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El Hipotiroidismo Congénito (HC), es una enfermedad que se conoce desde el siglo 15
donde las personas que sufrían de esta condición eran llamados cretinos. Es causada por la
ausencia anatómica o funcional de la glándula tiroides, lo que ocasiona una deficiencia en la
producción de hormonas tiroideas. Estas hormonas son imprescindibles para un adecuado
desarrollo físico y mental desde los primeros momentos de la vida. Esta enfermedad
constituye la causa más frecuente de retardo mental evitable en el niño.
El HC está incluido en los programas de Tamizaje Neonatal de muchos países y estados
por las siguientes razones:
1.- La enfermedad trae como consecuencias anormalidades neurológicas irreversibles.
2.- La detección clínica en neonatos es prácticamente imposible, ya que sus síntomas son
muy subjetivos y escasos.
3.- La enfermedad puede ser tratada eficazmente con un tratamiento simple, suplementación
oral con tiroxina.
4.- La incidencia de la enfermedad es de 1:4000 recién nacidos.
5.- Los métodos de tamizaje disponibles son simples, rápidos, confiables y económicos.
6.-La relación costo-beneficio resulta positiva para la sociedad. El síndrome de hipotiroidismo
congénito HC fue conocido antes del advenimiento del tamizaje masivo para esta
enfermedad.
ETIOLOGÍA: Deficiencia en la producción de hormonas tiroideas.
CLASIFICACIÓN: HC primario (afectación a nivel del tiroides). HC secundario
(afectación a nivel de la hipófisis). HC terciario (afectación a nivel de hipotálamo)
CONSECUENCIAS: Retardo mental, cretinismo, retardo en el crecimiento y desarrollo
psicomotor anormal.
TIPO DE PRUEBA: Inmunoensayos para medir concentraciones de las hormonas
TSH y T4.
UNIDADES: TSH (mUI/L o mUI/mL) y T4 (mg/dL o nmol/L)
CONSIDERACIONES ESPECIALES: Existen valores fisiológicos diferentes en niños
prematuros y enfermos. En el 10 % de los casos se produce una elevación tardía de la
TSH. La medicamentación materna, los anticuerpos maternos antitiroideos o la
exposición del recién nacido frente a iodo ejerce un efecto sobre el tiroides del niño.
TRATAMIENTO: Terapia substitutiva con Levo-tiroxina sódica.
El diagnóstico de la función tiroidea consiste en un control del mecanismo de regulación
mediante la determinación de la TSH y la hormonas T4 (TSH en sangre de cordón). Para el
tiempo diagnóstico de los infantes:
1.- Realización del tamizaje utilizando como prueba inicial de tamizaje la determinación de
T4, y utilizando la determinación de TSH en la confirmación de casos positivos al tamizaje.
2.- Realización del tamizaje utilizando como prueba inicial de tamizaje la determinación de
TSH y utilizando la determinación de T4 en la confirmación.
TSH:
Enzimoinmunoensayo tipo sandwich en el cual los anticuerpos están dirigidos contra la
cadena ß de la TSH. Es un ensayo de tipo cuantitativo.
Elevado:
>= 30mUI/L –en suero
>= 25mUI/L –en papel de filtro
T4: 2
CARACTERÍSTICAS DE LOS HAPTENOS
Son generalmente moléculas pequeñas
No son inmunogénicas por sí solas
Necesitan ser acopladas a proteínas portadoras
Tienen un solo determinante antigénico
Se detecta mediante un ensayo competitivo para la determinación de tiroxina total en
sangre seca colectada en papel de filtro donde el Ag natural y marcado con Enzima
compiten por una cantidad limitada de sitios de unión.
(UMELISA T4), donde < 55,17 nmol/L --- Bajo.
