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Universidad Autónoma de

Coahuila

Escuela de Ciencias Biológicas

Apuntes del curso de

Análisis Instrumental

Dra. Erika Flores Loyola

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Índice Pág.

Unidad I. Introducción al análisis instrumental 3 1.1.Clasificación de los métodos analíticos 3 1.2. Instrumentación en el análisis. 5 Unidad II. La radiación electromagnética y sus inte racciones con la materia. 12 2.1. Naturaleza de la energía radiante. 12 2.2. Teoría ondulatoria y teoría cuántica. 12 2.3. Espectro electromagnético. 14 2.4. Interacción de la radiación con la materia. 15 Unidad III. Espectroscopía de absorción de radiació n UV y visible 18 3.1. Aspectos cuantitativos de las mediciones de ab sorción. 18 3.2. instrumentación 20 3.3. Procedimientos para la realización de un análi sis espectrofotométrico. 23 3.4. Aplicaciones. 24 Unidad IV. Espectroscopía de absorción infrarroja 39 4.1. Teoría de la absorción infrarroja. 40 4.2. Instrumentos IR. 42 4.3. Regiones espectrales importantes en IR. 46 4.4. Interpretación de espectros IR. 46 4.5. Aplicaciones. 46 Unidad V. Espectroscopia de absorción atómica 5 3 5.1. Principios de la absorción atómica. 53 5.2. Instrumentación para absorción atómica. 55 5.3. Aplicación e interpretación de datos. 58 Unidad VI. Cromatografía 61 6.1. Conceptos generales 61 6.2. Tipos de cromatografía (Clasificación) 65 6.2.1. Cromatografía de adsorción 67 6.2.2. Cromatografía de partición 67 6.2.3. Cromatografía de intercambio iónico 68 6.2.4. Cromatografía de exclusión por tamaño 70 6.2.5. Cromatografía de afinidad 70 6.3. Aplicaciones 72 BIBLIOGRAFIA 73

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Unidad I. Introducción al análisis instrumental. 1.1. Clasificación de los métodos analíticos El análisis químico es una herramienta muy importante en el estudio de la química en general ya que es por medio del análisis que puede llevarse a cabo la evaluación de nuevos productos, además de que el cuidado del medio ambiente requiere de técnicas analíticas especializadas. El análisis químico no se enfoca únicamente a la química pura, sino que abarca áreas muy diversas, tal es el caso de la ecología, mecánica, biología, medicina, etc. La instrumentación proporciona los límites de detección más bajos requeridos para que podamos disponer de alimentos, agua y aire no contaminados. Es necesario distinguir entre una técnica analítica y un método analítico. Una técnica es un proceso científico fundamental que se utiliza para obtener información sobre la composición de una sustancia determinada, mientras que un método analítico consiste en la aplicación de la técnica analítica para resolver un problema analítico específico. Generalmente existen procedimientos estandarizados descritos para la aplicación de un método de análisis desarrollados por la ASTM (American Society for Testing and Materials) y por la ADAC (Association of Official Analytical Chemists) los cuales describen los pasos a seguir para la realización de análisis específicos. Clasificación de las Técnicas Instrumentales Las técnicas instrumentales que proporcionan la base para el estudio de la instrumentación química se clasifican de la siguiente manera:

Técnicas Instrumentales

Sin embargo existen algunas técnicas como el análisis térmico y la espectrometría de masas que no se ajustan de manera apropiada a esta clasificación. Cada una de las técnicas instrumentales considera un buen número de técnicas. Entre las principales que considera cada una de ellas se encuentran: Técnicas espectroscópicas Técnicas Cromatográfica s UV-Visible Cromatografía en columna Infrarrojo Cromatografía en papel Raman Cromatografía en capa fina Fluorescencia Cromatografía de gases Absorción Atómica Cromatografía de líquidos de alta

resolución (HPLC)

Espectroscopia Electroquímica Cromatografía Ópticas

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Emisión en plasma Cromatografía de permeación en gel Emisión de flama (GPC) Resonancia magnética nuclear Rayos X Espectrometría de masas Técnicas Electroquímicas Técnicas ópticas Potenciometría Refractometría Electrogravimetría coulométrica Polarimetría Voltametría y polarografía Conductimetría Para la elección del método de análisis adecuado es necesario considerar las propiedades químicas y físicas que se puedan utilizar en el análisis cualitativo o cuantitativo. En la tabla I.1 se muestran la mayoría de las propiedades características que se utilizan actualmente en el análisis instrumental. La mayor parte de ellas requiere de una fuente de energía para estimular una respuesta medible que procede del analito. Por ejemplo, en emisión atómica se requiere de un aumento en la temperatura del analito para que, en primer lugar se produzcan átomos en estado gaseoso y después para excitar dichos átomos a niveles de mayor energía. Posteriormente, dichos átomos emiten una radiación electromagnética característica que es la cantidad medida por el instrumento. Tabla I.1. Propiedades de la radiación que emplean las técnicas instrumentales

Técnicas Instrumentales

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Como puede observarse en la tabla I.1, las seis primeras entradas corresponden a interacciones del analito con radiación electromagnética. En la primera, el analito origina la señal radiante, mientras que las cinco siguientes implican cambios en el haz de radiación producidos por su interacción con la muestra. Las cuatro que siguen son eléctricas. Por último cuatro propiedades diversas se agrupan conjuntamente: la relación masa/carga, la velocidad de reacción, las señales térmicas y la radiactividad. La segunda columna de la tabla indica los nombres de los métodos instrumentales relacionados con las propiedades físicas y químicas. Debe tenerse en cuenta que no siempre es fácil elegir el método óptimo de entre la cantidad de técnicas instrumentales disponibles, así como sus homólogos clásicos debido a que para la selección adecuada deben considerarse, además de la sensibilidad del instrumento la naturaleza fisicoquímica de la muestra a analizar. 1.2. Instrumentación en el análisis Para resolver un problema analítico, frecuentemente se sigue una serie de pasos que involucran 1 2 3 4

1. En este punto se debe conocer la naturaleza de la muestra a analizar. Por ejemplo, en el caso de una muestra orgánica se debe conocer si se encuentra en estado puro o es una mezcla de componentes. Generalmente esa información es proporcionada al analista por el proveedor de la muestra problema.

2. En esta etapa debe tenerse mucho cuidado para la selección del método de análisis. Por tal motivo es necesario conocer las limitaciones y alcances de cada uno de los métodos debido a que de eso depende en gran medida la calidad de la información obtenida.

3. Esta etapa consiste en realizar un tratamiento previo a la muestra para favorecer las condiciones idóneas para el análisis. Entre los tratamientos que pueden realizarse se encuentran: disolución, separación, dilución, concentración, entre otras.

4. Para evaluar la precisión y resultados de los análisis es necesario realizar las determinaciones más de una vez y con la ayuda de métodos estadísticos (curvas de distribución, limites de confianza, regresión lineal, etc.) obtener los resultados más confiables posible.

El propósito de la instrumentación química es el de obtener información básica de la sustancia que se está analizando. Estas sustancias al pasar a través de un instrumento de análisis se convierten en una serie de datos que una vez analizados proporcionan la información necesaria para conocer las características químicas de los componentes.

Definición del problema

Selección de los métodos apropiados

Tratamiento previo a la medición

Realizar las mediciones requeridas

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Un instrumento para el análisis químico transforma la información relacionada con las propiedades físicas o químicas del analito en información que pueda ser manipulada e interpretada por el analista, Por lo tanto, dicho instrumento puede ser considerado como un dispositivo de comunicación entre el sistema objeto de estudio y el científico. Para conseguir la información deseada del analito es necesario proporcionar un estímulo, generalmente en forma de energía electromagnética, eléctrica, mecánica o nuclear como se muestra en la Figura I.1. Dicho estímulo provoca una respuesta del sistema objeto del estudio cuya magnitud depende de sus propiedades fisicoquímicas.

Figura I.1. Diagrama de bloques del proceso de medición instrumental. En general los instrumentos analíticos constan solo de algunos componentes básicos entre los que se encuentran:

1. Generador de señales. 2. Transductor de entrada (Detector) 3. Modificador de señal 4. Transductor de salida

1. En este primer punto la señal es generada por la interacción del analito

de manera directa o indirecta con una forma de energía que puede ser radiación electromagnética, corriente eléctrica o energía térmica.

2. Los transductores de entrada o detectores son dispositivos que transforman las propiedades físicas o químicas el analito en una señal eléctrica.

3. Los modificadores de señal son componentes electrónicos que ejecutan operaciones tales como amplificación y filtrado de las señales provenientes de los detectores de entrada.

4. Finalmente, el transductor de salida convierte la señal eléctrica modificada en información que puede ser leída, registrada en interpretada por el analista.

Características de funcionamiento de los instrument os parámetros de calidad En la tabla I.2 se enumeran los criterios cuantitativos de funcionamiento de los instrumentos, criterios que se pueden utilizar para decidir si un determinado método instrumental es o no adecuado para resolver un problema analítico. Estas características se expresan en términos numéricos y se denominan parámetros de calidad. Para un problema analítico dado, los parámetros de calidad permiten reducir la elección de los instrumentos a tan solo unos pocos y entonces la selección entre ellos se hace con los criterios cualitativos de funcionamiento señalados en la tabla I.3.

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Tabla I.2.Criterios analíticos para seleccionar técnicas analíticas

Tabla I.3. Otras características a tener en cuanta para la elección de la técnica son

Precisión. La precisión de las técnicas analíticas se define como el grado de concordancia mutua entre los datos que se han obtenido de una misma forma. La precisión indica la medida del error aleatorio, o indeterminado de un análisis. Los parámetros de calidad de la precisión son la desviación estándar absoluta, la desviación estándar relativa, el coeficiente de variación y la varianza, los cuales se definen en la tabla I.4

Tabla I.4. Parámetros de calidad para la precisión de los métodos analíticos

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Unidad II. La radiación electromagnética y su interacción con la materia

La espectroscopia consiste en la medición e interpretación de fenómenos de absorción dispersión o emisión de radiación electromagnética que ocurren en átomos y moléculas. Esta absorción o emisión está asociada con cambios en los estados de energía de las especies químicas y dado que cada especie tiene estados energéticos característicos, la espectroscopia puede utilizarse con fines de identificación de diversas especies químicas. 2.1. Naturaleza de la energía radiante La radiación electromagnética, o luz, es una forma de energía cuyo comportamiento está descrito por las propiedades tanto de onda como partícula. Las propiedades ópticas de la radiación electromagnética, tales como la difracción y la dispersión son mejor descritas considerando a la luz como una onda. Sin embargo, muchas de las interacciones entre la radiación electromagnética y la materia, tales como absorción y emisión, se describen de una mejor manera considerando a la luz como un haz de partículas o fotones. La naturaleza exacta de la radiación electromagnética permanece aún sin aclarar desde su aparición con la mecánica cuántica a principios del siglo XX. Sin embargo, los modelos del comportamiento dual, como onda y partícula, proporcionan una descripción útil para la radiación electromagnética. 2.2. Teoría ondulatoria y teoría cuántica Propiedades de onda de la Radiación electromagnética

La radiación electromagnética consiste en un campo magnético y un campo eléctrico oscilantes que se propagan a través del espacio a lo largo de una ruta lineal y con una velocidad constante (Figura 1.). En el vacío, la radiación electromagnética viaja a la velocidad de la luz, c, esto es, a 2.99792x108 m/s. Sin embargo cuando ésta se mueve a través de un medio diferente del vacío, viaja con una velocidad, v, menor que la velocidad de la luz. Dado que la diferencia entre v y c es muy pequeña (<0.1%) el valor de 3.00x108 se considera bastante preciso para propósitos de cálculo en espectroscopia.

Campo eléctrico

Campo magnético

Dirección de propagación

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Figura 1. Radiación electromagnética polarizada en un plano. Se muestran los campos eléctrico y magnético así como la dirección de propagación. Los campos magnético y eléctrico que componen a la luz se encuentran en una posición perpendicular, uno con respecto al otro y a la dirección de propagación de las ondas. La figura 1 muestra un ejemplo del plano polarizado de la radiación electromagnética, el cual consiste en un campo eléctrico oscilante y un campo magnético oscilante, cada uno está restringido a un solo plano. Normalmente la radiación electromagnética está no polarizada, con los campos magnético y eléctrico oscilantes en todos los planos posibles orientados de forma perpendicular a la dirección de propagación. La interacción de la radiación electromagnética con la materia puede ser explicada utilizando ya sea un campo eléctrico o un campo magnético. Por esta razón, solo el componente eléctrico se muestra en la figura 2. El campo eléctrico oscilante es descrito como una onda de la forma

E = Ae sin(2πνt + Φ) Donde, E, es la magnitud del campo eléctrico en el tiempo t, Ae es la amplitud máxima del campo eléctrico, ν es la frecuencia o el número de oscilaciones en el campo eléctrico por unidad de tiempo y Φ es un ángulo de fase.

Figura 2. Componente del campo eléctrico de la radiación electromagnética.

