CAPITULO II

METODOLOGÍA EXPERIMENTAL

En este capítulo describiremos las propiedades y características de las

moléculas utilizadas en este trabajo de tesis, así como el método de preparación

de los liposomas y las técnicas utilizadas para su caracterización.

2.1 MATERIAL 2.1.1 Moléculas Utilizadas. 2.1.1.1 Fosfolípido

El fosfolípido utilizado para la formación de los liposomas es el 1-Stearoyl-2-

oleoyl phosphatidylserine (SOPS) un fosfolípido natural comprado en Avanti polar

lipids con las siguientes propiedades:

Peso molecular: 812.05 gr/mol

Pureza > 99%

Disuelto en cloroformo

2.1.1.2 Agua

El agua utilizada para la preparación de las soluciones es agua ultrapura

tipo millipore Milli-Q.

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2.1.1.3 Soluciones 2.1.1.3.1 Sales

Las sales utilizadas para el estudio del efecto en la forma y el tamaño de las

estructuras liposomales se presentan en la tabla I:

Tabla I. Concentración de sales monovalentes (NaCl, KCl) y divalentes (MgCl2 y

CaCl2) utilizadas en los experimentos.

2.1.1.3.2 Glucosa y Sacarosa

Las concentraciones de las soluciones de glucosa y sacarosa, que se

utilizan para el proceso de re-hidratación de la película de fosfolípido, se presentan

a continuación en la Tabla II.

Tabla II. Concentración de las soluciones de glucosa y sacarosa.

Las concentraciones de glucosa, sacarosa y soluciones salinas se

determinaron experimentalmente con un Osmomolarímetro modelo 3320.

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2.1.1.4 Polielectrolitos

Entre los pares de polielectrolitos de mayor y ampliamente estudiados en

muchos tópicos de multicapas de polielectrolitos y capsulas, se encuentran el

sulfonato de Poliestireno por sus siglas en ingles (PSS) cargado negativamente, e

hidrocloruro polialiamina (PAH) cargado positivamente (Fig.7).

Fig. 7 Monómeros de los polielectrolitos PSS y PAH

Estos son polímeros sintéticos donde el PAH tiene como contraión el Cl- y el

PSS tiene como contraión el Na+. La carga total de PSS no es afectado con los

cambios de pH en la solución. Por otro lado, algunos trabajos han mostrado que el

pH afecta el grado de protonación de PAH, es decir la densidad de carga del

polielectrolito, típicamente tiene una constante de disociación (Pka o Pkb) en el

rango de 2-10, lo que lleva a una disociación parcial protónica a pH intermedios

(densidad de carga parcial del polielectrolito). Por lo tanto, estos tipos de

polielectrolitos, llamados polielectrolitos débiles (weak polyelectrolyte), no son

totalmente cargados en la solución, y más aun su carga fraccional puede ser

modificada cambiando el pH en la solución, (Márquez-Beltrán, C., 2004).

En este trabajo de tesis, se seleccionan ambos polielectrolitos para analizar

su interacción con las vesículas creadas en el laboratorio, con el objeto de

observar los cambios morfológicos de las vesículas, así como estudiar la

adsorción de estos polielectrolitos en las membranas fosfolipídicas.

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2.2 MÉTODO DE PREPARACIÓN

El método utilizado para la formación de liposomas es el de re-hidratación

de una película de fosfolípido. A continuación se presentan los diferentes tipos de

experimentos que se llevaron a cabo, mediante las técnicas de Microscopía

Óptica, Dispersión Dinámica de Luz y Microscopía Electrónica de Criofractura.

2.2.1 Microscopía Óptica. 2.2.1.1 Experimentos sin Sal

El primer tipo de experimento que se realizó fue para formar liposomas con

SOPS. Comenzamos colocando 5 µl de SOPS en un desecador a vacío, durante

aproximadamente 3 h, obteniendo una película de fosfolípido seca. Después se

hidrata la película de fosfolípido con 100 µl de glucosa 200 mOsm/kg y 100 µl de

sacarosa 200 mOsm/kg, agitando solo un poco. Una vez realizada la hidratación,

tomamos 50 µl de analito y lo colocamos en un portamuestra. Finalmente lo

cubrimos con un cubre muestra, para ser observado en el microscopio óptico.