El Hipotiroidismo Congénito (HC), es una enfermedad que se conoce desde el siglo 15
donde las personas que sufrían de esta condición eran llamados cretinos. Es causada por la
ausencia anatómica o funcional de la glándula tiroides, lo que ocasiona una deficiencia en la
producción de hormonas tiroideas. Estas hormonas son imprescindibles para un adecuado
desarrollo físico y mental desde los primeros momentos de la vida. Esta enfermedad
constituye la causa más frecuente de retardo mental evitable en el niño.
El HC está incluido en los programas de Tamizaje Neonatal de muchos países y estados
por las siguientes razones:
1.- La enfermedad trae como consecuencias anormalidades neurológicas irreversibles.
2.- La detección clínica en neonatos es prácticamente imposible, ya que sus síntomas son
muy subjetivos y escasos.
3.- La enfermedad puede ser tratada eficazmente con un tratamiento simple, suplementación
oral con tiroxina.
4.- La incidencia de la enfermedad es de 1:4000 recién nacidos.
5.- Los métodos de tamizaje disponibles son simples, rápidos, confiables y económicos.
6.-La relación costo-beneficio resulta positiva para la sociedad. El síndrome de hipotiroidismo
congénito HC fue conocido antes del advenimiento del tamizaje masivo para esta
enfermedad.
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ETIOLOGÍA: Deficiencia en la producción de hormonas tiroideas.
CLASIFICACIÓN: HC primario (afectación a nivel del tiroides). HC secundario
(afectación a nivel de la hipófisis). HC terciario (afectación a nivel de hipotálamo)
CONSECUENCIAS: Retardo mental, cretinismo, retardo en el crecimiento y desarrollo
psicomotor anormal.
TIPO DE PRUEBA: Inmunoensayos para medir concentraciones de las hormonas
TSH y T4.
UNIDADES: TSH (mUI/L o mUI/mL) y T4 (mg/dL o nmol/L)
CONSIDERACIONES ESPECIALES: Existen valores fisiológicos diferentes en niños
prematuros y enfermos. En el 10 % de los casos se produce una elevación tardía de la
TSH. La medicamentación materna, los anticuerpos maternos antitiroideos o la
exposición del recién nacido frente a iodo ejerce un efecto sobre el tiroides del niño.
TRATAMIENTO: Terapia substitutiva con Levo-tiroxina sódica.
El diagnóstico de la función tiroidea consiste en un control del mecanismo de regulación
mediante la determinación de la TSH y la hormonas T4 (TSH en sangre de cordón). Para el
tiempo diagnóstico de los infantes:
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1.- Realización del tamizaje utilizando como prueba inicial de tamizaje la determinación de
T4, y utilizando la determinación de TSH en la confirmación de casos positivos al tamizaje.
2.- Realización del tamizaje utilizando como prueba inicial de tamizaje la determinación de
TSH y utilizando la determinación de T4 en la confirmación.
TSH:
Enzimoinmunoensayo tipo sandwich en el cual los anticuerpos están dirigidos contra la
cadena ß de la TSH. Es un ensayo de tipo cuantitativo.
Elevado:
>= 30mUI/L –en suero
>= 25mUI/L –en papel de filtro
T4:
CARACTERÍSTICAS DE LOS HAPTENOS
Son generalmente moléculas pequeñas
No son inmunogénicas por sí solas
Necesitan ser acopladas a proteínas portadoras
Tienen un solo determinante antigénico
Se detecta mediante un ensayo competitivo para la determinación de tiroxina total en
sangre seca colectada en papel de filtro donde el Ag natural y marcado con Enzima
compiten por una cantidad limitada de sitios de unión.
(UMELISA T4), donde < 55,17 nmol/L --- Bajo.
