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GENTICA

DIAGNSTICO MOLECULAR

QFB. Miguel Ruz de la Cruz

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PCR (polimerase chain reaction)

Reaccin en cadena de la polimerasa

Componentes del sistema

oligonucletidos (cebadores)

Tampn

Polimerasa termoestable

dNTP

DNA molde

Protocolo general

Aplicaciones

PCR inverso

PCR en tiempo real (PCR cuantitativo)

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PCR

amplificacin de la secuencia

comprendida entre los dos

cebadores

ciclos de amplificacin

desnaturalizacin

alineacin

polimerizacin

K. Mullis 1985

Premio Nobel 1993

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Componentes del sistema

1. Oligonucletidos

secuencia que flanquean el fragmento a amplificar

actan como cebadores

tamao de 20-24 nucletidos

diseo: 3-OH bien apareadoposibilidad de mutagnesis dirigida

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Componentes del sistema

2. Tampn

Tris pH 8,4, importancia de la concentracin de MgCl2. Afecta a:

incorporacin de dNTP, actividad polimerasa y Tm cebador-molde

A 0,5 mM

B 0,8 mM

C 1,5 mM

D 2 mM

E 2,5 mM

F 3 mM

Efecto de la

concentracin de MgCl2en la PCR

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Componentes del sistema

3. Polimerasas

Direccin de polimerizacin 5-3. Necesita 3-OH. Copian molde. Usan dNTP

Taq Thermus aquaticus 40 + - -

Vent Thermococcus litoralis 400 - + -

Pfu Pyrococcus furiosus 120 - + -

Tth Thermus thermophilus 20 + - +

DNA polimerasa a) b) c) d) e)

a) origen b) vida media (min) a 95C c) exo 5 d) exo 3 e) transcriptasa inversa

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Componentes del sistema

4. dNTPs

dATP, dGTP, dGTP, dTTP a 100-200mM

5. Molde

DNA cualquier secuencia

RNA usando polimerasas con actividad de trascriptasa inversa (RT-PCR)

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Procesamiento

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Protocolo general

Ciclo desnaturalizacin Alineacin polimerizacin

1 ciclo 5/94C 2/50C 3/72C2-34 ciclo 1/94C 2/50C 3/72C ltimo ciclo 1/94C 2/50C 10/72C

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Aplicaciones de la PCR

Diagnstico de enfermedades Establecimiento de la huella gentica Aislamiento de genes Secuenciacin Mutagnesis Amplificacin de RNA: RT-PCR (trascriptasa inversa) Amplificacin de secuencias adyacentes: PCR inversa PCR en tiempo real

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PCR

Resumen

Permite amplificar con gran rapidez segmentos relativamente cortos de

DNA por medio de tcnicas de calentamiento y enfriamiento.

La combinacin de los oligonucletidos descritos en el inciso de

hibridacin molecular y sondas gnicas para la identificacin rpida de

mutaciones puntuales.

La limitacin es que solo amplifica la porcin del gen en la que se sabe

que hay una mutacin concreta pero no informa nada sobre el resto del

gen.

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SOUTHERN (DNA)

Identificacin de un gen por:

1) El DNA se purifica y se trata con una o variasenzimas de restriccin.

2)Se fracciona DNA en mltiples segmentos unode los cuales contiene el gen, se somete a

electroforesis.

3)Se desnaturalizan estos segmentos separandolas cadenas dobles de DNAt

4)Se realiza la hibridacin

5)Se realiza deteccin.

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NORTHERN (RNA)

El procedimiento es idntico aSouthern, pero el cido nucleico

analizado es el RNA.

Se emplea principalmente para obtenerinformacin sobre tamao de Rnas y

sobre el mtodo de expresin de genes

especficos.

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Western blot

Su similitud mecanstica y tcnica es similar a las 2 anteriores.

Se utiliza para detectar protenas presentesen una muestra.

Son sometidas a electroforesis en gel de poliacrilamida ytransferidas a una membrana (Western blot).

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La deteccin de las bandas proteicasen la membrana o filtro se realiza a la

unin especfica de un anticuerpo

contra la protena o regin proteica que

se quiera estudiar.

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los seres humanos tenemos una variabilidad fenotpica

que podemos observar en muchos rasgos

causas

genticascausas

ambientales

variacin en la secuencia de nucletidos: mutacin/polimorfismo

18:49:11Deteccin y medida del polimorfismo a nivel de DNA

Si una persona se diferencia de otra en 1/300, 10 millones de pb nos

diferenciamos unos de otros. Esta variabilidad no puede detectarse

a nivel de protenas, donde los polimorfismos que se conocen no explican

la variabilidad existente en la secuencia de DNA

Polimorfismo de longitud de los fragmentos de DNA (RFLP)

son variaciones en la secuencia de DNA de un par de bases que afectan

a la secuencia de reconocimiento de una enzima de restriccin.

Se detectan por Southern blot. Biallico.

Polimorfismo del nmero de repeticiones de secuencias en tandem (VNTR)

son variaciones en la secuencia de DNA que afectan al nmero de

repeticiones de una secuencia. Corresponden normalmente a los

minisatlites y microsatlites. Se detectan por PCR. Muy polimrfico.

Polimorfismo de un solo nucletido (SNP)

son variaciones en la secuencia de DNA de un par de bases.

Se detectan con biochips

(STR)