Una onda electromagnética, por lo tanto, está caracterizada por varias propiedades fundamentales, incluyendo su velocidad, longitud de onda, frecuencia, ángulo de fase, polarización dirección de propagación. La longitud de onda de una onda electromagnética, λ, está definida como la distancia entre máximos sucesivos o mínimos sucesivos (Figura 2). Para radiación electromagnética UV y visible, la longitud de onda es expresada normalmente en nanómetros (nm, 10-9 m) y la longitud de onda para radiación infrarroja está dada en micras (mm, 10-6 m). A diferencia de la frecuencia, la longitud de onda depende de la velocidad de las ondas electromagnéticas, donde

+

-

Fuerza del campo eléctrico

Tiempo o

distancia

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νλ c=

Otra unidad utilizada para describir las propiedades de onda de la radiación electromagnética es el número de onda ν , el cual es el recíproco de la longitud de onda

λν 1=

Los números de onda son usados frecuentemente para caracterizar la radiación infrarroja, con sus unidades dadas en centímetros recíprocos (cm-1). Dos propiedades adicionales son la potencia P y la intensidad I, las cuales proporcionan el flujo de energía a partir de una fuente de radiación electromagnética. Propiedades de partícula de la radiación electromag nética Cuando una muestra absorbe radiación electromagnética, esta sufre un cambio de energía. La interacción entre la muestra y la radiación electromagnética es más fácil de entender si se asume que la radiación electromagnética consiste de un haz de partículas llamadas fotones. Cuando un fotón es absorbido por una muestra. Este es destruido y su energía es adquirida por la muestra. La energía de un fotón, en joules, está relacionada con su frecuencia, longitud de onda o número de onda por las siguientes ecuaciones:

donde h es la constante de Planck, la cual tiene un valor de 6.626 x 10-34 J s. La energía de un fotón proporciona una propiedad característica adicional de la radiación electromagnética. 2.3. El espectro electromagnético La frecuencia y longitud de onda de la radiación electromagnética varía en muchos órdenes de magnitud. Por conveniencia, la radiación electromagnética está dividida en diferentes regiones basadas en el tipo de transición atómica o molecular que da lugar la absorción o emisión de fotones (Figura 3).

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Figura 3. Espectro de la radiación electromagnética.

Los límites descritos en el espectro electromagnético no son rígidos y es posible un traslape entre las regiones espectrales. 2.4. Interacción de la radiación con la materia. Medición de los fotones como señal La espectroscopia es únicamente posible si la interacción de los fotones con una muestra determinada conduce a un cambio en una o más de las propiedades que caracterizan a la radiación electromagnética, tal es el caso de su energía, velocidad, longitud de onda, frecuencia, ángulo de fase, polarización y dirección de propagación.

Longitud de

onda (m)

Frecuencia (s-1)

Tipo de

transición

Región espectral

violeta azul verde amarillo naranja rojo

Longitud de onda (nm)

Electrones de valencia

Electrones cercanos al núcleo

Vibraciones moleculares

Rotaciones moleculares Spin electrónico

Spin nuclear

Microondas Ondas de radio

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La espectroscopía está dividida en dos clases principales. Una clase corresponde a aquellas técnicas en que la energía es transferida entre los fotones y el analito. En la espectroscopia de absorción la energía que porta un fotón es absorbida por el analito, promoviendo al analito desde un estado de baja energía hasta un estado de mayor energía o estado excitado (Figura 4). La fuente del estado energético depende de la energía de los fotones. Por ejemplo en el caso de luz visible, la absorción de energía por el analito conduce a que los electrones de valencia se desplacen hacia un nivel energético más alto energía. Por otra parte, cuando un analito absorbe radiación infrarroja, uno de sus enlaces químicos experimenta un cambio en su energía vibracional.

Figura 4. Diagrama de energía simplificada que muestra la absorción de un

fotón

La intensidad de los fotones que pasan a través de la muestra es atenuada debido a la absorción de energía. La medición de esta atenuación, a la cual se le denomina absorbancia, es la cantidad que se determina durante el análisis espectroscópico. Un gráfico de absorbancia en función de la energía de los fotones es llamado espectro de absorción (Figura 5).

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Figura 5. Espectro de absorción ultravioleta-visible de azul de bromotimol. La emisión de un fotón ocurre cuando un analito en un estado de energía mayor regresa a su estado de menor energía (Figura II.6). A una absorción seguida de una emisión se le llama fotoluminiscencia.

Figura II.6. Diagrama de energía simplificada que muestra la emisión de un fotón Una segunda clase de espectroscopia es aquella en que la radiación electromagnética sufre un cambio en longitud de onda, ángulo de fase, polarización o dirección de propagación como resultado de su refracción, reflexión, dispersión, o difracción por la muestra. Teoría de Orbitales Moleculares Para comprender las transiciones electrónicas producidas por absorción de radiación UV-visible, es necesario establecer la forma en que los electrones están distribuídos en una molécula. Esto puede ser explicado por la teoría de orbitales moleculares.

La Teoría de Orbitales Moleculares (T.O.M.) es la segunda aproximación al estudio del enlace covalente, y la más ampliamente empleada para explicar la estructura y la geometría de muchos sólidos inorgánicos. El punto de partida consiste en asumir que si los dos núcleos implicados en el enlace se ubican a la distancia de equilibrio, los electrones se alojarán no en orbitales atómicos de cada elemento, sino en orbitales moleculares, que son análogos a los atómicos, y que presentan características similares, como se verá más

Absorb

ancia

Longitud de onda (nm)

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adelante. Esta analogía es de tal grado que al igual que ocurría con los átomos polielectrónicos, no es posible resolver la ecuación de Schrödinger de forma exacta para la molécula, y de nuevo hay que recurrir a métodos aproximados para conocer la forma de las funciones de onda que representen los mencionados orbitales moleculares.

Uno de los métodos más empleados es el que hace uso de las Combinaciones Lineales de Orbitales Atómicos (CLOA). Esta aproximación puede entenderse de forma simple si se piensa que cuando un electrón esté cerca de uno de los núcleos, es decir, cuando esté “controlado” por un núcleo, su función de onda será muy similar a la de un orbital atómico. Los orbitales moleculares de la molécula de H2 se obtienen de forma aproximada mediante la combinación lineal de los orbitales atómicos 1s de cada átomo de hidrógeno. Únicamente se pueden escribir dos combinaciones lineales:

Ψ+ = cAφA +cBφB

Ψ- = cAφA – cBφB

Los coeficientes ci que aparecen en la combinación lineal reflejan la contribución de cada orbital atómico al orbital molecular: cuanto mayor sea el valor del coeficiente mayor será la participación del orbital atómico en el molecular. Para la molécula de H2 la contribución de ambos orbitales atómicos a los orbitales moleculares es la misma, esto es, cA = cB = 1, de forma que las expresiones matemáticas de las funciones de onda se pueden simplificar:

Ψ+ = φA + φB

Ψ- = φA – φB

Ψ + (izquierda) y Ψ- (derecha)

En la figura anterior se representan las funciones Ψ+ y Ψ- (parte radial) frente a la distancia internuclear. La función Ψ+ concentra la densidad electrónica entre

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los dos núcleos, debido a una interferencia constructiva φA y φB, lo que aumenta la amplitud en la región internuclear. Por el contrario, la función de onda Ψ- concentra la densidad electrónica fuera de la zona comprendida entre los dos núcleos. La interferencia de tipo destructivo entre las funciones de onda φA y φB

cancela sus amplitudes y da lugar a la formación de un plano nodal en la región internuclear. Obviamente, la molécula será más estable si los electrones se encuentran en el orbital Ψ+, porque esto origina un aumento de la atracción electrón-núcleo y una disminución de las repulsiones nucleares. La combinación Ψ+ = φA + φB corresponde al orbital molecular de menor energía y se denomina orbital molecular enlazante, que ahora se representa como Ψe. Por el contrario, la combinación Ψ- = φA – φB, representa al orbital molecular de mayor energía denominado orbital molecular antienlazante (Ψa). Las energías relativas de los dos orbitales moleculares se muestran en la siguiente figura, que constituye un ejemplo de lo que se conoce como Diagrama de Orbitales Moleculares o Diagrama de Niveles de Energía.

De forma análoga a las limitaciones en el caso de átomos, el principio de exclusión de Pauli limita a dos el número de electrones que pueden ocupar un orbital molecular, lo que obliga a su apareamiento. La molécula de H2 posee una energía menor que los dos átomos de H por separados porque los dos electrones ocupan el orbital molecular enlazante y ambos contribuyen a una disminución de la energía del sistema.

Diagrama de Orbitales Moleculares de la molécula de Hidrógeno.

En definitiva, el enlace en la molécula de hidrógeno puede ahora explicarse en función de la formación de dos orbitales moleculares a partir de dos orbitales atómicos. De forma general, N orbitales atómicos pueden conducir a la formación de N orbitales moleculares. Los electrones ocuparán los Orbitales moleculares siguiendo las mismas reglas que las especificadas para las configuraciones electrónicas de los elementos.

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Unidad III. Espectroscopía UV-visible.

3.1. Aspectos cuantitativos de las mediciones de ab sorción. La absorción molecular en la región UV visible del espectro depende de la estructura electrónica de la molécula. En el análisis por absorción UV visible se cuantifica la energía absorbida que da por resultado la elevación de los electrones del estado básico a orbitales de mayor energía en un estado excitado. Todas las moléculas pueden absorber radiación UV visible debido a que contienen electrones (e-) compartidos y sin compartir que pueden ser excitados a niveles de energía más elevados. Las longitudes de onda en los que ocurre la absorción dependen de que tan fuerte estén unidos los electrones en la molécula. Ejemplo. Los electrones en un enlace covalente están unidos fuertemente por los dos átomos y para su excitación se necesita radiación de alta energía. En el caso de los alcanos cuyos átomos se encuentran unidos por enlaces covalentes se necesitan energías con longitud de onda por debajo de 160 nm para que presenten transiciones. Por ejemplo, el metano CH4 presenta una transición σ-σ* en 122 nm, mientras que una molécula que contiene halógenos, por ejemplo –Cl: tiene e- de sin compartir y uno de estos puede sufrir una transición electrónica de n-σ*. En la práctica la espectroscopía ultravioleta está limitada en gran parte a los sistemas conjugados. Sin embargo se tiene la ventaja en cuanto a la selectividad de la absorción UV. Los grupos característicos pueden reconocerse en moléculas de complejidad ampliamente variable. El espectro UV (Figura III.1) esta formado por una gráfica de longitud de onda en función de la intensidad de absorción que puede estar en forma de transmitancia o absorbancia, siendo la transmitancia la cantidad de luz que pasa a través de la muestra que se está analizando y la absorbancia la cantidad de luz absorbida por la misma.

200 210 220 230 240 250

Figura III.1. Benzoato de hexametil amonio

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Generalmente, las transiciones generadas por la radiación UV visible consisten en la excitación de un electrón desde un orbital molecular lleno (normalmente un orbital π de enlace) a siguiente orbital de energía mayor: (un orbital π de antienlace π*). El orbital de antienlace se designa con un asterisco π - π* La ecuación que describe la relación entre la energía absorbida en una transición electrónica y la frecuencia, longitud de onda y número de onda de la radiación que produce la transición es:

ChhC

hE νλ

ν ===∆

h= constante de Planck C= velocidad de la luz ∆E= la energía absorbida en una transición electrónica desde un estado de energía básico hasta un estado de mayor energía (estado excitado). La energía absorbida depende de la diferencia de energía entre el estado básico y el excitado. Cuanto menor es la diferencia de energía mayor es la longitud de onda de la absorción. Debido a que la ecuación se requiere para producir una transición tiene un valor determinado, el espectro de absorción debería consistir en una línea simple. Sin embargo los espectros de una absorción consisten en bandas de absorción muy anchas en un intervalo de longitud de onda, esto es debido a que la energía de la radiación UV visible produce además de cambios en los niveles electrónicos, transiciones rotacionales y vibraciones traslapadas. Las principales características de una banda de absorción son su posición y su intensidad: • La posición de la absorción corresponde a la λ de la radiación con energía

igual a la que se necesita para que suceda una transición electrónica. • La intensidad de la absorción puede expresarse como transmitancia T

definida por: T= I / I0

Fracción de energía incidente que es transmitida por una muestra

I0 = intensidad de la energía radiante que incide sobre la muestra I = intensidad de energía radiante que sale de la muestra Existe una expresión más conveniente para la intensidad de la absorción que es lo que se deriva de la ley de Lambert-Beer, la cual establece una relación entre la transmitancia, el espesor de la muestra y la concentración de las especies absorbentes:

Log10 (I0 / I) = kcb = A

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Donde: k es una constante característica del soluto c es la concentración del soluto b la longitud de la trayectoria a través de la muestra A es la absorbancia Cuando “C” se expresa en mol/L y considerando que la longitud de la trayectoria (b) a través de la muestra se expresa en cm la expresión anterior se transforma en

A = εbc

Donde ε = absortividad molar o coeficiente de extinción molar. En el caso que “c” este dado en g/L

A = abcg/L

a = absortividad

ε = aM

M = peso molecular del soluto. De la ecuación puede observarse que a absorbancia es directamente proporcional a la concentración (A α concentración)

A T %T log T

3.2. Instrumentación

Un espectrómetro es un instrumento para medir la transmitancia o la absorbancia de una muestra en función de la λ determinada. También: Manuales Clasificación Simple (un haz) De registro Doble haz

C

C C

Pendiente=εb

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En la práctica, los instrumentos de un solo haz (Figura III.2.) por lo general se operan en forma manual y los de doble haz poseen registro automático de los espectros de absorción.

Figura III.2. Disgrama del sistema óptico de un espectrofotómetro de un solo haz. Espectrofotometría de un solo haz Los componentes esenciales son: 1. Una fuente de energía continua que cubre la región del epicentro en la cual

opera el instrumento. 2. Un monocromador. Esta es la parte que aísla una longitud de onda o un

pequeño intervalo de longitud de onda de todo el espectro emitido por la fuente (en la mayoría de los casos se considera que no es posible alcanzar una monocromación completa)

3. Recipiente para la muestra. (Celda de cuarzo, vidrio o polipropileno) 4. Detector (transductor que convierta la energía radiante en una señal

eléctrica. 5. Amplificador y un circuito asociado que traduce la señal eléctrica a la

lectura apropiada. 6. Un sistema de lectura de la medición que pone de manifiesto la magnitud

de la señal eléctrica. Fuente > Monocromador > Muestra > Detector Amplificador Instrumento para lectura

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Fuente de energía La fuente de energía radiante para la región UV visible es una lámpara incandescente con filamento de Tg. en condiciones de operación ordinaria la capacidad de la lámpara de Tg es útil en un intervalo de 350nm – 3000nm. La energía que emite el filamento caliente varía con la longitud de onda.

