadores en el cultivo, persiste en el suelo, cultivos infectados y malezas (Saxena et al, 1982). Puede sobrevivir dentro y fuera de la semilla (Pernezny et. al 2003) y es considerado un hongo trasmitido por semillas. Altas temperaturas favorecen la infección y propagación del hongo. Semillas y desechos de los cultivos son consideradas como fuentes primarias de infección por Colletotrichum spp (Manandhar & Hartman, 1999).

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Distribución geográfi ca: En regiones subtropicales y tropicales. Encontrado en Boaco y Matagalpa.

Método de identifi cación: Basados en análisis de secuencias ITS, y análisis morfológico aislados de este grupo de hongos fueron 100% idéntico a C. capsici.

Reporte: No existen reportes previos de este hongo infectando el cultivo del frijol en Nicaragua.

A B C

Fig. 16. Prueba de patogenicidad del aislado del hongo C. capsici. Síntomas: Lesiones pequeñas y decoloración de color marrón-café en el tallo y raíces causada después de 20 días de inoculación (A, B y C).

Diaporthe spp (Nitschke 1980), Anamorfo (Phomopsis) (Sutton, 1980) (Webster & Weber, 2007)

Taxonomía: Reino Fungi; Phylum Ascomycota; Clase Sordariomycetes; Orden Diapothales; Familia: Diaporthaceae. Género: Diaporthe/Phomopsis.

Descripción: Colonias de Diaporthe sp (Anmorfo Phomopsis) en PDA, crecen en forma fl ocosa, micelio denso y blanco a los 14 días. Picnidios formados de color negro en la parte superior del cultivo son observados (Figura 17A). Parte inferior del cultivo puro del hongo en medio PDA es de color bronceado marrón oscuro y con propagación de estromas o estomas de color negro pulvinado ((Figura 17B).

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Diaporthe sp (Anamorfo Phomopsis). Ascas y Arcosporas de Diaporthe sp son observados (Figura 18A) y conidias de Phomopsis sp también fueron observados (Figura 18B).

A B

Fig. 17. Crecimiento de Diaporthe sp (Anmorfo Phomopsis) en medio de cultivo PDA aislado de semillas de frijol. Colonias del hongo en PDA de forma flocosa, micelio denso y blanco a los 14 días. Picnidios formados de color negro en la parte superior del cultivo (A). Parte inferior del cultivo puro del hongo en medio PDA es de color bronceado marrón oscuro y con propagación de estromas o estomas de color negro pulvinado (B).

A B

Ascas y arcosporasConidias

Fig. 18. Ascas y Arcosporas de Diaporthe sp (A) y Conidia de Phomopsis sp (B).

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Huéspedes: Han sido reportados especialmente en el cultivo de la soya, uvas, girasol y cítricos (Agrios, 2005), causando grandes pérdidas en los rendimientos.

Sintomatología: Son considerados endófi tos y patógenos afectando un amplio rango de hospederos y responsables de muchas enfermedades, algunas de las cuales son de importancia económicas. El complejo de Diaporthe sp (Anamorfo Phomopsis sp),es un grupo importante de enfermedades de hongos trasmitidas por semillas y por rastrojos infectados de cultivos previos por ejemplo: la soya (Glycine max). Son considerados en este estudio como hongos patogénicos ya que causan úlceras en plántulas, suavidez del tallo y lesiones oscuras de color café/marrón o rojizo en los cotiledones, etc. (Figura 19). Causan tizón del tallo y vainas, pudrición en las semillas; presentan síntomas como moho y crecimiento de micelio del hongo de color blanco, semillas agrietadas, aspecto arrugado y de apariencia blanca. Especies de Diapothe/Phomopsis se encuentra en la soya causando tizón del tallo y vaina así como en otros cultivos de leguminosas (Webster & Weber 2007).

Ocasionan úlceras/chancros en las ramas y hojas y provocan disminución en la geminación y calidad de la semillas. Además, pueden ocasionar la muerte de las plántulas.

Las especies de Diaporthe spp, causan pudrición fi nal de las raíces y tallo.

