transplante de embriones ovinos y caprinos

5/24/2018 Transplante de Embriones Ovinos y Caprinos ....

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SISTEMAS DE PRODUCCION DE

ALIMENTOS (OTRAS ESPECIES)TALLER #2

TEMA: TECNICA DE TRANSPLANTEDE EMBRIONES


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INDICE

Pg.

1. Introduccin..32. Preparacin fisiolgica de las receptoras......5

2.1Especie caprina....52.2Especie ovina....6

3. Preparacin fisiolgica de las donadoras.......73.1Especie caprina.....73.2Especie ovina......8

4. Mtodos de trasplante de embriones....94.1mtodo por laparoscopia.104.2mtodo por va laparotoma o quirrgico ..114.3mtodo por va cervical ...12

5. medios lquidos para la recoleccin de embriones ..13 6. bsqueda y evaluacin de la calidad de los embriones157. Tcnica de duplicacin de embriones.17.

7.1tcnica de separacin de blastmeros..177.2tcnica de biparticin de embriones18

8. conclusin199. bibliografa 20


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1. INTRODUCCION

La tcnica de trasplante embrionario esta revelndose como una de las

ms eficientes biotecnicas de la reproduccin, teniendo en vista el

mejoramiento gentico del rebao.

La importacin de razas exticas sin riesgos de enfermedades o de otros

problemas, como aquellos relacionados a la calidad gentica de los animales,

es prcticamente inexistente cuando se utiliza el trasplante embrionario.

La tcnica permite a los criadores costos bien bajos si son comparados al de

los animales vivos, adems de no presentar cualquier peligro sanitario, pues

los embriones son prcticamente inmunes a virus y bacterias, por el hecho

de ser sometidos a sucesivos lavados antes de su congelamiento.

La adaptacin al medio ambiente de los animales nacidos de trasplante de

embriones es extremadamente beneficiosa, por tanto las cras maman el

calostro de la receptora, siendo un animal normalmente adaptado al

ambiente y ms resistente a determinadas enfermedades, a travs de las

inmunoglobulinas y anticuerpos con otras enfermedades propias del medio

tropical.

El trmino Transferencia de Embriones es la tcnica por medio de la cual

se colectan embriones en animales donantes y son transferidos o

implementados en animales receptores. Este proceso se lleva a cabo con los

elementos necesarios como droga y equipo y se desarrolla en el campo

gracias al trabajo en conjunto del elemento humano donde se integran los

conocimientos y la prctica diaria de la actividad.


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Historia

En 1890 Walter Heape report que una camada de conejos haba nacido en

su laboratorio como resultado de un trasplante de embriones. Este impacto

fue muy importante y aos ms tarde se reporta las primeras transferencias

de embriones en bovinos y el nacimiento en 1951 del primer ternero a

travs de este medio. A medida que pas el tiempo el inters por la T.E. se

fue haciendo mayor y su aplicacin industrial en ganado se realiz en

Estados Unidos, Australia y Nueva Zelanda a mediados de los setentas.

Los mtodos iniciales usaban la ciruga bajo el efecto de anestesia, tanto

para la recoleccin como para la transferencia. El desarrollo y la

investigacin permiten hoy que este proceso se lleve a cabo sin cirugas y

usando anestesia local.


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2. PREPARACIN FISIOLGICA DE LAS RECEPTORAS:2.1 Especie caprina:

Se utiliza el mtodo francs Chrono gest (I.N.R.A) que consiste en el

uso de esponjas intravaginales impregnadas con 45 mg de acetato de

fluorogestona, depositadas en la porcin craneal de la vagina por un periodo

de 10 das. En el 8 da se realiza la aplicacin intramuscular de 200 UI de

ECG (gonadotrofina corionica equina) y 75 ug de cloprostenol (anlogosinttico de PGF 2C).

En el 10 da se retiran las esponjas y enseguida son observados los celos

con el auxilio de machos vasectomizados o por observacin del

comportamiento de las hembras trabajadas.

En el 15 da del tratamiento, las hembras son sometidas a un ayuno hdrico

y alimentar por 24 horas y en el 16 da son transportadas en el inicio de la

maana al laboratorio para la realizacin de los trasplantes.


