FACULTAD DEL MEDIO AMBIENTE Y RECURSOS NATURALESPROYECTO CURRICULAR DE INGENIERIA FORESTAL

ASIGNATURA FITOMEJORAMIENTO FORESTALGUIA PARA REALIZACIÓN DE ACETOLISIS

LABORATORIO DE SILVICULTURA Y FITOMEJORAMIENTO FORESTAL

Realizada por: MOISÉS ROJAS SALAZAR Modificada por: KATHERINNE BENAVIDES

Parte importante del conocimiento previo a la formulación, diseño y puesta en marcha de

un plan de mejoramiento genético, no solo para especies forestales, sino para cualquier

especie vegetal, tiene que ver con la biología reproductiva en general y en particular con

el grado de conocimiento de las estructuras ó unidades que contienen y transmiten la

información genética (óvulos y polen ), máxime cuando se trata de mejoramiento genético

no clásico, es decir a nivel molecular, ó asistido por marcadores genéticos, o en otras

aplicaciones como el cultivo de protoplastos de anteras, técnica empleada recientemente,

con éxito en la propagación asexual de especies agrícolas como el arroz.

Particularmente se busca introducir al estudiante en la terminología y técnicas para la

preparación y descripción de muestras de polen. Así, la presente guía contiene la

información acerca de los pasos necesarios para la realización de la técnica de acetólisis,

herramienta utilizada en el campo de la palinología para el estudio y caracterización tanto

de polen fósil como del actual, de manera que el estudiante conozca además su

importancia y aplicación en el ámbito del estudio e investigación básica de las especies

forestales.

OBJETIVOS

Objetivo general

Caracterizar las estructuras del polen predominantes en la especie a trabajar

Objetivos específicos

Realizar el método denominado como Acetólisis de Erdtman para la

caracterización del polen de la especie.

Descripción y caracterización de los aspectos más relevantes como tamaño,

forma, polaridad, aperturas, protuberancias y simetría del polen, con el fin de apoyar

futuros estudios entorno a esta especie.

INTRODUCCION

Según Soejarto & Fonnegra (1972) el grano de polen es el elemento reproductivo que

mantiene la continuidad genética en las plantas superiores (angiospermas y

gimnospermas) de una generación a otra. Para realizar esta función, se necesitan dos

procesos: 1) polinización 2) fecundación.

El primero se refiere al traslado del polen de una antera hacia al estigma receptivo de la

flor de la misma u otra especie, y el segundo se refiere al acto de encuentro entre un

espermatozoide con un huevo para producir un cigoto. Este cigoto se desarrollará

formando un embrión, que mas tarde crecerá para formar la planta adulta, y así continuar

la existencia de la especie. Sin polinización, no se realiza la fecundación ni se forma el

cigoto, lo que implica la descontinuación de la generación. Por lo tanto la polinización es

un proceso biológico sumamente importante para las plantas.

En la naturaleza se encuentra una gran diversidad en formas y tamaños del polen. Se ha

interpretado que esta diversidad ha sido el resultado de una adaptación para asegurar

que el polen pueda llegar hacia el estigma de la flor de la misma especie por varios

portadores tales como:

1. Gravedad (Principalmente en autopolinización)

2. Viento (Principalmente en polinización cruzada)

3. Insectos (Tanto en autopolinización como en polinización cruzada)

4. Agua (Principalmente en las plantas acuáticas)

5. Otros (Pájaros, murciélagos, etc.)

En su condición viva, el grano de polen, como cualquier otra célula vegetal, está formado

por dos componentes: el protoplasma (la parte viviente) y la pared celular (la parte inerte).

Sin embargo, la pared celular del polen (esporodermo) es algo diferente de la pared

celular en general, porque el esporodermo generalmente es mas grueso y además está

constituido por dos capas, una interior (la intina) y otra exterior (la exina). La intina esta

en contacto directo con la membrana celular, es delgada y su composición química es de

celulosa: la exina es exterior a la intina es más gruesa que está, y su composición

química es principalmente de esporopolenina, un polímero de ácidos grasos mono- o

dicarboxilicos con peso molecular alto. En las esporas de los helechos hay otra capa

llamada perina, exterior a la exina, pero su estructura y composición química no es bien

conocida.