2.2.1.2 Experimentos con Sal

El segundo tipo de experimento que se realizó fue para estudiar el efecto de

las sales en los liposomas de SOPS. Comenzamos secando 5 µl de SOPS

durante aproximadamente 3 h en un desecador a vacío, obteniendo una película

de fosfolípido seca. A continuación se hidrata la película de fosfolípido con 100 µl

de glucosa 200 mOsm/kg y 100 µl de sacarosa 200 mOsm/kg. De igual manera

que en el experimento anterior agitamos solo un poco. Después de esto

agregamos 30 µl de solución salina. Luego, tomamos 50 µl de analito y lo

colocamos en un portamuestra. Finalmente lo cubrimos con un cubre muestra,

para ser observado en el microscopio óptico.

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Las soluciones salinas utilizadas para este tipo de experimento son cuatro:

a) Cloruro de sodio

b) Cloruro de potasio

c) Cloruro de magnesio

d) Cloruro de calcio

2.2.1.3 Experimentos con Polielectrolitos

El tercer tipo de experimento fue para analizar el efecto del polielectrolito

PAH en los liposomas de SOPS. Comenzamos secando 5 µl de SOPS durante

aproximadamente 3 h en un desecador a vacío; obteniendo una película de

fosfolípido seca. Después se hidrata la película de fosfolípido con 100 µl de

Glucosa 200 mOsm/kg y 100 µl de sacarosa 200 mOsm/kg, de igual manera que

en el experimento anterior agitamos solo un poco. Después de esto agregamos 30

µl de solución salina, luego tomamos 50 µl de analito y lo colocamos en un

portamuestra. Finalmente lo cubrimos con un cubre muestra, para ser observado

en el microscopio óptico.

2.2.2 Experimentos Mediante DLS

2.2.2.1 Experimentos con Sal

Este tipo de experimentos se realizó para analizar el efecto de las sales

sobre los liposomas formados. Comenzamos secando 6 µl de SOPS durante

aproximadamente 3 h en un desecador a vacío, obteniendo una película de

fosfolípido seca. Una vez hidratada la película de fosfolípido con 100 µl de glucosa

200 mOsm/kg y 100 µl de sacarosa 200 mOsm/kg, agitamos solo un poco.

Después de esto agregamos 30 µl de solución salina, luego agregamos 900 µl de

glucosa y 900 µl de sacarosa. Después la muestra se somete a sonicación

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durante un tiempo 5 min. Para finalizar el experimento la muestra es colocada en

contenedor del equipo de DLS y así mismo analizada.

Este tipo de experimento se llevó a cabo con 4 diferentes soluciones

poliméricas:

a) PAH (Poly (alyamine- chloridric acid) 1000ppm

b) PSS (Poly (steryren 4-sulfonate) 1000ppm

c) Complejo PAH-PSS-NaCl 400 ppm PSS, 2500 ppm PAH, 0.1M NaCl

d) Complejo PAH-PSS-NaCl 500 ppm PSS, 2500 ppm PAH, 0.1M NaCl

2.2.2.2 Experimentos con Polielectrolitos

Este tipo de experimentos se realizó para observar el efecto de los

polielectrolitos sobre los liposomas formados. Comenzamos secando 6 µl de

SOPS durante aproximadamente 3 h en un desecador a vacío; obteniendo una

película de fosfolípido seca. Después hidratamos la película de fosfolípido con 100

µl de Glucosa 200 mOsm/kg y 100 µl de sacarosa 200 mOsm/kg y de igual

manera que en los experimentos anteriores agitamos solo un poco. Después de

esto agregamos 20 µl de solución polimérica, 900 µl de glucosa y 900 µl de

sacarosa. Una vez preparada la muestra se somete a sonicación durante un

tiempo de 5 min. Finalizamos el experimento analizando la muestra con la técnica

de DLS.

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2.2.3 Experimentos Mediante Microscopía Electrónica de Criofractura 2.2.3.1 Experimentos con Polielectrolitos

La formación de los liposomas se realiza exactamente igual que en los

experimentos descritos para la técnica de microscopía óptica.

Primeramente secamos 5 µl de SOPS durante aproximadamente 3 h en un

desecador a vacío. Transcurrido ese tiempo se hidrata la película de fosfolípido

seca con 100 µl de Glucosa 200 mOsm/kg y 100 µl de sacarosa 200 mOsm/kg,

agitamos solo un poco, y agregamos 30 µl de solución polimérica. Volvemos a

agitar solo un poco y tomamos una gota de la muestra para después colocarla en

el portamuestra especial para el equipo de criofractura.

