1.2.1 Guía de Laboratorio N° 2: Infecciones de la Piel

1. Introducción

La piel, como superficie externa en contacto con el ambiente, está expuesta a la acción de múltiples microorganismos. Por ello, las infecciones cutáneas son muy frecuentes en patología infecciosa humana (figura 1).

Figura 1. Estratos del tejido epitelial

Las infecciones de piel y tejidos blandos (IPTB) son frecuentes y su gravedad es variable. En el diagnóstico lo más importante es determinar la profundidad de la lesión (estructuras involucradas, existencia o no de necrosis, grado de afectación sistémica).

Resistencia natural de la piel

La piel normal de las personas sanas es altamente resistente a la invasión de una amplia variedad de bacterias a las cuales se encuentra expuesta en forma continua. Las bacterias son incapaces de penetrar las capas queratinizadas de la piel normal y, cuando son aplicadas en la superficie cutánea muestran rápidamente una disminución cuantitativa. La resistencia natural de la piel está dada por los siguientes factores:

Estrato córneo intacto

Resultado de la cohesión armónica de los corneocitos y la dureza de la queratina, sin embargo, pueden ser puntos débiles los orificios de los folículos pilosos y de las glándulas sudoríparas, los cuales pueden ser flanqueados, en especial si la piel está húmeda y macerada. La existencia de una solución de continuidad o la presencia de cuerpos extraños sobreañadidos aumenta considerablemente la posibilidad de infección.

Exfoliación cutánea continúa

La capa córnea está en continua renovación, produciéndose la eliminación de las células que puedan estar contaminadas.

pH de la superficie cutánea

La epidermis tiene un pH de 5.6, la acidez de la superficie cutánea impide que muchas bacterias colonicen la piel. Si se lava mucho la piel o se inflama, se alcaliniza y facilita el desarrollo de bacterias, virus u hongos. Recientes estudios parecen demostrar la completa ineficacia del manto ácido.

Grado de humedad

La relativa sequedad de la superficie cutánea normal contribuye a limitar de modo marcado el crecimiento de bacterias, en especial de bacilos gramnegativos que requieren alto grado de humedad.

Manto lipídico

Los lípidos de la superficie cutánea, sobre todo los ácidos grasos libres, tienen potente efecto antimicrobiano contra estafilococos y estreptococos, y cierto efecto estimulante sobre el Propionibacterium, el cual produce ácido propiónico que también tiene efecto antimicrobiano sobre muchos organismos. El ácido linoleico y linolénico (ácidos grasos libres) son más inhibitorios para S. aureus que para el estafilococo coagulasa negativa, habitantes normales de la microbiota bacteriana. La reducción de los lípidos de la superficie cutánea por tratamiento con solventes tópicos ha prolongado el tiempo de supervivencia del S. aureus sobre la piel. Recientes estudios sugieren la evidencia que las ceramidas, uno de los principales componente del estrato córneo puede tener propiedades inmunomoduladoras. Se ha observado alteraciones en la función de la ceramida cutánea con incremento de

infecciones cutáneas bacterianas en la dermatitis atópica.

Secreciones glandulares y sebáceas con sustancias bactericidas

La presencia de sustancias antibacterianas naturales en las secreciones sebáceas puede ser un factor en la eliminación de bacterias de la superficie de la piel. Las enzimas celulares eliminadas por el sebo y el sudor también tienen propiedades antibacterianas.

Interferencia bacteriana

Es el efecto supresor de una cepa o una especie bacteriana sobre la colonización por otras. La complejidad de la flora cutánea normal ejerce una gran influencia sobre la colonización de bacterias patógenas en la piel.

En los últimos años, han aparecido en la comunidad infecciones cutáneas por gérmenes multirresistentes, principalmente Staphylococcus aureus meticilin resistente, Streptococcus pyogenes resistente a eritromicina y Enterobacterias productoras de BLEE. Ante la presencia de progresión de la infección a pesar del tratamiento antibiótico inicial o en casos de infecciones cutáneas inicialmente con criterios de gravedad, los pacientes necesitan ser evaluados clínicamente para completar el diagnostico etiológico, valorar las complicaciones y realizar un tratamiento antibiótico dirigido según antibiograma y tratamiento quirúrgico si procede.