100 1000 1200 2000 nm

El calor de la lámpara puede ser problemático por lo que el lugar donde se encuentra la lámpara posee un ventilador para evitar que se caliente la muestra u otros componentes del instrumento. Por debajo de los 350nm se debe emplear una fuente diferente. La más común es un tubo de descarga de hidrógeno (o deuterio) el cual se utiliza de 175 – 400nm. La luz emitida por cualquiera de las 2 fuentes es dirigida hacia la muestra a través de espejos. Monocromador Instrumento óptico que sirve para separar de una fuente de radiación continua un haz de elevada pureza espectral y de cualquier longitud de onda. Los componentes esenciales de un monocromador con rendijas y un elemento dispersor. La radiación de la fuente se enfoca sobre la rendija de entrada y es colimada (seleccionada) por una lente o por un espejo para que el haz llegue paralelo al elemento dispersor el cual puede ser un prisma o una rejilla de difracción. Al mover el prisma o la rejilla de difracciones del espectro que produce el elemento dispersor se enfocan sobre la rendija de salida de donde se dirigirá hacia la muestra. Los espectrofotómetros que abarcan la región UV visible del espectro utilizan monocromadores de cuarzo. La pureza espectral de la radiación que emerge del monocromador depende del poder del elemento dispersor y del ancho de la rendija de salida. Portamuestras La mayor parte de la espectrofotometría utiliza soluciones y por esta razón la mayoría de los recipientes para las muestras son celdas para colocar líquidos en el haz del espectrofotómetro, la celda debe transmitir la energía radiante a la región del análisis. Por ejemplo las celdas de vidrio sirven para la región visible y las de cuarzo para la región UV. Las celdas deben tener superficies planas (Figura III.3) para que no intervenga la óptica de la superficie con la luz incidente.

Energía

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Figura III.2. Celdas típicas usadas en espectroscopía UV-visible. Las celdas deben ser llenadas de tal forma que el haz pase a través de la solución con el menisco por arriba del haz. Por lo general las celdas se mantienen inmóviles en la cavidad que las contiene o mediante sujetadores de resorte que aseguran una posición reproducible. Las celdas típicas para las regiones UV visible tienen 1cm de paso de luz (cuadrados 1x1cm) pero pueden existir celdas con camino óptico desde fracciones de cm hasta 10 cm. Detector Características que debe tener un detector: sensibilidad elevada en la región espectral que nos interesa, respuesta lineal para la energía radiante, tiempo de respuesta rápido, buena disponibilidad para la amplificación y alta estabilidad o bajo nivel de ruido. Sin embargo en la práctica no se pueden tener todas estas características sin afectar alguna otra, por ejemplo sensibilidad elevada incrementa en el ruido. Los detectores más comunes en espectro UV visible son los detectores fotoeléctricos de los cuales el más común es el fototubo. El fototubo consiste en un tubo al vacío con una ventana transparente que contiene un par de electrodos) 3.3. Procedimiento para realización de un análisis Los pasos a seguir para cualquier análisis espectrofotométrico, son los siguientes:

1. Selecciona la longitud de onda. 2. Coloca un blanco (solvente puro). 3. Ajustar escala del instrumento para leer cero absorbancia (100%

transmitancia) 4. Colocar la muestra y leer absorbancia o transmitancia.

Cada vez que se cambie la longitud de onda se debe registrar la escala

para compensar cualquier absorción que pudiera tener la solución de referencia con la nueva longitud de onda: por lo general se emplean 2 celdas,

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una para la solución de referencia y la otra para la muestra que se va a medir, el único requisito es que sean celdas iguales.

3.4. Aplicaciones Interpretación de los espectros UV visible.

Los valores de longitud de onda de una molécula conjugada dependen de la naturaleza exacta del sistema conjugado y de sus sustituyentes.

R.B. Woodward y L.F. Fieser 1940 desarrollaron un conjunto de

correlaciones entre las estructuras moleculares y sus máximos de absorción y enunciaron las reglas de Woodward – Fieser los cuales consideran que pueden realizarse algunas generalidades sencillas para estimar los valores aproximados de longitud de onda máxima.

Por ejemplo en el caso de dobles enlaces aislados, las moléculas presentan

máximos de absorción entre 170 y 180nm por centímetro.

H2C CH2

Etileno Ciclohexeno 1,4 hexadieno 171 nm 182 nm 180 nm

En el caso de dienos conjugados la longitud de onda máxima se desplaza

hacia mayores longitudes de onda debido a la mayor deslocalización de los electrones por resonancia (menor energía para transiciones electrónicas)

2,4 hexadieno 3 metileno ciclohexeno 217 nm 227 nm 256 nm 232 nm

(Al agregar un doble enlace) La adición de un doble mas a un sistema conjugado conduce a un

incremento en la longitud de onda máxima entre 30 – 40nm. Los grupos alquilo también incrementan cada valor de longitud de onda

máximo en aproximadamente 5nm por cada uno. Por ejemplo:

λmac 217 nm λmac 232 nm 1,3 butadieno 2, 4 diemtil – 1, 3 - pentadieno

Ejercicio

27

185 nm 235 nm 273 nm 300 nm

Términos utilizados en UV visible

• Efecto batocrómico de grupos alquilo. Desplazamiento de la longitud de onda hacia mayores longitudes de onda.

• Efecto desplazamiento hipsocrómico. Desplazamiento hacia longitudes de onda más corta.

• Auxocromo: sustituyente que no es cromóforo por sí mismo pero que altera la longitud de onda o el coeficiente de extinción cuando se fija a un cromóforo.

• Cromóforo: grupo funcional responsable de la absorción. Ejemplos: o Dienos y polienos o Poliinos y eninos o Aldehídos y cetonas o Ácidos α, β insaturados, lactones y esteres o Aromáticos y heterocíclicos

Espectros de absorción UV de dienos y polienos Efecto batocrómico de grupos alquilo Cada grupo alquilo funciona como un auxocromo, produciendo un desplazamiento batocrómico pequeño de aproximadamente 5nm. Número de grupos alquilo Compuesto λmax (nm)

0 H2C

HC

HC CH2

217

1 H3C

HC

HC

HC CH2

224

1 H2C C

HC CH2

CH3

220

2 H2C C C CH2

CH3 CH3

226

2 H3C

HC

HC

HC

HC CH3

227

3 H3C C

HC C CH2

CH3 CH3

232

28

4 H3C C

HC C

HC CH3

CH3 CH3

241

Efectos de conformación para los dienos que tienen principalmente la conformación trans se forma un valor base de longitud de onda máximo igual a 217nm que es el valor del butadieno no sustituido. A este valor se le suma 5nm por cada sustituyente alquilo. Para dienos sujetos a una conformación cis por un anillo de 6 miembros, el valor base es de 253nm + 5nm por cada sustituyente alquilo por ejemplo:

217 nm 217 nm + 10 nm 253 nm + 10 nm

Dobles enlaces conjugados adicionales Para trienos y sistemas conjugados mayores se suman 30nm a los valores base por cada doble enlace adicional. Sin embargo el doble enlace debe estar unido al extremo del sistema conjugado para aumentar la longitud del sistema polienico.

217 nm + 30 nm = 247 nm 253 nm + 30 nm + 10 nm = 293 nm

Existe una contribución más que es la suma de 5 nm mas si alguno de los dobles enlaces en el sistema conjugado es exocíclico con respecto a un anillo. Un enlace exocíclico es aquél que está unido por extremo a un anillo. Por ejemplo:

Reglas de Woodward Fieser para dienos conjugados 1. Agrupamiento 2. Corrección por sustituyente (nm) 3. Otro C=C conjugado +30 4. Grupo alquilo +5

29

5. Doble enlace exocíclico +5 además del aumento por longitud del solvente

253 + 4(5) + 2(5) = 283 nm 253 + 30 + 5(5) + 3(5) = 323 nm 253 + 2(30) + 5(5) + 3(5) = 353 nm

Absorción de grupos carbonilo Los grupos carbonilo tienen 2 tipos de electrones fácilmente disponibles que pueden sufrir transiciones en UV: los e- π y los pares de electrones no compartidos o e- n sobre el oxígeno. Transiciones n→π* requieren de menor energía que las transiciones π→π*. Las primeras se encuentran a mayores valores de longitud de onda. En el caso de sistemas conjugados como las cetonas α, β – insaturadas muestran las 2 transiciones n→ π* y π →π* desplazadas hacia longitudes de onda mayores que la de los sistemas aislados. La naturaleza de la transición puede ser anulada por el efecto del cambio en la polaridad del disolvente sobre la longitud de onda máxima.

Disolventes más polares producen transiciones n→π* desplazadas hacia longitudes de onda menores y hacen que las transiciones π→π* sean desplazadas hacia longitudes de onda mayores.

Para explicar el efecto que tienen estos disolventes se considera la

formación de enlaces por puentes de hidrógeno entre el grupo carbonilo y el hidrógeno de grupos hidroxilo.

En disolventes polares, los electrones no enlazados del átomo de

hidrógeno están coordinados con disolventes hidroxílicos disminuyendo la carga neta de los electrones no enlazantes por lo que transición n→π* es de mayor energía o de menor longitud de onda. La cantidad del desplazamiento hacia una longitud de onda menor es de hecho una medida de la fuerza de los enlaces por puentes de hidrógeno en ese disolvente

R

RC O H OR

Por otro lado, la transición π→π* es desplazada hacia longitudes de onda mayores en un disolvente más polar: esto es debido a la estabilización del sistema excitado por la presencia de un grupo polar, por ejemplo.

30

C O C O

Esto disminuye la distancia entre π→π* disminuyendo la energía o aumentando la longitud de onda de la transición

π* π*

n n π π

Disolvente no polar Polar El efecto del disolvente sobre las transiciones n→π y π→π* de la 4–metil –3–penten–2–ona se muestra en la siguiente tabla.

CH3 O

Disolvente π → π* n → π* Hexano 229.5 327

Eter 230 326 Etanol 237 315

Metanol 238 312 H2O 244.5 305

Predicción de las transiciones π → π en cetonas α,β–insaturadas

Valores base

R

O 210 nm, si R = H

215 nm si R = alquilo

31

Por cada grupo alquilo ubicado en posición α al grupo carbonilo, la longitud de onda máxima se incrementa en 10 nm; por cada grupo alquilo en posición β la longitud de onda máxima se incrementa en 12 nm. Cada grupo alquilo en posición γ y δ incrementa la longitud de onda en 18 nm. Cada doble enlace exocíclico desplaza la longitud de onda máxima en 5 nm. Cada doble enlace conjugado adicional incrementa la longitud de onda en 30 nm. Por ejemplo:

H3C

C

H3C

HC C CH3

O

CH3

O

O

O

O

O

32

O

Aplicaciones de la espectrofotometría UV-visible %T Vs. λ A Vs. λ Energía Vs. λ

A = abC A = εbC

TA

1log=

La forma del espectro de absorción depende de la concentración de las muestras. Si consideramos la ley de Beer podemos observar que a cada concentración hay un cambio en la absorbancia a cada longitud de onda.

Figura III.4. Variación del (a) % de transmitancia y (b) la absorbancia en función de la concentración de la muestra. Identificación de sustancias químicas El espectro de absorción de una muestra se puede considerar como una característica física más de un compuesto que no varía y puede ser utilizada junto con Pf, índice de refracción y otras propiedades para caracterizarlo.

Pend = ab

C

C

C

A

%T

Log T

33

Debe tenerse en cuenta que el espectro de absorción no solo depende de la naturaleza química del compuesto en cuestión sino de la presencia de disolventes que puede producir una desviación de la longitud de onda en las bandas de absorción. La forma de una banda y en particular la definición de las bandas pueden depender de las características del instrumento, como son resolución, velocidad de banda y ganancia.

Existen ya registrados los espectros de eventos de compuestos por lo que para identificar muestras desconocidas se recurre a una comparación. Para identificación de compuestos desconocidos con frecuencia son muy útiles las correlaciones de espectro – estructura en las regiones UV – infrarrojo.

Análisis multicomponentes En algunos casos no es completamente necesario que los componentes

individuales de una mezcla compleja sean separados de los demás, por ejemplo en espectroscopía UV–visible, algunas veces es posible medir más de un componente en solución. Supongamos que una solución tiene dos componentes X y Y que absorben radiación. La complejidad de la situación depende de los espectros de absorción de X y Y.

Caso 1(Figura III.5).

Figura III.5. Espectros no superpuestos. En el caso en que los espectros no se sobreponen, o al menos es posible encontrar una longitud de onda en donde X absorbe y Y no. Los componentes X, Y se miden sencillamente en las longitudes de onda, λ1 y λ2 respectivamente.

Caso 2 Sin embargo en el caso en que los espectros se sobreponen

paralelamente (Figura 2). Y no interfiere con la medición de X en λ1, pero X si absorbe en forma apreciable junto con Y en λ2. La concentración de X se determina directamente a partir de la absorbancia de la solución en λ1. Después, la absorbancia Y tiene esta concentración de X en λ2 se calcula a partir de la absortividad molar de X en λ2. Esta contribución se resta a la

A

X

Y

λ1 λ2

34

absorbancia del componente Y, cuya concentración se calcula después en la forma acostumbrada.

Figura III.6. Espectros parcialmente superpuestos.

Caso 3 Los espectros se sobreponen por completo cuando no se pueden

encontrar una longitud de onda en la que X o Y absorban de forma exclusiva, como se sugiere en la figura 3. Es necesario resolver dos ecuaciones simultáneamente con dos incógnitas.