A B C D

Fig. 19. Prueba de patogenicidad del aislado del hongo Diaporthe sp (Anamorfo Phomopsis). Síntomas: crecimiento del hongo en el cotiledón de color blanco y hundimiento del tallo (A). Úlceras/chancro en el cotiledón, tallo, hundimiento del tallo (B). Hundimiento/suavidez del tallo y raíces de color marrón-oscuras después de 20 días de inoculación (C y D).

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Trasmisión: Se considera que el complejo Diaporthe/Phomopsis se trasmite por semillas. Condiciones favorable que ayudan a enfermedades causadas por el complejo Diaporthe sp (Anamorfo Phomopsis), incluyen altas temperaturas y humedad relativa.

Distribución geográfi ca: Fue encontrado en lotes de semillas procedente de Boaco y Estelí.

Método de identifi cación: Basados en análisis de secuencias ITS, y análisis morfológico, aislado de este grupo de hongos fueron 99 % idéntico a Diaporthe (anamorfo Phomopsis).

Reporte: Diaporthe sp/Phomopsis sp de acuerdo a resultados de este estudio es un hongo patogénico en semillas de frijol. Su presencia como patógeno es informada por primera vez en Nicaragua (no se encontraron reportes ofi ciales previos). Hongos patogénicos.

Corynespora cassiicola (Berk. & M.A. Curtis) C.T. Wei, (1950)

Taxonomía: Reino Fungi, Phylum Ascomycota; Clase Dothideomycetes; Orden Pleosporales; Familia Corynesporascaceae; Género Corynespora.

Descripción: Colonias del hongo en PDA emiten un color de color grisáceo o café- marrón y aterciopelado y fi namente velloso (Figura 20A). En la parte inferior el cultivo del hongo muestra un color rojizo marrón en medio (Figura 20B). Presentan conidias y conidióforos de (Figura 21A) y las conidias se encuentran formando cadenas acropetal (Figura 21B).

A B

Fig. 20. Crecimiento de Corynespora cassiicola en medio de cultivo PDA aislado de semillas de frijol. Colonias del hongo en PDA emiten un color de color grisáceo o café- marrón y aterciopelado y finamente velloso. Parte superior del cultivo puro del hongo en medio de cultivo PDA (A). Parte inferior del cultivo puro del hongo de color rojizo marrón en medio PDA (B).

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A B

Conidias y conidiósforos Conidias formanto cadenas acropetal

Fig. 21. Conidias y conidióforos de C. cassiicola (A). Conidias formando cadenas acropetal (B).

Huéspedes: Patógeno de plantas que es capaz de causar enfermedades en una amplia gama de especies como: papaya (Carica papaya), Tomate (Lycorpesicum esculetum Mill), Soya (Glycine max L.), melón (Cucumis melo), pepino (Cucumis sativus) y Vigna sinensis. no afecta gramineas.

Sintomatología: Los nombres de las enfermedades causada por este patógeno son conocidas como: la mancha anillada, tizón foliar y mancha de la hoja; son consideradas enfermedades de importancia económica ya que provocan perdidas en los rendimientos de los cultivos de 150-200 kg/ha como en el caso del cultivo de la soya (Fundacruz 2006).

Causa daños en hojas, tallos, vainas y raíces y se trasmite por semillas (Fundacruz, 2006). Los síntomas son lesiones en las hojas de color rojizas marrones, hojas cloróticas, lesiones necróticas y manchas pequeñas de color marrón con halos. Los daños se producen sobre todo en la fase reproductiva.

Pruebas de patogenicidad dieron como resultado lesiones/úlceras de color café-marrón sobre plántulas de frijol después de 20 días de inoculación (Figura 22A , 22B y 22C).

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A B C

Fig. 22. Prueba de patogenicidad del aislado hongo identificado como Corynespora cassiicola. Síntomas: Lesiones/úlceras de color café-marrón sobre plántulas de frijol después de 20 días de inoculación (A, B y C).