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2.2 Especie ovina:

Se utiliza el mtodo francs Chrono gest (I.N.R.A) que consiste en el uso

de esponjas intravaginales impregnadas con 45 mg de acetato de

fluorogestona, depositadas en la porcin craneal de la vagina por un periodo

de 12 das, donde es realizada tambin la aplicacin intramuscular de 400

U.I de E.C.G.

En el 12 da, se retiran las esponjas y enseguida son observados los celos

con el auxilio de machos vasectomizados o por observacin del

comportamiento de las hembras trabajadas.

En el 18 da del tratamiento, las hembras son sometidas a un ayuno hdrico

y alimentar por 24 horas y en el 19 da son transportadas en el inicio de la

maana al laboratorio para la realizacin de los trasplantes.


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3. PREPARACION FISIOLOGICA DE LAS DONADORAS:3.1 Especie caprina:

Se utiliza el mtodo francs anteriormente citado, Chrono gest

(I.N.R.A), que consiste en el uso de esponjas intravaginales impregnadas con

45 mg de FGA, en la porcin craneal de la vagina, permaneciendo por 10

das. En el 6 da, se aplican por va intramuscular 8 mg de FSH (hormona

folculo estimulante), siendo 4 mg en la maana y 4 mg en la tarde. En el 7

da 4mg de FSH, siendo 2 mg en la maana y 2 mg en la tarde ye n el da 8, 4

mg de FSH, siendo 2 mg en la maana y 2 mg en la tarde, haciendo un total

de 16 mg.

En el 10 da se procede a la retirada de las esponjas, realizndose 3

servicios, con un reproductor genticamente superior y de comprobada

fertilidad, en intervalos de 12, 24 y 36 horas.

Transcurrido 17 das del tratamiento, se procede a la recolecta de

embriones, los cuales pueden ser transferidos a fresco por las receptoras

preparadas dentro del mismo periodo de las donadoras. Caso contrario, se

puede procesar el congelamiento de los referidos embriones siendo que, en

promedio, de cada 10 embriones colectados, 6 de ellos son perfectamente

congelables y 4 pueden ser trasplantados a fresco. As como las receptoras,

las donadoras tambin debe ser sometidas a ayuno hdrico y alimentar 24

horas antes de realizar la recolecta de los embriones.


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3.2 Especie ovina:Se utiliza el mtodo francs anteriormente citado, Chrono gest (I.N.R.A),

que consiste en el uso de esponjas intravaginales impregnadas con 45 mg de

FGA, en la porcin craneal de la vagina, permaneciendo por 12 das. En el 9

da, se aplican por va intramuscular 10 mg de FSH (hormona folculo

estimulante), siendo 5 mg en la maana y 5 mg en la tarde. En el 10 da 6mg

de FSH, siendo 3 mg en la maana y 3 mg en la tarde y en el da 11, 4 mg de

FSH, siendo 2 mg en la maana y 2 mg en la tarde, haciendo un total de 20

mg.

En el 12 da se procede a la retirada de las esponjas, realizndose 3

servicios, con un reproductor genticamente superior y de comprobada

fertilidad, en intervalos de 24, 48 y 60 horas.

Transcurrido 19 das del tratamiento, se procede a la recolecta de

embriones, los cuales pueden ser transferidos a fresco por las receptoras

preparadas dentro del mismo periodo de las donadoras. Caso contrario, se

puede procesar el congelamiento de los referidos embriones siendo que, en

promedio, de cada 10 embriones colectados, 6 de ellos son perfectamente

congelables y 4 pueden ser trasplantados a fresco. As como las receptoras,

las donadoras ovinas, tambin deben ser sometidas a ayuno hdrico y

alimentar 24 horas antes de realizar la recolecta de los embriones.


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4. METODOS DE TRASPLANTE DE EMBRIONES:

Tratamiento de induccin

Recolecta y

Trasplante

Laparotomia

Via Cervical

Laparoscopia

Sper ovulacin

(donadora) esponja+ FSH

Sincronizacin (receptora)

esponja + E.C.G

Caprinos y Ovinos

Caprinos y ovinos

Caprinos

RESULTADOS

Ecografas 2 embriones trasplantados

por receptoras.

85% de receptoras gestantes

1.6 producto por receptora (embriones frescos);

1.5 producto por receptora (embriones descongelados)


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4.1 Mtodo por Laparoscopia

Este mtodo fue desarrollado con el fin de mejorar las posibilidades de

repetir en hembras donantes permanentes, la recoleccin de embriones,

evitando adherencias en el tero, oviducto y ovarios.

