evaluación de la utilidad de la molécula hla-g soluble...
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Evaluación de la utilidad de la molécula HLA-G soluble (sHLA-G1 y HLA-G5) como un potencial biomarcador para el diagnóstico oportuno del cáncer gástrico
Yeimmy Paola Prada Cubillos
Universidad Distrital Francisco José de Caldas
Facultad de Ciencias y Educación
Licenciatura en Biología
Bogotá D.C.
2019
Evaluación de la utilidad de la molécula HLA-G soluble (sHLA-G 1 y HLA-G5) como un potencial biomarcador para el diagnóstico oportuno del cáncer gástrico
Yeimmy Paola Prada Cubillos
Trabajo de grado para optar por el título de Licenciada en Biología
Director Interno
MSc. Carmen Helena Moreno
Universidad Distrital Francisco José de Caldas
Facultad de Ciencias y Educación
Licenciatura en Biología
Director externo
MSc. Josefa Antonia Rodríguez
Grupo de Investigación en Biología del Cáncer
Instituto Nacional de Cancerología
Bogotá D.C.
2019
AGRADECIMIENTOS
Deseo agradecer a mi familia, mis padres quienes con esfuerzo y constante apoyo me han brindado una educación, mis hermanas quienes en mi proceso de formación han sido incondicionales con sus consejos y fuerza para continuar cada día
A la profesora Josefa Rodríguez ya que gracias a ella inicia mi desarrollo en la investigación, brindándome la oportunidad de realizar el actual trabajo en el Instituto de Cancerología, a MSc. Johana Lineros y la Dra. Alba Combita quienes me colaboraron en el análisis de los resultados, a Adriana por tomar las muestras de sangre, a Esperanza por brindarme sus consejos y enseñanzas de técnicas y protocolos importantes a desarrollar en el laboratorio, a Alexander Chivata por ser un compañero y amigo, a la profesora Carmen Helena por dirigir este trabajo de grado y mantener vínculos importantes interinstitucionales para generar condiciones que lleven a desarrollar procesos investigativos y a Pablo por su cariño, paciencia y apoyo y a todas aquellas personas que durante lo largo de la carrera formaron parte de mi vida compartiendo experiencias.
A mi alma mater la Universidad Distrital Francisco José de Caldas por formarme como licenciada en biología y al Instituto Nacional de Cancerología especialmente al grupo de investigación en biología del cáncer por permitir realizar este trabajo con sus recursos e instalaciones.
TABLA DE CONTENIDO LISTA DE FIGURAS ......................................................................................................................... 5
LISTA DE TABLAS ........................................................................................................................... 5
LISTA DE ABREVIATURAS ........................................................................................................... 5
RESUMEN .......................................................................................................................................... 7
INTRODUCCIÓN .............................................................................................................................. 8
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................................................... 11
1.1 Descripción del problema ....................................................................................................... 11
1.2 Pregunta problema ................................................................................................................. 14
1.3 Justificación ............................................................................................................................. 14
1.4 Objetivos .................................................................................................................................. 17
1.4.1 Objetivo general ............................................................................................................... 17
1.4.2 Objetivos específicos ........................................................................................................ 17
2. MARCO TEÓRICO ..................................................................................................................... 18
2.1 Cáncer Gástrico ...................................................................................................................... 18
2.1.2 Patología del cáncer gástrico .......................................................................................... 19
2.2. Sistema inmune en el cáncer ................................................................................................. 20
2.2.1 Principales células que intervienen en la respuesta inmune antitumoral ................... 21
2.3. Complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) ............................................................... 22
2.3.1 estructura de la molécula de HLA ................................................................................. 24
2.4 La molécula de HLA - G y cáncer. ....................................................................................... 26
2.4.1 Estructura de HLA-G ..................................................................................................... 27
2.4.2 Características funcionales inmunológicas de HLA-G ................................................. 28
2.4.3 Características funcionales de HLA-G soluble ............................................................. 30
2.4.4. HLA-G como biomarcador de diagnóstico ................................................................... 32
3. METODOLOGÍA ......................................................................................................................... 33
3.1 Diseño del estudio ................................................................................................................... 33
3.2 Población de estudio. .............................................................................................................. 34
3.3 Muestras de estudio: ............................................................................................................... 34
3.3.1 Procesamiento de las muestras: ...................................................................................... 35
3. 4 Evaluación de los niveles plasmáticos de de sHLA-G .................................................... 35
3.5 Análisis estadísticos de lo resultados ..................................................................................... 36
RESULTADOS ................................................................................................................................. 38
5. DISCUSIÓN .............................................................................................................................. 43
CONCLUSIONES ............................................................................................................................ 49
REFERENCIAS ................................................................................................................................ 50
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Principales tipos histológicos de cáncer gástrico
Figura 3. Estructura de HLA-I
Figura 5: Algunas de las actividades inmunoreguladoras mediadas por HLA-G
Figura 6. Diagrama de caja y bigotes (boxplots) de los niveles de expresión de
sHLA-G
Figura 7. Análisis de la curva de características operativas del receptor (ROC)
Figura 8. Diagrama del porcentaje de los FN, FP, VN, VP
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Niveles plasmáticos de sHLA-G
Tabla 2: categorías diagnósticas obtenidas a partir de la cuantificación de sHLA-
G
Tabla 3. Variables para determinar la utilidad de la medición de los niveles de
expresión sHLA-G en el diagnóstico del cáncer gástrico
LISTA DE ABREVIATURAS
APC: Célula presentadora de antígeno. “Antigen presenting cell”.
HLA: Antígeno leucocitario humano. “Human leucocyte antigen”
NK: Células Natural killer.
sHLA-G: Antígeno leucocitario humano soluble
β2m: 2-beta microglobulina
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MHC: Complejo Mayor de Histocompatibilidad. “Major Histocompatibility
Complex
ADN- DNA: Ácido desoxirribonucleico. “Deoxyribonucleic acid”
DC: Célula dendrítica “Dendritic Cell”
DCm: Célula dendrítica madura
DCi: Célula dendrítica inmadura
ILT: Receptor de tipo inmunoglobulina “immunoglobulin-like transcript”
CTL: linfocito T citotóxico “Cytotoxic T cell”
TCR: Receptor de células T “T Cell Receptor”
MØ: Macrófagos
ELISA: un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas
HRP: Peroxidasa de rábano “horseradish peroxidase”
DO: densidad óptica
ROC: curva de característica de funcionamiento del receptor (receiver operating
characteristic curve)
AUC: área bajo la curva
FN: falso negativo
FP: falso positivo
VN: Verdadero negativo
VN: verdadero positivo
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RESUMEN
El Antígeno leucocitario Humano G, HLA-G, es una molécula del complejo
mayor histocompatibilidad de clase I no clásica, cuya expresión fue descrita inicialmente
en las células trofoblásticas durante el embarazo, para proteger al feto. Sin embargo,
diversos estudios han demostrado que esta molécula se encuentra relacionada con el
desarrollo tumoral debido a que posee propiedades inmunosupresoras tales como la
inhibición de la citotoxicidad mediada por las células natural killer (NK) y de la actividad
efectora de las células dendríticas y de las células T (CD8 y CD4), lo que tiene como
consecuencia la progresión tumoral.
El gen que codifica HLA-G genera 7 isoformas: 4 de membrana y 3 solubles,
con actividad inmuno inhibidora. Las isoformas de membrana requieren la interacción
directa entre las células del sistema inmune y las que expresan HLA-G en su superficie
(tumorales) mientras que las isoformas solubles pueden ejercer un efecto sistémico.
Numerosos estudios han postulado a HLA-G como un biomarcador tumoral al
demostrar el incremento de su expresión en pacientes con cáncer de mama, ovario,
colorrectal, melanoma, neuroblastoma y trastornos linfoproliferativos, en comparación
con los controles sanos o pacientes con neoplasias benignas. En el presente estudio se
propone investigar si HLA-G soluble (sHLA-G) puede ser utilizado como un potencial
biomarcador para el diagnóstico del cáncer gástrico y para encontrar la respuesta a este
interrogante se midieron los niveles de expresión de sHLA-G en el plasma de 46
pacientes con patologías gástricas benignas y 68 pacientes con cáncer gástrico mediante
el uso de un ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), de tipo sándwich
específico para HLA-G. Se encontró que los niveles plasmáticos de sHLA-G eran
significativamente más altos en los pacientes con cáncer que en aquellos que tenían una
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patología gástrica benigna (p <0,0001). El área bajo las curva de característica de
funcionamiento del receptor (ROC) para sHLA-G fue de 0,77; intervalo de confianza IC
del 95% 69,6- 86,2 con una especificidad del 82% y una sensibilidad de 63%. Este
hallazgo sugiere que la molécula sHLA-G puede ser útil debido a que puede contribuir
en el diagnóstico oportuno de Cáncer Gástrico siendo usada como una prueba de tamizaje.
Palabras Clave: sHLA-G, diagnóstico, ELISA, Cáncer Gástrico, Patología
Benigna, Biomarcador
INTRODUCCIÓN
El cáncer se puede definir como un grupo de enfermedades malignas donde se
presenta un proceso de crecimiento y diseminación incontrolada de células anormales en
el cuerpo. De acuerdo con la organización mundial de la salud, el cáncer se considera un
problema de salud pública cuya incidencia y mortalidad ha incrementado en los últimos
años (Piñeros & Murillo, 2004). El Cáncer Gástrico representa una de las causas más
frecuentes de muerte en el mundo, siendo de una incidencia variable en los distintos países
y regiones del planeta (Boixeda D, 1996). En Colombia ha sido por muchos años una
considerable carga social de salud y varios estudios epidemiológicos lo han señalado
como uno de los principales causantes de muerte por cáncer (Correa, Piazuelo, 2010).
Datos como los presentados en GLOBOCAN en el 2018 ubica al Cáncer Gástrico dentro
de los cuatro más frecuentes en nuestro país. (IARC,2018)
Este cáncer es una enfermedad multifactorial que depende de diferentes
condiciones como; medioambientales, y/o genéticas dentro de ellas se pueden
mencionar, la poca ingesta de verduras y frutas frescas, la alta ingesta de sal y el
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tabaquismo, entre otras (Alberts, Cervantes, & Velde, 2003). Generalmente aparece en
estómagos con antecedentes de gastritis atrófica y metaplasia intestinal. por lo que se
estima que el 10% de pacientes con atrofia gástrica pueden desarrollar este tumor en un
periodo de 15 años. (Gómez, Otero, & Arbeláez, 2009). Los síntomas del Cáncer Gástrico
generalmente se pueden confundir con enfermedades gástricas benignas tales como la
dispepsia, la úlcera gástrica y duodenal benigna y el reflujo gastroesofágico; por lo cual
la Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda que antes de iniciar un
tratamiento se considere la posibilidad de enfermedad maligna en todos los pacientes
mayores de 40 años y especialmente con sospecha de úlcera por que ellos requieren una
mayor vigilancia debido a que estos pacientes de edades ya avanzadas y con estos
síntomas pueden estar desarrollando un cáncer gástrico y al medicarse con la ranitidina u
omeprazol se enmascarar dificultando el diagnóstico temprano (OMS, 2004). La
endoscopia digestiva es la prueba de oro para la detección del cáncer gástrico, pero su
implementación en poblaciones con un riesgo promedio de desarrollar la enfermedad no
es costo efectiva (Areia M & Carvalho R, et all, 2013), porque además de ser un
procedimiento invasivo e incómodo para el paciente, tiene el riesgo ocasionar una
hemorragia o perforación de la mucosa gástrica (karimi, Islami, Anandasabapathy,
Freedman & Kamangar,2014) que puede ser fatal.