Trasmisión: Sobrevive en suelos no cultivados por periodos largos de hasta dos años y sobrevive en el suelo con o sin rastrojos. La presencia de la enfermedad es favorecida por humedad relativa encima del 80% y temperaturas entre 15-20 º C. En época seca este hongo no es capaz de infectar y colonizar hojas y raíces (Brooks 2004). El ciclo de la enfermedad se completa en 7-10 días.

Los mecanismos de difusión lluvia y viento constituyen un gran problema para el control de este hongo. Los conidios pueden afectar las hojas y el tallo.

Distribución geográfi ca: Encontrado en Carazo.

Método de identifi cación: Basados en análisis de secuencias ITS, aislados de este grupo de hongos fueron 100 % idéntico a Corynespora cassiicola (Berk. & M.A. Curtis) C.T. Wei, (1950). Analisis morfologico y microsocopico indicaron que los aislados de este grupo de hongos efectivamente pertenecen a C. cassiicola.

Reporte: No existen reportes previos de este hongo infectando frijol común en Nicaragua. Hongo patogénico.

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Complejo de Fusarium spp (F. incarnatum (R.) Sacc, equiseti (Corda) Sacc. Sensu Gordon y Chlamydosporum (Wollenv)

Taxonomía: Reino Fungi: Phylum Ascomycota; Clase Sordariomycetes; Orden Hypocreales; Familia Nectriaceae (Agrios 2005).

Descripción: Las colonias del complejo Fusarium en medio de cultivo PDA son de color: blanco, rosado, amarillo, amarillo anaranjado y son de forma algodonosa (Figura 23A y Figura 23C). Durante análisis microscópico fueron observados clamidosporas (Figura 23B) y esporas (Figura 23D), las que son típicas características de Fusarium spp.

A B

DC

Clamidosporas

Esporas

Fig. 23. Crecimiento de hongo Fusarium spp en medio PDA. Grupo de hongos asociados a un complejo de especies (A-D) de Fusarium spp (F. incarnatum, equiseti y chlamydosporum). Las colonias en medio de cultivo PDA son de color blanco amarillo y de forma algodonosa (A y C). Aislado 78 (A) Clamidosporas de Fusarium spp (B). Aislado 64 (C) esporas de Fusarium spp (D).

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Huéspedes: Son hongos que se encuentran en el suelo y en asociación con plantas. La mayoría de las especies de Fusarium son saprofi tos y afectan un amplio rango de huéspedes como plantas, animales y humanos. Afecta un amplio rango de leguminosas como Vicia faba, Pisum sativum, Lens culinaris y Vigna unguiculata.

Sintomatología: Enfermedades en las plantas causadas por especies del género Fusariumson causa de grandes pérdidas económicas en la agricultura. Entre los síntomas más comunes en las plantas son: pudriciones de raíces, tallo, semillas, manchas en las hojas, tizón y marchitez (Agrios 2005). En Vigna unguiculata F. equiseti causa necrosis en la parte alta de la planta; la enfermedad progresa en el resto de la planta que incluye pudricion en el tallo y muerte de la planta con el tiempo (Rodrigues & Menezes 2005).

De acuerdo a pruebas de patogenicidad durante la investigación se considera que este complejo de especies de Fusarium son considerados hongos patogénicos ya que tienen la capacidad de infectar semillas y plantas. Dentro de los síntomas están: pudrición/lesiones en el tallo y raíces; además crecimiento del micelio del hongo en el cotiledón (Figura 24).

A B C D

Fig. 24. Pruebas de patogenicidad de aislados del grupo de hongos complejo Fusarium spp (F. incarnatum, equiseti y chlamydosporum). Síntomas: Pudrición/lesiones en el tallo y raíces. Crecimiento del micelio del hongo en el cotiledón (A y B).

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Trasmisión: Altas temperaturas, humedad relativa y rastrojos favorecen la dispersión del hongo en el campo y pueden ser trasmitidos por semillas.

Distribución geográfi ca: Este complejo de especies de Fusarium fue detectado en lotes de semillas procedentes de Boaco, Carazo, Estelí y Matagalpa.