El animal es anestesiado y colocado sobre la hamaca de sujecin con una

inclinacin antero-posterior de 30 a 45, afeitndose y desinfectndose el

campo operatorio. Se realiza una primera puncin a unos 4-5 cm delante de

la ubre y a 10-15 am a la izquierda de la lnea blanca para colocar una cnula

que se conecta con el endoscopio. Despus de haber colocado aire en lacavidad abdominal para separar la vsceras de los rganos genitales, se

coloca una segunda cnula, al otro lado de la primera, con el objetivo de

introducir una pinza, se sujeta uno de los cuernos por la base con el fin de

punzarlo (aguja de Mintz). Es colocada una tercera cnula, para pasar una

sonda de tres vas, donde se introduce el extremo de la misma por el orificio

de la puncin dentro de la luz uterina.

El globito introducido con la sonda (va 1) es inflado con la finalidad de

obstruir la luz uterina en la base del cuerno, donde es colocado el extremo

de un catter (va 2). El otro catter (va 3) es introducido por el otro su

extremidad lo ms cerca posible de la unin tero- tubrica. La pinaza es

colocada sobre el istmo con el fin de evitar que el lquido pase para el

oviducto. Es inyectado por la sonda (va 3) en torno de 40-50 ml de lquido

fisiolgico de recoleccin que se recupera junto con los embriones por la

sonda (va 2) colocada en la base del cuerno.

Para efectuar el trasplante en la receptora se sigue prcticamente el mismo

procedimiento realizado en la recoleccin de la donadora. Esta operacin


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permite decidir si efectuar o no el trasplante, asi como seleccionar el cuerno,

a travs de la respuesta ovulatoria. El operador ya decidido que es posible

realizar el trasplante en la receptora, escoge el cuerno uterino que recibir

los embriones, siendo sujetado por su parte superior (tercio prximo a la

unin tero- tubrica) con la ayuda de la pinza traumtica y punzado conuna aguja de Mintz, por donde sern colocados los embriones.

4.2 mtodo por laparotoma o quirrgico

Despus de la anestesia se prepara el campo operatorio igual como para la

recoleccin para laparoscopia. Es hecha una incisin de 8 a 10 cm sobre la

lnea blanca que comienza a 3-4 cm delante de la ubre, de permitiendo as

exteriorizar los cuernos uterinos y contar con los cuerpos lteos presentes

en los ovarios. Como fue visto, la recoleccin de embriones se realiza en los

das 6-7, despus del ultimo servicio, en la cual se lava cada cuerno, a nivel

del ligamento intercornual para introducir una sonda de folley y una aguja

en la luz uterina, obstruyndola a travs del globo inflado en el extremo de la

sonda. En el otro lado del cuerno, cerca de la unin tero- tubrica, se

realizar una segunda puncin, donde se introduce un catter el cual se fija a

una pinza atraumtica, permitiendo con que se de una buena obstruccin,

evitando el reflujo de lquido para la cavidad peritoneal. Son inyectados

despus de esto, entorno de 40 a 50 ml de lquido de recoleccin a +37c, ya

sea en la base del cuerno (va retrgada) o cerca de la unin tero- tubrica

(va antergrada). Por el extremo opuesto mediante la sonda o el catter, es

recuperado el lquido, junto con los embriones, que sern depositados en

una placa de Petri.


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Para el trasplante es realizado una incisin de 7-8 cm en la lnea blanca, para

exteriorizar los cuernos uterinos junto con los ovarios, con el fin de decidir

si conviene o no efectuar el trasplante el operador selecciona el cuerno y

realiza una pequea puncin con aguja de punta cnica, evitando lesionar la

mucosa uterina, depositando delicadamente los embriones. Terminado eltrasplante o la recolecta, se coloca en la cavidad abdominal un antibitico

(para evitar infecciones) y posteriormente se sutura el peritoneo y la piel.