El protoplasma del polen permanece vivo por lo general, solamente varios días después

de que escapa de la antera en el momento de la antesis, y en ciertos casos permanece

vivo por solo varias horas. A su vez, la exina queda intacta y es muy resistente, tanto a

las temperaturas altas (hasta 250 ºC, en condición anaeróbica) como a las sustancias

corrosivas, tales como ácido sulfúrico, ácido acético anhidro, etc. La intina se destruye

por temperaturas altas y sustancias corrosivas. De esta manera la forma y el tamaño del

polen y la estructura de la exina no se alteran a un cuando el protoplasma del mismo haya

muerto por mucho tiempo (hasta millones de años). Esta es la base del estudio

palinológico.

Para los estudios e investigaciones palinológicos, los granos de polen se someten a una

serie de tratamientos químicos simples para eliminar el protoplasma y la intina, antes de

examinarlos al microscopio. Esto es necesario, debido a que el protoplasma impide la

transmisión de luz y no permite ver con claridad los detalles de la exina. Además, el

tratamiento químico hace brillar más la exina y aumenta el contraste microscópico.

Generalmente no es necesario colorear. Uno de los métodos mas ampliamente usados

para procesar el polen antes de estudiarlo microscópicamente se conoce como el método

de Acetolisis de Erdtman.

El conocimiento sobre la estructura, forma y tamaño del polen es una gran contribuyente a

la botánica sistemática, sobre todo cuando para colocar un organismo vegetal, en un

grupo determinado, correcto y definitivo fallan los caracteres mas manifiestos de los

órganos, tales como: numero, morfología, función, importancia, correlación y diferencias

entre estos. (Uribe & Fonegra 1979).

Lo anterior se debe a que la diversidad del polen en cuanto a la estructura, forma y

tamaño se refiere es ordenada, en el sentido que un tipo particular de polen es

característico para cada grupo taxonómico : ya sea género, o especie.

Los primeros estudios detallados sobre morfología polínica se iniciaron con Erdtman hacia

1920, quien fué el primero en proponer una metodología de clasificación de polen y

esporas basado en la posición, número y forma de las aberturas germinales y en la

caracterización estructural de la exina. A nivel nacional los primeros estudios en esta área

se presentan a partir de 1952 con Van der Hammer. Otros trabajos realizados sobre

morfología polínica son los de Soejarto & Fonnegra, 1972; Murillo & Bless (1974,1978),

Uribe & Fonnegra,1979 y mas recientemente los de Velásquez y Rangel (1995),Herrera &

Urrego (1995) Jiménez et al(1999), Bogotá y Sánchez, (2001).

La importancia principal del estudio palinológico es su contribución a la clasificación

(Taxonomía) de las plantas, ya que las evidencias palinológicas pueden aportar

conclusiones respecto a las relaciones taxonómicas y filogenéticos basadas en el estudio

de la morfología de las partes vegetativas y reproductivas, y aun pueden ayudar a decidir

la posición taxonómica de cualquier grupo dudoso. Entonces la morfología, la taxonomía

y la palinología, son tres campos de estudios vegetales muy ligados entre si. (Soejarto &

fonnegra 1972).

Las especies se pueden diferenciar por caracteres palinológicos, tomando en

consideración la forma, el tamaño y la ornamentación del tamaño del grano de polen.

Estas características aunadas a la estructura de la exina y a la disposición de las

aperturas, han permitido a Reille (1967) en Palacio et al (1996) relacionar la palinología

con la taxonomía, creando nuevos géneros.

MARCO TEORICO:

ORIGEN DEL POLEN

En la totalidad de las plantas con flores (fanerógamas), encontramos estructuras

especializadas en las que se producen y alojan los gametófitos masculinos (polen),

corresponden éstas a las anteras, cuerpos rectangulares vistos en un corte transversal y

de forma más o menos prismática al considerarlas en tres dimensiones. Cada uno de los

cuatro vértices o cantos de la antera es el lugar en donde se produce la génesis tanto de

las células madres de los gametófitos masculinos, como de los sacos polínicos que los

contienen.

Por medio de dos divisiones meióticas consecutivas, de las cuales en la segunda no

ocurre la síntesis de ADN, es decir que no se produce la replicación de los cromosomas,

las células madres de los granos de polen (CMP) dan origen a éstos. El gametófito

masculino como tal es producto de una división mitótica posterior cuyo producto son dos

células separadas entre si por una membrana en forma de vidrio de reloj, ambas con

núcleos haploides, una de ellas mas grande que la otra, siendo esta la manera como

madura y es dispersado el polen de aproximadamente dos terceras partes de las

angiospermas (principalmente Liliáceas, Rosaceas y Solanaceas), mientras que en otras

antes de la fecundación se produce una segunda mitosis que ocurre solo en el núcleo

generativo, de modo que el polen es dispersado en forma trinuclear (Rutishauser, 1982).