Método de identifi cación: Basados en análisis de secuencias ITS, aislados de este grupo de hongos mostraron 99-100 % de identidad a un complejo de especies de Fusarium (F. chlamydosporum, equiseti e incarnatum). F. chlamydosporum (Wollenv), F. equiseti (Corda) Sacc. Sensu Gordon and F. incarnatum (R.) Sacc. Analisis morfologico indicaron por estructuras microscopicas que este grupo de hongos pertencen a Fusarium.

Reporte: No existen reportes previos de este complejo de Fusarium sp, afectando al frijol común en Nicaragua. Hongo patogénico.

Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid (Syn o anamorfo Rhizoctonia bataticola (Taub)

Taxonomía: Reino Fungi: Phylum Ascomycota; clase Dothideomycetes; subclase Incertae sedis; Orden Botryosphaeriales; Familia Botryosphaeriacea; Género Macrophomina.

Descripción: En medio de cultivo PDA, las colonias del hongo son de color negro y homogéneo porque los microesclerosios están formados por todas partes (Figura 25). Los picnidios son negros y globosos (Figura 26).

A B

Fig. 25. Crecimiento de Macrophomina phaseolina en medio de cultivo PDA aislado de semillas de frijol. Colonias del hongo en PDA son de color negro y homogéneo porque los microesclerosios están formados por todas partes. Los picnidios son negros y globosos. Parte superior del cultivo puro del hongo en medio de cultivo PDA (A). Parte inferior del cultivo puro del hongo de color negro (B).

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A B

Proliferación y agregación de hifas

Picnidio y esclerotio

Fig. 26. Proliferación y agregación de muchas hifas (A). Picnidio y esclerotio de M. phaseolina (B).

Huéspedes: Wyllie (1988), reportó que este hongo se encuentra infectando al menos 500 especies de plantas que incluyen: Phaseolus vulgaris L. (frijol), Brassica oleracea (repollo); Capsicum annuum (chiltoma); Cucumis spp. (pepino, melon); Glycine max (soya); Ipomea batatas (camote); Sesamum indicum (ajonjoli); Zea mays (maiz) y Sorghum bicolor (Sorgo).

Sintomatología: M. phaseolina infecta las semillas las cuales no germinan o producen plántulas débiles que mueren una vez que emergen, ataca plantas jóvenes y adultas produciendo lesiones negras y grises y además causan pudrición de raíces. Las plantas afectadas retardan su crecimiento y maduran prematuramente.

De acuerdo a resultados de las pruebas de patogenicidad fue considerado un hongo patogénico capaz de infectar semillas y plántulas (Figura 27). La enfermedad causada por este hongo es conocida como pudrición carbonosa o pudrición gris del tallo y raíces.

Es considerado como uno de los patógenos de mayor importancia económica por causar grandes pérdidas en los rendimientos en países tropicales (Jiménez et al, 1983).

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A B C

Fig. 27. Prueba de patogenicidad de aislado de M. phaseolina. Síntomas: Pudrición carbonosa sobre plántulas de frijol (A). Lesiones en el tallo de color café-marrón (quemadura) después de 20 días de inoculación (B y C).

Trasmisión: Es un hongo que persiste en el suelo como esclerocios que son producidos en tejidos de las plantas infectadas. Los esclerocios pueden vivir en el suelo por periodos largos hasta de 3 años (Dhingra et al. 1977) y puede trasmitirse por semilla, siendo el principal mecanismo de trasmisión (Abawi & Corrales, 1990).

La temperatura y altos contenidos de humedad en el suelo favorecen la propagación de la enfermedad.

Distribución geográfi ca: Encontrado en regiones de Boaco, Carazo y Matagalpa.

Método de identifi cación: Basados en análisis de secuencias ITS, aislados de este grupo de hongos fueron 99-100 % idéntico a Macrophomina phaseolina (Tassi) Goid., 1947 (anamorfo/sinonimo Rhizoctonia bataticola). Análisis morfologico y microscopico mostraron que este grupo de muestras de hongos pertenecen a M. phaseolina.