4.3mtodo por va cervical

Para la recolecta de embriones por va cervical el animal es anestesiado y

enseguida es introducido en la vagina un especulum con iluminacin para

visualizar el cuello uterino el cual es sujetado con una pinza atraumtica. El

tcnico introducir un dedo en el recto del animal con el fin de guiar el paso

de la sonda de recoleccin en el orificio de la crvix. El paso del catter

dentro del orificio del cuello no siempre es posible en la cabra y menos

todava en la oveja. Al pasar los anillos de la crvix, llegando al cuerpo del

tero evitando el reflujo liquido de la vagina. Despus de obstruido el canal

se inyecta el medio de recoleccin (10 a 20 ml de PBS) en el tero (lavado

los dos cuernos), recuperndose despus con la ayuda de la sonda de

recoleccin. Son practicados varios lavados sucesivos hasta totalizar 100 a200 ml de medio lquido de recoleccin por hembra. Debido a la dificultad

de sobrepasar el cuello uterino y la imposibilidad de manipular los cuernos

uterinos por palpacin rectal como en los bovinos y equinos, la recoleccin

de embriones por la via genital natural es todava una tcnica poco

desarrollada en los que respecta a los pequeos rumiantes.

De la misma forma ocurre con el trasplante, donde los embriones se

expulsan en la base de una de los cuernos o dentro del cuerpo del tero,

siendo siempre incierto el punto exacto alcanzado por el extremo delcatter. Por otra parte, este mtodo no nos permite conocer el estado


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ovrico de la receptora, pudiendo depositar el embrin en el ovario que no

posee el cuerpo o cuerpos lteos, incluso en hembras sin ovulacin.

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MEDIOS LQUIDOS PARA LA RECOLECCIN DE EMBRIONES.La preparacin del medio para la recoleccin y conservacin de los

embriones se detalla en la siguiente tabla:

Es necesario aadir protenas a esta solucin salina para la supervivencia

del embrin y las aporta el 4% de albmina sdica que se aade (BSA)., o

bien un 10% de suero fetal de oveja o de cabra.

En el caso de emplearse suero, ste deber ser descomplementado,

con el fin de inactivar la protena complemento que puede ser txica para elembrin.

Debido a la dificultad de sobrepasar el cuello uterino y la

imposibilidad de manipular los cuernos uterinos por palpacin rectal como

en los bovinos y equinos, la recoleccin de embriones por va genital natural

es una tcnica poco desarrollada por lo que respecta a los pequeos

rumiantes. La recoleccin de huevos por este mtodo es en general baja e

inferior a la obtenida por laparoscopia o ciruga.

MEDIO DE RECOLECCIN PBSSOLUCIN 1 MG/L SOLUCIN 2 MG/LCaCl2 2H2O 132,5 NaCl 8000

MgCl2 6H2O 100,0 KCl 200KH2PO4 200Na2HPO4 1150BSA 4000D-glucosa 1000Na piruvato 36Sulfato deestreptomicina

50

Na penicilina-G

1000000U.I.

Disolver los reactivos de las soluciones 1 (en 200 ml) y 2(en 800 ml de agua destilada)Ajustar el pH a 7,3Esterilizar la solucin final y conservar a 4C


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La recoleccin quirrgica es la que ms frecuentemente se utiliza, lo

que permite exteriorizar los cuernos uterino y contar los cuerpos lteos

presentes en el ovario.

Cuando la recoleccin se realiza los das 2-4 despus del inicio delcelo, la mayor parte de los embriones todava estn en el oviducto por lo que

la tcnica se puede realizar mediante dos tcnicas:

- Introducir el catter de un milmetro de dimetro a 2 cm en el

oviducto por el pabelln de las trompas, luego se inyectan el PBS que se

recoge a travs de un catter tipo Folley que se habr colocado en el final del

cuerno uterino.

- La otra consiste en recoger en el pabelln el lquido inyectado en la

base del cuerno uterino.

Cuando la recoleccin se realiza los das 6-7, el lavado de cada cuerno

uterino se realiza separadamente. Se efecta una puncin en la base del

cuerno, a nivel del ligamento intercornual para introducir una sonda Folley.

La luz uterina se obstruye mediante el inflado de la ampolla situada en el

extremo de la sonda o comprimiendo el cuerno alrededor de la misma por

medio de una pinza a traumtica. En el extremo opuesto del cuerno, cerca de

la unin tero-tubrica, se realiza una segunda puncin, mediante la cual se

introduce un catter de 1-2 cm en la luz y se fija con un clamp vascular o una

pinza a traumtica.