EL ESTUDIO DEL POLEN

ESTRUCTURA Y COMPOSICIÓN DEL POLEN

El grano de polen es considerado como una espora (microspora) ya que es una estructura

celular envuelta por una pared gruesa y resistente. En su condición viva, como cualquier

otra célula vegetal, esta formado por dos componentes, la pared celular que es inerte y el

protoplasma o la parte viva. Sin embargo, el esporodermo o pared celular del polen es

diferente a la pared celular general, al ser mas grueso y estar constituido por dos capas

principales, la intina, que se encuentra en contacto directo con la membrana celular, es

delgada y constituida principalmente por celulosa y la exina que es mas gruesa,

constituida por esporopolenina, un polímero de ácidos grasos mono o dicarboxilicos con

peso molecular alto y que es exterior a la primera. La exina es altamente resistente a las

altas temperaturas tanto como a la acción de ácidos fuertes como el acético y el sulfúrico,

de modo que perdura a la degradación de la intina y el protoplasma, lo que constituye la

base del análisis palinológico. (Soejarto y Fonnegra, 1972).

La exina consta de dos capas, una interna o endexina y la ektexina o capa externa y se

diferencian por la reacción que presentan al tratarse con fuchina B, en la que la endexina

tiñe de rosado, mientras que la ektexina de rojo oscuro, permitiendo así una diferenciación

morfológica entre éstas. La endexina se caracteriza por ser lisa y homogénea, mientras

que la segunda se distingue por la disposición radial de sus elementos que se pueden

diferenciar en tres subcapas de afuera hacia adentro, téctum, infratéctum y base. (Faegri

& Iversen, 1975 en Bogotá, 2002.) Erdtman, 1986, citado por el mismo autor, distingue en

cambio dentro de la exina dos capas: sexina o externa y nexina o interna, las cuales son

solo diferenciables morfológicamente ya que la nexina la constituye además de la

endexina, la base de la ektexina de la nomenclatura de Faegri & Iversen. Sáenz de Rivas,

1978 en Bogotá 2002 recomiendan usar la nomenclatura de Erdtaman cuando se trabaja

con polen sin tinción al microscopio óptico o al electrónico.

DESCRIPCIÓN MORFOLÓGICA

Para la caracterización morfológica del polen se recomienda utilizar los atributos descritos

por según Soejarto & Fonnegra (1972) y Huang (1972), adoptada por Herrera y Urrego.

Debido a que la diferencia nomenclatural disminuye el entendimiento para el estudiante y

dificulta la comparación de los resultados con otros estudios:

1. Tamaño: Existe gran diversidad en el tamaño de polen estudiado desde 8-150 µ. La

gran mayoría de las especies tiene polen con diámetro promedio aproximadazo desde

15-50 µ .También son comunes los granos que miden 50-90 µ. Polen con tamaño menos

de 15 µ y más de 100 µ es poco común. Debido a que la forma del polen puede ser

esférica, elipsoidal, reniforme, triangular, aplanada o irregular, estos números describen el

diámetro promedio del grano.

Según Soejarto & Fexiste correlación entre el tamaño del polen con los agentes

polinizadores. Se pueden citar las familias gramíneas (los pastos) y las compuestas que

tiene polen de tamaños que varían desde 15-60 µ, en realidad son generalmente

anemófilas ( polinizadas por el viento ) mientras que las especies con polen mas grande

que 60 µ ( pe . Hibiscus, Aphelandra, Thunbergia) son entomófilas polinizadas por

insectos. Estas observaciones corresponden a la conclusión de Echlin 1968).

2. Forma: El polen en términos generales se puede describir como esférico, subesférico,

elipsoidal, reniforme, o con alas .Se considera la polaridad, la simetría y la relación

existente entre la dimensión del eje polar y la dimensión del eje ecuatorial del grano,

llamado índice P/E.

También se puede considerar la clasificación de Huang (1972), adoptada por Herrera y

Urrego. Ver anexo 1.