A1 absorbancia medida en λ1 A2 absorbancia medida en λ2

ε X1 absortividad molar de X en λ1

ε X2 absortividad molar de X en λ2

ε Y1 absortividad molar de Y en λ1

ε Y2 absortividad molar de Y en λ2

Cx Concentración molar de X

A

X

Y

λ1 λ2

X + Y

X

Y

35

Cy Concentración molar de Y B Ley de trayectoria Puesto que la absorbancia es la suma de las contribuciones de

absorción de cada uno de los componentes de la solución

A1 = εX1bCx + εY1bCy A2 = εX2bCx + εY2bCy

Incógnitas C x y Cy Los valores de ε deben conocerse a partir de la medición de las

soluciones, puras de X y Y en las dos longitudes de onda. Se pueden establecer las ecuaciones para cualquier número de

componentes siempre y cuando se midan los valores de absorbancia de cada uno de ellos en todas las longitudes de onda. Sin embargo la importancia de pequeños errores al hacer la medición se incrementa al aumentar el número de componentes y en la práctica este sistema por lo general se limita a un sistema de dos o posibles tres componentes.

Preparación de muestras

Algunos de los elementos de la tabla periódica absorben con fuerza en la región visible o en UV, pero sólo cuando presentan ciertos estados de oxidación para preparar estas muestras se requiere de incluir tanto reacciones redox como separaciones, por ejemplo. El Mn2+ frecuentemente se determina espectrofotométricamente después de una oxidación a Mn (VII) mediante adición de persulfato o peryodato.

2 Mn2+ + 5 S2O8

2- + 8 H2O > 2 MnO4- + 10 SO4

2- + 16 H+ La solución púrpura de se MnO4

- mide alrededor de 525nm. El Cr se determina en forma similar después de que se oxida a Cr (VI). El Fe puede determinarse mediante el color rojo que se obtiene al tratar

soluciones de Fe (III) con tiocianato.

Fe3+ + SCN- > (Fe SCN)2+ Otros ejemplos de complejo coloridos que se forman con reactivos

inorgánicos son el complejo azul de tetra amincobre (Cu (NH3)4)2+ y diversos

complejos ácidos como el ácido fosfomolibdico (H3P (Mo3O10)4)·29 H2O que se utilizan para determinar elementos como el P y el Si. El ion yoduro forma iones complejos amarillentos que presentan un máximo de absorción en la región UV con varios metales incluyendo Br, Sb y Pd, por ejemplo.

PdI4

2-

Los complejos coloridos que se forman con los iones metálicos y los reactivos orgánicos ofrecen una variedad impresionante de métodos

36

espectrofotométricos que son especialmente útiles en el análisis de trazas de algún compuesto (aguas de desecho).

Algunas veces la baja solubilidad acuosa de muchos de los compuestos

metálicos quelatos pero, por otra parte, la extracción de los metales en disoluciones no acuosas por medio de agentes quelantes puede llevar a métodos analíticos muy poderosos. En los casos favorables puede ser posible encontrar el metal, separarlo de las interferencias y desarrollar el sistema absorbente en una sola etapa. Por ejemplo los quelatos de la 8 hidroxiquiroleína (oxina) con metales como Al, Fe (III) y Cd, Ga, Pb y Cu, son solubles en cloroformo y antes de hacer una determinación espectro fotométrica se realizan extracciones con este disolvente. La extracción se puede hacer de forma muy selectiva controlando el pH de la fase acuosa y adicionando agentes formadores de complejos que enmascaran ciertos iones metálicos. Con las soluciones de cloroformo que tienen una concentración de µg/ml. Por lo general se obtienen valores ed absorbancia razonables. Sin embargo en los procedimientos espectrofotométricos en algunas regiones del espectro no únicamente debe disolver la muestra, sino que además no debe absorber en forma apreciable en la región en donde se va a realizar la determinación.

Disolvente Mínima aprox.

(nm) Disolvente

Agua 190 Cloroformo 250 Metanol 210 Tetracloruro de C. 265

Ciclohexano 210 Benceno 280 Hexano 210 Tolueno 285

Eter dietílico 220 Pridina 305 P. dioxano 220 Acetona 330

Etanol 220 Bisulfuro de C. 380

Problemas de la ley de Beer 1. El compuesto orgánico 3–ciano–5–metilpiridina (C7H6N2 PM 118.14)

presenta una banda de absorbancia UV en 272nm en solución de etanol. Una solución que contienen 0.274mg de este compuesto en 10ml de etanol dio una absorbancia de 0.7 con una celda de 1cm. Calcule la absortividad y (b) la absortividad molar de compuesto en una longitud de onda de 272nm.

2. El reactivo orgánico soluble en agua e incoloro 1, 10 fenantrolina

forma un ion complejo con el Fe2+ de color rojo intenso (Fe(Fen)3)2+ que

algunas veces se utiliza para la determinación espectrofotométrica del hierro. La longitud de onda para la máxima absorción es 310nm. Para desarrollar el color, la solución que contiene hierro se trata con un agente reductor como la hidroxilamina, que convierte todo el hierro a Fe2+ y después se le adiciona un exceso de fenantrolina.

Siguiendo este procedimiento se trató una alícuota de 5.00 ml de una solución estándar con un total de 20µg de Fe y se diluyó a un volumen final de 10ml. Se encontró que la absorbancia de la solución a 510nm en una celda de 1.0cm fue de 0.397. Calcule la absortividad molar del Fe en el ion complejo.

37

3. Una alícuota de 5ml de una solución que contenía una cantidad de

hierro desconocida se trató con el mismo procedimiento del problema #2. La absorbancia en 510 nm fue de 0.142 con una celda de 1cm. Calcule los contenidos de Fe presente en µg/mL.

4. Un compuesto cuyo peso molecular es 100 tiene una absortividad

molar de 1*105 ¿Cuántos gramos de este compuesto se deben disolver en exactamente 1 litro de solución para que después de diluirla 200 veces la solución tenga una A=0.5 en una celda de 1cm?

5. Una muestra de 1.0g de un acero desconocido se disolvió en HNO3 y

el Mn se oxidó a MnO4- con persulfato de potasio. Después la solución se

diluyó a 500ml en un matraz volumétrico. Se trató de igual forma 0.578g de una muestra de acero certificada por la asociación nacional de estándares con 0.25% de Mn. La absorbancia de la muestra desconocida fue 236 veces más que la del estándar. Calcule el % de Mn presente en la muestra de acero desconocido.

6. Una muestra de 0.525g de una aleación de acero se disolvió; el Mn se

oxidó a MnO4-2 y la solución se diluyó a 100ml en un matraz volumétrico. La A a

525nm en una celda de 1cm = 0.496. La ε del MnO4- a 525nm es 2.24*103.

Calcule el % de Mn en el acero. PM MnO4 = 118.93 7. El volumen de sangre de una persona se puede estimar inyectándole

en una vena una cantidad conocida de tintura innocua y determinando su concentración en el plasma sanguíneo por medio de espectrofotometría unos minutos después cuando toda la tintura se ha mezclado bien por la circulación. Se supone no hay sangre que se acumule o estanque dentro del cuerpo, que la tintura permanece en el sistema vascular y que solo está en el plasma sanguíneo, esto es, que no forma parte de las células de la sangre. Al haber obtenido el volumen del plasma, se calcula el volumen total de la sangre que a partir de la información sobre la fracción del plasma en toda la sangre. Un laboratorio utiliza una solución estéril en ampolleta que contiene tintura conocida como azul de Evans. A una persona del sexo masculino que pesa 75kg se le inyecta por vía intravenosa exactamente 1mL de esta solución, 10 min después se le saca una muestra de sangre. La sangre se centrifugó para separar cada plasma de las células y se encontró que el plasma representaba el 53% del volumen total. La absorbancia del plasma representaba en una celda de 1cm en la longitud de onda apropiada fue 0.323. Otra muestra de 1ml de la solución de tintura original se diluyo exactamente a 1 litro en un matraz volumétrico. Se tomó una alícuota de 10 mL de esta solución y se diluyó a 50 mL en un matraz de aforación. La A de la solución final fue de 0.20. Calcule el volumen de sangre del hombre expresada en litros.

8. Muchas aminas forman sales cristalinas con el ácido pícrico. Todas

las soluciones en etanol de estas sales tienen casi el mismo espectro UV con una λmax = 380nm y ε= 1.35*104, debido al componente picrato. El peso molecular del ácido pícrico (2, 4, 6 trinitrofenol) C6H3N3O7 es de 229.1. Una muestra de una amina desconocida se convirtió en picrato y la sal se

38

recristalizó y se secó. Se disolvieron 16.2 mg de la sal en 100 mL de etanol y 10 mL de esta solución se diluyeron a 100 mL. La A de esta solución fue de 0.624 a 380nm en una celda de 1cm.

a. Calcule el peso molecular de la amina b. El químico orgánico que tenía la amina sospechaba que se trataba de

la 4 etil anilina C5H11N. Es la determinación del peso molecular confirmatoria? Solución a los problemas

1. lgg

l

ml

mgC /027.0

10*10

10*274.0

10

0274.3

3

=== −

−

92.25)/0274.0)(1(

7.0 ===lgcmbc

Aa

aM=ε

17.3018

)/14.118)(54.25(

==

εε molg

2.

lgl

g

ml

gC /10*2

10*10

10*20

10

20 33

6−

−

−

=== µ

5.188)/10*2)(1(

397.03

=== − lgcmbc

Aa

410*108.1

)/85.55)(5.198(

===

εε molgaM

3.

lmolb

AC

lgcmab

AC

/10*29.110*1.1

142.0

/10*15.7)1)(5.198(

142.0

54

4

−

−

===

===

ε

1mol > 55.85 g 1.29*10-5 >>>>>>>>>>>>> 7.2*10-4 g/l

4. lmolcmb

AC /10*5

)1)(10*1(

5.0 65

−− ===

ε Diluida

39

lmolC

lmoloriginalnsolC

/10*1

)200)(/10*5(_´.3

6

−

−

==

VPM

gM

.=

gg

lmolglmolg

VPMMg

1.0

)1)(/100)(/10*1(

))()((3

==

=−

5. 1g acero + HNO3 0.578g acero estándar

aceroabCA = 0.25% Mn

stst abCA =

stacero

stacero

stacero

CC

abCabC

AA

36.2

36.2)(

36.2

==

=

0.25% de 0.578g = 1.445*10-3g de Mn

lg

volgC

volgC

volgC

acero

acero

st

/10*82.6

/10*41.3

)/10*445.1)(36.2(

/10*445.1

5

3

3

3

−

−

−

−

=

=

=

2g/L > 100% 6.82*10-3 >>>>>>>>>>>> 0.341% Mn 6.

lmolcmab

ACMnO /10*214.2

)1)(10*24.2(

%4.0 434

−− ===

)/93.54)(/10*214.2( 4 molglmol− mol1 lMnO /4 > g93.54 de lMn /2+

mol410*214.2 − >>>>>>>>>>>>>>>>>>>> lg /012.0 2+Mn 0.525g / 0.1l > 2.25 lg / 2.25 lg / > 100% 0.012 lg / >>>>>> 0.23%

40

7. Solución en sangre Solución de Evans

abC

A

bCaA

s

s

sss

=

=

abC

A

abCA

E

E

EE

=

=

E

sEs

E

E

s

s

A

ACC

C

Aab

C

A

=

==

lmllml

Cs

lmll

ml

ml

mlCE

/323.02.0

)323.0)(/2.0(

/2.005.0

01.0

50

01.0

==

===

En la sangre se tienen 0.323ml de solución de Evans por cada litro de

sangre ∴1ml se encuentra en 3.096 litros de sangre. #.096 represente el 53% Total de sangre 5.84 litros. 8. PM = 229.1 Amina + Acido pícrico > PM picrato ε = 1.33*104

16.2mg 100ml 100ml 10ml

lgmg

g

l

mg

l

mgiónConcentrac /162.0

)1000(

)1(2.16

1.0

62.1 ===

aM

lgcmbC

Aa

=

===

ε

518.38)/0162.0)(1(

624.0

518.38

10*35.1 4

==a

Mε

48.350=M del picrato M de la amina molg /38.1211.22948.350 =−=

41

Unidad IV. Espectroscopía infrarroja (I.R.)

La espectrometría del infrarrojo es sumamente útil para determinaciones cualitativas de compuestos orgánicos y para deducir estructuras moleculares a partir de sus grupos funcionales tanto de compuestos orgánicos como inorgánicos. En el análisis cualitativo la espectroscopia de infrarrojo puede usarse para la identificación de sustancias puras o para la absorción, localización e identificación de impurezas. Para localizar una impureza en una sustancia se hace una comparación en el espectro de las sustancia que se estudia y una muestra de la sustancia pura. Las impurezas causan bandas de absorción adicionales que aparecen en el espectro. En el IR también se está encontrando uso cada vez mayor en el análisis cuantitativo, el principal campo de aplicación de este tipo de análisis se halla en la cuantificación de contaminantes atmosféricos que provienen de procesos industriales.

La región del infrarrojo (del latín infra = debajo) del espectro corresponde a energía que va desde valores inferiores a las frecuencias del visible hasta valores que colindan con frecuencias más altas que el microondas y radar: es decir abarca longitudes de onda entre 8*10-5cm–1 y 10-2 cm-1. Los espectrofotómetros infrarrojos normales trabajan a la mitad de esta región a longitudes de onda 2.5*10-4 cm y 25*10-4 cm que corresponde a energías desde 1.1 – 11 Kcal por mol. Aunque los fotones infrarrojos no tienen la energía suficiente para provocar transiciones electrónicas pueden hacer que vibren grupos de átomos con respecto a los enlaces que los unen. Al igual que las transiciones electrónicas, estas transiciones vibracionales corresponden a energías específicas y las moléculas solo absorben radiación infrarrojo a ciertas longitudes de onda y frecuencias.