Se inyecta el lquido colector a 37C cerca de la unin tero-tubrica y

se recupera por la sonda. Terminado el lavado se introduce antibitico en la

cavidad abdominal.

La eficacia de la recoleccin es del 70 al 90%, pero disminuye segn se

va repitiendo la tcnica en los mismos animales ya que aparecen

adherencias en el tero, oviductos y ovarios. Este fenmeno puede paliarsemediante la aspersin del tracto genital con suero fisiolgico heparinizado

(50 U.I. de heparina/ml).


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6 BSQUEDA Y EVALUACIN DE LA CALIDAD DE LOS EMBRIONES.

El lquido de recoleccin recuperado despus del lavado de los

cuernos uterinos debe ser revisado mediante una lupa binocular de 10

aumentos como mnimo, de manera que los embriones recuperados seaspiran con una pipeta pina de vidrio en un volumen lo ms reducido

posible y se colocan en una placa de petri con PBS filtrado y un 4% de BSA.

Una vez agrupados e identificados los embriones el operario debe proceder

al control de calidad de los embriones.

Con el fin de limitar los riesgos de contaminacin externa y evitar

eventuales choques trmicos, es preciso o interesante efectuar las

operaciones de manipulacin bajo una cmara de flujo laminar o dentro de

una cmara provista de filtracin de Aire y regulacin trmica.

La calidad de los embriones se basa en aspectos morfolgicos y se

examinan con lupa binocular a 80 aumentos, dando vueltas a stos con una

pipeta de vidrio para apreciar toda su morfologa.

- La zona pelcida debe aparecer ntegra.

La clasificacin es la siguiente:

Excelente: Embrin ideal, esfrico, simtrico, con clulas de tamao,color y textura uniforme.

Bueno: embrin con pequeas desigualdades entre los blastmeros,algo de picnosis y pequeas vesculas.

Regular: embrin con algunas clulas degeneradas, vesiculacin yblastmeros irregulares.

Malo: embrin con muchas clulas degeneradas, grande y grancantidad de vesculas.

El grado de desarrollo embrionario debe ser el adecuado con respectoal momento de recogida. Los embriones que presenten un retraso en el


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desarrollo superior a 48 horas deben ser eliminados. Tampoco se

conservar ningn embrin para el transplante o congelacin a causa del

excesivo retraso de su desarrollo. En los caprinos, el desarrollo embrionario

precoz presenta un retraso de 12 a 24 horas respecto al observado en

ovinos. Al sptimo da despus del inicio del celo la proporcin deembriones en estadio entre blastocisto y blastocisto fuera de la pelcida, es

ms elevada en la oveja que en la cabra.

ESTADO DE DESARROLLO DE EMBRIONES EN LA OVEJA Y LA CABRA

DA DERECOLECCIN

OVEJA CABRA

2 2-4 clulas 1-2 clulas3 8 clulas 4-8 clulas

4 8-20 clulas 8-20 clulas5 mrula joven 20 clulas-mrula joven6 mrula compactada-

joven blastocistomrula

7 blastocisto expandido yfuera de la zona pelcida

mrula compactada.blastocisto expandido

8 blastocisto fuera de lazona pelcida

blastocisto expandido yfuera de la zona pelcida

Cualquiera que sea el desarrollo, el embrin debe ser esfrico y con

los contornos de las clulas perfectamente visibles.

En el estado de mrula compacta, los blastmeros estn muy unidos y

no se pueden apreciar bien los lmites celulares. La presencia de algunas

clulas separadas en el espacio perivitelino no constituye un motivo de

eliminacin, si la mayora de los blastmeros forman una masa esfrica sin

opacidad marcada.

En el estadio de blastocisto las diferentes estructuras deben ser

visibles. Se pueden observar blastmeros en el espacio perivitelino con

granulaciones de las clulas lo que supondra la eliminacin de estos

embriones, as como una opacidad marcada de los blastmeros. Los

embriones con un aspecto dudoso se conservarn de una a dos horas para

ser sometidos a un nuevo examen.

El examen morfolgico no es un test absoluto de viabilidad pero a

veces se constata una diferencia importante entre la apreciacin de lacalidad de los embriones y su supervivencia tras el trasplante.