INMUNOENSAYOSENSAYOS INMUNOENZIMÁTICOS. GENERALIDADESPRINCIPIOS Y CARACTERÍSTICAS DE LOS ENSAYOSINMUNOENZIMÁTICOS
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INMUNOENSAYOS
Introducción
Los primeros intentos de medir moléculas de interés médico en los fluidos biológicos, datan
de la década del 40 del siglo XX, y concernieron principalmente a metabolitos tales como
glucosa y urea, cuyas concentraciones eran elevadas (mayor de 0.1 mM), o enzimas, ya que
estas podían transformar muchas moléculas de sustrato. Sin embargo, una importante
cantidad de sustancias de interés vital, no podían medirse directamente, ni podían someterse
al análisis enzimático, o estaban presentes en concentraciones muy pequeñas para su
detección por los métodos clásicos de química clínica.
A partir de las últimas décadas del pasado siglo creció el interés por aquellos métodos de
análisis que aprovechan la gran sensibilidad y especificidad de las reacciones inmunológicas.
Esto ha permitido que puedan ser detectadas sustancias presentes en concentraciones muy
pequeñas en muestras biológicas y tienen gran significado en la práctica médica.
Los métodos inmunológicos están basados en el extraordinario poder discriminatorio que
presentan los anticuerpos, los que pueden ser producidos por el sistema inmune de los
vertebrados prácticamente de forma ilimitada, éstos presentan una gran afinidad por agentes
externos extraños (inmunógenos).
Concepto de Inmunoensayo
De acuerdo a las consideraciones expuestas anteriormente se definen como
inmunoensayos a aquellos procedimientos analíticos, cuyo principio se basa en la elevada
especificidad y sensibilidad de la reacción antígeno–anticuerpo para la detección de diversas
sustancias o compuestos, ya sea en forma cualitativa o cuantitativa.
Existen diferentes tipos de inmunoensayos dentro de los que se encuentran los
siguientes:
Cromatografía de afinidad
Radioinmunoensayo (RIA)
Ensayo Radioinmunométrico (IRMA
Enzimoinmunoensayo (EIE)6
Inmunoelectroforesis
Ensayo inmunofluorescente
Inmunoblotting (Western Blot)
Turbidimetría y Nefelometría
Desarrollo y Evolución de los Inmunoensayos
1950: Coons y Kaplan describieron los métodos de marcaje fluorescente de Ac para la
técnica de Inmunofluorescencia.
1959-1960: El surgimiento de las Técnicas de Radioinmunoensayo (RIA), a partir de los
trabajos de Yalow y Berson.
1971: Las técnicas ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) fueron descritas casi al
mismo tiempo por dos grupos de trabajo, el de Engvall y Perlmann en Suecia y el de Van
Weemen y Schuurs en Holanda.
1972: Rubenstein y col. desarrollaron un procedimiento analítico de Inmunoensayo
homogéneo, en el que marcaban la enzima con haptenos, procedimiento denominado EMIT
(Enzyme Multiplied Immunoassay Technique).
1975: Desarrollo de la Tecnología de obtención de Anticuerpos Monoclonales por Kölher y
Milstein.
1980: Ensayos Radioinmunométricos o IRMA (Ekins y col.)
En 1959, Yallow y Benzon presentan un método para la detección de algunas sustancias, las
cuales estaban marcadas con isótopos, éstas constituían antígenos para determinados
anticuerpos, surgiendo así los conocidos métodos de Radioinmunoensayos (RIA). Estos
métodos tuvieron una amplia difusión, jugando un papel importante en el desarrollo de las
ciencias biomédicas.
Estos RIA originalmente utilizaban a las sustancias que se querían determinar marcadas
isotópicamente, es decir presentaban marcado al antígeno.
Pocos años después aparecieron métodos en los cuales los anticuerpos eran marcados con
isótopos, surgiendo así el llamado ensayo Radioinmunométrico o IRMA, lo cual lo distingue
del RIA, que como se ha señalado es el antígeno el que está marcado isotópicamente. De
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manera general se les denomina “radioinmunoensayo”, indistintamente si lo que se
muestra marcado es el antígeno o el anticuerpo.