La posición de una banda de absorción infrarrojo se especifica por su

longitud de onda medida en micrómetros o micras (µm). 1 micra = 10-6 m. Sin embargo la unidad mas empleada en la reacción infrarrojo es el número de onda ν que corresponde al número de ciclos (longitudes de onda) de la onda en 1 cm. Este número de onda es el recíproco de la longitud de onda en centímetros. Las unidades del número de onda son cm-1.

)(

/10000

)(

1)( 1

m

cmm

cmcm

µλµ

λν ==−

)(

/10000)(

1−=cm

cmmm

νµµλ

Por ejemplo:

42

14000

5.2

/10000 −== cmm

cmm

µµν

mcm

cmm µµλ 42500

/100001

== −

El número de onda es proporcional a la frecuencia ν y por lo tanto

también es proporcional a la energía de la radiación ya que νhE =

3.1. Teoría de la absorción IR Para explicar las vibraciones de una molécula, los enlaces covalentes

entre los átomos son representados como un resorte el cual si se estira, tiene que haber una fuerza de restauración que jala entre si a los dos átomos hacia la longitud de enlace de equilibrio. Por el contrario si el enlace es comprimido, la fase de restauración empuja a los dos átomos, alejándolos. El estiramiento o compresión del enlace para soltarlo es lo que hace que los átomos vibren. Fuerza del resorte Fuerza del resorte Long. de enlace en elequilibrio Estirado Comprimido La frecuencia de la vibración de tensión depende de dos cantidades: las masas de los átomos y la rigidez del enlace. Los átomos más pesados vibran más lentamente que los más ligeros por ejemplo en un enlace C–D tiene una característica L que el enlace C–H. En un grupo de enlaces con energías de enlace similares. La D disminuye cuando aumenta el peso atómico. Los enlaces más fuertes por lo general son más rígidos y necesitan de mayor fuerza para extenderlos o comprimirlos por lo tanto vibran más rápidamente que los enlaces más débiles (suponiendo que los átomos tengan masas semejantes) por ejemplo los enlaces O – H son más fuertes que C – H y por lo tanto los primeros vibran a mayor frecuencia. De igual manera los dobles enlaces vibran a mayores frecuencias que los enlaces sencillos. En un grupo de enlaces con átomos de masas semejantes la frecuencia aumenta con la energía de enlace.

Frecuencia de tensionamiento de enlaces Tipo de enlace Energía enlace kcal Frecuencia de tensión

C - C 83 1200 C = C 146 1660 C = C 200 2200 C – N 73 1200

43

C = N 147 1650 C = N 213 2200 C – O 86 1100 C = O 178 1700 C – H 100 3000 C – D 100 2100 C – C 83 120

Existen muchas absorciones diferentes aparte de las vibraciones de flexión. En una vibración de flexión las longitudes de los enlaces permanecen constantes, pero los ángulos de enlace vibran con respecto a sus valores de equilibrio. Por ejemplo, los modos de vibración del grupo metileno serán:

Una molécula no lineal con n átomos tiene por lo general 3n – 6 modos fundamentales de vibración por lo tanto CH4 tiene (3)5–6=9 modos fundamentales y el etano 3(8) – 6 = 18 modos fundamentales por lo que el número de absorciones en un espectro infrarrojo es bastante grande para moléculas sencillas. Es poco probable que dos campos diferentes tengan las mismas fracciones para todas sus ubicaciones complejas. Por este motivo se considera que el espectro infrarrojo de una huella dactilar de una molécula. De hecho la región del espectro que contiene la mayor parte de estas vibraciones complejas (600 – 1400 cm-1) se llama normalmente región dactilar del espectro.

44

Como las vibraciones de tensión simple son las más características y predecibles, el estado de la espectroscopia infrarroja se concentrará en ellas aunque por el momento se ignoren las vibraciones de flexión. Vibraciones activas e inactivas en infrarrojo No todas las vibraciones moleculares absorben radiación infrarroja. Para comprender cuales lo hacen y cuales no es necesario tener en cuenta la interacción entre el campo electromagnético con un enlace molecular. La clave de esta interacción esté en el momento dipolar del enlace. Un enlace con momento bipolar puede visualizarse como una carga (+) y una (–) separadas por un resorte. Si se coloca este enlace en un campo eléctrico este se estira o se comprime dependiendo de la dirección del campo. Cuando el campo eléctrico se encuentra en la misma dirección que un enlace dipolar el enlace se comprime y disminuye su momento dipolar. Cuando el campo se opone al momento dipolar, el enlace se estira y aumenta su momento dipolar. Si esta por tensión y compresión alternas de enlace por la onda electromagnética ocurre a la frecuencia de la velocidad natural de vibración de la molécula se absorberá energía. Las vibraciones de enlaces con momentos dipolares generalmente ocasionan absorciones infrarrojo y se dice que son activas en infrarrojo.

Por otra parte si un enlace es simétrico y tiene momento dipolar cero, el campo eléctrico no interacciona con el, por ejemplo el triple enlace del acetileno tiene momento dipolar cero y sigue siendo cero si se estira o se comprime. Como la ubicación no produce cambio en el momento dipolar no puede haber absorción de energía y se dice que esta vibración es inactiva en infrarrojo y no se observa una frecuencia característica con el espectro infrarrojo, por lo tanto la clave de vibración activa en infrarrojo es que la vibración debe cambiar el momento dipolar de la molécula. En general si un enlace tiene un momento dipolar su frecuencia de tensión origina una absorbancia en el infrarrojo sin embargo los enlaces con momentos dipolares cero a veces tienen absorciones (generalmente débiles) debido a las colisiones moleculares, rotaciones y otras vibraciones que las hacen asimétricas durante una pequeña porción de tiempo.

4.2. Instrumentación Medición del espectro infrarrojo Un espectrofotómetro infrarrojo (Figura IV.1) mide las frecuencias de la luz infrarroja que absorbe un compuesto. En un instrumento típico se emplean dos rayos de luz. El rayo de muestra pasa a través de la celda de la muestra que la mantiene en forma de capa delgada o en disolución. El rayo de referencia pasa a través de la celda de referencia que contiene sólo disolvente. Un espejo rotatorio permite que la luz de cada rayo llegue en forma alternada al monocromador.

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Figura IV.1. Esquema de un espectrofotómetro de doble haz. Las líneas gruesas y obscuras indican una conexión mecánica; las líneas delgadas una conexión eléctrica; las líneas de trazos indican la trayectoria de la radiación. El monocromador emplea prismas o rejillas de difracción para permitir el paso de solamente una frecuencia de luz hacia el detector.

La fuente más común de radiación infrarrojo es un filamento de Nicromo con un centro de cerámica el cual brilla cuando una corriente eléctrica pasa a través de el. Esta fuente es relativamente barata y accesible sin embargo tiene poca intensidad. Una fuente más intensa es la Globar, la cual consiste de un anillo de carbono de silicio de 50mm de largo y 4mm de diámetro. • Monocromador. Prisma de NaCl o rejillas de dispersión. • Detector. La mayoría de los detectores son simplemente termopares que

registran el calor incidente. Un tipo de estos detectores consiste en una pieza de lámina de oro obscurecida.

• Detector Golay. Consiste en una celda de gas xenon que tiene una placa de un metal conductor del calor. Cuando el metal es calentado por la luz, este expande el gas atrapado produciendo una señal que es detectada por un fototubo.

TRATAMIENTO DE MUESTRAS MUESTRAS DE GASES Se pueden obtener espectros de un líquido de bajo punto de ebullición o gas permitiendo que la muestra se expanda en una celda especial y adecuada. Este tipo de celdas puede variar desde centímetros hasta metros en la longitud de la trayectoria de la luz. Las mayores longitudes de trayectoria se obtienen en celdas compactas proporcionando superficies reflectoras internas de modo que el haz hace numerosas pasadas por la muestra antes de salir de la celda. Por lo general las celdas son de 10 cm de longitud. Las celda se vacía y se llena a través de una válvula de aguja.

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MUESTRAS LIQUIDAS Al trabajar con soluciones diluidas en el infrarrojo ofrece ventajas como la reproductividad de los datos, y además, eligiendo bien la concentración y la longitud de la celda puede hacerse clara y evidente la forma y estructura de las bandas que aparecen en el espectro de absorción y que son de mayor importancia. A pesar de estas ventajas es difícil y a veces imposible encontrar un líquido con la capacidad de disolvente deseada que no sea absorbido fuertemente en la región espectral de interés y además puede ser que haya alguna reacción entre muestra y disolvente por lo que es obvio evitar esta técnica. Entre los disolventes usados se encuentran: acetona, acetonitrilo, benceno, ciclohexano, cloroformo, el disulfuro de carbono, el tetracloruro de carbono estos dos últimos son volátiles, tóxicos y deben ser usados con precaución. Cuando se necesario usar disolventes polares que afectarían la celda de sal por que la disuelve se usan celdas de Irtran. Los disolventes usados en el infrarrojo deben ser previamente desecados para evitar las bandas de absorción del agua y prevenir el ataque a las ventanas de la celda. Las celdas infrarrojas suelen ser de 0.015 a 1 mm y son un poco más estrechas que las usadas en la región del UV -Visible. La trayectoria de la luz en esta gama normalmente requiere concentraciones de muestras de 0.1 a 10%. Generalmente las celdas son desmontables con espaciadores para permitir variación en la longitud de la trayectoria. Celdas de longitud fija de trayectoria son llenadas o vaciadas con una jeringa hipodérmica. Generalmente las celdas son de cloruro de sodio; estas finalmente se velan debido a la absorción de humedad (Guardarlas en el desecador). Cuando la cantidad de muestra es pequeña o cuando se dispone del disolvente apropiado es común correr el espectro de líquido puro, la manera de llevar a cabo el experimento es comprimir una gota de liquido puro entre dos placas de sal de roca de 0.015 mm o menos de espesor. Las dos placas unidas por capilaridad se montan en la trayectoria de la luz, este proceso no da datos de transmitancia muy reproducibles, pero es satisfactoria para investigaciones cualitativas. Los líquidos puros o volátiles los podemos trabajar en las celdas desmontables.

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Figura IV.2. Vista extendida de una celda desmontable de infrarrojo para muestras líquidas. Se dispone de espaciadores de teflón con grosores de 0.015 a 1 mm. MUESTRAS SOLIDAS Cuando los sólidos no pueden disolverse en disolventes trasparentes en el IR pueden ser suspendidos en un medio trasparente apropiado formando una mezcla de dos fases. Una característica importante es que el tamaño de partícula del sólido suspendido debe ser menor que la longitud de onda de la radiación ya que si no se cumple esta condición se pierde parte de la radiación por dispersión. Las técnicas comunes son dos: Técnica del Amasado. Consiste en triturar finamente de 2 a 5 mgrs. de la muestra en estudio (tamaño de partícula menor de 2m), colocar en un portaobjetos una cantidad mínima de estos cristales y agregar de 1 o 2 gotas de aceite pesado de hidrocarburo (Nujol). Si interfieren las bandas de hidrocarburos, puede usarse fluoroluble o perfluoroqueroseno, y con la esquina del portaobjetos o con una espátula hacemos una “masa”. Se toma una gota de la muestra y se pone en la ventana de NaCl. Lo que hace el aceite es bloquear la refracción de los cristales de la muestra. Técnica de Pastillaje. Un miligramo de la muestra finamente triturada se mezcla íntimamente con 100 mg de polvo de KBr desecado. La mezcla puede hacerse en un mortero de ágata. Después se vierte con una espátula y con mucho cuidado la cantidad suficiente de muestra para cubrir la matriz, para uniformar la superficie cubierta se le pueden dar golpecitos. Después se cubre con el émbolo y se le lleva a un prensa hidráulica a 240 Kgr/cm2 para obtener un disco trasparente, al llegar a esa presión se deja unos 2 minutos y se descomprime lentamente para evitar la ruptura de la pastilla. Se saca la matriz de la prensa y se desliza delicadamente el émbolo, para separar la pastilla y pasarla cuidadosamente al portamuestras. Se obtienen mejores resultados si se forma el disco en el vacío para eliminar el aire ocluido, para eso es la boquilla. Después el portamuestras que contiene la pastilla se coloca en el paso del haz del instrumento colocando el atenuador al 80% de transmitancia se corre el espectrograma y se obtiene el espectro de absorción.