- Polaridad : El polen se origina a partir de la célula madre ( por meiosis ) , en

grupos de a cuatro , llamados tétradas ( Gr tetras= cuatro ).Cuando los granos de

polen se maduran , se separan en forma de granos individuales en la mayoría de

las plantas .Los granos no se separan y permanecen en condición de tétrada que

puede ser tetrahedral, tetragonal, raras veces los granos se separan en grupos

de a dos , llamados díadas , y en casos especiales los granos se agrupan en una

masa llamada polinia. De todas maneras, un grano de polen tiene dos lados o

caras, el lado proximal que se halla hacia el centro de la tétrada, y el lado distal

que se halla hacia fuera, opuesto al lado proximal.

El eje polar es una línea imaginaria que va desde el centro del polo proximal

hasta el polo distal. Un plano imaginario que queda perpendicular al eje polar se

refiere como plano ecuatorial. En un polen isopolar el plano ecuatorial divide el

grano en dos mitades idénticas (proximal y distal) y cuando es imposible

determinar polaridad o no es definida como en los granos de polen esféricos, se

habla de polen apolar.

Lado o cara proximal (Centro de tétrada)

Lado o cara distal (Exterior de la tétrada)

Figura 1. Esquema de tétrada indicando las caras distal y proximal del grano de polen.

- Simetría: Una de las características más sobresalientes de un grano de polen en

general, es su simetría. Un polen isopolar con simetría radial (posee un plano

horizontal ecuatorial) y dos o mas planos verticales (polares) de simetría, cada

uno de los cuales divide el grano en dos mitades iguales.

3. Aperturas: Las aberturas son áreas adelgazadas de la exina y especialmente

delimitadas que permiten la salida del tubo polínico y ante las variaciones de humedad

medioambientales posibilitan la expansión del citoplasma, las aberturas que cumplen esta

función se denominan harmomégatas, mientras que las primeras son

germinativas(Wodehouse, 1935; Faegri & Iversen, 1975, en Bogotá, 2002).

El grosor del esporodermo no es uniforme: en ciertas partes de este se encuentran puntos

delgados o perforados llamados aperturas o poros. Esta apertura esta relacionada con la

germinación del grano de polen durante el ciclo biológico de la planta, ya que por ahí sale

el tubo polínico que conduce los espermatozoides hacia el ovulo para efectuar la

fecundación (Ver anexos).

Tres aspectos de la apertura se pueden analizar para describir el polen. Estos son: el

número, la posición y el carácter. Este sistema es conocido como clasificación- NPC (N=

numerus P= positio C= charácter)

- Numero: Teniendo en cuenta el numero de las aperturas e ignorando las formas o

caracteres de estas se han establecido los siguientes términos: monotreme,

ditreme, tritreme, tretratreme, etc. La palabra- treme en griego significa poro o

apertura.

- Posición: Teniendo en cuenta la posición de las aperturas, se han establecido los

siguientes términos: cuatratreme (apertura proximal), anatreme (apertura distal)

zonotreme (aperturas alrededor del plano ecuatorial y pantrotreme (Aperturas en

toda la superficie).

- Carácter: Una apertura puede ser simple o compuesta. Teniendo en cuenta el

carácter de tipo de apertura simple, se distingue un colpo ( colpus= apertura

alargada ) y un poro ( abertura en forma circular).Una apertura compuesta es

aquella formada por un poro rodeado por otra estructura que puede ser circular

elevada denominada ora ( Lat.os = boca, pl, ora).

Figura 2. Representación esquemática de los tipos de aperturas, de izquierda a derecha poro, colpo, poro en colpo y ora. Tomado y modificado de (Soejarto y Fonnegra, 1972).

4. Protuberancias supratectales: A las variaciones de las estructuras supratectales se

refieren la escultura u ornamentación de la exina. Así se distingue si la superficie es

reticulada, espinosa, rugosa, clavada o baculada.

Debido a que la estratificación y la ornamentación de la exina son características del

polen de una especie o genero dado, estas son también importantes para la

caracterización del polen al igual que el tamaño y la forma, Recientemente se han

desarrollado métodos para estudiar mejor los detalles del esporodermo, principalmente en

relación con el uso del microscopio electrónico. La exina descrita por Iversen & Faegri,

1975 consta de dos estratos: endexina y ektexina; de esta última se pueden diferenciar a

la vez tres estratos o capas : téctum, infratéctum(columnas o báculos) y base Hideux y

Ferguson, 1975, en Bogotá, 2002.