Las infecciones de piel y tejidos blandos pueden ser primarias o secundarias. Las primarias, presentan un cuadro clínico y evolución características, son causadas por un solo agente y generalmente afectan a piel previamente sana. Los tipos más comunes son el impétigo, la foliculitis y los furúnculos.

En cambio, las infecciones secundarias ocurren sobre piel dañada y su etiología puede ser tanto monomicrobiana como polimicrobiana, tal como ocurre en algunas infecciones gangrenosas causadas por anaerobios. En casos de infección secundaria, la extensión y curso clínico son variables debido a la presencia de enfermedades de base o de traumatismos subyacentes

Impétigo: Infección primaria superficial de la piel, constituida por pequeñas vesículas, rodeadas de halo inflamatorio, que evolucionan a pústulas y posteriormente se rompen dando lugar a lesiones costrosas muy pruriginosas (figura 2). Afecta generalmente a niños de 2-5 años, en áreas expuestas (cara y miembros) y en relación con falta de higiene. No suele existir afectación sistémica. Suele estar causado por Staphylococcus aureus o Streptococcus pyogenes

Figura 2. Lesiones clásicas del Impétigo

Erisipela: Infección de la dermis superior, con afectación de los vasos linfáticos superficiales, que se manifiesta por una placa sobreelevada, color rojo brillante, bien demarcada de la piel sana circundante y muy dolorosa (figura 3). Suele ser de aparición brusca, con dolor y fiebre, predominio en niños, o en pacientes con diabetes mellitus en la cara o extremidades. Pueden aparecer ampollas flácidas a los pocos días. A los 5 o 10 días pueden descamarse. Suele estar

causado por Estreptococos del grupo A, ocasionalmente otros (B,C,G) y excepcionalmente S. aureus.

Figura 3. Lesiones clásicas de la Erisipela

Celulitis simple: Es una infección de la dermis que afecta a tejido subcutáneo, a menudo a raíz de pequeños traumatismos o lesiones previas de la piel de extensión rápida. Se manifiesta como una lesión extensa eritematosa caliente y dolorosa con aspecto edematoso y de bordes mal definidos, que puede acompañarse de fiebre, adenopatías regionales y malestar general. Las celulitis asociadas a forúnculos, abscesos o venopunción son generalmente causados por S. aureus., mientras que las formas difusas o no asociadas a una puerta de entrada definida generalmente son por Streptococos sp. Otras bacterias causan Celulitis según sea la condición de contacto o del hospedero:

• Mordeduras: Pasteurella multocida (animales) y Eikenella corrodens (humanas) (figura 4).

• Heridas en contacto con agua dulce: Aeromonas hydrophila

• Heridas en contacto con agua marina o alimentos marinos: Vibrios, Mycobacterium marinum

• Inmunodeprimidos: Enterobacterias, Pseudomonas spp.

• Planta del pie con lesión por clavo: Pseudomonas aureuginosa

• Agricultura o trabajo con carnes y pescados: Erisipelothrix rusiophatiae

Figura 4. Lesiones clásicas de celulitis por mordedura

Abscesos cutáneos: Colecciones de pus entre la dermis y los tejidos profundos. Generalmente nódulos eritematosos fluctuantes, dolorosos, que pueden tener una pústula y rodeados por un ribete eritematoso (figura 5). Es de tipo polimicrobiana, con microbiota de la piel y organismos procedentes de mucosas adyacentes. Causa más frecuente S. aureus. Son frecuentes también Streptococcus sp (anginosus, etc), anaerobios de la boca.

Figura 5. Lesiones clásicas de abscesos cutáneos

Antibioticoterapia en infecciones de la piel: La decisión de usar antibióticos depende de los hallazgos clínicos

2. Competencias

2.1 Competencia general

Conocer los procedimientos y fundamento del cultivo de lesiones de herida y piel y las pruebas bioquímicas para la identificación de las bacterias.