Un número creciente de publicaciones han reportado ventajas de incluir el uso
de diferentes biofluidos (sangre, orina, esputo, saliva), como alternativa a la biopsia con
aguja convencional para el cáncer de pulmón (Huang, W et al, 2017), demostrando que
la biopsia líquida puede ser una herramienta prometedora y tan eficaz como las muestras
de tejido, proporcionando una alternativa viable para el diagnóstico no invasivo o el
monitoreo en serie de la evolución de la enfermedad(Chudasama D et al, 2019).
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Estudios in vitro realizados en diferentes modelos tumorales (mama, esofago,
pulmón entre otros), demuestran que existen moléculas que al ser liberadas por los
tumores a la circulación, pueden ser detectadas y tener utilidad para el diagnóstico,
pronóstico y seguimiento del curso clínico de la enfermedad (Kleinberg, y otros 2006;
Suárez, Díaz & Álvarez, 2003;Zheng, J et al,2014;Rouas-F, et al,2005).
Una de estas moléculas es la molécula G del antígeno leucocitario humano
(HLA-G) Esta molécula de clase I no clásica la cual tienen expresión restringida al
citotrofoblasto y ha sido postulada como un importante regulador de la inmunidad, capaz
de modular la actividad efectora de todas las células inmuno competentes, incluidas las
Natural Killer (NK), los linfocitos T CD4 o CD8 y células dendríticas (Clements, Kjer-
Nielsen, McCluskey, & Rossjohn, 2007). La expresión aberrante de HLA-G es una
estrategia de evasión inmune que se ha asociado con el mal pronóstico en pacientes con
cáncer y su expresión se ha reportado en numerosos modelos tumorales. (Zheng, y otros,
2014).
A diferencia de las moléculas de HLA-I clásicas que tienen un gran
polimorfismo, HLA-G, es más conservada en su secuencia y su polimorfismo está dado
por el corte y empalme alternativo del transcrito primario que genera siete isoformas:
cuatro de membrana (HLAG1, -G2, -G3 y -G4), y tres solubles (HLA-G5, -G6 y -G7)
(Paul, Cabestre, Ibrahim, & al., 2000). Adicionalmente se demuestra que las isoformas
HLA-G5 (soluble) y la sHLA-G1, que es generada mediante mediante el clivaje
proteolítico de la molécula HLA-G1 de membrana (mHLA-G1), poseen funciones muy
similares tales como la inhibición citolítica de las NK de la sangre periférica y uterina,
función citotóxica específica de antígeno de los linfocitos T CD8, la respuesta
aloproliferativa de las células T CD4 +, la proliferación de células T y células NK en
sangre periférica, y la maduración y función de las células dendríticas. y que a pesar que
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las otras isoformas de HLA-G han sido menos estudiadas y se sabe poco acerca de su
función, se conoce que la HLA-G2, HLA-G3 y HLA-G4 unidas a la membrana pueden
inhibir la citólisis de linfocitos T citotóxicos y linfocitos NK in vitro(Carosella, E. et
al,2008)
Las isoformas solubles de HLA-G (sHLA-G1 y HLA-G5) pueden ser fácilmente
detectadas en sangre periférica, fluido amniótico, ascitis malignas, efusiones pleurales, o
de ovario, fluido cerebroespinal y esperma (Rebmann, y otros,1999; Singer, y otros, 2003;
Zilberman et al, 2012; Davidson et al, 2005), por lo cual podría ser utilizado como un
potencial biomarcador de diagnóstico.
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
1.1 Descripción del problema
La OMS señala que el cáncer gástrico es una de las neoplasias más frecuentes
del mundo contemporáneo, Datos reportados por GLOBOCAN en el 2018 el número
estimado de muertes en el mundo por esta neoplasia en el mundo fue 704. 893 (8,3%);
siendo la tercera causa de muerte en hombres 472.128 (9,8%) y la cuarta en mujeres
237.765 (6,4%).(IARC, 2018). En Colombia, es una enfermedad de alta prevalencia y
alta morbimortalidad, siendo las primera causa de muerte por cáncer, en ambos sexos
(Otero,2008; IARC,2018)
La mayoría de los casos de cáncer gástrico se diagnostica en etapas avanzadas,
cuando el tumor ha invadido la capa muscular del estómago y dado que la etapa en la que
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se realiza el diagnóstico tumoral es un factor determinante para elegir el tratamiento
adecuado, la predicción de la efectividad del mismo; y debido al diagnóstico tardío de la
enfermedad en nuestro país la tasa de supervivencia a los 5 años es inferior al 20%
(Correa, 2011).
Los pacientes a los que se les diagnostica el cáncer gástrico en estadios
tempranos generalmente son sometidos a cirugía radical seguida de quimioterapia, estos
pacientes tienen un buen pronóstico y las tasas de supervivencia a 5 años son del 90%.
Sin embargo, el porcentaje de pacientes que son diagnosticados de manera temprana es
bajo debido en gran parte a la ausencia de síntomas y signos específicos que permitan
detectar un cáncer gástrico en la mayoría de los pacientes (> 70%) son diagnosticados
estadios avanzados, cuando ya no existe la posibilidad de realizar cirugía ya cuando el
potencial metastásico del tumor es avanzado limitando las opciones de tratamiento el cual
lleva a un pronóstico general malo (Zheyu, Yuanyu, Jiebing, Dingquan, & Xuedong,
2017).
La difícil detección de la enfermedad en sus etapas iniciales está determinada
por el riesgo a padecerla debido a que los pacientes que poseen ciertas afecciones a
padecerla generalmente son tratados con medicamentos que disfrazan los síntomas o
porque son personas mayores y esto hace que se reduzcan las opciones de tratamiento
oportuno, además de esto el Cáncer Gástrico constituye un problema de salud pública
para el país, por el coste que genera esta al sistema de salud y la endoscopia digestiva ha
sido la técnica más usada para la detección del cáncer gástrico en Japón y otras áreas de
alta incidencia de la la enfermedad (Areia M & Carvalho R, et all, 2013), en Colombia
su implementación como herramienta de tamizaje se ve limitado debido al alto costo que
representa para el sistema de salud y adicionalmente es un procedimiento invasivo e
incómodo para el paciente y Colombia siendo un país en vías de desarrollo, con grandes
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problemas sociales y un alto índice de mortalidad por esta enfermedad, es necesario
desarrollar e implementar pruebas válidas y de menor costo que sirvan para la detección
temprana del cáncer gástrico con el fin de realizar los tratamientos de manera oportuna
(Gómez, Otero, & Arbeláez, 2009).
Por otra parte, tradicionalmente se ha utilizado la biopsia del tejido tumoral para
el análisis molecular de los tumores, pero en la actualidad se está intentando implementar
métodos no invasivos o mínimamente invasivos como la toma de muestra de sangre
periférica, que se hace de rutina en la práctica clínica para detectar cantidades variables
de biomoléculas originadas por el tumor permitiendo de esta manera el monitoreo y la
optimización posterior en el tratamiento del cáncer. (Saarenheimo Jatta, Eigeliene
Natalja, Andersen Heidi, Tiirola Marja, Jekunen Antti, 2019)
La cuantificación de los niveles séricos de HLA-G podría ser un novedoso
marcador tumoral, debido a que esta molécula inmunosupresora, cuya expresión se
encuentra restringida a la interface materno fetal y a tejidos adultos con privilegio inmune,
se expresa de manera aberrante en diferentes neoplasias malignas protegiendo al tumor
de la respuesta inmune antitumoral (Carosella, Favier, Rouas-Freiss, Moreau, &
LeMaoult, 2008), lo que confirma su potencial uso como biomarcador para el diagnóstico
y/o Pronóstico de varias malignidades, incluido el Cáncer Gástrico. (Cao, y otros, 2011)
Por lo anteriormente expuesto este estudio se propone realizar la cuantificación
de sHLA-G mediante una prueba ELISA específica para la detección de esta molécula en
plasma de pacientes con cáncer gástrico y de pacientes con patologías gástricas benignas,
para definir si esta cuantificación puede ser propuesta como una prueba de diagnóstico
temprano para el cáncer gástrico.
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1.2 Pregunta problema
¿Es posible establecer la utilidad de la molécula sHLA-G como un biomarcador
para el diagnóstico temprano de cáncer gástrico mediante la realización de una prueba
ELISA en plasma de pacientes con patologías gástricas?
1.3 Justificación
El cáncer gástrico es la tercera causa de muerte por cáncer en ambos sexos en
todo el mundo (IARC,2018). En años como el 2012 se reportó que la incidencia del cáncer
gástrico fue alrededor de 934000 casos, de los cuales el 56% de los casos provenían del
oriente de Asia, 41% de China y 11% de Japón, adicionalmente se hallan altas tasas de
incidencia de esta patología en el Oriente de Europa y Sudamérica; en comparación con
las bajas tasas de incidencia de Norte América y algunas partes de África. En general del
65% al 70% de la incidencia y muertes por cáncer gástrico ocurre en países en desarrollo
(Daza, 2012).
En Colombia se reporta que es la primera causa de mortalidad por cáncer,
causando alrededor de 6000 muertes por año (Pardo et al, 2017; IARC,2018), y más de la
mitad de pacientes con cáncer gástrico, el diagnóstico se realiza en estadios avanzados y
para hacerlo en etapas tempranas debe implementarse intervención de prevención
primaria pero los costos son muy elevados, (Moros, Jurado, Mora, et all, 2004)
sumándose a esto ciertas condiciones sociodemográficas que posee la población para
determinar un eficiente diagnóstico, entre estas están largos periodos de evolución de los
síntomas, múltiples consultas a los servicios de salud, tratamientos empíricos sin
respuestas, la falta de solicitud de estudios diagnósticos, etc.(Martinez,Garzon,&
Lizarazo, 2010), convirtiendo esta enfermedad en un problema de salud pública para el
país, otro problema para el diagnóstico temprano del cáncer gástrico es que es
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asintomático y suele progresar a estadios avanzados en 44 días y aumenta la incidencia
con la edad y el inicio de tamizaje por la enfermedad es entre los 40 y 50 años cuando la
enfermedad ya se encuentra en estadios avanzados (Leung WK, Wu Ms, Kakugawa Y et
al,2008).
La endoscopia de vias digestivas es una herramienta importante para
diagnosticar el cáncer gástrico, aunque se ha demostrado posee una gran eficacia hasta
el momento, es una prueba operador - dependiente que requiere un adecuado
entrenamiento y la disponibilidad de costosos equipos por; ello hoy en día el uso de esta
herramienta es poco factible incluso en países con alta prevalencia por esta enfermedad
(Ayala & Lotero, 2012). Por ello es importante desarrollar e implementar pruebas válidas
y de bajo costo que posean gran eficacia para la detección temprana del cáncer gástrico y
así asignar tratamientos de manera oportuna y reducir los índices de mortalidad por esta
enfermedad en el país (Gómez, Otero, & Arbeláez, 2009).
En diferentes modelos de cáncer como el de pulmón se viene implementando
estrategias que incluye el uso de diferentes fluidos como sangre, orina esputo, saliva;
como alternativa para biopsia convencional (Huang, W et al, 2017) debido que en estos
biofluidos, específicamente en sangre se pueden detectar ciertas células tumorales que
circulan y pueden ayudar al diagnóstico de la enfermedad y a determinar un mejor
tratamiento (Hundt et al, 2007).
En esta medida el uso de la biopsia líquida en cáncer gástrico, puede
considerarse como una herramienta prometedora, viable y no invasiva ya que en la sangre
se puede examinar diferentes células tumorales circulantes (CTC) y/o biomoléculas que
pueden proporcionar una mejor comprensión de la dinámica y desarrollo de
la enfermedad, siendo que dichas biomoléculas tumorales presentes en la sangre son
desprendidas del tumor primario (Chudasama D et al, 2019) e incluyen información
16
importante y al ser liberadas por el tumor pueden ser cuantificadas y usadas como
marcadores de especificidad ya que pueden brindar una utilidad como prueba de tamizaje
que conlleven a un diagnóstico oportuno.