Muchos ensayos fueron utilizados, principalmente para la cuantificación de hormonas
mediante métodos de RIA, la rápida aceptación de éste, atribuida a su aplicación general,
especificidad y sensibilidad del isótopo radiactivo que minimiza las interferencias, lo convirtió
en un método casi rutinario.
Sin embargo debido a que el tiempo de vida media de mucho de los isótopos radiactivos es
limitada, el efecto dañino de las radiaciones tanto para la salud humana de los operadores
como para el ambiente, así como la necesidad de separar los anticuerpos unidos a los
antígenos marcados y no marcados, además del alto costo de los equipos contadores de
radiactividad y las restricciones legales en el uso de marcadores radioactivos en algunos
países, motivó a que muchos investigadores desarrollaran otros métodos de inmunoensayo
en los que utilizaban marcadores no isotópicos.
El desarrollo de inmunoensayos que utilizan marcadores no radiactivos, hizo posible la
aparición de métodos en los cuales no era necesario la separación de los componentes de
las reacciones, es decir métodos en una sola fase u homogéneos, así como permitió el
desarrollo de ensayos diagnósticos simples en su uso como por ejemplo las pruebas de
embarazo y otros.
En general los inmunoensayos constan de dos etapas fundamentales:
1. Formación del complejo antígeno-anticuerpo.
Incubación del anticuerpo con un extracto que contenga el antígeno.
Adsorción del antígeno (o el anticuerpo) a una fase sólida.
2. Detección del complejo antígeno-anticuerpo.
Conjugación directa del anticuerpo (o el antígeno) con un marcador detectable
(radioactivo, fluorescente, enzima).
Conjugación de un anticuerpo (anti-especie) que reconozca al primer
anticuerpo.
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Conjugación de Proteínas A o G que son capaces de detectar el complejo
antígeno-anticuerpo.
Diferentes tipos de fases sólidas han sido utilizadas en los inmunoensayos dentro de ellos
podemos señalar:
Poliestireno (PES)
Cloruro de Polivinilo (PVC)
Nylon
Polipropileno
Nitrocelulosa
Celulosa
Látex
Goma de Silicona
Vidrio
Muchos son los marcadores que han sido utilizados en los inmunoensayos en la detección
de sustancias biológicas, entre ellos podemos citar a:
- Radioisótopos
- Bacteriófagos
- Liposomas
- Grupos fluorescentes
- Grupos quimioluminiscentes
- Partículas de látex
- Iones lantánidos
- Inmunosensores
- Enzimas
Uno de los marcadores más ampliamente utilizados han sido las enzimas, empleadas
inicialmente en la identificación y localización de antígenos en preparados histológicos.
En 1971 Eva Engvall y Perlman describen por primera vez un inmunoensayo, en el cual
utilizan tubos de poliestireno como soporte o fase sólida en que fijaron anticuerpos, a los que
se enlazaban los antigénos o sustancias a detectar, a éstas posteriormente se le unían 9
anticuerpos marcados con enzimas, las que actuaban sobre un sustrato determinado,
pudiéndose de ésta manera cuantificar la cantidad de dicha sustancia en una muestra
biológica, surgiendo así lo que actualmente es conocido como ELISA. En ese mismo año
Von Wemeen y Schuurs reportan un enzimoinmunoensayo con características similares.
Muchas aplicaciones y modificaciones de las técnicas de enzimoinmunoensayos
aparecieron seguidamente para el uso de la química clínica y la investigación, haciéndose
universal su utilización debido a que su especificidad, sensibilidad y reproducibilidad es
comparable a los RIA.
ENZIMOINMUNOENSAYOS
Concepto de enzimoinmunoensayo
Los enzimoinmunoensayo (EIE), se definen como aquellos inmunoensayos en los cuales la
detección del compuesto a determinar es realizada al evaluar los cambios de concentración
en el producto de una reacción enzimática.