2.2 Competencias específicas

Diferenciar los microorganismos patógenos de los componentes de la microbiota normal de piel.

Identificar mediante pruebas bioquímicas los posibles microorganismo implicados

Aplicar los conocimientos en los laboratorios anteriores para la identificación del tratamiento a seguir con el antibiótico (antibiogramas)

3. Lista de Equipos

Microscopio Óptico

Incubadora a 37°C

Micropipetas

3.1. Lista de materiales y reactivos

Provistos por el Alumno:

EPP necesarios para mantener la Bioseguridad en la práctica

Papel Absorbente

Asas redondas y rectas

Material necesario para realizar todas las anotaciones de los resultados

Coloración de Gram

Laminas portaobjetos

Colorantes Gram

Cultivo

Agar Sangre

Agar Chocolate

Agar MacConkey

Prueba de la Catalasa

Lámina portaobjetos

Peróxido de hidrógeno

Coagulasa

Lámina portaobjetos

Plasma citratado

Palillos

Susceptibilidad a la novobiocina

Agar Sangre

Asa redonda

Sensidisco de Novobiocina

Sensibilidad a la bacitracina

Agar Sangre

Asa redonda

Sensidisco de Bacitracina

Prueba de CAMP

Agar Sangre

Cepa de Staphylococcus aureus

Bilis esculina

Agar bilis esculina

Asa redonda

Prueba de tolerancia a NaCl 6,5%

Caldos de NaCl 6.5%

Sensibilidad a la optoquina

Agar Sangre

Asa redonda

Sensidisco de optoquina

4. Procedimiento

1. Toma de la Muestra

Dependiendo del sitio afectado y del tipo de lesión. Se prefieran los productos purulentos recogidos por aspiración directa con jeringa o tejidos sospechosos, a las muestras tomadas con hisopos o torundas con algodón.

Para las lesiones abiertas, se debe remover la flora y detritus superficiales antes de recolectar la muestra de los márgenes de avance de la lesión.

· En caso de lesiones secas o costrosas los cultivos no están recomendados salvo que presenten exudado.

· En el caso de abscesos cerrados la recolección se realizará con aguja y jeringa de la pared del mismo, previa antisepsia de piel.

· En el caso de abscesos abiertos se debe descontaminar primero como en el caso de heridas abiertas.

· Las quemaduras se cultivan luego de una extensa limpieza y debridamiento. Se recomiendan cultivos de biopsia ya que los cultivos superficiales pueden ser poco representativos de lo que sucede en la profundidad del tejido.

2. Gram:

a. Preparar el frotis , secar y fijar

b. Coloración

Paso 1. Tinción con cristal violeta 1 minuto.

Paso 2. Lavar con agua.

Paso 3. Fijación con Lugol 1 minuto. Estabiliza el cristal violeta.

Paso 4. Lavar con agua.

Paso 5. Decoloración con alcohol acetona 15 segundos.

Paso 6. Lavar con agua.

Paso 7. Tinción de contraste con safranina 30 segundos.

Paso 8. Lavar con agua.

Resultado: Observación al microscopio en objetivo 100x con aceite de inmersión

3. Cultivo: Con el aplicador o hisopo sembrar el inóculo en Agar Sangre, agar chocolate y agar MacConkey, realizar estrías por agotamiento e incubar a 37°C durante 18 a 24 horas.

4. Identificación: Según lo observado en la coloración de Gram y el crecimiento obtenido realizar las pruebas bioquímicas para la identificación del Género y Especie del microorganismo.

a. Prueba de la Catalasa : El objetivo es buscar la presencia de la enzima catalasa. El peróxido de hidrógeno se produce al utilizar la bacteria el azúcar por vía oxidativa. Al ser éste un compuesto muy oxidante las bacterias la eliminan mediante la producción de la enzima catalasa (H2O2 -> H2O + ½ O2).