Una de estas moléculas; es la molécula G del antígeno leucocitario humano
(HLA-G) Esta molécula de clase I no clásica tienen expresión restringida al
citotrofoblasto y ha sido postulada como un importante regulador de la inmunidad, capaz
de modular la actividad efectora de todas las células inmuno competentes, incluidas las
Natural Killer (NK), los linfocitos T CD4 o CD8 y células dendríticas (Clements, Kjer-
Nielsen, McCluskey, & Rossjohn, 2007). el cual ha sido introducido como un marcador
tumoral para el cancer de mama, pulmón, y ovario; mostrando que al evaluar los niveles
de HLA-G en suero o plasma puede aumentar la especificidad del diagnóstico.(Heidari
MH, Movafagh A, & Abdollahifar MA,et all,2017).
El transcrito primario de HLA-G genera 7RNAm alternativos, los cuales HLG-
1, G2,G3,G4 están unidos a la membrana y G-5,G-6, G-7 son isoformas de proteínas
solubles(Carosella, Moreau & Le,2003 ) el empalme alternativo de la transcripción
primaria de HLA-G se destaca porque 1). conduce a la producción de proteínas solubles
y de membrana, y 2) se puede regular, según lo indicado , ya que dependiendo del tipo de
célula y la situación se pueden expresar algunas isoformas (Morales PJ, Pace JL, & Platt,
et all, 2003), como lo es la mHLA-G 1, ya que a través de un clivaje proteolítico pasa a
ser de isoforma soluble sHLA-G1 cumpliendo funciones similares HLA-G5 tales como
la inhibición citolítica de las NK de la sangre periférica y uterina, función citotóxica
específica de antígeno de los linfocitos T CD8, la respuesta aloproliferativa de las células
T CD4 +, la proliferación de células T y células NK de sangre periférica, y la maduración
y función de las células dendríticas. y que a pesar que las otras isoformas de HLA-G han
sido menos estudiadas y se sabe poco acerca de su función, se conoce que la HLA-G2,
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HLA-G3 y HLA-G4 unidas a la membrana pueden inhibir la citólisis de linfocitos T
citotóxicos y linfocitos NK in vitro(Carosella, E. et all,2008)
La importancia de esta investigación radica en que al lograr cuantificar los
niveles séricos de sHLA-G1 y HLA-G5 en plasma de pacientes con cáncer gástrico y
enfermedades gástricas benignas a través de una ELISA específica, pueden ser usados
estos biomarcadores como una estrategia de diagnóstico oportuno de cáncer gástrico. De
igual manera abrir el campo de investigación frente a las diferentes alternativas
terapéuticas que lleven a elegir tratamientos más adecuados de acuerdo a la evolución de
la enfermedad implementando estudios moleculares - específicos del tumor a partir de
exámenes de rutina que no trastornan el paciente y el costo sea mínimo.
1.4 Objetivos
1.4.1 Objetivo general
Determinar si la evaluación de los niveles de expresión de sHLA-G en plasma
de pacientes con cáncer gástrico y enfermedades gástricas benignas, podría tener valor
como biomarcador para el diagnóstico oportuno.
1.4.2 Objetivos específicos
1.4.2.1 Cuantificar los niveles de sHLA-G presentes en plasma de pacientes con
cáncer gástrico y enfermedades gástricas benignas mediante una prueba ELISA
específica.
1.4.2.2 Realizar análisis de las cuantificaciones arrojadas por la lectura de las
ELISA
1.4.2.3 Determinar si los niveles de sHLA-G permiten diferenciar una patología
gástrica benigna del cáncer gástrico
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2. MARCO TEÓRICO
2.1 Cáncer Gástrico
2.1.1 Epidemiología y etiología
Es uno de los tumores más frecuentes a nivel mundial, siendo la segunda causa
de muerte (IARC,2012);(Bioxeda D, 1996) en colombia es la segunda patología
neoplásica más frecuente en los hombres despues del cancer de prostata, en las mujeres
la cuarta despues del cancer de mama y la primera causa de muerte por cáncer (Bang Y,
Chung H & Xu J et al, 2009) (Correa, Piazuelo, 2010). constituyéndose como un
problema de salud pública por su alta incidencia de muerte y el alto costo que le genera
al sistema de salud.
El cáncer gástrico se origina en la mucosa a nivel del cuello de las foveolas donde
se mantiene por determinado tiempo ya que la extensión superficial es lenta que la
invasión profunda. Ya iniciada la invasión profunda, esta avanza hacia las capas
musculares, la serosa y algunos órganos vecinos como el páncreas, colon transverso,
diafragma y el hígado (Esteban, CE, Manrique, AI, Sastre, VJ, Díaz-Rubio, GE,2000).
En el cáncer gástrico existen factores de riesgo tales como : la gastritis crónica
atrófica, metaplasia intestinal, Anemia perniciosa, pólipos adenomatosos gástricos,
factores medioambientales y genéticos donde se destaca el bajo consumo de frutas y
verduras, alto consumo de sal y de ahumados, el tabaquismo (Roder DM, 2002)(Oliveira
19
C. et al,2015) y es de gran importancia mencionar la infección por Helicobacter pylori, la
cual está reconocida como un factor cancerígeno de clase I desde 1994 por la OMS.
2.1.2 Patología del cáncer gástrico
El cáncer gástrico es considerada como una enfermedad esporádica, pero existe
gran evidencia que dichos casos ocasionales provienen de un componente hereditario
(Smith, Hold & Tahara Et al, 2006). La mayoría de las neoplasias malignas del estómago
son consideradas como adenocarcinomas, en esta medida el adenocarcinoma gástrico
comprende un espectro de afecciones dependiendo del sitio de origen del tumor y la
apariencia patológica de la lesión. Existe una clasificación histológica propuesta por
Lauren, la cual es descrita dicha clasificación en dos tipos: intestinales y difusos; los
tumores intestinales se caracterizan por la formación de glándulas que se disponen en
diferentes patrones de crecimiento y predomina en el antro gástrico y el tumor difuso
caracterizado por la proliferación de células neoplásicas en forma no cohesiva y sin
formación de glándulas (Lauren P. 1965), el tipo intestinal generalmente suele presentarse
en personas mayores mientras que el difuso es más común en individuos de temprana
edad (Rodríguez, 2014)
Existe una serie de pasos que demuestra la evolución de los tumores intestinales
donde dan inicio con una gastritis que progresa hacia una atrofia de la mucosa, seguida
por una metaplasia intestinal, displasia y finalmente el carcinoma con diseminacion
metastasica, no hay evidencia aún registrada acerca de la patogenia del carcinoma difuso,
únicamente se encuentra asociada la gastritis crónica que caracteriza la infección
por Helicobacter pylori (Smith, Hold & Tahara Et al, 2006).
20
Figura 1 Principales tipos histológicos de cáncer gástrico según la clasificación de lauren (Tomada de tesis doctoral María Alsina Maqueda, 2016)
2.2. Sistema inmune en el cáncer
Thomas y Burnet en 1957 fueron los primeros en hablar acerca del papel que
desempeña el sistema inmune en el control de tumores, ellos proponen la teoría de la
Vigilancia inmunológica; la cual postula que dentro de un organismo siempre habrá la
producción de células malignas que son identificadas y eliminadas por el sistema inmune
para evitar convertirse en cáncer(Burnet FM, 19676 Thomas, 1982).
Sin embargo a pesar de esta capacidad de vigilancia las células transformadas
presentan algunos mecanismos que le permiten el escape tumoral ya que los tumores son
tejidos que están compuestos por células tumorales e inmunes que otorga al tumor la
capacidad de crecimiento y metástasis, dentro de estas características está: el poder
brindar al tumor un soporte de señal proliferativo, la prevención de supresores de
crecimiento, la elusión a la muerte celular, la inmortalidad celular, la angiogénesis, la
21
activación metastásica, la capacidad de reprogramar el metabolismo celular para apoyar
la proliferación neoplásica y la destrucción por linfocitos T y B, macrófagos y células
asesinas naturales (NK) (Hanahan D & Weinberg RA.2011)
Dentro de la respuesta inmune antitumoral intervienen células de la inmunidad
innata y adaptativa, donde la inmunidad innata media la vigilancia y lisis tumoral rápido
e inespecífico,en cambio la respuesta inmune adaptativa es más específica. Las
principales células que intervienen en esa respuesta inmune antitumoral son, los linfocitos
T y las Células NK, que gracias a la participación de las APC, se puede dar la inducción
a la respuesta inmune adaptativa específica y eficiente contra tumores (Lorenzo, S.
2014).
2.2.1 Principales células que intervienen en la respuesta inmune
antitumoral
Las células NK
Son las principales células efectoras de la inmunidad innata contra células
tumorales o infectadas por virus, destruyen diferentes tipo de células, en especial aquellas
que pierden la expresión de HLA-I, siendo este una mecanismo comúnmente utilizado
por virus y células tumorales para escapar del reconocimiento que hacen los linfocitos T,
la respuesta dada por las células NK depende de un balance entre señales activadoras e
inhibidoras, siendo el reconocimiento de las moléculas de HLA-I la principal señal
inhibidora, es así que la pérdida de estas moléculas en la superficie de las células
tumorales las convierte en el objetivo principal de las NK (Lorenzo, 2014).
Los linfocitos T
22
Los T CD8+ son las células que principalmente destruyen células tumorales de
la inmunidad adaptativa, son fundamentales en la vigilancia inmune contra el cáncer ya
que reconocen y destruyen directamente a las células tumorales por los péptidos derivados
de proteínas endógenas que expresa, y como el cáncer es una enfermedad del DNA, en la
célula tumoral se generan péptidos alterados que son presentados en HLA-I Los linfocitos
T CD4+ ayudadores (LTh) polarizan la respuesta hacia una respuesta celular (Th1) o
humoral (Th2). Los linfocitos Th1 secretan citoquinas como IL-2, e IFN γ, que estimulan
la inmunidad mediada por células. (Abbas, Lichtman, & Pillai, 2015).
Células Presentadoras de Antígeno (APC)
Son fundamentales para la generación de respuestas inmunes adaptativas. Estas
células, además de ser capaces de fagocitar, procesar y presentar antígenos de células
tumorales en HLA-II a los linfocitos T CD4+, están implicadas en la producción de
citoquinas como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF) con fuerte actividad citotóxica,
factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF) e Interleuquina
1(IL-1) (Batista, 2003).y expresan receptores para la fracción constante de las
inmunoglobulinas (Fc) (Kindt, Goldsby, & Osborne, 2007).
Pero para que se desarrolle una respuesta inmune efectiva contra los tumores,
deben participar diferentes poblaciones celulares del sistema inmune adaptativo
(linfocitos T y B (LT y LB)), e innato (células Natural Killer (NK), macrófagos (MØ) y
células dendríticas (CD)) y moléculas solubles como citoquinas, quimioquinas y factores
de crecimiento (Tham & Abastado, 2011).
2.3. Complejo mayor de histocompatibilidad (MHC)
23
Las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad han sido definidas
como proteínas de superficie celular que están cargadas con péptidos antigénicos que son
reconocidos por receptores en células T, para así iniciar o propagar respuesta en la
inmunidad adquirida, inicialmente fueron descritas como; la molécula de clase I, que era
responsable del pronto rechazo de injerto en ratones y la molécula de clase II fue
identificada como producto de los genes de respuesta inmune, que es la capacidad de un
organismo para responder a estímulos antigénicos específicos(Bakela &
Athanassakis,2017; Kimball, 1933).
A lo largo de la historia los loci de histocompatibilidad especialmente de ratones
y humanos han sido objeto de estudio durante los últimos 50 años aproximadamente, estos
revelan estructuras múltiples, complejas y altamente reguladas, responsables de todos los
mecanismos de defensa del sistema inmunológico(Bakela & Athanassakis,2017).