Figura 1. Esquema de la estructura y escultura de la exina, comparando la nomenclatura propuesta por Erdtman, 1986 (izquierda y cursiva), con la propuesta por Iversen y faegri, 1975 (derecha). Tomado y modificado de Soejarto y Fonnegra, 1978

MATERIALES Y EQUIPOS REACTIVOS

- material polinifero de la especie - Ácido Acético glacial

- Equipo de disección botánica - Alcohol etílico

- 1 caja petri - Glicerina

- 2 Tubos de centrifuga

- Agua destilada

- 4 Laminas porta y cubreobjetos

- Centrifugadora

- Estufa Memmert 600

- Microscopio

- Cámara digital

METODOLOGÍA

Los pasos que se deben seguir para la realización de este laboratorio son los siguientes.

LITERATURA CONSULTADA

- Bogotá,R.G. 2002. El polen de la subclase Asteridae en el páramo de Monserrate. Centro de Investigaciones y Desarrollo científico. Universidad Distrital. Bogotá D.C.

- Blackmore, S., Le-thomas, A. Nilsson, S. & Punt, W. 1992.- Glossary of palynological terms

- Erdtman, G. 1966 . Pollen morphology and plant taxonomy angiosperms. Hafner Publishing Company. NEy York. En Soejarto, D. & Fonnegra.

- Faegri, K, & Iversen, J. 1975.Textbook of pollen analysis. Munksgaard. Copenhagen

- Jansonius, J. & Mcgregor, D. 1996. Palynology: principles and applications. American Association of Stratigraphic palynologists Foundation. Salt Lake City. USA.

- Moore, P., Webb, J. & Collinson, M. 1991. Pollen analysis. Blackwell Science LtdOxford,London

- Herrera, L., &Urrego, L. 1995. Atlas de polen de plantas útiles y cultivadas de la amazonia colombiana: Fundación Erigaie. Santafé de Bogotá. Colombia.

- Palacios, C., Arreguin, M., Quiroz, D. 1996. Morfología del polen de las familias Acantahceae , Vitaceae y Violaceae del valle de México. Acta botánica mexicana. Numero 34. Instituto de Ecología. Patzcuaro. Mexico.

- Rutishausser, A. 1982. Introducción a la embriología de la plantas superiores. Ed. trillas. Madrid. España.

- Reille, M. 1999. Pollen et spores D’Europe et D’Afrique du Nord. (2ª ed.). Laboratoire de Botanique historique et Palynologie, Marseille. 535 pp.

- Reille, M. 1967. Contribution à l´ètude palynologique de la familie Vitaceae. Pollen et esporas 9 (2): 279- 303. En Palacios et al (1996).

- Ribeiro dos Santos, F., DÈl Rei, M.,Makin, H.,Renato, H.1997.Palinotaxonomia de especies brasileñas del género ossaea dc. (melastomataceae). Polibotanica. Numero 5. paginas 1-12. Mexico.

- Saenz, C. (1978).- Polen y Esporas: introducción a la palinología y vocabulario ç palinológico. Madrid.

- Soejarto, D. & Fonnegra, R. 1972. Polen: Diversidad en formas y tamaños. Actualidades Biológicas, Volumen 1, No 1 . Medellín. Colombia.

- Uribe F., Fonnegra R. 1995. Importancia de la Forma, Estructura y Tamaño del Polen en la determinación de la famila Melastomataceae.

- Valdés, B., Díez, M. & Fernández, I. (Eds.) 1987. Atlas polínico de Andalucía Occidental. Instituto de desarrollo regional de la Universidad de Sevilla. Excma. Diputación de Cádiz. 450 pp.

EN LA WEB:

- http://books.google.com.ar/books?id=- 5McogMmDfkC&printsec=frontcover&dq=pollen&lr=&ei=FqSNS8yMMKOsMv-7tcwM&cd=1#v=onepage&q=&f=false

- http://books.google.com.ar/books?id=F- DAV3jL25UC&printsec=frontcover&dq=POLLEN&cd=4#v=onepage&q=&f=false

- http://books.google.com.ar/books? id=D1dB9bZwpKYC&printsec=frontcover&dq=POLLEN&cd=8#v=onepage&q=&f=false

ANEXOS

Procedimiento de la acetólisis según Erdtman (1966).

.

PROCEDIMIENTO GENERAL DE LABORATORIOCalentar a 30 – 40ºC

Adaptado de Bogotá, 2002