Procedimiento: En una placa portaobjetos agregar una gota de peróxido de hidrógeno al 3% a continuación tomar una muestra de la cepa del microorganismo a estudiar con un palillo y mezclar con H2O2, la muestra solamente debe acercarse a la muestra de la solución líquida de peróxido de hidrogeno, observar la reacción: la prueba se considera como positiva si observamos burbujas de oxígeno.

b. Coagulasa: La coagulasa es una enzima proteica con actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el fibrinógeno en fibrina, provocando la formación de un coágulo visible en un sistema analítico adecuado. Se cree que la coagulasa funciona in vivo, produciendo una barrera en el sitio de infección estafilocóccica. En el laboratorio, la prueba de coagulasa se utiliza más comúnmente para diferenciar al Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) de otros Staphylococcus. La coagulasa se halla presente en dos formas, “libre” y “fija”, cada una de las cuales posee diferentes propiedades que requieren el uso de técnicas de determinación diferentes.

• Coagulasa fija (prueba en portaobjetos) : la coagulasa fija está unida a la pared celular bacteriana. Los hilos de fibrina formados entre las células suspendidas en plasma (que contiene fibrinógeno) provocan su aglutinación, indicada por la presencia de agregados visibles en el portaobjetos. Colocar una gota de agua destilada sobre un portaobjetos, emulsionar suavemente el organismo en estudio en la gota de agua de manera de obtener una suspensión cargada homogénea. Agregar una gota de plasma reconstituido junto a la gota de la suspensión del m.o. Mezclar bien con el ansa. Inclinar el portaobjetos hacia uno y otro lado, observando la formación inmediata de un precipitado granular o de grumos blancos.

• Coagulasa libre (prueba en tubo) : la coagulasa libre es una enzima extracelular que se halla presente en los filtrados de cultivos. Cuando una suspensión de bacterias productoras de coagulasa se mezcla en partes iguales con plasma en un tubo de ensayo, se forma un coágulo visible como consecuencia de la utilización de los factores de coagulación del plasma de manera similar a cuando se añade trombina. Colocar asépticamente 0,5 ml de plasma reconstituido en el fondo de un tubo estéril. Añadir 0,5 ml de cultivo de 24 horas (o suspensión en suero fisiológico de un cultivo en placa). Mezclar por rotación el tubo, evitando remover o agitar el contenido. Colocar en baño de agua a 37°C y observar cada hora hasta 4 horas y luego a las 24 horas, la formación de un coágulo visible.

c. Susceptibilidad a la novobiocina: Separar S.saprophyticus (resistente a la novobiocina) de los demás estafilococos coagulasa negativos. Varias especies del género Staphylococcus son resistentes a la novobiocina (disco de 5 μg).

Procedimiento: Se siembra una placa de agar sangre de la cepa a estudiar con asa redonda Luego se aplica el disco de novobiocina y se incuba a 35º por 18 horas.

Interpretación de resultados: Un halo de inhibición de crecimiento menor o igual a 16mm corresponde a S.saprophyticus. Un halo de inhibición mayor de 16mm corresponde a otros estafilococos coagulasa negativos.

d. Sensibilidad a la bacitracina: Separar el Streptococcus pyogenes de los demás estreptococos beta hemolíticos. Streptococcus pyogenes es sensible a bajas concentraciones de Bacitracina (discos conteniendo 0,04U). También existe un 5% de cepas de S. agalactiae que son sensibles a la Bacitracina.

Procedimiento: Se realiza sembrando un inóculo, tomado con asa bacteriológica de un cultivo puro, que se estría sobre una placa de agar sangre en varias direcciones intentando obtener un cultivo confluente. Luego se coloca el disco de Bacitracina y se incuba 18-24 horas a 37ºC.

Interpretación de resultados : La aparición de cualquier diámetro de halo de inhibición de crecimiento alrededor del disco se considera prueba positiva.

e. Prueba de CAMP: Separar S. agalactiae de los demás Estreptococos ß-hemolíticos. Se basa en que los estreptococos del grupo B producen un factor llamado CAMP (factor de monofosfato de adenina cíclica) que aumenta la zona de hemólisis producida por un estafilococo productor de ß lisina.