El complejo mayor de histocompatibilidad humana, se encuentra en la región
6p21.3, por lo menos con 3,4pb de ADN, contiene hasta 420 genes incluido el sistema
HLA y otros genes relacionados con el sistema inmune (Zúñiga, Yu, Barquera, Alosco,
Ohashi, Lebedeva, Yunis, 2013). se clasifica en dos tipos de genes, HLA clase I, en HLA
I clásicos (HLA-A, -B, -C), los clase I no clásicos (HLA-E, -F, -G, -H), y los clase II
(HLA-DR, -DQ, -DM) y -DP), que participan en la presentación de antígenos a células T
CD8 + , células asesinas naturales (células NK) y células T CD4 +, (Crux & Elahi, 2017)
24
Figura 2 “Diagrama simplificado de la posición y organización de los genes del antígeno leucocitario humano (HLA) en el cromosoma humano 6. HLA-clase I abarca los loci HLA-Ia "clásico" y HLA-Ib "no clásico", que se diferencian por azul y rosa. respectivamente. Los HLA-clase II están codificados por varios loci HLA-II marcados con rojo. A diferencia de HLA clase I y II, la región HLA clase III no codifica HLA. En su lugar, esta región densamente empaquetada codifica varias moléculas inflamatorias, complementarias y proteínas de choque térmico. Telómero, ter; p-brazo, brazo corto; brazo q, brazo largo; Centromere, cen” ( Tomado de Crux & Elahi, 2017)
2.3.1 estructura de la molécula de HLA
Las moléculas de HLA pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas,
participan en procesos de reconocimiento antigénico. Poseen una hendidura polimórfica
en la región extracelular para la unión del péptido antigénico, esta hendidura se forma por
el plegamiento de la molécula y está compuesta por hélices alfa pareadas que descansan
sobre una superficie de 8 cintas beta. Dentro y alrededor del sitio de unión al péptido se
encuentran los aminoácidos polimórficos de la molécula a los que se une el péptido
antigénico para ser presentados al TCR que reconoce el péptido junto con las hélices alfa
de la molécula de HLA. Esta variabilidad de aminoácidos en el sitio de unión al péptido
permite acomodar diferentes péptidos según su secuencia de aminoácidos, lo que genera
25
la especificidad del reconocimiento antigénico por parte de los linfocitos T. (Abbas,
Lichtman, & Pillai, 2015).
molécula HLA - I: es una glicoproteína de membrana compuesta por una cadena
pesada α y una cadena liviana , la β2 microglobulina (β2m), y un péptido antigénico. La
cadena pesada contiene una región citoplasmática, una transmembrana y una extracelular
con tres dominios α1, α2 y α3. Los dominios α1 y α2 forman el sitio de unión al péptido
donde pueden acomodar péptidos de entre 8 y 10 aminoácidos y el dominio α3, más
cercano a la membrana; está plegado en dominio inmunoglobulina. La cadena pesada α,
está unida de manera no covalente con una cadena liviana , la β2 microglobulina (β2m)
Figura 3. Estructura de HLA-I. Izquierda muestra el ensamblaje completo de la molécula y a la derecha se observa la vista superior de la hendidura de unión de péptidos. En esta molécula el sitio de unión al péptido está entre los dominios α1 y α2 de la cadena pesada y el dominio de inmunoglobulina se va a encontrar en la subunidad α3 y en la β2m. A este dominio se une el CD8+. Los péptidos que se presentan en la hendidura son producto de la degradación de proteínas por el proteosoma que genera péptidos pequeños para unirse a HLA, ser presentados y reconocidos por los linfocitos TCD8+ (Abbas, Lichtman, & Pillai, 2015) (Tomado de Celular and Molecular Immunology. Abbas, A., Lichtman, A., & Pillai, S., 2015)
26
2.4 La molécula de HLA - G y cáncer.
Las células tumorales han desarrollado diversas estrategias, como poder incluir
células reguladoras, lograr alterar la presentación del antígeno y la producción de
mediadores supresores inmunitarios, para que de manera exitosa pueda tener una evasión
inmunológica (Urosevic & Dummer,R., 2003)
El antígeno leucocitario humano- G (HLA-G), localizado dentro del complejo
mayor de histocompatibilidad (MHC) en el cromosoma 6p21.3. El HLA-G es un antígeno
HLA de clase I no clásico y se diferencia de las moléculas HLA I clásicas; por su
diversidad genética, estructura, expresión y función. Ya que mientras que HLA I clásica
es altamente polimórfica, HLA-G posee un polimorfismo limitado con 43 alelos que se
distribuyen dentro de los dominios globulares α1, α2 y α3.(Amiot, Ferrone,Grosse &
Seliger, 2010)
En condiciones fisiológicas la expresión constitutiva de HLA-G es altamente
restringida a tejidos fetales como células amnióticas, precursores de eritroides y
citotrofoblastos, adicionalmente a órganos con privilegios inmunitarios como; córnea,
timo, islotes pancreáticos, precursores de células endoteliales y eritroblastos. Además,
estudios han demostrado la expresión de HLA-G en diferentes enfermedades que
incluyen cánceres, trasplantes, esclerosis múltiple, enfermedades inflamatorias e
infecciones virales (Alegre, Rizzo,Bortolotti,Fernández, Fainardi &
González,2014)(Amiot, et all 2010)
27
2.4.1 Estructura de HLA-G
La estructura general de HLA-G tiene similaridad a otras moléculas de MHC de
clase I. Existen siete isoformas de HLA-G, puesto que el empalme alternativo del ARNm
y la unión no covalente a los dominios globulares (α1, α2, α3) diferencial con la β 2-
microglobulina ( β 2-m) forma cuatro isoformas unidas a membrana (HLA-G1, -G2, -G3
y -G4) y tres formas solubles secretadas (HLA-G5, -G6 y -G7), las cuales carecen de los
dominios transmembrana e intracelular del HLA-G unido a la membrana. Adicionalmente
HLA-G1 También puede ser liberado de la membrana por un clivaje proteolítico como
HLA-G1 soluble (sHLA-G1). (Alegre et all, 2014)(Amiot, et all 2010)
Figura 4. Diferentes isoformas de HLA-G generadas por el empalme alternativo del ARNm de HLA-G. (A) Siete isoformas HLA-G identificadas, que incluyen cuatro moléculas unidas a membrana (HLA-G1, -G2, -G3, -G4) y tres moléculas solubles (HLA-G5, -G6, -G7). Las estructuras extracelulares de HLA-G1 y HLA-G5 contienen dominios α1, α2 y α3; HLA-G2 y HLA-G6 contienen dominios α1 y α3; HLA-G3 contiene dominios α1; HLA-G4 contiene
28
dominios α1 y α2; HLA-G7 contiene un dominio α1 vinculado a dos aminoácidos codificados por el intrón 2.(Lin & Yan, 2018)
las moléculas de sHLA-G se detectaron en líquido amniótico y también se
reporta que las formas solubles parecen ser más frecuentemente expresadas bajo
condiciones patológicas que las isoformas de membrana, reportado en plasma de
pacientes con melanoma, ascitis de carcinoma de mama y ovario y esclerosis múltiple
(Sebti, Le Maux,Gros,De Guibert, Pangault, Rouas-Freiss,Bernard, Amiot, 2007)
2.4.2 Características funcionales inmunológicas de HLA-G
HLA-G posee un papel importante durante el embarazo, específicamente
relacionado en la regulación de la respuesta inmune, ya que las moléculas de HLA-G
muestran propiedades inmunotolerantes, que pueden contribuir al escape inmune de
células infectadas por virus (Sebti et al, 2007). Dentro de las propiedades
inmunomoduladoras que presentan las diferentes isoformas están; ser un inhibidor
citolítico natural e inhibidor citológico de células T, producir la inducción de la apoptosis
mediada por CD95 / CD95L en NK y células T8, la inhibición de la proliferación de
células T4 en respuesta a la estimulación alogénica. (Sebti et al, 2007)
Este efecto inhibitorio está mediado por la unión directa de HLA-G a receptores
inhibidores, como el receptor 2 del transcrito de tipo inmunoglobulina ILT -2 (CD85j),
expresada en las células linfoides y mielomonocíticas e ILT -4 (CD85d), expresado por
células dendríticas, macrofagos, y monocitos, además, el receptor tipo inmunoglobulina
KIR2DL4 / p49 (CD158d) se ha descrito como un receptor específico de HLA-G
29
expresado por todas las células NK, es así como HLA-G puede interactuar directamente
a través de estos receptores con células B, NK, T y las células presentadoras de antígeno
profesionales (APC), logrando ejercer sus funciones inmunotolerantes en diferentes
etapas de la respuesta inmune, es decir: diferenciación, proliferación, citolisis, citoquina
y secreción.(Carosella et all ,2003).
Figura 5: Estas son algunas de las actividades inmunoreguladoras mediadas por HLA-G , algunas células diana y los receptores involucrados(Tomado de Pistoia,, Morandi, Wang, & Ferrone, 2007)
Estas funciones anteriormente descritas son compartidas por las diferentes
isoformas de membrana y solubles, pero cabe incluir que la isoforma soluble HLA-G5
puede ejercer efecto inhibitorios a través de un mecanismo de retroalimentación, ya que
inhibe la respuesta proliferativa de las células T CD4 + alorreactivas que lo secretan,
30
mientras que las proteínas HLA-G unidas a la membrana pueden actuar localmente donde
se expresan, el HLA-G5 soluble puede ejercer funciones en el entorno cercano de su sitio
de origen y en sitios distantes debido a la distribución a través del sistema de circulación
(Lila N, Rouas-Freiss N, Dausset J, Carpentier A, Carosella ED,2001)(Rouas-Freiss,
Moreau, Ferrone & Carosella, 2005)
La expresión de HLA-G es asociado con la transformación maligna porque
nunca se ha detectado HLA-G en los tejidos normales adyacentes. El cual fue estudiado
mediante el análisis de biopsias de piel sana, tumor cutáneo primario, metástasis en
ganglios linfáticos y un sitio de regresión tumoral dentro del tumor primario de piel, todo
obtenido de un paciente con melanoma, aquí HLA-G se expresó en gran cantidad en el
sitio del tumor primario como en el metastásico, pero no fue detectado en piel sana (Paul,
Cabestre, Le Gal et al, 1999). Seguidamente se estudió la expresión de la molécula en
diferentes tumores como pulmón, próstata, vejiga, ovario, mama entre otros, donde se
demuestra que en la mayoría de los casos, el HLA-G se expresa mediante células
tumorales y no por los tejidos sanos circundantes (Amiot, et all 2010)
2.4.3 Características funcionales de HLA-G soluble
Existen siete isoformas de HLA-G generadas por el empalme alternativo de la
transcripción primaria de HLA-G, cuatro de ellos HLA-G1, G2, G3, G4 están unidos a la
membrana, en cambio HLA-G5, G6 y G7 son solubles, estas tres últimas son contraparte
con HLA-G1, G2 y G3 respectivamente. HLA-G1 es la única isoforma derivada de la
traducción total de HLA-G. La estructura de las isoformas solubles se parece a las
31
isoformas de membrana en la parte extracelular, pero su diferencia está en el extremo C-
terminal. Tanto las isoformas solubles como las de membrana poseen un dominio
extracelular y una cola intracitoplásmica presente en las isoformas unidas a la membrana,
mientras que las isoformas solubles poseen una cola corta hidrofílica (Paul, Cabestre,
Ibrahim et al, 2000 )
Esta características de diferenciación son importantes para lograr distinguir entre
las isoformas solubles propiamente HLA-G5 de las que son desprendidas
o proteolíticamente escindidas HLA-G1, las cuales comparten actividades
inmunosupresoras mediadas por la unión a receptores, que tienen una distribución celular
diferencial, como, CD85j (ILT-2) se expresa por células B, NK y T, CD160 (BY55) se
expresa por células endoteliales, NK y T, CD85d (ILT-4) se expresa solo por Macrófagos
y CD158d (KIR2DL4) solo por células NK (Pistoia, 2007).
cabe incluir la diferencia de la actividad inmunoinhibidora del HLA-G unido a
la membrana la cual requiere una interacción directa entre las células inmunocompetentes
y las células con HLA-G en su superficie. Encambio, los antígenos sHLA-G pueden
ejercer su efecto de forma independiente en el sitio de su producción, incluso en lugares
distantes (Poláková, Železníková & Russ, 2013)
Dentro de las propiedades funcionales inmunosupresoras adicionales a las que
presentan todas las isoformas de HLA-G, se incluye que sHLA-G1 inhibe la actividad
citotóxica del antígeno HLA de clase I, CTL específico para antígeno (Rouas-Freiss,
Khalil-Daher, Riteau et al, 1999), sHLA-G5 también inhibe la aloproliferación de células
T CD4 y CD8 mediante el bloqueo Progresión del ciclo celular. Sin embargo, sHLA-G5
no induce apoptosis de células T alorreactivas (Bahri, Hirsch, Josse et al, 2006
)(Pistoia,et al,2007)
32
La expresión de las isoformas de HLA- G solubles siempre han sido estudiada
plasma, demostrando que la molécula es expresada en sueros de pacientes afectados por
una variedad de trastornos, principalmente en trasplantes, trastornos del sistema inmune
y enfermedades tumorales como el cáncer de mama y ovario, melanoma,
próstata(Pistoia,et al,2007). Logrando postular esta molécula como una candidata para la
realizar diagnóstico pronóstico de enfermedades a través de pruebas en sangre.