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Film. Se recorta una cartulina de 4.9 cm de ancho por 7.6 cm de largo. A 2 cm de uno de los extremos se dibuja una ranura exactamente centrada de 0.9 cm de ancho por 2 cm de largo y se recorta. Sobre esta base se monta el polímero: poliestireno, celofán, etc. Se pone frente al haz del aparato colocando el atenuador de tal manera que el graficador quede al 80% de transmitancia y se corre el espectrograma. Se puede determinar el grosor del film , si se calcula el número de ondas (ΛN ) entre dos longitudes de onda determinadas λ 1 y λ2, y se sustituye en la ecuación : b = ΛN 2( λ1-λ2 ) 4.3 Regiones espectrales importantes en IR Presentación del espectro infrarrojo El espectro infrarrojo puede dividirse en 3 regiones: • Región de grupos funcionales 4000–1400 • Región dactilar 1400–910 • Región aromática 910–650 cm-1 Grupos funcionales: –OH, CH, -NH, -SH, C=O, C≡C, C=C, C=C-H y C≡C-H 4.4. Interpretación de espectros IR y aplicaciones Espectroscopía de hidrocarburos Los hidrocarburos solo tienen enlace C-C y C-H por lo que las frecuencias de los enlaces C-C y C-H pueden indicar la presencia de dobles y triples enlaces C-C (Figura IV.1). Los enlaces más fuertes absorben a frecuencias más altas que los débiles debido a la mayor rigidez, los enlaces C-C absorben a 1200, C=C en 1660 y C=C 2200. Las absorciones de los dobles enlaces C=C son de mucha utilidad para la determinación de estructura. La mayor parte de los enlaces sustituidos asimétricamente producen vibraciones de tensión observables en la región entre 1000-1680 cm-1. La frecuencia de vibración de tensión del doble enlace depende si hay otro doble enlace cercano. Por ejemplo, cuando se tienen dos dobles enlaces conjugados, el traslape de los enlaces π provoca una mayor densidad electrónica en los dobles enlaces, por lo tanto son menos rígidos y vibran a menor energía que un doble enlace aislado. Los dobles enlaces absorben entre 1640 y 1680 cm-1 y los dobles enlaces conjugados entre 1620 y 1640 cm-1. El efecto de la conjugación es aún marcado en compuestos aromáticos. Los dobles enlaces aromáticos corresponden aproximadamente a 1 ½ enlaces más que dobles enlaces verdaderos y por lo tanto son menos rígidos y por consecuencia presentan una menor frecuencia de absorción, pues se presentan alrededor de 1600 cm-1.

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C= aislado 1640 – 1680 C=C conjugado 1620 – 1640 C=C aromático aprox – 1600 Los triples enlaces en los alquinos son más fuertes que los enlaces sencillos dobles y por lo tanto absorben luz infrarroja a mayores frecuencias. La mayor parte de los triples enlaces tiene fracciones de tensión entre 2100 y 2200 cm-1. Los alquinos terminan por lo general dan señales nítidas de tensión C=C de intensidad moderada. La absorción de tensión en los enlaces triples de un alquino interno puede ser débil o estar ausente debido a la simetría del triple enlace disustituído con momento dipolar muy pequeño o cero. R–C=C–H tensión 2100 – 2200 cm-1 R–C=C–R tensión débil Tensión de enlace C–H Los enlaces C–H absorben generalmente en fracciones inferiores, muy cercanos a 3000 cm-1, mientras que los que tienen carbonos hibridados sp2 absorben en valores superiores y cercanos a 3000 cm-1. Un orbital sp3 tiene ¼ parte de carácter s mientras que un orbital sp2 tiene 1/3 parte de carácter s por lo que se espera que el enlace con el orbital sp2 sea más fuerte que el enlace con sp3 y por lo tanto el primero tenga mayor fuerza de vibración. El C–H de alquino terminal se forma con un orbital híbrido sp con ¼ s el cual es más rígido que sp2 y sp3 y absorbe a mayor frecuencia.

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Figura IV.1. Espectros IR de hidrocarburos. Otros grupos funcionales El aspecto típico de un espectro IR es el que se muestra en la figura:

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Cada absorción observable en el espectro corresponde a una vibración determinada de algún enlace dentro de la molécula.

MODOS DE VIBRACIÓN DE LOS ENLACES

Hay diferentes modos normales de vibración en las moléculas, llevan asociado un movimiento característico de los átomos, los principales son: las deformaciones de enlace, angulos de valencia, angulos diedros, deformaciones fuera del plano, etc. Deformación de enlace

Cada uno de estos tipos de vibración tiene asociada una frecuencia característica, que puede ser calculada mediante la ecuación de Hooke para el movimiento vibratorio:

υ = (1/2π)�√k/mA (ec. 1)

υ = (1/2π)�√k/u (ec. 2) donde k es la constante de fuerza del enlace y u es la masa reducida del sistema. Según sea la relación entre las masas de los átomos que intervienen en el enlace, así usaremos la ecuación (1) cuando mA << mB o la (2) cuando ambas masas sean equiparables. Como ya se mencionó, en una molécula con n átomos deben aparecer 3n-6 bandas de tensión y flexión (3n-5 cuando la molécula es lineal); de todas ellas solo darán una banda observable en el IR aquellas vibraciones que produzcan un cambio en el momento bipolar (las vibraciones simétricas no aparecen en el IR, pero se podrían observar en la espectroscopia Raman). A la hora de identificar los grupos funcionales con la espectroscopia IR vamos a considerar el espectro de IR dividido en varias zonas tal y como se mencionó anteriormente. De acuerdo con dicha división se podrán identificar diversos grupos funcionales, tal y como se indica en la siguiente Tabla:

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GRUPO FUNCIONAL NUMERO

DE ONDA

(cm-1)

GRUPO

FUNCIONAL

NUMERO

DE ONDA

(cm-1)

OH (enlace de hidrógeno)

3100-3200 -C ≡ C- 2300-2100

OH (sin enlace de hidrógeno)

3600 -C ≡ N ~ 2250

Cetonas 1725-1700 -N=C=O ~ 2270

Aldehídos 1740-1720 -N=C=S ~ 2150

Aldehídos y cetonas α,β-insaturados

1715-1660 C=C=C ~ 1950

Ciclopentanonas 1750-1740 NH 3500-3300

Ciclobutanonas 1780-1760 C=N- 1690-1480

Ácidos carboxílicos 1725-1700 NO2 1650-1500 1400-1250

Esteres 1750-1735 S=O 1070-1010

Esteres α,β-insaturados 1750-1715 sulfonas 1350-1300 1150-1100

δ-Lactonas 1750-1735 Sulfonamidas y sulfonatos

1370-1300

1180-1140

γ-lactonas 1780-1760 C-F 1400-1000

Amidas 1690-1630 C-Cl 780-580

-COCl 1815-1785 C-Br 800-560

Anhidridos 1850-1740(2)

C-I 600-500

Como se puede observar la mayor parte de los grupos funcionales más frecuentes en Química Orgánica presentan una absorción característica en el espectro IR. Valgan como ejemplos los que se muestran a continuación:

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Unidad V. Espectroscopía de absorción atómica

5.1 Principios de la absorción atómica

Mientras que la mayoría de las técnicas espectroscópicas se utilizan para el estudio y caracterización de moléculas o iones en su entorno cristalino, la espectroscopía de emisión y absorción atómica se usa casi exclusivamente para el análisis de átomos. Por consiguiente, la técnica resulta casi insuperable como método de análisis elemental de metales. En principio, la espectroscopía de emisión puede utilizarse para la identificación y para la determinación cuantitativa de todos los elementos de la tabla periódica.

Cuando la transición se produce desde el estado fundamental hasta un estado excitado del átomo mediante la absorción de radiación de una determinada frecuencia (característica para cada átomo), estamos en el caso de las técnicas de absorción. En el caso en que los átomos se lleven previamente a un estado excitado y se mide la intensidad de la radiación emitida a la frecuencia característica correspondiente a la transición desde el estado excitado al estado fundamental, hablamos de técnicas espectrofotométricas de emisión. A continuación se tratan las técnicas espectrofotométricas de absorción atómica, de fotometría de llama y de emisión por plasma.

Pueden identificarse tres clases diferentes de procesos de emisión que difieren en cómo la sustancia alcanza el estado excitado previo a la emisión.

a) Emisión a partir de una excitación electromagnética.

b) Emisión a partir de excitación térmica.

c) Emisión a partir de excitación eléctrica.

Los tipos más importantes de espectros de emisión se basan en la utilización de energía no electromagnética para llevar a un átomo o a una molécula al estado excitado, a partir del cual se miden las emisiones de radiación. El proceso puede describirse según:

X + (energía eléctrica o térmica) ® X* (excitación)

X* ® X + hv (emisión)

• Fotometría de llama

Es una técnica de emisión que utiliza una llama como fuente de excitación y un fotodetector electrónico como dispositivo de medida. Se trata principalmente de un método de análisis cuantitativo y es uno de los métodos más sencillos y precisos para el análisis de metales alcalinos, la mayor parte de los metales alcalinotérreos y algún otro elemento metálico. También es posible realizar un análisis cualitativo examinando todas las longitudes de onda del espectro de emisión (espectrofotometría de llama o fotometría de llama). Su aplicación es limitada si se compara con la espectroscopía de emisión ordinaria, ya que la

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energía de la llama permite excitar únicamente de 30 a 50 elementos, siendo este número función del tipo de llama utilizada. La muestra debe estar disuelta.

Espectroscopía de absorción atómica

Es una técnica muy relacionada con la fotometría de llama ya que se utiliza una llama para atomizar la disolución de la muestra de modo que los elementos a analizar se encuentran en forma de vapor de átomos. Ahora bien, en absorción atómica existe una fuente independiente de luz monocromática, específica para cada elemento a analizar y que se hace pasar a través del vapor de átomos, midiéndose posteriormente la radiación absorbida.

En la siguiente figura se compara un esquema de espectrofotómetro de emisión de llama (a) y él de absorción atómica (b).

Dada la estrecha relación existente entre absorción atómica y fotometría de llama es inmediata una comparación entre ellas. En fotometría de llama la sensibilidad es proporcional al número de átomos que se han excitado, mientras que, en absorción atómica la sensibilidad depende del número de átomos que se encuentran en el estado fundamental. Normalmente, tan sólo un pequeño porcentaje de átomos se encuentran en estado excitado en la llama. Por lo tanto, la absorción atómica da lugar, en general, a una mayor sensibilidad que la fotometría de llama para un gran número de elementos.

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Además, la absorción atómica es una técnica que presenta menos interferencias y es más simple que la fotometría de llama, lo que explica el espectacular desarrollo de la técnica en los últimos años. Hay que señalar que a pesar de ello, la absorción atómica no ha eliminado el uso de la fotometría, sino que ambos métodos deben considerarse complementarios, siendo la sensibilidad de cada uno de ellos superior a la del otro para determinados elementos.

Las ventajas fundamentales de la utilización de la llama como fuente de excitación son que los espectros son muy sencillos y que los resultados cuantitativos tienden a ser más reproducibles. Los espectros son sencillos debido a la baja energía de excitación de la llama que da lugar a pocas líneas de emisión. Este hecho hace disminuir el problema de las interferencias espectrales a partir de líneas y bandas de otros elementos y además no implica la necesidad de un monocromador de elevada resolución. La mayor reproducibilidad de estos métodos se debe al mejor control de las variables en una excitación por llama.

Las dos desventajas más importantes de los métodos de emisión en llama son que la energía de excitación es demasiado baja para la mayoría de los elementos y que la muestra debe estar disuelta. En absorción atómica la baja energía no es una desventaja tan importante ya que la misión de la llama, en ese caso, es únicamente atomizar la muestra y formar un vapor de átomos sin excitar; por esta razón es aplicable a un mayor número de elementos que la fotometría de llama.

La diferencia entre fotometría de llama y absorción atómica radica principalmente en los distintos métodos de medida de las señales.

5.2. Instrumentación para absorción atómica

Un espectrofotómetro de absorción atómica es básicamente un espectrofotómetro de llama al que se le ha añadido una fuente de radiación. Para conseguir eliminar la señal de fotometría de llama y recoger únicamente la de absorción se modula la fuente de cátodo hueco.

a) Fotómetros de llama

Existe una gran variedad de equipos que van desde los fotómetros de filtro de haz único a los espectrofotómetros de multicanal con corrección automática del ruido de fondo.

b) Espectrofotómetros de absorción atómica

En los últimos años se han desarrollado a gran velocidad los espectrofotómetros de absorción atómica y en el mercado existen desde los instrumentos muy sencillos de haz simple hasta diseños complejos automatizados. La mayoría de los instrumentos se diseñan de modo que puedan utilizarse en fotometría de llama. En la siguiente figura se recoge el

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diagrama de bloques de espectrofotómetros de absorción atómica.

Función y condiciones de las llamas

La llama tiene tres funciones básicas: permite pasar la muestra a analizar del estado líquido a estado gaseoso; descompone los compuestos moleculares del elemento de interés en átomos individuales o en moléculas sencillas y excita estos átomos o moléculas.

Las condiciones que debe cumplir una llama para considerarla satisfactoria es que tenga la temperatura adecuada y que en ella se forme un ambiente gaseoso que permita las funciones mencionadas. Además, el ruido de fondo de la llama no debe interferir las observaciones a efectuar.

Una llama típica consta de: cono interno, cono externo y zona entre conos como podemos observar en la siguiente figura.

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El cono interno es la zona en que tiene lugar, generalmente, una combustión parcial, es decir sin equilibrio térmico. Esta zona se calienta por conducción y radiación a partir de la región más caliente que se encuentra sobre ella. En ella se forman los productos de oxidación intermedios, se produce una gran emisión de luz (a partir del combustible y no de la muestra), una elevada ionización y una gran concentración de radicales libres. Es muy poco utilizada para trabajo analítico.

Inmediatamente encima de la región del cono interno se encuentra la zona interconal Es la llamada parte caliente de la llama y en ella tiene lugar una combustión completa y se alcanza casi un equilibrio termodinámico. Esta llama es la que se utiliza prácticamente en análisis por fotometría de llama y espectroscopía de absorción atómica. La altura de esta zona sobre el quemador varía considerablemente con el tipo de quemador, la naturaleza de los gases utilizados y su velocidad de flujo.

La región del cono externo es una zona de combustión secundaria en la que los productos parcialmente oxidados como el monóxido de carbono pueden completar su combustión. Esta región se enfría por el aire circundante y es, en general, una región poco útil.

Fenómenos que tienen lugar en la llama

1. - Se evapora el agua o los otros disolventes dejando como residuo diminutas partículas de sal seca.

2. - La sal seca se vaporiza, es decir, pasa al estado gaseoso.

3. - Las moléculas gaseosas, o una parte de ellas, se disocian progresivamente dando lugar a átomos neutros o radicales. Estos átomos neutros son las especies absorbentes en espectroscopía de absorción atómica y son las especies emisoras en fotometría de llama.