Reporte: En este estudio es encontrado como un hongo patogénico. Esta enfermedad se conoce como pudrición carbonosa. Reportado previamente por MAGFOR (2004) en el cultivo del frijol.

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HONGOS DE ALMACENAMIENTO

Penicillium citrinum (Link) y Aspergillus fl avus (Link)

Taxonomía: Reino Fungi; Phylum Ascomycota; Clase Eurotiomycetes; Orden Eurotiales; Famila Trichocomaceae; Género Penicillium y Aspergillus.

Descripción: La colonia del hongo Penicillum citrinum, es de color verde debido a la presencia de conidios (Figura 28A y 28B)). Mientras que el crecimiento de Aspergillus fl avus en PDA es de color amarillo-verde (Figura 28C). La observación microscópica de A. fl avus muestra conidióforo en el extremo con una vesícula globosa donde se desprenden conidias de color verde (Figura 28D).

A B

DC

Conidias

Conidiófero en el extremo con una vesícula globosa

Fig. 28. Crecimiento de Penicillium citrinum en medio de cultivo PDA. La colonia del hongo es de color verde debido a la presencia de conidios (A). Conidias de Penicillium citrinum (B). Crecimiento de Aspergillus flavus en PDA aislado de semillas de frijol Colonia de A. flavus crece en PDA de color amarillo-verde (C). Identificación morfológica. Conidióforo en el extremo con una vesícula globosa donde se desprenden conidias de color verde (D).

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Huéspedes: Frutas, verduras, cereales, granos, semillas y legumbres.

Sintomatología: Penicillium y Aspergillus son principalmente considerados como agentes de enfermedades de almacenamiento de productos vegetales y legumbres. Algunas de las enfermedades de almacenamiento de frutas, verduras, cereales y legumbres son el resultado de infecciones causadas por patógenos en el campo, que permanecen latentes hasta el almacenamiento. Las especies de Penicillium se encuentran comúnmente causando podredumbres y son considerados como uno de los hongos más destructivo en enfermedades de almacenamiento. Especies de Aspergillus que atacan granos en el campo generalmente invaden los embriones de las semillas y causan disminución en la germinación de la misma infectada para la siembra (Tseng et al. 1995). Es un género de hongo que se encuentra causando moho de granos y legumbres (Agrios 2005). En granos y legumbres la producción de sustancias tóxicas conocidas como micotoxinas es causada por algunos microorganismos, que incluyen hongos como Aspergillus fl avus y Penicillium spp. (Agrios 2005). Aspergillus fl avus tiene la capacidad de producir afl atoxinas que producen la sustancia cancerígena más potente de origen biológico. El daño se relaciona con aspectos agrícolas y médicos (Gravesen et al. 1994). Los patógenos son capaces de producir toxinas en las semillas almacenadas. Es importante proporcionar semillas sanas de legumbres y granos para reducir la producción de cualquier micotoxina.

Los resultados sugieren que el manejo de cultivos inapropiados en las prácticas de campo y almacenamiento debe ser responsable de la aparición bastante común de Penicillium yAspergillus que son patógenas en frijol.

Se hicieron pruebas de patogenicidad con aislados de hongos de P. citrinum y A. fl avus y aunque causaron ciertas síntomas en semillas sanas no fueron considerados patogénicos de importancia como los mencionados anteriormente (Figura 29).

Trasmisión: A nivel de campo y almacenamiento.

Distribución geográfi ca: Penicillium citrinum y Aspergillus fl avus se encontraron en lotes procedentes de Boaco, Carazo, Estelí, Matagalpa y Nueva Guinea.

Método de identifi cación: Basados en análisis de secuencias ITS, aislados de este grupo de hongos fueron 99-100% idénticos a Penicillium citrinum. Mientras que aislados del grupo de hongos Aspergillus fueron 100% idénticos a Aspergillus fl avus (Link). Los análisis morfologicos y microscópicos corresponden con los mismos resultados mediante el análisis de secuencias.

Reporte: Ya han sido reportados previamente en frijol común.

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A B C

Fig. 29. Prueba de patogenicidad de aislado de Penicillium citrinum. Síntomas: Suavidez y lesiones sobre el tallo (A, B y C) después de 20 días de inoculación (B y C).