2.4.4. HLA-G como biomarcador de diagnóstico
Un biomarcador se define como cualquier medición que refleje una interacción
entre un sistema biológico y un peligro potencial, que puede ser químico, físico o
biológico. La respuesta medida puede ser funcional y fisiológica, bioquímica a nivel
celular o una interacción molecular. (OMS, 2003) y este biomarcador puede detectar su
funcionalidad en sangre y otros tejidos (Smith, M et al, ,2010)
Existe una amplia variedad de sustancias que pueden ser clasificadas como
biomarcador, incluyendo antígenos asociados a tumores, enzimas, proteínas específicas
y metabolitos (Suárez, 2003)
Es bien sabido que la expresión de HLA-G se encuentra involucrada en el
desarrollo del cáncer, puesto que diferentes estudios revelaron que HLA-G y sHLA-G
tienen múltiples mecanismos de participación en el desarrollo de tumores malignos , ya
que se ha demostrado que HLA-G está involucrado activamente en el mecanismo de
escape de las células tumorales (Carosella ED et al,2015), la inmunoedición del cáncer,
un proceso en el cual está divido en tres pasos esenciales; la fase de eliminación, la fase
de equilibrio y la fase de escape donde HLA-G participa de manera activa y siendo este
un importante proceso en la protección del huésped.(Amiot et al, 2010) (Zhang, Y et all,
2018)
33
Funciones de HLA-G donde al unirse a sus receptores especiales en las células
efectoras inmunes, bloquean la proliferación y la función lítica de las células NK y
periféricas en un contexto fisiológico, este mismo mecanismo lo usa sHLA-G liberada
por por las células cancerosas ya que puede unirse a los receptores en las células NK y
las células T, llevandolas a la apoptosis de las células inmunitarias. adicionalmente HLA-
G puede incrementarse con numerosas citoquinas proinflamatorias del microentorno del
tumor, incluido el interferón (IFN) -β y el IFN-γ, que mejoran la protección de las células
tumorales de Citólisis mediada por células NK (Moreau et al,2003)(Zhang, Y et all,
2018)
Además en estudios de cáncer de ovario, melanoma, próstata y otros determinó
que HLA-G puede estar involucrado en etapas de invasión y metástasis de la progresión
del tumor.(Zhang, Y et all, 2018)
Lo que lleva a ver la relación tan íntima entre la expresión de HLA-G y la
progresión tumoral de diferentes tipos de cáncer demuestra que HLA-G puede ser
propuesto como un biomarcador de diagnóstico para el cáncer gástrico
3. METODOLOGÍA
3.1 Diseño del estudio
El presente trabajo forma parte de un proyecto del Instituto Nacional de
Cancerología titulado “Utilidad clínica de la molécula HLA-G soluble en el diagnóstico
y pronóstico del Cáncer Gástrico”. Es un estudio de casos y controles de prueba
diagnóstica que tiene por objeto la cuantificación de los niveles de sHLA-G en el plasma
34
de pacientes con cáncer gástrico y pacientes con patología gástrica benigna, para
determinar la utilidad clínica de esta molécula en el diagnóstico del cáncer gástrico.
3.2 Población de estudio.
La población del estudio se dividió en dos grupos:
1. Casos: pacientes con diagnóstico primario de cáncer gástrico.
2. Controles: pacientes con diagnóstico de enfermedad gástrica benigna
confirmada por endoscopia-biopsia no mayor a 1 año, sin antecedentes de cáncer.
A todos los pacientes se les tomó una muestra de sangre periférica previa firma del
consentimiento informado.
3.3 Muestras de estudio:
Para la cuantificación de sHLA-G se utilizaron muestras de plasma recolectadas
en el marco del proyecto “Utilidad clínica de la molécula HLA-G soluble en el
diagnóstico y pronóstico del Cáncer Gástrico” que se encuentra en fase de ejecución. Las
muestras seleccionadas fueron recolectadas desde noviembre de 2018 hasta marzo de
2019 en la consulta de gastroenterología del Instituto Nacional de Cancerología. Previa
firma del consentimiento informado, se tomaron 6 ml de sangre periférica en tubos con
el anticoagulante EDTA (Ethylene-Diamine-Tetra-Acetic-acid). Las muestras fueron
transportadas al laboratorio de procesamiento de muestras del Grupo de Investigación en
Biología del Cáncer, en un periodo no mayor a dos horas para la separación del plasma.
35
3.3.1 Procesamiento de las muestras:
• Una vez tomada la muestra, inmediatamente se invierte el tubo 8-
10 veces para prevenir la formación de coágulos de fibrina.
• Las muestras se centrifugan a 1500 RPM durante 10 minutos.
• Durante el tiempo de la centrifugación se marcan crioviales de
1.5ml con las iniciales del paciente, el número de inclusión en el estudio seguido
del número 1 para los casos y el número 2 para los controles, y finalmente la fecha
de recolección de la muestra siguiendo la guía de buenas prácticas clínicas, es
decir, las dos cifras del día, las tres primeras letras del mes y el año completo.
• Una vez finalizada la centrifugación, cuidadosamente se retira el
plasma con una pipeta pasteur, y se pasa a los crioviales de 1.5ml previamente
marcados en alícuotas de 500μl. Se debe evitar tomar células de la superficie del
pellet celular.
• Las alícuotas de plasma se almacenaron a -80°C en un
ultracongelador, hasta su uso en la prueba ELISA.
3. 4 Cuantificación de los niveles plasmáticos de de sHLA-G
Los niveles plasmáticos de sHLA-G (sHLA-G1 y HLA-G5), fueron
cuantificados en el plasma de 68 pacientes con cáncer gástrico y 46 pacientes con
patología gástrica benigna mediante una ELISA tipo sándwich, usando el KIT de
(Elabscience-Biotechnology-Human MHC-G/HLA-G(Major histocompatibility complex
G class I). El ensayo se realizó sobre una placa de 96 pozos, que contiene el anticuerpo
de captura, específico para sHLA-G Humano, siguiendo las instrucciones del fabricante.
Brevemente, se prepararon los reactivos según la indicación del Kit, y se procedió a
36
realizar el ensayo. En las dos primeras columnas de la placa se adicionaron 100μl del
estándar y sus diluciones por duplicado. En los demás pozos se agregaron, también por
duplicado, 100μl de plasma. la placa se cubrió con un sellador y se incubó por 90 min a
37°C. Una vez finalizada la incubación, se desechó el líquido de cada pozo y se
adicionaron 100μl del anticuerpo de detección biotinilado a cada pozo. Nuevamente se
cubrió con el sellador, se mezcló suavemente y se incubó por 1 hora a 37°C. Se retiró la
solución del anticuerpo biotinilado y se realizaron tres lavados con 350μl de buffer de
lavado durante 1 o 2 min. Después de cada lavado se desechó el buffer y se secó la placa
mediante golpes secos sobre papel absorbente. Posteriormente, se adicionaron 100μl de
la solución de trabajo del conjugado de peroxidasa (HRP) a cada pozo y se cubrió
nuevamente con el sellante y se incubó por 30 min a 37°C, tras lo cual se realizaron 5
lavados como se describió previamente. Se añadieron 90μl del reactivo del sustrato a cada
pozo, se cubrió de un nuevo con el sellador y se incubó por 15 min a 37° C en oscuridad.
Posteriormente se adicionaron 50μl de solución de parado a cada pozo en el mismo orden
en que se adicionaron las muestras y posteriormente se realizó la lectura de la absorbancia
a 450 nm en un lector de ELISA y se determinó la densidad óptica en cada pozo.
3.5 Análisis estadísticos de lo resultados
La lectura de las densidades ópticas se realizó en el lector de microplacas Multi
skant de Thermo Scientific y las conversiones de las lecturas fueron realizadas con el
SkanIt Software 5.0. La curva estándar para el ensayo ELISA se construyó mediante la
realización de diluciones seriadas del estándar de HLA-G suministrado con el Kit, cuya
concentración es de 40 ng/ml de sHLA-G y el punto de corte se calculó promediando las
lecturas de los duplicados de cada estándar y de las muestras, para restar la media de la
densidad óptica del estándar cero. Posteriormente se trazó una curva logística de cuatro
37
parámetros en log-log, donde los valores de la concentración estándar se ubicaron en el
eje X y los de la densidad óptica en el eje Y.
El análisis estadístico de los datos se realizó utilizando un paquete estadístico de
Excel (Xlstat), usando diagramas de box-plot, para determinar si se obtuvieron datos
atípicos entre los grupos de estudio y conocer la distribución de los valores mínimos y
máximos obtenidos. Se utilizó la curva ROC (receiver operating characteristic curve o
característica operativa del receptor) para determinar la exactitud de la ELISA específica
para sHLA-G en el diagnóstico del cáncer gástrico. Esta curva es una representación
gráfica de la sensibilidad frente a la especificidad para un sistema clasificador binario
(Cáncer gástrico/patología gástrica benigna) según se varía el umbral de discriminación.
Se utilizó con el propósito de determinar el punto de corte con la más alta sensibilidad y
especificidad y evaluar la capacidad discriminativa de la ELISA para diferenciar sujetos
sanos versus enfermos.
Por otra parte, se estimó el área bajo la curva (AUC) ROC para determinar la
capacidad de esta ELISA para distinguir entre un paciente con cáncer gástrico y uno con
patología gástrica benigna y así evaluar el valor diagnóstico que posee sHLA-G. Un valor
de p <0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
38
RESULTADOS
Las concentraciones de HLA-G soluble presentes en el plasma de pacientes con
cáncer gástrico (casos) y patología gástrica benigna (controles), se determinaron mediante
la realización de la prueba ELISA. Los datos obtenidos fueron los siguientes: El rango de
detección de sHLA-G para los pacientes con cáncer gástrico fue de 2,159ng/ml a 74,80
ng/ml, con una mediana de 20,167 ng/ml, mientras que para el grupo control fue de 2,53
ng/ml a 26,30 ng/ml con una mediana de 9,644 ng/ml. La Tabla 1.muestra los niveles
plasmáticos obtenidos en los dos grupos de estudio, cuya diferencia fue estadísticamente
significativa
Tabla 1. Niveles plasmáticos de sHLA-G hallados en cada uno de los grupos de estudio
sHLA-G ng/ml
Enfermedades gástricas benignas
(n= 46)
Cáncer gástrico
(n=68)
Media IQR 9,644 (9,245-10,042)
Rango 2,53 - 26,30
Media IQR 20,167 (18,47-21,864)
Rango 2,159 - 74,80
Con el fin de corroborar los datos y examinarlos de manera visual, se realizó un
diagrama de cajas-bigotes a partir del cual podemos observar que la concentración de
sHLA-G es significativamente mayor en los pacientes con cáncer gástrico que en aquellos
que tenían una patología gástrica benigna.