Muchas son las ventajas que avalan el uso de las enzimas como marcadores de anticuerpos
y antígenos, entre ellas podemos mencionar:
- Estabilidad en condiciones de almacenamiento y en la realización del análisis.
- Relativa facilidad en su obtención.
- Relativamente económicas.
- Forman conjugados estables y conservan su actividad después de la conjugación.
- No se contaminan fácilmente.
- No se requiere permiso para su utilización.
- Gran cantidad de sustratos disponibles quimioluminiscentes, fluorigénicos y cromogénicos.
- Gran especificidad y versatilidad de las mismas.
- Pureza, fácil preparación y bajo costo.
- Actividad detectable fácilmente.
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En la siguiente tabla se muestran algunas de las enzimas más usadas como marcadores y
sus correspondientes sustratos, así como el método mediante el cual se detecta el producto
de la reacción.
Enzima Sustrato Método de detección
Peroxidasa de Rábano
Ácido r -hidroxifenilacético Fluorimétrico
Ác. 3-(4-hidroxifenil) propiónico Fluorimétrico
o-fenilendiamina Colorimétrico
Ácido 5-aminosalicílico Colorimétrico
Fosfatasa Alcalina
4-metilumbeliferil fosfato Fluorimétrico
b-naftil fosfato Fluorimétrico
r-nitrofenil fosfato Colorimétrico
BCIP/NBT Colorimétrico
b-Galactosidasa
4-metilumbeliferil-b-D-galactosido Fluorimétrico
o-nitrofenil-b-D-galactosido Fluorimétrico
6-Bromo-2-naftil-b-D-galactosido Fluorimétrico
o-nitrofenil b-D-galactopiranosido Colorimétrico
Clasificación
Diversas son las distintas clasificaciones que encontramos en la literatura con relación a este
tipo de inmunoensayo, nosotros para una mejor comprensión de los mismos los
clasificaremos, teniendo en cuenta si es necesaria o no la separación de los participantes en
dicha reacción, en dos grandes grupos: homogéneos y heterogéneos.
EIE Homogéneos
Estos ensayos se caracterizan por ocurrir en una sola fase (líquida). Este tipo de ensayo no
conlleva la realización de lavados intermedios para separar los componentes que han
reaccionado, lo que se explica por la modificación de la actividad de la enzima utilizada en el
sistema, no siendo necesaria esta separación para poder evaluar el resultado del ensayo.
11
Debido a que estos EIE ocurren en una sola fase líquida, es que reciben el nombre de
homogéneos. Tiene su fundamento en la inhibición o activación catalítica en la reacción Ag-
Ac.
La inhibición en la actividad enzimática se basa probablemente en una inhibición en el
espacio de entrada del sustrato al conjugado Hapteno-Enzimas durante la formación del
complejo Hapteno-Anticuerpo.
Los EIE homogéneos, se caracterizan porque el conjugado que ha reaccionado puede
distinguirse funcionalmente del que no lo ha hecho, y por tanto, es posible distinguirlos, y por
consiguiente, evaluar los resultados del ensayo sin separar la fracción del conjugado que
reacciona de la que no lo hace, por lo cual se denomina "separation-free".
El primer EIE homogéneo desarrollado fue descrito en 1972, con la publicación de
Rubinstein, Schneider y Ullaman de un EIE para la detección de Morfina. En general, estos
EIE son muy empleados en la detección de drogas en fluidos biológicos y en el monitoreo
terapéutico.
Características
Los EIE homogéneos se caracterizan por:
Diferenciación funcional de la fracción del conjugado que ha reaccionado y la que no lo ha
hecho, y por tanto, no requieren la separación de ambas fracciones para evaluar los
resultados del ensayo.
Se basan en un diseño competitivo, en el cual el analito libre compite con el analito
conjugado.
Son generalmente muy rápidos.
Clasificación
Existen diversos tipos de EIE homogéneos, y las clasificaciones que se han hecho de ellos
mismos son muy variadas. A continuación se muestra una clasificación de este tipo de EIE,
abarca a la mayor parte de los mismos:
1- EIE homogéneos en los que el analito se conjuga a una enzima simple.