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4. - Parte de los átomos neutros se excitan térmicamente o se ionizan. La fracción excitada térmicamente es importante en análisis por fotometría de llama ya que el retorno al estado fundamental de los electrones excitados es el responsable de la emisión de la luz que se mide.

5. - Parte de los átomos neutros o de los radicales que se encuentran en la llama pueden combinarse para formar nuevos compuestos gaseosos. La formación de estos compuestos reduce la población de los átomos neutros en las llamas y constituye las llamadas interferencias químicas que se presentan en los métodos de análisis que utilizan llamas.

La eficacia con que las llamas producen átomos neutros tiene mucha importancia. La llama de óxido nitroso-acetileno, que es más caliente que la de aire acetileno, parece ser más efectiva para la formación de átomos neutros. Los metales alcalinos son una excepción, probablemente debido a que la ionización es apreciable en la llama caliente. En cualquier caso, estos dos tipos de llama son los más adecuados para fotometría de llama y absorción atómica.

A las temperaturas ordinarias de llamas es relativamente baja la fracción de átomos del estado fundamental que se excita. Únicamente si la temperatura de la llama es muy elevada la fracción de átomos excitados empieza a ser apreciable. Este hecho pone de manifiesto la necesidad de controlar la temperatura de la llama cuidadosamente para fotometría de emisión. Por el contrario, la fracción de átomos en el estado fundamental es muy elevada y, por lo tanto, pequeñas fluctuaciones en la temperatura de la llama no son importantes para el análisis por absorción atómica.

La ionización que tiene lugar en las llamas produce normalmente la pérdida de un sólo electrón y se puede representar:

A ® A+ + e-

A = átomo neutro

A+ = su ion positivo

e- = electrón libre

Este proceso de disociación depende de la concentración o de la presión, ya que una especie se disocia en dos. Al aumentar la presión parcial de los átomos en la llama, el porcentaje de ionización disminuye tal como debe esperarse de la aplicación de la ley de Le Chátelier.

A la temperatura de la llama acetileno-oxígeno la mayor parte de los elementos se encuentran apreciablemente ionizados. El grado de ionización del elemento a analizar puede disminuirse por adición de una elevada concentración de otro elemento que sea más fácilmente ionizable (tampón de radiación o supresor de ionización).

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Es preferible, por lo general, suprimir de este modo la ionización a utilizar temperaturas de llama más bajas que hacen aumentar las interferencias químicas.

UNIDAD VI. CROMATOGRAFÍA

6.1. Conceptos generales La característica que distingue a la cromatografía de la mayoría de los métodos físicos y químicos de separación, es que se ponen en contacto dos fases mutuamente inmiscibles. La fase estacionaria y la móvil. Una muestra que se introduce en la fase móvil es transportada a lo largo de la columna que contiene una fase estacionaria distribuida. Las especies de la muestra experimentan interacciones repetidas (repartos) entre la fase móvil y la fase estacionaria. Cuando ambas fases se han escogido en forma apropiada los componentes de la muestra se separan gradualmente en bandas en la fase móvil. Al final del proceso los componentes separados emergen en orden creciente de interacción con la fase estacionaria. El componente menos retardado emerge primero, el retenido más fuertemente eluye al último. El reparto entre las fases aprovecha las diferencias entre las propiedades físicas y/o químicas de los componentes de la muestra. Los componentes adyacentes (picos) se separan cuando el pico que sale después es retardado lo suficiente para impedir la sobreposición con el pico que emergió antes. Una amplia gama de selección de materiales para las fases móvil y estacionaria, permite separar moléculas que difieren muy poco en sus propiedades físicas y químicas. En un sentido amplio, la distribución de un soluto entre dos fases es el resultado del balance de fuerzas entre las moléculas del soluto y las moléculas de cada fase. Refleja la atracción o repulsión relativas que presentan las moléculas o iones de las fases competidoras por el soluto y entre sí. Estas fuerzas pueden ser de naturaleza polar, proviniendo de momentos dipolares permanentes o inducidos, o pueden deberse a fuerzas de dispersión del tipo London. Parámetros teóricos que afectan la separación croma tográfica

- Comportamiento cromatográfico de los solutos. El comportamiento cromatográfico de un soluto puede describirse de diversas formas. Se considera importante introducir las definiciones de algunos términos importantes para la cromatografía en columna (ver figura), como son:

Tiempo de retención, tr. El tiempo que un soluto permanece en la columna, se mide desde el momento de la inyección hasta la elusión del pico máximo. Es

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característico del soluto para condiciones de operación constantes. Auxiliar en la identificación de los solutos. Tiempo muerto, t0. El tiempo requerido para eluir un soluto que no se retiene en la fase estacionaria. Tiempo que un soluto permanece en fase móvil. Representa el espacio vacío de la columna. Tiempo de retención ajustado, t’r. Mide el tiempo que el componente permanece en fase estacionaria.

t’r = tr – t0 Ancho a la base, Wb. Es la porción de la línea base intersectada por las tangentes al pico. Para un pico gaussiano es igual a 4. Tradicionalmente usado en el cálculo de la eficiencia del sistema. Ancho a la mitad de la altura, W_. Una medida mas reproducible, adecuada para evaluar manualmente la eficiencia del sistema (platos teóricos). Número de platos teóricos (N). Cada plato teórico representa un equilibrio teórico de distribución del soluto entre las fases. El número total de platos teóricos de una columna representa el poder de separación de la columna. Una buena columna tiene un número alto de platos teóricos. Se calcula con cualquiera de las ecuaciones:

Comportamiento de retención El comportamiento de retención refleja la distribución del soluto entre la fase móvil y la estacionaria. El volumen de fase móvil necesario para transportar la banda de soluto desde el punto de inyección, a través de la columna, hasta el detector (en el máximo del pico del soluto) se define como el volumen de retención, Vr. Se puede obtener directamente del cromatograma multiplicando el tiempo de retención correspondiente, tr, por el gasto o flujo volumétrico, Fc, expresado como el volumen de fase móvil por unidad de tiempo.

Vr = tr Fc El gasto o flujo volumétrico, en términos de los parámetros de la columna, depende la sección transversal de la columna vacía, la porosidad total del relleno (empaque) de la columna y la velocidad lineal promedio de la fase móvil. Coeficiente de repartición Cuando un soluto entra al sistema cromatográfico inmediatamente se reparte o distribuye entre la fase móvil y la estacionaria. Si la fase móvil se para en cualquier momento el soluto establece un equilibrio de distribución entre las dos fases. La concentración en cada fase está dada por el coeficiente termodinámico de partición (o reparto):

K = Cs / Cm

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donde Cs y Cm son las concentraciones de soluto en la fase estacionaria y móvil, respectivamente. Cuando K = 1, el soluto se encuentra igualmente distribuido entre las dos fases. El coeficiente de reparto determina la velocidad promedio de cada zona de soluto, más específicamente, del centro de la zona de soluto conforme la fase móvil avanza a lo largo de la columna. Resolución El grado de separación o resolución de dos bandas adyacentes se define como la distancia entrelos picos (o centros) dividida entre el ancho promedio de las bandas. Si la retención y el ancho de la banda se miden en unidades de tiempo (ver figura 2), la resolución está dada por:

Rs= 2(tr,2 – tr,1)/(Wb,2+Wb,1) donde los tiempos de retención y los anchos se expresan en las mismas unidades. La resolución mínima aceptable en mezclas sencillas es 1.0 (ver figura 3), una resolución de 1.5 representa separación a la línea base.

La resolución alcanzada en un sistema es proporcional al producto de la selectividad, la eficiencia y la capacidad del sistema, que son los tres más importantes parámetros de control en una columna cromatográfica, siendo la expresión analítica para Rs la siguiente: La resolución de picos adyacentes puede mejorarse ya sea aumentando la separación de los picos o disminuyendo los anchos de los picos individuales.

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Esto involucra la selectividad de la columna cuando se alejan más los picos y la eficiencia cuando se intenta disminuir el ancho del pico. Factor de Capacidad El factor de capacidad o retención k es la cantidad más importante de cromatografía en columna. Relaciona el equilibrio de distribución de la muestra dentro de la columna con las propiedades termodinámicas de la columna y con la temperatura. Para un conjunto dado de parámetros de operación, k es una medida del tiempo transcurrido en la fase estacionaria en relación el tiempo transcurrido en fase móvil. Se define como el cociente de los moles de un soluto en la fase estacionaria entre los moles en la fase móvil:

La razón volumétrica de fases, Vm / Vs, se denota usualmente por β. Así, k’ = K / β. Dicho de otra forma, la razón de reparto es el tiempo adicional que una banda de soluto requiere para eluir, en comparación con un soluto no retenido (para el cual k’ = 0), dividido entre el tiempo de elusión de una banda no retenida:

Capacidad La capacidad en un intercambiador iónico es una medida cuantitativa de su habilidad de tomar contra-iones intercambiables. La capacidad puede ser expresada como la capacidad iónica total, capacidad disponible o capacidad dinámica. La capacidad iónica total es el número de sustituyentes cargados por gramo drenado de intercambiador iónico o por mL de gel hidratado. La capacidad total puede medirse por titulación con un ácido o base fuerte. Eficiencia La eficiencia de la columna está relacionada con el ensanchamiento de la banda que se encuentra en la columna y puede ser calculada:

donde W1/2 es el ancho del pico a una altura media y se expresa como un número de platos teóricos (N) para la columna bajo condiciones experimentales específicas. La eficiencia es conocida frecuentemente como el número de platos teóricos por metro de cama cromatográfica, o expresada como H que es la longitud de la cama (L) dividida por el número de platos teóricos.

H = L / N

A partir de que el valor observado de N depende de factores experimentales tales como la velocidad de flujo y la carga de la muestra, es importante que las

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comparaciones sean hechas bajo condiciones idénticas. En el caso de la cromatografía de intercambio iónico, la eficiencia se mide bajo condiciones isocráticas, usando una sustancia que no interacciona con la matriz como por ejemplo, la acetona. Mejorar la cinética del sistema aumenta la eficiencia de la separación. Una de las principales causas del ensanchamiento de zona en una cama cromatográfica es la difusión longitudinal de moléculas de soluto. El efecto se minimiza si las distancias disponibles para difusión, en ambos la fase móvil y la fase estacionaria, son mínimas. En la práctica esto se logra usando tamaños de cuentas uniformes y pequeños. La mayor eficiencia se logra con minicuentas de 3µm de diámetro, no porosas diseñadas para aplicaciones analíticas y micropreparativas. Después del tamaño de cama, el segundo factor importante es una buena técnica experimental. Las camas cromatográficas empaquetadas irregularmente y burbujas de aire en ellas, producirán canales, ensanchamiento de la zona y pérdida de la resolución. Las buenas separaciones requieren columnas bien empaquetadas. Selectividad La selectividad (α) se define la habilidad del sistema para separar los picos, por ejemplo la distancia entre dos picos. El factor de selectividad puede ser calculado del cromatograma usando la expresión: Una buena selectividad es un factor muy importante, mejorar la selectividad implica alterar la termodinámica del sistema cromatográfico. Rs está relacionada de forma lineal con la selectividad pero relacionada de forma cuadrática con la eficiencia. Esto significa que un incremento de cuatro veces en la eficiencia es necesario para duplicar la resolución en condiciones isocráticas. La selectividad en la cromatografía de intercambio iónico depende no solo de la naturaleza y número de grupos iónicos en la matriz, también depende del pH y fuerza iónica. 6.2. Tipos de cromatografía (Clasificación) La cromatografía puede clasificarse de acuerdo al tipo de equilibrio involucrado, mismo que es gobernado por el tipo de fase estacionaria utilizada. Así la cromatografía puede ser de (1) adsorción, (2) partición, (3) intercambio iónico, (4) exclusión, y (5) afinidad (ver figura 4).

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Nota. Estas son clasificaciones arbitrarias de la técnicas cromatográficas, y algunos tipos de cromatografía se les considera juntas como una técnica separada, como la cromatografía de gases para la cromatografía gas-sólido y gas-líquido. En cualquier caso, los equilibrios sucesivos son los que determinan cuanto tiempo el analito permanecerá unido o se moverá con el eluyente (fase móvil).

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6.2.1. Cromatografía de adsorción La fase estacionaria es un sólido en el que los componentes de la muestra son adsorbidos. La fase móvil puede ser un líquido (cromatografía líquido-sólido) o un gas (cromatografía gas-sólido); los componentes se distribuyen entre dos fases a través de la combinación de los procesos de adsorción y desorción. La cromatografía de capa fina (TLC) es un ejemplo especial de cromatografía por adsorción en la cual la fase estacionaria es un plano, en la forma de un soporte sólido en un plato inerte. 6.2.2. Cromatografía de partición La fase estacionaria de la cromatografía de partición es un líquido soportado en un sólido inerte. De nueva cuenta, la fase móvil puede ser un líquido (cromatografía de partición líquido-líquido) o un gas (cromatografía de partición gas-líquido, GLC). La cromatografía en papel es un tipo de cromatografía de partición en la cual la fase estacionaria es una capa de agua adsorbida en una hoja de papel. La cromatografía de gases es la técnica a elegir para la separación de compuestos orgánicos e inorgánicos térmicamente estables y volátiles. La disponibilidad de detectores versátiles y específicos, y la posibilidad de acoplar el cromatógrafo de gases a un espectro de masas o a un espectrofotómetro de infrarrojo, amplían aún más la utilidad de la cromatografía de gases. Un cromatógrafo de gases consiste en varios módulos básicos ensamblados para: 1) proporcionar un gasto o flujo constante del gas transportador (fase móvil), 2) permitir la introducción de vapores de la muestra en la corriente de gas que fluye, 3) contener la longitud apropiada de fase estacionaria, 4) mantener la columna a la temperatura apropiada (o la secuencia del programa de temperatura), 5) detectar los componentes de la muestra conforme eluyen de la columna, y 6) proveer una señal legible proporcional en magnitud a la cantidad de cada componente. Sólo aprox. 20% de los compuestos conocidos permiten ser analizados por cromatografía de gases, ya sea por que son insuficientemente volátiles y no pasan a través de la columna, o porque son térmicamente inestables y se descomponen en las condiciones de separación. La cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC, de high-performance liquid chromatography) no está limitada por la volatilidad o la estabilidad térmica de la muestra. La HPLC es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales lábiles, materiales poliméricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso molecular. Con una fase móvil líquida interactiva, otro parámetro se encuentra disponible para la selectividad, en adición a una fase estacionaria activa. La separación cromatográfica en HPLC es el resultado de las interacciones específicas entre las moléculas de la muestra con ambas fases, móvil y estacionaria. Tales interacciones esencialmente no existen en la fase móvil para la cromatografía de gases. La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor gama de estas interacciones selectivas y más posibilidades para la separación.