39
Figura 6. Diagrama de caja y bigotes (boxplots) de los niveles de expresión de sHLA-G para los dos grupos grupos del estudio. En el grupo de cáncer gástrico la concentración sHLA-G fue significativamente más alta que en el grupo control (p<0,001)
Se construyó una curva ROC con el fin de determinar si los valores de sHLA-G
en plasma permiten diferenciar entre los pacientes con cáncer gástrico y aquellos con una
patología gástrica benigna, a partir de los valores de sHLA-G. Para ello se estableció un
punto de corte que permitió considerar positivos los valores que se encontraban por
encima de él, y negativos los valores que se encontraban por debajo. Al contrastar los
resultados obtenidos de la ELISA para sHLA-G, con la prueba de oro para el diagnóstico
del cáncer gástrico (Biopsia por endoscopia), surgieron cuatro posibles alternativas
diagnósticas:
1. Pacientes que tienen cáncer gástrico según la prueba de oro cuyos
valores de sHLA-G plasmático los clasifica como positivos. Estos pacientes
corresponden a los verdaderos positivos (VP).
40
2. Pacientes que tienen cáncer gástrico según la prueba de oro, pero
sus valores de sHLA-G plasmático los clasifica como negativos. Estos pacientes
corresponden a los falsos negativos (FN).
3. Pacientes que no tienen cáncer gástrico según la prueba de oro,
cuyos valores de sHLA-G plasmático los clasifica como negativos. Estos
pacientes corresponden a los verdaderos negativos (VN).
4. Pacientes que no tienen cáncer gástrico según la prueba de oro, pero
sus valores de sHLA-G plasmático los clasifica como positivos. Estos pacientes
corresponden a los falsos positivos (FP).
Figura 7. Diagrama del porcentaje de las cuatro posibles alternativas diagnósticas obtenidas con la prueba ELISA para sHLA-G
La figura 7 muestra el diagrama de las cuatro posibles alternativas diagnósticas
que se obtuvieron al contrastar los resultados obtenidos con la prueba ELISA para sHLA-
G, y los obtenidos con la Biopsia por endoscopia. Y evidencia el punto de corte que se
41
obtuvo, el cual fue el mas optimo debido a que representa los porcentajes de verdaderos
positivos, verdaderos negativos, falsos negativos y falsos positivos es del 29%.
Teniendo en cuenta el número de pacientes con cáncer gástrico y con patología
gástrica benigna, se calculó la sensibilidad y especificidad para el punto de corte teniendo
en cuenta las siguientes fórmulas: sensibilidad=VP/(VP+FN) y
especificidad=VN/(FP+VN). (Tabla 2). La sensibilidad de la prueba fue del 63,2% y la
especificidad fue del 82,6%.
La curva ROC ilustra la sensibilidad y especificidad de cada uno de los posibles
puntos de corte de la prueba ELISA como test diagnóstico para el cáncer gástrico (Figura
7). Para evaluar la exactitud diagnóstica de esta prueba, en este estudio se realizó un
diseño transversal en el cual cada paciente fue evaluado mediante la prueba ELISA para
sHLA-G y la biopsia por endoscopia, ya que los pacientes del estudio debían tener
diagnóstico de cáncer gástrico (casos) o patología gástrica benigna (Controles) por
biopsia. Con los resultados obtenidos de la ELISA para sHLA-G, los pacientes se
clasificaron en VP, VN, FP y FN, y se calculó la sensibilidad y especificidad para cada
concentración de la molécula. Con base en estos cálculos se construyó la curva ROC y se
identificó el punto de corte que determina la sensibilidad y especificidad más alta de
sHLA-G plasmática. Dado que en este estudio se busca disponer de una prueba altamente
sensible (para el tamizaje), o altamente específica (para el diagnóstico) del cáncer
gástrico, se tomó el punto de corte que determinó la sensibilidad o especificidad más alta
para el diagnóstico de cáncer gástrico, cuyo valor fue de 16,12 ng/ml.
42
Tabla 2: categorías diagnósticas obtenidas a partir de la cuantificación de sHLA-G.
Prueba de oro positiva Prueba de oro negativa
ELISA positiva Verdaderos positivos (VP) Falsos positivos (FP)
ELISA negativa Falsos negativos (FN) Verdaderos negativos (VN)
Sensibilidad = VP/(VP+FN). Especificidad = VN/(FP+VN)
El valor del AUC fue de 77,9 con un intervalo de confianza del 95 % (IC
95%)(figura 8), y el valor predictivo positivo es de 84.3% y el valor predictivo negativo
del 60.3%. La tabla 3 muestra los valores de las variables con los cuales se puede
determinar la utilidad clínica de la medición de los niveles de expresión de sHLA-G para
el diagnóstico del cáncer gástrico.
Figura 8. Análisis de la curva de características operativas del receptor (ROC) que evalúan el rendimiento del antígeno G de leucocitos humanos solubles (sHLA-G) en el diagnóstico de Cáncer Gástrico
43
Tabla 3. Variables para determinar la utilidad de la medición de los niveles de expresión sHLA-G en el diagnóstico del cáncer gástrico.
Variable sHLA-G
Punto de corte
AUC
CI%
sensibilidad %
especificidad %
VPP/VPN
16,12
77,9
95
63,20
82,60
84,3/60,3
5. DISCUSIÓN
En Colombia, el cáncer gástrico es la primera causa de muerte por cáncer en
hombres y mujeres (IARC, 2018), debido en parte a la falta de un diagnóstico oportuno,
que permita disminuir las cifras de mortalidad por este tipo de cáncer ya que al realizar
un tratamiento oportuno, mejorarían las tasas de supervivencia. Sin embargo, debido a
que en sus inicios, esta enfermedad es asintomática y cuando aparecen los primeros
síntomas éstos son similares a los ocasionados por patologías gástricas benignas, en
muchos casos son tratados con medicamentos como el omeprazol o la ranitidina (OMS,
2004) que alivian los síntomas, demorando el diagnóstico hasta que el tumor se encuentra
en estadios avanzados cuando las opciones de tratamiento disminuyen y la tasa
supervivencia a cinco años se reduce a menos del 5% (Zheyu et al, 2017). Lo anterior
resalta la importancia de encontrar una estrategia para realizar un diagnóstico oportuno
del cáncer gástrico mediante la implementación de una prueba de tamizaje que permita
diferenciar este tipo de cáncer de las patologías gástricas benignas tan comunes en nuestra
sociedad.
44
Como se mencionó anteriormente, las células tumorales desarrollan mecanismos
para evadir la respuesta inmune y muchos de estos mecanismos de evasión están
mediados por la expresión aberrante de las moléculas de HLA, fundamentales para el
desarrollo de la respuesta inmune adaptativa. HLA-G, es una molécula del complejo
mayor de histocompatibilidad no clásica que a diferencia de las clásicas, tiene función
supresora y juega un papel fundamental en la regulación de la inmunidad y en el escape
de las células tumorales a la respuesta inmune antitumoral del huésped (Rouas-Freiss &
Moreau et al ,2005; Amiot et al., 2011). En pacientes con cáncer se han encontrado
niveles elevados de sHLA-G en comparación con individuos sanos. Esto se debe a que el
tumor es capaz de liberar sHLA-G directamente, o inducir su secreción por otras
poblaciones celulares como monocitos y células dendríticas. Esta sobreexpresión genera
una inmunosupresión sistémica debido a que todas las células inmunes poseen receptores
para esta molécula, que inhiben su función efectora, permitiendo el desarrollo y la
diseminación del tumor (Morandi et al, 2014) por lo cual, cuando se expresa de manera
aberrante en el suero de pacientes con cáncer, se asocia con la transformación maligna
(Amodi et al, 2004).
La relevancia clínica de sHLA-G en diferentes neoplasias malignas ha sido
reportada en numerosos estudios (Pistoia et al,2007; Carosella ED et al,2015) y su
expresión en diferentes modelos de cáncer ha postulado a esta molécula como un
biomarcador de diagnóstico, tal como lo reportado por Cao et al, 2011, Singer et al, 2003,
y Pan et al ,2016., cuyos estudios evidencian el incremento de su expresión en aquellos
pacientes con diagnóstico de cáncer y demuestran que sHLA-G posee la sensibilidad y
especificidad en el diagnóstico de Cáncer Gástrico (Cao et all, 2011; Pan et al ,2016).
Teniendo en cuenta que una prueba para el tamizaje de enfermedades malignas
debe cumplir con ciertas características que permitan su fácil implementación en la
45
población, y dado que las moléculas de sHLA-G presentes en el plasma y otros fluidos
corporales pueden ser fácilmente detectables por medio de una prueba ELISA, en este
estudio se propuso la detección de los niveles de expresión de sHLA-G en el plasma como
un potencial biomarcador de que brinde información de diagnóstico del cáncer gástrico y
se encontró que el rango de detección de sHLA-G para los pacientes con cáncer gástrico
fue de 2,16 ng/ml a 74,80 ng/ml, con una mediana de 20,167 ng/ml, mientras que para el
grupo control fue de 2,53 ng/ml a 26,30 ng/ml con una mediana de 9,644 ng/ml. La
concentración de sHLA-G fue significativamente más alta en los pacientes con cáncer
gástrico que en aquellos que tienen diagnóstico de enfermedad gástrica benigna (p<
0,001), lo que indica que los niveles de expresión de sHLA-G podrían proponerse como
un biomarcador para el cáncer gástrico.
Al analizar los resultados arrojados por la curva ROC se determinó la exactitud
de la ELISA específica para sHLA-G en el diagnóstico del cáncer gástrico. En el actual
estudio se determinó que el punto de corte de 16,12 ng/ml nos arroja un AUC de 77,9 con
un intervalo de confianza del 95 % (IC 95%), lo que indica que la medición de la
concentración de sHLA-G mediante una prueba ELISA efectivamente permite
discriminar de manera aceptable entre pacientes con cáncer gástrico y patología gástrica
benigna. Estudios previos reportan valores de AUC similares a los encontrados en este
estudio: Pan et al en 2016 midieron el nivel plasmático de sHLA-G en 81 pacientes con
cáncer gástrico, 53 con enfermedad gástrica benigna y 77 controles sanos mediante
ELISA y reportaron un valor de AUC del 73%; Cao et al, en 2011 midieron los niveles
plasmáticos de sHLA-G en varios tipos de cáncer, incluidos 28 casos de cáncer gástrico,
y controles sanos, para determinar si pueden ser usados como un potencial biomarcador
para el diagnóstico del cáncer, reportando un valor de AUC del 91% y Du et al. en 2011
para determinar el potencial de sHLA-G para el diagnóstico de cáncer gástrico, midieron
46
los niveles de la molécula en 58 pacientes con cáncer gástrico y 64 controles, reportaron
un AUC del 83% y concluyeron que el nivel plasmático de sHLA-G podría ser un
biomarcador altamente específico y sensible para el diagnóstico del cáncer gástrico (Du
L et al, 2011).