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Aspergillus niger (Link)

Taxonomía: Reino Fungi; Phylum Ascomycota; Clase Eurotiomycetes; Orden Eurotiales; Famila Trichocomaceae; Género y Aspergillus.

Descripción: Aspergillus niger se presenta en forma de colonias aterciopeladas de color negro (Figura 30) en medio PDA. Las cabezas conidiales son de tonos negros. Es un hongo que elabora esporas negra produciendo moho negro.

A

Fig. 30. Aspergillus niger en medio de cultivo PDA aislado de semillas de frijol. Colonia aterciopelada de color negro.

Huéspedes: Maíz, cacahuates, cereales, semillas y granos.

Trasmisión: Patógeno de postcosecha.

Distribución geográfi ca: Carazo, Chinandega, Jinotega y Nueva Guinea.

Método de identifi cación: Método convencional (medio de cultivo).

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Cuadro 1. Hongos identificados e infectando el frijol común en Nicaragua (Periodo y cosecha de primera 2008)

Hongos trasmitidos por semillas

Nombre común de la enfermedad

Método de identi� cación

Variedades analizadas

Lotes de procedencia Observaciones

Lasiodiplodia theobromae (Teleomorfo: B. rhodina)

Muerte regresiva y gangrenosa

Morfológico y molecular

INTA RojoBoaco y Carazo (segundo lote)

Primera vez reportado en Nicaragua.Hongo patogénico(Marcenaro, 2009)

Macrophomina phaseolina (Rhizoctonia bataticola)

Pudrición carbonosa


INTA Rojo

Boaco, Carazo (segundo lote), Matagalpa (primer lote)

Reportado por (MAGFOR, 2004).Hongo patogénico por (Marcenaro, 2009)

Complejo de Fusarium(equiseti, incarnatum y Chlamydosporum)

Pudrición de raíz y tallo y pudrición seca o marchitez


INTA Rojo

Boaco, Carazo (segundo lote), Estelí (ambos lotes) y Matagalpa(primer lote)

Primera vez reportado en Nicaragua.Hongos patogénicos(Marcenaro, 2009)

Colletotrichum capsici AntracnosisMorfológico y molecular

INTA RojoBoaco y Matagalpa (primer lote)


Colletotrichum gloesporiodes (Teleomorfo Glomerella cingulata)

AntracnosisMorfológico y molecular

INTA Rojo Boaco


Corynespora cassiicola

Mancha anillada, tizón foliar y mancha de la hoja


INTA Rojo Carazo (primer lote)

Primera vez reportado en Nicaragua. Hongo patogénico(Marcenaro, 2009)

Diaporthe/Phomopsis spp

Tizón del tallo y de la vaina y Podredumbre de la semilla


INTA RojoBoaco y Estelí (segundo lote)

Primera vez reportado en Nicaragua. Hongo patogénico(Marcenaro, 2009)

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Cuadro 1a. Hongos de almacenamiento identificados e infectando el frijol común en Nicaragua (Periodo y cosecha de primera 2008)

Hongos trasmitidos por

semillas

Nombre común de la enfermedad

Método de identi� cación

Variedades analizadas

Lotes de

procedenciaObservaciones

Penicillum citrinum

Podredumbre de postcosecha

Moho azul de las raíces y frutos


INTA Rojo

Boaco, Carazo (ambos lotes)Estelí (ambos lotes) y Matagalpa (primer lote)

Hongo patogénico (menos agresivo que los descritos en el cuadro 1. (Marcenaro, 2009)

Aspergillus � avus

Podredumbre de postcosecha y moho de granos y leguminosas

Pudrición de semillas


INTA RojoEstelí (segundo lote y Matagalpa (primer lote)

Hongo patogénico (menos agresivo que los descritos en el cuadro 1.(Marcenaro, 2009)

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VIII. RECOMENDACIONES• Uso de semillas libres de patógenos con alta calidad genética.