Antes de introducir la muestra al equipo de criofractura, la gota es

previamente congelada en nitrógeno líquido. Una vez en el equipo la gota ya

congelada, se fractura manualmente con una navaja la cual esta

aproximadamente a una T = -170° C.

Una vez fracturada la gota, la superficie es cubierta con un material

metálico, en nuestro caso Platino y Carbono. Esta cubierta metálica nos da una

réplica de la superficie. Posteriormente la réplica se observa en el microscopio

electrónico de transferencia, y se capturan las imágenes de la misma.

Las muestras analizadas en esta técnica son solo para el sistema de

Liposomas SOPS- Polielectrolito (PAH a diferentes concentraciones).

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2.3 TECNICAS EXPERIMENTALES

2.3.1. Microscopia Óptica

Esta técnica se utilizó para observar los liposomas formados y poder

estimar el número de agregados presentes en la muestra, así como determinar los

diámetros de los agregados obtenidos. Se utilizó un microscopio óptico del tipo

Olympus IX71 (Fig.9).

El microscopio óptico utiliza la luz visible para crear una imagen aumentada

del objeto. El más simple es la lente convexa doble con una distancia focal corta.

Estas lentes pueden aumentar un objeto hasta 15 veces. Por lo general, se utilizan

microscopios compuestos, que disponen de varias lentes con las que se

consiguen aumentos mayores. El microscopio compuesto consiste en dos

sistemas de lentes, el objetivo y el ocular, montados en extremos opuestos de un

tubo cerrado ((Fig. 8). El objetivo está compuesto de varias lentes que crean una

imagen real aumentada del objeto examinado. Las lentes de los microscopios

están dispuestas de forma que el objetivo se encuentre en el punto focal del

ocular. Cuando se mira a través del ocular se ve una imagen virtual aumentada de

la imagen real. El aumento total del microscopio depende de las distancias focales

de los dos sistemas de lentes.

Las muestras que se examinan con un microscopio, son transparentes y se

observan con una luz que los atraviesa; se suelen colocar sobre un rectángulo fino

de vidrio. El soporte tiene un orificio por el que pasa la luz. Bajo el soporte se

encuentra un espejo que refleja la luz para que atraviese la muestra. El

microscopio puede contar con una fuente de luz eléctrica que dirige la luz a través

de la muestra. La resolución del microscopio óptico puede estar limitada a 0.2 µm.

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Fig.8. Partes del microscopio óptico

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Fig.9. Microscopio óptico utilizado para observar los liposomas.

2.3.2 Dispersión Dinámica de Luz (DLS)

La dispersión dinámica de la Luz es una de las técnicas más usadas para

determinar algunos parámetros físicos como el coeficiente de difusión, radio

hidrodinámico, radio de giro y polidispersión de partículas o agregados en

suspensión [Pécora, R, 1985].

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Fig.10. Esquema experimental del equipo de dispersión dinámica de la luz.

La técnica consiste en hacer incidir un haz de radiación con longitud de

onda λ y vector de onda ( 2 /q π λ= ) en una suspensión con partículas en

movimiento. Al interactuar la radiación con las partículas una parte de la energía

es absorbida, otra es transmitida sin modificación del vector de onda incidente y

otra es dispersada en todo el espacio. La luz dispersada a un cierto ángulo θ es

colectada por un detector (fotomultiplicador). Estudiando la dispersión de la

muestra en función del vector de onda de difusión 4 ( / 2)q senπ θλ

= (suponiendo

que la energía incidente es igual a la energía transmitida) y correlacionando las

intensidades de dispersión a diferentes tiempos se puede construir la función de

correlación. Dependiendo del tipo de partículas o estructuras presentes en la

muestra, dicha función de correlación puede ser ajustada por un modelo físico

para determinar el coeficiente de difusión, la distribución de tamaños y la

polidispersión. Para partículas esféricas monodispersas y el vector de onda q , la

función de correlación puede ser ajustada por una función exponencial simple 2

( ) Dq tG t A Be−= + . Donde A y B son parámetros de ajuste y D es el coeficiente de

difusión. En la práctica, la función de correlación está normalizada y el

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experimento puede considerarse confiable si se tiene bien definida la línea base y

la intensidad de dispersión fluctúa alrededor de un valor medio.