Procedimiento: Se realiza estriando un cultivo de estreptococo ß-hemolítico en forma perpendicular a una estría de un estafilococo productor de ß-lisina en agar sangre. Se incuba 18-24 horas a 37ºC.

Interpretación de los resultados: La prueba positiva se evidencia por la presencia de una zona de potenciación de la hemólisis en forma de puntas de flecha en el lugar donde se contactan las dos estrías.

f. Bilis esculina: Separar los estreptococos del grupo D de los demás grupos de estreptococos. Se basa en la capacidad de los estreptococos del grupo D de crecer en un medio de cultivo que contiene un 40% de bilis y de hidrolizar la esculina a esculetina, la cual se combina con el citrato ferroso que posee el medio, dando un complejo de color negro. La concentración de bilis es fundamental, ya que existen estreptococos del grupo Viridans que son capaces de crecer a concentraciones menores de bilis.

Procedimiento : Se realiza sembrando en superficie tubos de agar bilis esculina inclinado o en caja de agar. Se incuba a 37°C durante 24 horas. Una reacción positiva se evidencia como ennegrecimiento del medio.

g. Prueba de tolerancia a NaCl 6,5% (caldo salado): Separar los enterococos, capaces de crecer en caldo salado, de los demás estreptococos del grupo D. Se basa en la capacidad de los enterococos de crecer en una concentración de 6,5% de NaCl.

Procedimiento: Se inocula el caldo salado con la cepa de Estreptococos Grupo D a estudiar y se incuba 18-24 horas a 37ºC. La no aparición de turbidez indica una prueba negativa.

h. Sensibilidad a la optoquina: Diferenciar S.pneumoniae de otros estreptococos α-hemolíticos. Se basa en la sensibilidad de S.pneumoniae a una concentración menor o igual a 5μg/ml de hidroxicuprina (optoquina).

Procedimiento : Estriar un cuadrante de una placa de agar sangre en varias direcciones. Colocar luego un disco de optoquina en el centro del área estriada. Incubar 18-24 horas a 37ºC. Halos de inhibición mayores de 15mm son característicos de S.pneumoniae.

5. Antibiograma

Técnica de difusión

Fundamento: Se basa en la difusión de los antibióticos a partir de un disco de papel impregnado con una cantidad determinada de antibiótico. Esta técnica, basada en el método de Kirby-Bauer, es un método suficiente para la determinación de la sensibilidad de las bacterias de crecimiento rápido. Los discos con el antibiótico son colocados sobre una placa de agar Mueller-Hinton, previamente sembrada con un inóculo estándar del microorganismo a estudiar. Las placas, después de ser incubadas por 18 horas, presentan zonas de inhibición bacteriana alrededor de cada disco que contiene un antibiótico activo frente al microorganismo. El diámetro de la zona en inhibición determina si existe sensibilidad o resistencia.

Técnica :

Para empezar a realizar este procedimiento recuerde las normas de bioseguridad y los EPP. Debe iniciar preparando un inóculo de la cepa problema.

Preparación del inóculo

a. De una placa de cultivo con agar no selectivo e incubada por 18 - 24 h, seleccionar colonias aisladas y preparar una suspensión directa en solución salina o caldo.

b. La suspensión debe ser inmediatamente ajustada a la escala 0,5 de Mc. Farland.

Inoculación de las Placas

a. Dentro de los 15 minutos siguientes al ajuste de la turbidez del inóculo, sumergir un hisopo estéril en la suspensión, rotar el hisopo varias veces presionando firmemente sobre la pared interior del tubo por encima del nivel del líquido para remover el exceso de inóculo.

b. Inocular la superficie seca del agar Mueller Hinton, estriando con el hisopo en tres direcciones para asegurar una distribución uniforme del inóculo (Figura 1). Antes de colocar los discos dejar secar la placa a temperatura ambiente durante 3 a 5 minutos para que cualquier exceso de humedad superficial sea absorbido.