• Destacar la importancia que tienen las semillas y granos durante su transporte y almacenamiento (temperaturas e infraestructuras óptimas de almacenamiento) ya que algunas especies de hongos por su producción de micotoxinas causan problemas de salud humana y animal.

• El uso o la búsqueda de variedades tolerantes a hongos patogénicos mencionados previamente en esta investigación podría ser un importante componente en el control de enfermedades y del incremento de la producción.

• Curado o tratamiento de las semillas con fungicidas podrían ayudar a reducir la presencia de patógenos (protege las semillas durante la etapa de germinación y emergencia en el campo).

• Uso de tratamientos biológicos como Trichoderma spp.

• Buenas prácticas culturales o manejo agronómico antes, durante y después de la siembra como preparación del terreno, rotación de cultivos, barreras vivas, remover plantas enfermas y rastrojos.

• Se requiere de mayor investigación en patología de semillas relacionada con el uso de pruebas estandarizadas para la detección e identifi cación de patógenos asociados a las semillas.

• Son necesarios mas estudios sobre la epidemiologia de las enfermedades trasmitidas por semillas incluyendo los potenciales patógenos que fueron reportados en este estudio.

• El uso de marcadores moleculares específi cos pueden ser usados en reacciones de cadenas de polimerasas (PCR) para ser utilizados en inspecciones de semillas y en estudios de epidemiología, ecología y control de patógenos de hongos en el cultivo del frijol en el campo.

• Análisis sanitarios que incluyen métodos convencionales y técnicas moleculares son necesarios implementarlos de manera rutinaria para la identifi cación y diagnósticos de enfermedades y patógenos presente en semillas y plantas en diferentes regiones del país.

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IX. CONCLUSIONES El crecimiento y desarrollo de la agricultura exige continuamente que los productores produzcan semillas de óptima calidad genética y patológica. Las pruebas de sanidad en semillas, es un componente de relevancia para el manejo de enfermedades y para la certifi cación fi tosanitaria de lotes de semillas.

Una gran cantidad de hongos están presentes en las semillas de frijol, pero solamente algunos de ellos son económicamente importantes porque reducen claramente la germinación, afectando el rendimiento del cultivo. En este documento, resultado de diferentes análisis para la detección e identifi cación de hongos trasmitidos por semillas en frijol común, fue realizado mediante el uso de pruebas de incubación, pruebas de germinación usando sustrato estéril, pruebas de patogenicidad y pruebas PCR para dar a conocer que hongos están presente en las muestras y determinar e identifi car la presencia de cada patógeno (incidencia).

Un amplio rango de aislados de hongos aislados de semillas de frijol se detectó y se identifi caron en diferentes lotes de semillas procedentes de regiones de Nicaragua como Boaco, Carazo, Estelí, Chinandega, Jinotega, Matagalpa, Nueva Guinea y El Rama. Se analizaron un total de 37 lotes de semillas de frijol durante el periodo comprendido del 2008 al 2011.

Once grupos de hongos fueron detectados e identifi cados y de los cuales seis de ellos fueron reportados en este estudio como primera vez afectando e infectando el cultivo del frijol y que de acuerdo a pruebas de patogenicidad son considerados patogénicos y que algunos aislados de hongos mostraron variación en virulencia (grado de severidad en los daños).

En la primera colecta de semillas 2008 ocho grupos de hongos fueron identifi cados. M. phaseolina fue detectado en Boaco, Carazo y Matagalpa. Reportado por el MAGFOR (2004) encontrado a través de pruebas de patogenicidad como un hongo patogénico. Ocasiona pudrición de aspecto carbonosa tanto en planta como en semillas. L. theobromae fue encontrado en Boaco y Carazo, reportado como hongo patogénico y como primera vez infectando el cultivo del frijol en Nicaragua. Este patógeno causa muerte regresiva y gangregonisidad de plantas. Complejo de Fusarium spp (equiseti, incarnatum y clamyosporum) fue descubierto en lotes procedentes de Boaco, Carazo, Estelí y Matagalpa. No existen reportes previos de estas especies presente en frijol en Nicaragua, por lo que igualmente pueden ser reportados como primera vez, es importante recalcar que son considerados hongos patogénicos. Estas especies de Fusarium presentes en las semillas de frijol reducen la germinación, afectan la elongación del hipocótilo, produciendo plantas anormales y que una vez en campo estas no crecen con vigor. Además provocan pudriciones de raíces, tallos y semillas al igual que marchitez.