En términos generales todos los equipos de dispersión de luz contienen los

mismos componentes como son: una fuente de radiación, un detector situado al

ángulo de dispersión y un correlador (Fig.10).

Esta técnica fue utilizada para estudiar la distribución de tamaños de los

liposomas con sales y polielectrolitos. El equipo utilizado es el tipo ALV/DLS/SLS-

5022F (Fig.11), funcionando con un laser de longitud de onda de 653 m. El

sistema de enfriamiento consiste de un contenedor cilíndrico de cuarzo donde se

deposita el tubo con la muestra, el cual se encuentra inmerso en un baño con

tolueno.

Fig. 11. Equipo de DLS (visto desde varios ángulos) utilizado en los experimentos

realizados para el estudio de la distribución de tamaños de los liposomas puros,

con sal y con polielectrolitos.

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2.3.3 Microscopia Electrónica de Criofractura.

La técnica de Microscopia Electrónica de criofractura, ha sido un método

muy popular en biología de membranas durante varias décadas y ha sido de gran

valor, en el estudio de los detalles estructurales de dispersiones lipídicas en

medio acuoso. La técnica de microscopía electrónica de criofractura da

información sobre características que no pueden ser detectadas por otras

técnicas. Esto se debe a que la técnica provee una visualización directa de la

estructura molecular, más que información promediada surgiendo

simultáneamente de algún lugar de la muestra. Esta técnica se divide en dos

partes; primeramente se realiza la criofractura y una vez obtenida la réplica de la

muestra, se obtiene la información mediante microscopía electrónica.

2.3.3.1 Criofractura

En la técnica de criofractura existen tres pasos importantes que pueden

considerarse esenciales en el método:

a) Rápido congelamiento de la muestra,

b) Fracturación

c) Sombreado y replicación.

En el primer paso, la muestra es enfriada muy rápidamente en nitrógeno

líquido para preservar las estructuras moleculares. En el segundo paso del

procedimiento, el espécimen es fracturado bajo alto vacío para evitar problemas

de contaminación (principalmente agua) que puede llevar a una falsa replicación

de las caras fracturadas.

En el último paso, el espécimen fracturado es replicado sombreando con

platino/carbono, seguido de sombreado de carbono para asegurar la estabilidad

mecánica de la réplica para su subsecuente microscopia electrónica. La réplica

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limpiada es inerte al rayo electrónico, así que se excluyen artefactos o estructuras

inducidas por el daño del rayo electrónico. La resolución del método está

determinada por el tamaño del grano de platino que es alrededor de 30 Å.

a) b)

Fig.12. a) Equipo de criofractura utilizado en los experimentos b) zoom en la

sección del equipo donde se realiza la fractura de muestra ya congelada, y se

deposita el platino y el carbono.

a) b)

Fig. 13. a) Microscopio donde es visualizada la réplica de la muestra b) Viales

con las muestras de los liposomas con polielectrolitos a diferentes diluciones

utilizados en los experimentos de microscopia electrónica de criofractura.

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2.3.3.2 Microscopia Electrónica de Transmisión

Ésta técnica se rige bajo los mismos principios que la microscopía óptica,

solo que la luz se sustituye por un haz de electrones que pasan por un tubo (para

mejorar el paso de los electrones, en el tubo se ha hecho el vacío). Permite la

observación de las estructuras interiores de las células.

El haz de electrones es lanzado por un cañón en el que se establece una

diferencia de potencial, entre el cátodo y el ánodo. El chorro de electrones pasa a

través de la muestra a observar, la cual está colocada en una rejilla (d < 1 mm).

Los electrones chocan con la muestra y se desvían, y estas desviaciones son

recogidas por la pantalla. La imagen se observa a través de una pantalla que es

excitada por los electrones que llegan a ella (mecanismo parecido a la televisión).

Las imágenes las recogemos mediante una placa fotográfica que es impresionada

directamente por los electrones.

Los electrones tienen poco poder de penetración en el medio normal, por lo

que para permitir/facilitar su desplazamiento, hay que realizar vacío en el tubo a

través del que se desplazan. Existen electroimanes que dirigen la dirección del

haz. El equipo utilizado se describe en la Fig.14.

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Fig.14. Microscopio electrónico de transmisión marca JEOL-JEM2010F utilizado

para el estudio de las muestras preparadas por criofractura.

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