Aplicación de los discos

c. Colocar los discos individuales o multidiscos sobre la superficie del agar con la ayuda de una pinza estéril o la punta de una aguja presionando suavemente sobre cada disco para asegurar un contacto completo con la superficie del agar.

d. Distribuir los discos uniformemente, de modo que estén a una distancia mínima de 25 mm uno del otro (el diámetro de los discos según las normas de la Organización Mundial de la Salud (OMS) debe ser de 6 mm) (figura 2). No deben colocarse más de 12 discos en una placa de 150 mm, ni más de 6 en una placa de 100 mm de diámetro interno, para evitar la superposición de las zonas de inhibición. Un disco no debe ser removido una vez que tomó contacto con la superficie del agar debido a que algunos antibióticos se difunden rápidamente.

Incubación

e. Incubar las placas en posición invertida a 35°C – 37°C, dentro de los 15 minutos posteriores a la aplicación de los discos.

Lectura de las placas e interpretación de los resultados

f. Después de 18 a 24 horas de incubación examinar cada placa y medir los diámetros de los halos de inhibición alrededor de cada disco con ayuda de una regla milimétrica (figura 3). En los casos de Staphylococcus spp y Enterococcus spp el tiempo de incubación debe prolongarse por 24 horas para una mejor detección de la resistencia a Oxacilina y Vancomicina, respectivamente.

g. Cuando se realice la medición se debe mantener iluminada la parte posterior de la placa petri con una luz reflejada localizada a unos cuantos centímetros sobre un fondo negro. Tener la precaución de observar la placa siguiendo una vertical directa para evitar una lectura errónea de las marcas de la regla por efecto de paralelismo. En los medios suplementados con sangre, las zonas son medidas en la parte superior de la superficie del agar y retirando la tapa. Tener cuidado de no medir la zona de la hemólisis sino la de inhibición del crecimiento.

h. Para Staphylococcus spp o Enterococcus spp, usar luz transmitida ,manteniendo la placa arriba de la luz para examinar un posible ligero crecimiento de cepas resistentes a Oxacilina/Meticilina o Vancomicina dentro de los halos aparentes de inhibición. Cualquier desarrollo dentro de la zona de inhibición es indicativo de resistencia a Meticilina (Oxacilina) o Vancomicina.

i. El punto final debe tomarse como el área que no muestra un crecimiento obvio, visible, que puede ser detectado mediante observación visual, no incluyendo velo de crecimiento o colonias muy pequeñas que puedan ser detectadas solo con mucha dificultad en el borde de la zona. Sin embargo las colonias mayores creciendo dentro de la zona clara deberán ser subcultivadas, reidentificadas y reensayadas.

Resultados y discusión

j. Los diámetros de inhibición son interpretados basándose en las Tablas N° 1 al 9 del Manual de Procedimientos para la Prueba de Sensibilidad Antimicrobiana por el Método de Disco Difusión (8). La sensibilidad de la cepa bacteriana será reportada como sensible (S), intermedio (I), o resistente (R).

6. Conclusiones

7. Evaluación/Autoevaluación

- Cuáles son las pruebas complementarias para la identificación por Ags de Estreptococos según la clasificación de Lancefield?

- Esquematiza la metodología utilizada durante la práctica.

- Califica la práctica y metodología utilizada.

- Califica tu trabajo realizado desde el punto de vista individual y grupal.

8. Observaciones

9. Bibliografía- Webibliografía

DEPARTAMENTO DE LABORATORIO CLÍNICO. HOSPITAL DE CLÍNICAS. Manual de toma de muestras para estudio bacteriológico, parasitológico y micológico. 2004. Documento en: http://www.bvsops.org.uy/pdf/laboratorio.pdf

NORIEGA L. ¿En qué ayuda el antibiograma al médico clínico en la atención de sus pacientes?. Rev Chil Infect (2004); 21 (Supl 1): S34-S38.

SEIJA, V. COCOS GRAM POSITIVOS: Aspectos prácticos. Documento en: http://www.cepeu.edu.py/LIBROS_ELECTRONICOS_1/Cap%2019.pdf

Virulence Mechanisms of Bacterial Pathogens. 3rd ed. Edited by Brogden KA et al. 2000. ASM Press, Washington.