Al contrastar los resultados obtenidos de la ELISA para sHLA-G, con la prueba
de oro para el diagnóstico del cáncer gástrico (Biopsia por endoscopia), se determinaron
cuatro posibles alternativas diagnósticas: verdaderos positivos (VP), falsos positivos
(FP), verdaderos negativos (VN) y falsos negativos (FN). También se evidenció que el
mayor porcentaje de los datos se ubica dentro de los verdaderos positivos y verdaderos
negativos (71%), mientras que el menor porcentaje se ubica dentro de los falsos negativos
y falsos positivos (29%), lo cual confirma la posible utilidad de sHLA-G como un
biomarcador de diagnóstico, en concordancia con lo observado en los estudios previos.
Utilizando las fórmulas para determinar la sensibilidad y especificidad se
determinó que en el presente estudio la sensibilidad de la prueba utilizada fue del 63,2%
y la especificidad fue del 82,6%. Estos valores son cercanos a los reportados por Pan et
al, en 2016 quienes, para determinar el valor diagnóstico potencial de sHLA-G, midieron
el nivel plasmático de sHLA-G junto con otros marcadores tumorales séricos (alfa
fetoproteína (AFP), antígeno carcinoembrionario (CEA), antígeno de cáncer 125
(CA125), antígeno de cáncer 19-9 (CA19-9) y antígeno de cáncer 72-4 (CA72-4), y
encontraron para sHAL-G una especificidad del 86,9% y una sensibilidad del 56,8%.
Ellos consideraron que esta especificidad era muy baja y podría aumentar la
cantidad de falsos positivos y disminuir la confiabilidad de la prueba para la confirmación
de la enfermedad, por lo cual decidieron analizar la expresión de sHLA-G en combinación
con los otros marcadores para el diagnóstico del cáncer gástrico y encontraron que al
combinarlos incrementa radicalmente su especificidad (96.2%) mejorando su utilidad
47
como biomarcador de diagnóstico para el Cáncer Gástrico (Pan et al, 2016). Al hablar de
especificidad y sensibilidad en pruebas de diagnóstico se habla de su capacidad
discriminativa y se refiere a la habilidad para distinguir pacientes sanos de enfermos. Esta
discriminación se confirma tras encontrar el AUC más alejada del 50% , Está a su vez
aumenta la especificidad, y los falsos positivos disminuyen. Cabe aclarar que una alta
sensibilidad determina el tamizaje de enfermedades y una alta especificidad la
confirmación de la enfermedad (Cerda & Cifuentes, 2012). Según lo postulado por estos
autores se determina que la prueba actual se postula como una prueba de tamizaje
Es así que con los resultados de sensibilidad y especificidad de la prueba ELISA
para sHLA-G puede determinar su utilidad clínica. Sin embargo, en la práctica clínica el
médico solicita un examen a un paciente, sin conocer su diagnóstico por lo cual ante un
resultado positivo o negativo de la prueba debe plantearse cuál es la probabilidad de que
el paciente esté realmente enfermo o sano, es por ello que el valor predictivo positivo, es
decir la probabilidad de tener cáncer gástrico cuando el resultado de la prueba ELISA
para sHLA-G es positivo, se estima a partir de la proporción de pacientes sHLA-G
positivos en la ELISA que tienen cáncer gástrico, y el valor predictivo negativo es decir
la probabilidad de que un paciente negativo para la sHLA-G no tenga cáncer gástrico, se
estima a partir de la proporción de pacientes sHLA-G negativos en la ELISA que tienen
una patología gástrica benigna.
En este estudio, el valor predictivo positivo es de 84.3% y el valor predictivo
negativo del 60.3%. Esto significa que en el 84.3% de los pacientes con ELISA positiva
para sHLA-G se confirmó la presencia de cáncer gástrico, mientras que de los pacientes
con ELISA negativa para sHLA-G un 60.3% tenían una patología gástrica benigna.
48
Tras los datos publicados por Farjadian et al, 2018 donde presentan a sHLA-G
como un biomarcador para el diagnóstico del cáncer gástrico. Donde realizaron una
prueba que al ser correlacionada la expresión de la molécula con el estadio del tumor,
demostraron que al aumentar significativamente la expresión de sHLA-G en pacientes
con tumor en estadio I, se debía a la sobreexpresión de HLA-G y al desprendimiento de
aquellas células tumorales que en etapa temprana inducen a la supresión inmune, lo que
a su vez facilita la progresión del tumor (Farjadian et al,2018). Dato a tener en cuenta
siendo una de las razones por las cuales sería efectiva esta prueba de tamizaje y aportaría
de manera significativa al diagnóstico oportuno ya que gracias a esa sobreexpresión en
estadio inicial se lograría implementar terapias oportunas y asimismo aumentar la
probabilidad de supervivencia para aquellos pacientes con cáncer gástrico
Cabe aclarar que, aunque se encontró que los niveles de sHLA-G son más altos
en pacientes con cáncer que en pacientes con enfermedad benigna, definiendo que la
concentración de sHLA-G en el plasma podría ser usada como biomarcador para el
diagnóstico oportuno del cáncer gástrico siendo implementada como prueba de tamizaje,
pero es necesario explorar más a fondo antes de ser aplicado como prueba final es
importante analizar un gran número de muestras debido que el actual estudio contó con
un bajo número de datos y puede ser significativamente pobre, otros estudios han
confirmado que es necesario sustentar su utilidad en cojunto de otras moléculas que
incrementan la especificidad e incluir parámetros asociados al ambiente del tumor para
lograr establecer a la molécula como un biomarcador de diagnóstico.
49
CONCLUSIONES
El ensayo realizado para este estudio fue ELISA el cual es una técnica
bioquímica que permite cuantificar o identificar determinado antígeno que se desee
estudiar, para este caso se usó tipo sandwich siendo muy específico en el reconocimiento
del antígeno ya que hay dos anticuerpos que lo capturan y una enzima que activa la señal
de unión, al ser un ensayo tan altamente específico y genera un menor costo es usado muy
ampliamente en el diagnóstico clínico. Se logró cuantificar los niveles de expresión de
HLA-G soluble (sHLA-G1 y HLA-G5) en plasma de pacientes con cáncer gástrico y
pacientes con patologías gástricas benignas
Se demostró que sHLA-G es mayormente expresado en aquellos pacientes que
tienen cáncer gástrico, debido a que es una molécula asociada a la proliferación y
crecimiento del tumor en diferentes tipos de cáncer para el cáncer gástrico no fue la
excepción.
Tras evaluar los niveles de expresión de la molécula en plasma y confirmar la
sensibilidad y especificidad del test sHLA-G puede utilizarse como un biomarcador de
diagnóstico para cáncer gástrico, siendo usado como prueba de tamizaje.
Es importante realizar análisis exhaustivos para determinar su utilidad clínica ya
que la heterogeneidad de los tumores puede desencadenar diferentes rutas de escape
usando otras biomoléculas y que además al lograr establecer la utilidad de sHLA-G en
conjunto de algunos de los biomarcadores asociados al escape inmune se puede ampliar
la especificidad de la prueba.
50
REFERENCIAS
Abbas, A., Lichtman, A., & Pillai, S. (2015). Cellular and Molecular Immunology. Philadelphia:
Saunders Elsevier Inc.
Alegre, E., Rizzo, R., Bortolotti, D., Fernandez-Landázuri, S., Fainardi, E., & González, A.
(2014). Some basic aspects of HLA-G biology. Journal of immunology research, 2014,
657625.
Alberts, S., Cervantes, A., & Velde, v. d. (2003). Gastric cancer: epidemiology, pathology and
treatment. Ann Oncol, ii31-ii36.
Amiot, L., Ferrone, S., Grosse-Wilde, H., & Seliger, B. (2010). Biology of HLA-G in cancer: a
candidate molecule for therapeutic intervention?. Cellular and molecular life sciences :
CMLS, 68(3), 417–431.
Amodio G, A.R. de Sales, S. Gregori, (2014). New insights into HLA-G mediated tolerance,
Tissue Antigens 84 (3) 255–263.
Areia M, Carvalho R, Cadime AT, Rocha Goncalves F, Dinis-Ribeiro M .(2013) Screening for
gastric cancer and surveillance of premalignant lesions: a systematic review of cost-
effectiveness studies. Helicobacter ;18:325–37
Bahri R, Hirsch F, Josse A, Rouas-Freiss N, Bidere N, Vasquez A, et al. (2006) Soluble HLA-G
inhibits cell cycle progression in human alloreactive T lymphocytes. J
Immunol.;176:1331–9.
Bakela, K., & Athanassakis, I. (2017). Soluble major histocompatibility complex molecules in
immune regulation: highlighting class II antigens. Immunology, 153(3), 315–324
51
Bank Y, Chung H, Xu J, et al. (2009) Pathological features of advanced gastric cancer(GC):
relationship to human eidermal growth factor receptor 2 (HER2) positivity in the global
screening programme of the ToGA Trial. ASCO Anual Meeting procedings; p. 4556.
Boixeda D, G. J. (1996). Prevalencia de la infección por Helicobacter pylori en el
adenocarcinoma gástrico y en la gastritis crónica. Rev Esp Enf Dig, 88:403-8
Bunet, FM,(1967). Inmunological aspects of malignant disease. Lancet 1 (7501),1171-1174
Carosella ED, Moreau P, Le Maoult J, Le Discorde M, Dausset J, Rouas-Freiss N. ( 2003)HLA-
G molecules: from maternal-fetal tolerance to tissue acceptance. Adv Immunol; 81: 199–
252
Carosella, E., Favier, B., Rouas-Freiss, N., Moreau, P., & LeMaoult, J. (2008). Beyond the
increasing complexity of the immunomodulatory HLA-G molecule. Blood,
111(10):4862-70.
Carosella ED, Rouas-Freiss N, Tronik-Le Roux D, Moreau P, LeMaoult J. (2015)HLA-G: An
immune checkpoint molecule. Adv Immunol;127:33–1444.
Cao, M., Yie, S., Liu, J., Ye, S., Xia, D., & Gao, E. (2011). Plasma soluble HLA-G is a potential
biomarker for diagnosis of colorectal, gastric, esophageal and lung cancer. Tissue
Antigens , 78(2):120-8.
Calpena, R., Lacuela, F., Oliver, I., Cansado, P., Pérez, F., Costa, D., & al, e. (2003). stado actual
del tratamiento multidisciplinario del cáncer gástrico avanzado. Cir Esp, 74(2):69-76
Cerda, Jaime, & Cifuentes, Lorena. (2012). Uso de curvas ROC en investigación clínica:
Aspectos teórico-prácticos. Revista chilena de infectología, 29(2), 138-141
Clements, C., Kjer-Nielsen, L., McCluskey, J., & Rossjohn, J. (2007). Structural studies on HLA-
G: implications for ligand and receptor binding. Hum Immunol, 68: 220–6.
52
Chudasama D, Katopodis P, Stone N, Haskell J, Sheridan H, Gardner B, Urnovitz H, Schuetz E,
Beck J, Hall M, Barr J, Sisu C , arroz, Polychronis A, Anikin V, Karteris E. (2019) Liquid
Biopsies in Lung Cancer: Four Emerging Technologies and Potential Clinical
Applications. Cancers (Basel). Mar 7;11(3)
Correa, P. (2011). Cáncer gástrico: una enfermedad infecciosa. Revista Colombiana de Cirugía,
111-117.
Contini P, Ghio M, Poggi A, Filaci G, Indiveri F, Ferrone S, Puppo F (2003 ) Eur J Immunol. ;
33 (1): 125-34.
Crux, N. B., & Elahi, S. (2017). Human Leukocyte Antigen (HLA) and Immune Regulation:
How Do Classical and Non-Classical HLA Alleles Modulate Immune Response to
Human Immunodeficiency Virus and Hepatitis C Virus Infections?. Frontiers in
immunology, 8, 832.
Davidson, B., Elstrand, M., McMaster, M., Berner, A., Kurman, R., Risberg, . . . Shih, I. ( 2005).
HLA-G expression in effusions is a possible marker of tumor susceptibility to
chemotherapy in ovarian carcinoma. Gynecol Onco, ;96(1):42-7.