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7 TCNICA DE DUPLICACIN DE EMBRIONEScuando el trasplante de embriones de forma convencional limita los

resultados satisfactorios en lo que se refiere los nmeros de

embriones producidos por las donantes, nuevas biotcnicas son

aplicadas para conseguir el mximo aprovechamiento gentico de lamatriz en el caso de la oveja, que produce entorno de 5 a 6 embriones,

que da lugar a 3 o 4 corderos, estos resultados pueden ser mejorados

a travs de las tcnicas de duplicacin de embriones que consisten en

el aislamiento de los blastmeros y la tcnica de biseccin o

biparticin de los embriones de las cuales sern abordadas a seguir.

7.1 Tcnica de separacin de blastmerosConsiste en el aislamiento de los blastmeros a travs de lamicromanipulacin. Despus de separados, los blastmeros son

colocados en una zona pelcida individualmente, dando origen a

nuevos embriones genticamente idnticos.

La obtencin de dos individuos a partir de un solo embrin parece ser

un lmite, pero, excepcionalmente, se han obtenido trillizos a

cuatrillizos a partir de pares de blastmeros de un embrin con 8

clulas. Este resultado demuestra que se puede aumentar el nmero

de animales producidos aislando grupos de clulas originarias, este

mtodo original es relativamente complejo y a pesar de haberse

obtenido nacimientos viables, el mismo reduce las probabilidades

numerosas manipulaciones. De hecho, algunas clulas aisladas y

despus depositadas en una zona pelcida muy abierta, son incapaces

de desarrollarse in vivo, esto se debe principalmente a que la zona

pelcida protege el embrin permitiendo as su divisin y dispersin

de los blastmeros.

El embrin joven de ovinos se desarrolla mal despus de las 8-16

clulas en las condiciones de cultivo in vitro, por esto, es necesariotrasplantar los embriones reconstituidos y envueltos en agarosa,

depositndolos en el oviducto de una receptora intermediaria. Estos

debern recuperarse algunos das ms tardes cuando hayan

alcanzado el estadio de mrula o blastocito, para extraerlos del

manguito de agarosa.

Estos sern definitivamente trasplantados en el tero de una hembra

receptora que asegurar su desarrollo hasta el parto.


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7.2 tcnica de biparticin de embriones

la principal biotcnica, que complementa el trasplante de embriones,

para conseguir un mayor ndice de gestacin, se llama biparticin o

biseccin de embriones. Bsicamente es un procedimiento en el cual

los embriones en el estadio de mrula compactada o blastocito, son

divididos en el medio en el medio dado origen a dos hemiembriones.

La divisin es hecha con la ayuda de una lmina y un

micromanipulador, que permite movimientos delicados los cuales no

perjudican el embrin. Esta tcnica es dividida en cuatro etapas,

mencionadas a seguir:

Se abre la zona pelcida con micromanipuladores Se extrae delicadamente el embrin; Con una lmina de vidrio, el embrin es dividido en dos partes

iguales;

Una parte es introducida en la zona pelcida de origen y la otraen una zona pelcida diferente.

La biseccin de los blastocitos en los das 9 y 10 permite obtener corderos

con una eficacia elevada. Este fenmeno se puede explicar por la

intervencin de una seleccin natural.

En el 10 da el embrin ya ha superado la etapa crtica que supone la

formacin del blastocito.


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8. CONCLUSIN

La TE puede incrementar el nmero de cras de una hembra

genticamente superior, permitiendo obtener en promedio 4 cras

por tratamiento de ovulacin mltiple.

Los recientes Avances en el incremento de la eficiencia

reproductiva en la TE han ampliado la posibilidad de su utilizacin

en los programas de mejoramiento gentico aumentando la

difusin de los genes de las ovejas y caprinos de alto valorproductivo.

Futuras investigaciones sern necesarias para reducir los costos e

incrementar el nmero de cras por oveja donante para facilitar su

aplicacin comercial, como se ha logrado en la especie bovina.


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9. BIBLIOGRAFA

Biotcnicas de la reproduccin caprina y ovina. JosFerreira Nunes, Rene Prez Fernndez. 1. Edicin. Cear-

Brasil. 2001. Pginas 61-75

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CCI%C3%93N_CAPRINA_2_DEF.pdf

http://www.produccion-animal.com.ar/produccion_ovina/inseminacion_ovinos/28-

MANUAL.pdf
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transplante de embriones ovinos y caprinos

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