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C. gloesporiodes fue encontrado en un lote procedente de Boaco. Catalogado de acuerdo a este estudio como primer reporte en frijol y como patógeno ya que es capaz de infectar y causar daños en plantas sanas (pruebas de patogenicidad); C. capsici fue encontrado en lotes procedente de Boaco y Matagalpa y aunque es un patógeno de importancia económica en cultivos de chiles y chiltomas aun no ha sido reportado en Nicaragua causando antracnosis en frijol; Diaporthe/phomopsis spp detectado en lotes de Boaco y Estelí. Causan tizón del tallo, de la vaina y podredumbre de la semilla. En este estudio son reportados por primera vez en Nicaragua presente en el cultivo del frijol. Son considerados hongos patogénicos.

Igualmente hongos de almacenamiento como Penicillium citrinum fueron detectados de lotes de semilla procedente de Boaco, Carazo, Estelí y Matagalpa.

Aspergillus fl avus fue encontrado en lotes de semillas de Estelí y Matagalpa. Ambos hongos se les conoce como podredumbre de postcosecha de granos, leguminosas, frutos y vegetales. Son capaces de deteriorar las semillas y reducir la capacidad de germinación. Producen micotoxinas que son dañinas para la salud humana y animal.

La colecta y análisis de semillas del 2010 muestran los mismos hongos encontrados e identifi cados previamente por Marcenaro (2009) a excepción de Aspergillus niger (Cuadro 6). Los análisis de lotes de semillas del 2011 mostraron poca incidencia de hongos en comparación con los del 2008 y 2010 ya que solo fueron detectados M. phaseolina, Fusarium spp, Penicillium sp, Aspergillus fl avus y A. niger.

Sintomatología en pruebas de patogenicidad y germinación usando sustrato estéril variaron en grados de severidad. Incluyen lesiones necróticas, pudriciones, manchas y muerte de plántulas y semillas. Estos resultados muestran la prevalencia de estos hongos en el tiempo capaz de causar infección y enfermedad. Esto fue soportado mediante pruebas de patogenicidad ya que cuando se inocularon semillas germinadas con estos aislados fueron capaces de causar infección y síntomas en las plántulas no así en el control sin inocular. Esto fue comprobado además aplicando los postulados de Koch y en las pruebas de germinación usando sustrato estéril pues cuando las semillas no germinaron y presentaban pudrición y crecimiento de hongos al igual que las plántulas, muestras de semillas no germinadas y tejido de plantas enfermas fueron tomadas, esterilizadas y analizadas encontrándose que mucho de los patógenos fueron los mismos descritos tanto morfológica y molecularmente por Marcenaro (2009).

Se puede concluir que los hongos detectados e identifi cados incluyendo los de almacenamiento en los 37 lotes de semillas disminuyen el crecimiento de las plántulas y la emergencia o germinación de las semillas, causando problemas en la calidad de las mismas así como en su producción.

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Al analizar los resultados en este estudio, se considera que más investigaciones necesitan a ser llevadas a cabo para entender la ocurrencia, presencia e infección de hongos trasmitidos por semillas así como el rol que ellos tienen en la epidemiologia y evolución de enfermedades trasmitidas por semillas.

La identifi cación y el diagnóstico de enfermedades y sus agentes causales (patógenos) en plantas, representan uno de los mecanismos de mayor importancia para los análisis de sanidad en lotes de semillas. El uso de herramientas biotecnológicas juega un papel importante para lograr una óptima producción de semillas y reducir de esta manera los riesgos de introducir nuevas razas de patógenos a lotes de producción de semilla. Finalmente, mencionar que este estudio provee información elemental acerca de cómo nuevos hongos de semillas podrían estar afectando e infectando el cultivo del frijol en Nicaragua.

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