Daza Doris,E,. (2012). CÁNCER GÁSTRICO EN COLOMBIA ENTRE 2000 Y 2009.
Universidad del Rosario. Facultad de medicina.
Digklia A, Wagner AD. Advanced gastric cancer: Current treatment and scape and future
perspectives. World J Gastroenterol 2016; 22(8): 2403-2414
Du L, Xiao X, Wang C, Zhang X, Zheng N, Wang L, Zhang X, Li W, Wang S, Dong Z,
(2011). Human leukocyte antigen‐G is closely associated with tumor immune escape in
gastric cancer by increasing local regulatory T cells. Cancer Sci.; 102 : 1272–1280.
53
Esteban, CE, Manrique, AI, Sastre, VJ, Díaz-Rubio, GE 2000. Cáncer de estómago. En: Díaz-
Rubio, E, García-Conde, J. Oncología Clínica Básica (Arán Ediciones) pp 406-410
Farhadian, S., Tabebordbar, M., Mokhtari, M., Safaei, A., Malekzadeh, M., & Ghaderi, A.
(2018). HLA-G Expression in Tumor Tissues and Soluble HLA-G Plasma Levels in
Patients with Gastrointestinal Cancer. Asian Pacific journal of cancer prevention :
APJCP, 19(10), 2731–2735.
Gómez, M., Otero, W., & Arbeláez, V. (2009). Tratamiento endoscópico de cáncer gástrico
temprano en Colombia con seguimiento a cinco años. Revista Colombiana Gastroenterol,
24 (4), 347-352.
Hanahan D, Weinberg RA.(2011) Hallmarks of cancer: The next generation. Cell.;144:646–674
Heidari MH, Movafagh A, Abdollahifar MA, Abdi S, Barez MM, Azimi H, Moradi A, Bagheri
A, Heidari M, Hessam Mohseni J, Tadayon M, Mirsafian H, Ghatrehsamani M. (2017 )
Evaluation of sHLA-G levels in serum of patients with prostate cancer identify as a
potential of tumor marker. Anat Cell Biol. Mar;50(1):69-72
Huang, W.-L.; Chen, Y.-L.; Yang, S.-C.; Ho, C.-L.; Wei, F.; Wong, D.T.; Su, W.-C.; Lin, C.-C.
Liquid biopsy genotyping in lung cancer: Ready for clinical utility? Oncotarget 2017, 8,
18590–18608.
International Agency for Research on Cancer (IARC), 2018. GLOBOCAN, Cancer today
Kimball JW. Introduction to Immunology. New York: McMillan Publishing co Inc, 1983.
Kleinberg L, Florenes VA, Skrede M, Dong HP, Nielsen S, McMaster MT, et al. Expression of
HLA-G in malignant mesothelioma and clinically aggressive breast carcinoma. Virchows
Arch. 2006;449:31–9
54
Lauren P. (1965). The two histological main types of gastric cancer: diffuse and so called
intestinal type carcinoma. An attempt at a histological classification. Acta Pathol
Microbial Scand 64: 31-49
Leung WK, Wu Ms, Kakugawa Y et al; Asia Pacific Working Group on Gastric cancer.
screening for gastric cancer in Asia: current evidence and practice. Lancet Oncology.
2008 Mar;9(3):279-87
Li, J. B., Ruan, Y. Y., Hu, B., Dong, S. S., Bi, T. N., Lin, A., & Yan, W. H. (2017). Importance
of the plasma soluble HLA-G levels for prognostic stratification with traditional
prognosticators in colorectal cancer. Oncotarget, 8(30)
Lila N, Rouas-Freiss N, Dausset J, Carpentier A, Carosella ED. Soluble HLA-G protein secreted
by allo-specific CD4+ T cells suppresses the allo-proliferative response: a CD4+ T cell
regulatory mechanism. Proc Natl Acad Sci U S A 2001; 98: 12150–5.
Lin, A., & Yan, W. H. (2018). Heterogeneity of HLA-G Expression in Cancers: Facing the
Challenges. Frontiers in immunology
Lorenzo, S. (2014). Efecto de la activación e inhibición de células linfoides en la respuesta
antitumoral de las células NK. Instituto universitario de oncología, Universidad de
Oviedo, 9-39.
Mareel M, Leroy A.(2003). Clinical, cellular, and molecular aspects of cancer invasion.Physiol Rev.
Apr;83(2):337-76.
Martínez Marín, Julián David, Garzón Olarte, Martín Alonso, Lizarazo Rodríguez, Jorge Iván,
Marulanda Gómez, Juan Carlos, Molano Villa, Juan Carlos, Rey Tovar, Mario Humberto,
& Hormaza, Natán. (2010). Características de los pacientes con cáncer gástrico del
55
departamento de Cundinamarca, remitidos al Hospital Universitario de la Samaritana
entre los años 2004 y 2009. Revista Colombiana de Gastroenterologia, 25(4), 344-348.
Maqueda Maria Alsina. (2016). Caracterización molecular del cáncer gástrico HER2 positivo;
mecanismos de resistencia al tratamiento con anticuerpos monoclonales dirigidos. Tesis
doctoral en medicina. Universidad Autónoma de Barcelona.
Pardo C, Vries E, Buitrago L, Gamboa O. (2017). Atlas de Mortalidad por Cáncer en
Colombia.cuarta edición INC & IGAC, Bogotá .
Morales PJ, Pace JL, Platt JS,et al. 2003. Placental cell expression of HLA-G2 isoforms is
limited to the invasive trophoblast phenotype. J Immunol;171:6215-6224
Moreau P, Mouillot G, Rousseau P, Marcou C, Dausset J, Carosella ED. (2003).HLA-G gene
repression is reversed by demethylation; Proc Natl Acad Sci USA;pp. 1191–1196
Moros, Manuel, Jurado, Ciro, Mora, Hernando, Wilches, Germán, Escobar, Raúl, González,
Getty, Espitia, Ivon, Gamboa, Ivonne, & Hernández, Maryory. (2004). Estrategia de
intervención al cáncer gástrico en el Norte de Santander. Revista Colombiana de
Gastroenterologia, 19(1), 9-12. Retrieved April 08, 2019
Morandi F., Rouas-Freiss. N. , Pistoia. V., (2014) The emerging role of soluble HLA-G in the
control of chemotaxis, Cytokine Growth Factor Rev. 25 327–335.
Oliveira C, Pinheiro H, Figueiredo J, Seruca R, Carneiro F. (2015) Familial gastric cancer:genetic
susceptibility, pathology, and implications for management. Lancet Oncol.;16:e60–e70.
OMS. ( 2004). Formulario Modelo de la OMS. Organización Mundial de la Salud 17 ed, p. 17.1.
Pan, Y., Ruan, Y., Peng, J., Han, Q.-Y., Zhang, X., Lin, A., & Yan, W. (2016). Diagnostic
significance of soluble human leukocyte antigen-G for gastric cancer. Human
Immunology, 77(4), 317–324.
56
Paul P, Cabestre FA, Le Gal FA, et al. (1999) Heterogeneity of HLA-G gene transcription and
protein expression in malignant melanoma biopsies. Cancer Res; 59: 1954–60
Paul, P., Cabestre, F., Ibrahim, E., & al., e. (2000). Identification of HLA-G7 as a new splice
variant of the HLA-G mRNA and expression of soluble HLA-G5, -G6, and -G7
transcripts inhuman transfected cells. Hum Immunol, 61: 1138–49.
Pistoia, V., Morandi, F., Wang, X., & Ferrone, S. (2007). Soluble HLA-G: Are they clinically
relevant?. Seminars in cancer biology, 17(6), 469–479.
Poláková k, Železníková T, Russ G. (2013). HLA-G5 in the blood of leukemia patients and
healthy individuals. Leukemia Research, 37(2), 139-145
Rebmann, V., Pfeiffer, K., Passler, M., Ferrone, S., Maier, S., Weiss, E., . . . Wilde, H. (1999).
Detection of soluble HLA-G molecules in plasma and amniotic fluid. Tissue Antigens,
53(1):14-22
Roder DM, ( 2002) The ephidemiology of gastryc cancer. Gastric cancer;5:5-11
Rouas-Freiss N, Khalil-Daher I, Riteau B, Menier C, Paul P, Dausset J, et al.( 1999)The
immunotolerance role of HLA-G. Semin Cancer Biol.; 9 : 3–12
Rouas-Freiss N, Moreau P, Ferrone , Carosella ED, (2005). HLA-G Proteins in Cancer: Do They
Provide Tumor Cells with an Escape Mechanism?. Cancer Res, (65) (22) 10139-10144
Rodríguez J. A. (2017). HLA-mediated tumor escape mechanisms that may impair
immunotherapy clinical outcomes via T-cell activation. Oncology letters, 14(4), 4415–
4427.
Rodriguez Montero Fiorella (2014). Cancer gastrico: diagnostico y manejo. Revista medica de
Costa Rica y Centroamérica LXXI(610) 339-342
57
Saarenheimo Jatta, Eigeliene Natalja, Andersen Heidi, Tiirola Marja, Jekunen Antti. The Value
of Liquid Biopsies for Guiding Therapy Decisions in Non-small Cell Lung Cancer
(2019). Frontiers in Oncology. p129
Sebti Y, Le Maux A, Gros F, De Guibert S, Pangault C, Rouas-Freiss N, Bernard M, Amiot L.
(2007). Expression of functional soluble human leucocyte antigen-G molecules in
lymphoproliferative disorders. Br J Haematol.
Singer, G., Rebmann, V., C. Y., Liu, H., Ali, S., Reinsberg, J., . . . Cheng, C. (2003). HLA-G is
a potential tumor marker in malignant ascites. Clin Cancer Res, 9(12):4460-4.
Smith, M. G., Hold, G. L., Tahara, E., & El-Omar, E. M. (2006). Cellular and molecular aspects
of gastric cancer. World journal of gastroenterology, 12(19), 2979–2990.
Strimbu, K., & Tavel, J. A. (2010). What are biomarkers?. Current opinion in HIV and AIDS,
5(6), 463–466.
Suárez,M.,Díaz, A., Álvarez, O., Vazquez, J., Vizoso, F. (2003 )Utilidad clínica de los
marcadores tumorales séricos. Aten Primaria;32:227-39
Thomas, L. (1982). On Immunosurveillance in human cancer. Yale j Biol med. 55(3-4), 329-333
Urosevic, M., & Dummer,R. (2003). HLA-G and IL-10 expression in human cancer different
stories with the same message. Semin. Cancer Biol. 13,, 337-342.
Zhang, Y., Yu, S., Han, Y., Wang, Y., & Sun, Y. (2018). Human leukocyte antigen-G expression
and polymorphisms promote cancer development and guide cancer diagnosis/treatment.
Oncology letters, 15(1), 699–709.
Zheng, J., Xu, C., Chu, D., Zhang, X., Li, J., Ji, G., . . . Zhao, Q. (2014). Human leukocyte antigen
G is associated with esophageal squamous cell carcinoma progression and poor
prognosis. . Immunol Lett, 1(1):13-9.
58
Zheyu, S., Yuanyu, W., Jiebing, Y., Dingquan, Y., & Xuedong, F. (2017). Progress in the
treatment of advanced gastric cancer. Tumor Biology.
Zilberman, S., Schenowitz, C., Agaugue, S., Benoit, F., Riteau, B., Rouzier, R., . . . Menier, C.
(2012). HLA-G1 and HLA-G5 active dimers are present in malignant cells and effusions:
the influence of the tumor microenvironment. . Eur J Immunol , 42(6):1599-608.
Zúñiga, J., Yu, N., Barquera, R., Alosco, S., Ohashi, M., Lebedeva, T., … Yunis, E. J. (2013).
HLA class I and class II conserved extended haplotypes and their fragments or blocks in
Mexicans: implications for the study of genetic diversity in admixed populations. PloS
one, 8(9)