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El recobro de la muestra es fácil en la HPLC. Las fracciones separadas se recolectan en forma sencilla, colocando un recipiente abierto al final de la columna. El recobro es usualmente cuantivativo (exceptuando la adsorción irreversible en la columna) y los componentes separados son fácilmente asilados del disolvente de la fase móvil. Adicionalmente al tipo usual de compuestos orgánicos, la cromatografía líquida en columna puede manejar separaciones de compuestos iónicos, productos lábiles de origen natural, materiales poliméricos y compuestos polifuncionales de alto peso molecular. En el modo normal de operaciones de partición líquido-líquido, una fase estacionaria polar (p. ej. agua, metanol) se usa con una fase estacionaria no polar (p. ej. hexano). Esto favorece la retención de compuestos polares y la elusión de compuestos no polares y se le conoce como cromatografía fase normal. Si se utiliza una fase estacionaria no polar con una fase móvil polar, entonces los solutos no polares serán retenidos y los solutos polares eluidos. Esto se conoce como cromatografía por fase reversa. El mecanismo de separación en cromatografía de fase reversa depende de interacciones hidrofóbicas entre las moléculas de soluto en la fase móvil y el ligando hidrofóbico inmovilizado en la fase estacionaria. La naturaleza actual de las interacciones de unión hidrofóbica asume que la interacción de unión es el resultado de un efecto entrópico favorable. Las condiciones iniciales de unión de la fase móvil usadas en la cromatografía de fase reversa son acuosas lo cual indica un grado alto de estructuras de agua organizadas alrededor de las moléculas de soluto y el ligando inmovilizado. A medida que el soluto que une al ligando hidrofóbico inmovilizado disminuye el área hidrofóbica expuesta hacia el disolvente. Así, el grado de organización de la estructura de agua disminuye con un favorable aumento de entropía en el sistema. 6.2.3. Cromatografía de intercambio iónico La separación en la cromatografía de intercambio iónico depende la adsorción reversible de moléculas de soluto cargadas, a una resina con grupos iónicos de carga opuesta. El mecanismo de separación se basa en un equilibrio de intercambio iónico. Muchos de los experimento de intercambio iónico se llevan a cabo en cinco etapas. La primera etapa es un equilibrio en el cual el intercambiador iónico se encuentra en las condiciones apropiadas de pH y fuerza iónica, lo que permitirá la unión de las moléculas de soluto. En este estado inicial, los grupos que se intercambiarán están asociados con sus respectivos contra-iones (usualmente aniones o cationes simples, como cloruro o sodio). En una segunda etapa se encuentra la aplicación de la muestra y su adsorción, en la cual las moléculas del soluto llevan a cabo el apropiado desplazamiento de carga de los contra-iones y se unen reversiblemente al gel. Las substancias que no se unen son eluídas de la cama del intercambiador usando el buffer inicial.

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En la tercera etapa, se lleva a cabo la desorción de la muestra cambiando las condiciones de elusión, al desfavorecer la formación del enlace iónico de las moléculas de la muestra y la cama del intercambiador. Esto normalmente se logra aumentando la fuerza iónica del buffer de elusión o cambiando su pH. En la cuarta y quinta etapas corresponden a la remoción de sustancia no eluídas bajo las condiciones experimentales previas y regresar al equilibrio de las condiciones iniciales para la siguiente purificación. La separación de diferentes sustancias se lleva a cabo porque éstas tienen diferentes grados interacción con el intercambiador iónico debido a diferencias en sus cargas, densidades de carga y distribuciones de carga en su superficie. Estas interacciones pueden ser controladas variando condiciones como la fuerza iónica y el pH. Las diferencias en propiedades de carga de compuestos biológicos son a menudo considerables, y tomando en cuenta que la cromatografía de intercambio iónico es capaz de separar especies con propiedades poco diferentes. Se pueden llevar a cabo separaciones por intercambio iónico en una columna, mediante un procedimiento en lote o por adsorción en cama extendida. La matriz. Un intercambiador iónico consiste de una matriz sólida insoluble a la cual se unen de forma covalente grupos cargados. Los grupos cargados se asocian a contra-iones móviles. Estos contra-iones pueden intercambiarse reversiblemente a otros iones de la misma carga sin alterar la matriz. La matriz puede tener carga positiva o negativa y los contra-iones también. Los intercambiadores cargados positivamente tienen contra-iones cargados negativamente (aniones) disponibles para ser intercambiados por lo que son llamados intercambiadores aniónicos. Intercambiadores cargados negativamente tienen contra-iones cargados positivamente (cationes) y se les conoce como intercambiadores catiónicos. La matriz puede estar hecha de compuestos inorgánicos, resinas sintéticas o polisacáridos. Las características de la matriz determinan sus propiedades cromatográficas tales como su eficiencia, capacidad y recuperación, así como su estabilidad química, fuerza mecánica y fluidez. La naturaleza de la matriz afectará su comportamiento hacia sustancias biológicas y el mantenimiento de la actividad biológica. Grupos cargados. La presencia de grupos cargados es una propiedad fundamental de un intercambiador iónico, y el tipo de grupo determina el tipo y fuerza del intercambiador iónico; su número total y disponibilidad determina la capacidad. Hay una variedad de grupos que pueden escogerse para usarse en intercambiadores iónicos; algunos de estos se muestran a continuación.

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Se usan los grupos sulfónico y amino cuaternario para formar intercambiadores iónicos fuertes, los otros grupos formar intercambiadores iónicos débiles. Los términos fuerte y débiles se refieren a la extensión de variación de ionización con pH y no a la fuerza del enlace. Los intercambiadores iónicos fuertes están completamente ionizados en un amplio rango de pH mientras que con los intercambiadores iónicos débiles, el grado de disociación y la capacidad de intercambio varían más marcadamente con el pH. 6.2.4. Cromatografía de exclusión por tamaño En la cromatografía de exclusión puede separarse moléculas solvatadas de acuerdo a su tamaño y habilidad a penetrar en una estructura tamiz (la fase estacionaria). La separación en cromatografía de partición y en cromatografía de intercambio iónico se logra de diferentes interacciones de solutos con la fase móvil y la fase estacionaria. En contraste, las separación en cromatografía de exclusión por tamaño se lleva a cabo por diferencias en tamaño molecular y la habilidad de diferentes moléculas para penetrar los poros de la fase estacionaria a diferentes tamaños o magnitudes. La cromatografía de exclusión por tamaño se usa extensivamente para las separaciones preparativas de macromoléculas de origen biológico, así como para la purificación de polímeros orgánicos sintéticos. 6.2.5. Cromatografía de afinidad Este tipo de cromatografía utiliza interacciones altamente específicas entre un tipo de moléculas de soluto y una segunda molécula unida covalentemente (inmovilizada) a la fase estacionaria. Por ejemplo, la molécula inmovilizada podría ser un anticuerpo específico para un proteína particular. Cuando una mezcla cruda que contiene miles de proteínas se pasa a través de una columna, sólo una proteína reacciona con el anticuerpo que está unido a la columna. Después de lavar todos los otros solutos de la columna, la proteína deseada es desplazada del anticuerpo cambiando el pH, la fuerza iónica o la polaridad.

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Las interacciones entre las moléculas del ligando y blanco pueden ser el resultado de interacciones hidrofóbicas o interacciones electrostáticas, fuerzas de van der Waals y/o puentes de hidrógeno. La purificación por afinidad requiere un ligando bioespecífico que puede ser unido covalentemente a una matriz cromatográfica. El ligando acoplado debe retener su afinidad específica de enlace hacia las moléculas blanco, y después de lavar el material no unido, la unión entre la molécula blanco y el ligando debe ser reversible y permitir que las moléculas blanco sean removidas en forma activa. Cualquier componente puede ser usado como un ligando para purificar a su compañero respectivo. Algunas interacciones biológicas típicas usadas frecuentemente en cromatografía de afinidad son: � Enzima sustrato análogo, inhibidor, cofactor. � Anticuerpo antígeno, virus, célula. � Lecitina polisacárido, glicoproteína, receptor de superficie celular, célula. � Ác. nucleico secuencia base complementaria, histonas, polimerasa de ácidos nucleicos, proteína de unión al DNA. � Hormona, vitamina receptor, proteína acarreadora. � Glutatión glutatión-S-transferasa o proteínas de fusión GST � Iones metálicos proteínas de fusión poli (his), proteínas nativas con histidina, residuos de cisteína y/o triptofano en sus superficies. La matriz. Es un soporte inerte al cual un ligando puede ser directa o indirectamente acoplado. Algunas características importantes para ésta son: � adsorción no específica extremadamente baja es esencial ya que el éxito de la cromatografía de afinidad depende de interacciones específicas, � los grupos hidroxilo en los residuos de azúcar pueden servir para unirse a un ligando, proporcionando una plataforma ideal del desarrollo del medio de afinidad, � la estructura de poro abierta asegura una capacidad de unión alta, aún para biomoléculas grandes porque el interior de la matriz estaría disponible para el ataque de ligandos, � propiedades de fluido buenas para la rápida separación, � estabilidad bajo un rango de condiciones experimentales tales como pH alto y bajo, detergentes y agentes disociadores. El ligando. Es la molécula que se une reversiblemente a moléculas específicas o grupo de moléculas, capacita la purificación por cromatografía de afinidad. La selección del ligando para cromatografía de afinidad está influenciado por dos factores: El ligando debe presentar una afinidad de unión específica y reversible para la sustancia blanco y debe tener grupos químicamente modificables que permitan ser unidos a la matriz sin destruir su capacidad de unión. Brazo espaciador. El sitio de unión de una proteína blanco a menudo se localizan dentro de la molécula y un medio de afinidad preparado con pequeños ligandos acoplados directamente a la columna puede exhibir una capacidad de unión baja debido a interferencias estéricas, por ejemplo, el ligando no podría accesar al sitio de unión de la molécula blanco. En estas

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circunstancias un brazo espaciador se pone entre la matriz y el ligando para facilitar la unión específica. El brazo espaciador puede ser diseñado para maximizar la unión específica. 6.3. APLICACIONES La cromatografía de adsorción es particularmente adecuada para el análisis de moléculas no ionizantes, insolubles en agua y relativamente simples, que frecuentemente son isómeros o compuestos muy relacionados. El intervalo de compuestos que pueden separarse se extiende desde los hidrocarburos muy polares hasta compuestos polifuncionales fuertemente polares. Esta cromatografía se ve poco influida por las diferencias en peso molecular y más por los grupos funcionales específicos. En consecuencia, la separación por adsorción de compuestos que difieren solamente en el grado o tipo de sustitución alguilo, como en los miembros de las series homólogas, es pobre. Esta cromatografía se utiliza en la separación de la vitamina D3 y sus metabolitos las vitaminas A, D y E (y compuestos muy relacionados a estas vitaminas), muchas drogas de abuso (LSD, por ejemplo), antidepresivos tricíclicos, bloqueadores beta y los PTHamino ácidos. Los aceites naturales y los extractos de esencias se analizan fácilmente y los pigmentos menos polares de las plantas, tales como los carotenoides y las porfirinas, se han separado con éxito durante muchas décadas. Los ésteres también son factibles de ser separados, siendo los glicéridos y los ftalatos típicos de esta clase de compuestos. También han sido separadas en clumnas de sílice las aflatoxinas y otras micotoxinas. En química clínica cada vez se realiza con más frecuencia el análisis cuantitativo de las drogas de abuso por medio de la cromatografía de fase reversa. Los productos farmacéuticos que se analizan en forma rutinaria incluyen a los barbitúricos, drogas antiepilépticas, analgésicos y sedantes. Aplicaciones adicionales de los métodos de fase reversa son los conservadores alimentarios, herbicidas y azúcares. En el campo farmacéutico ha venido en aumento el uso de esta técnica a costa de la cromatografía de adsorción. Un amplio espectro de biomoléculas, lipofílicas o iónicas, pequeñas o grandes, pueden ser separadas debido a que el contenido de agua en la fase móvil puede variar desde el 100% hasta porcentajes muy bajos o ninguno en absoluto. Los compuestos lipofílicos, tal como los triglicéridos, que tienen una solubilidad muy pobre en los disolventes acuosos de la fase inversa, con frecuencia pueden separarse con una fase inversa no acuosa utilizando una columna empacada de octadecilo y disolventes orgánicos polares como el acetonitrilo o el tetrahidrofurano. En la actualidad, la cromatografía ha alcanzado tal nivel de fineza y especialización que cada uno de sus tipos constituyen herramientas imprescindibles en las áreas de la ciencia y la tecnología, en la industria química, farmacéutica, cosmética, en estudios ambientales, en la clínica, en alimentos, etc.

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