2- EIE homogéneo en los que el analito se conjuga a una apoenzima.
3- EIE homogéneo en los que el analito se conjuga a un grupo prostético.
4- EIE homogéneo en los que el analito se conjuga a un modulador enzimático.
5- EIE homogéneo en los que el analito se conjuga a un sustrato.12
Debido al hecho de que los EIE homogéneos más difundidos, tanto a nivel de laboratorio
como en forma comercial, son aquellos en los cuales el analito a estudiar se encuentra
conjugado con una enzima simple o con un sustrato, sólo consideraremos a continuación
estos casos.
EIE homogéneos en los cuales el analito se conjuga a una enzima simple
Es el tipo de EIE homogéneo más difundido. En el mismo, se establece una competencia
entre el analito conjugado a la enzima y el analito libre por anticuerpo antianalito que se
incluyen en el sistema. La unión del anticuerpo al conjugado determina una alteración de la
actividad enzimática (generalmente una disminución de la misma). Por supuesto, mientras
mayor sea la concentración del analito libre en la muestra, menor será la cantidad de
anticuerpos que se unan al analito unido al conjugado y por consiguiente, menor será, en
términos cuantitativos, el número de moléculas de enzimas cuya actividad es alterada. La
utilización de estándares de concentración contra la cual se comparan los resultados
obtenidos con una muestra de concentración desconocida.
Este tipo de ensayo se ha comercializado fundamentalmente bajo el nombre de EMIT, y se
han desarrollado kits para la determinación de anticonvulsivantes, antibióticos y otros
medicamentos, tales con Digoxina, Teofilina, etc.
Fig. 1. EIE homogéneo donde el analito se conjuga a una enzima simple.
EIE Homogéneos en los que el analito se conjuga con un sustrato
A
A
A
AE
AE
AE
AE
P
P
SS
A
A
A
A
A
A
AE
AE
AE
AE
AE
AE
AE
AE
AE
AE
AE
AE
AE
AE
AE
P
P
PP
PP
SS SSSS
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Se basa en que un sustrato conjugado con un analito, puede ser transformado en la reacción
enzimática, pero ello no ocurre si el conjugado reacciona con un anticuerpo específico al
analito.
Debe destacarse que en este ensayo la enzima no produce efecto de amplificación, sino que
se usa solamente para distinguir y cuantificar la fracción sustrato-analito libre de la que ha
reaccionado con el anticuerpo. Por ello, para poder obtener señales medibles, se requiere de
sustratos fluorigénicos.
Este tipo de ensayos se recomienda para medir analitos en el rango micromolar.
El analito puede ser una sustancia de bajo peso molecular (menor de 1000) como drogas
terapéuticas, o una macromolécula, como la IgE y la IgM.
Fig. 2. EIE homogéneo donde el analito se conjuga con un sustrato.
EIE Heterogéneos
E
E
A
AA
A
A
AS
AS
AS
AS
P
P
SS
SS
E
E
EE
EE
A
AA
A
AA
AA
A
A
AS
AS
AS
AS
AS
AS
AS
AS
AS
AS
AS
AS
P
P
PP
PP
SS
SS
SS
SS
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Los EIE heterogéneos fueron los primeros en ser descritos, y en general, se conocen como
ELISA (Enzyme Linked InmunoSorbent Assay), ya que en los mismos se utiliza un soporte
sólido en el cual se fija uno de los componentes de la reacción.
Estos ensayos transcurren en dos fases: la fase sólida, en la cual se fija uno de los
componentes de la reacción, y la fase líquida, ya que el resto de los reaccionantes se añade
en solución. Este tipo de ensayo conlleva la realización de lavados intermedios para separar
los componentes que han reaccionado con la sustancia fijada en el soporte, de los que no lo
han hecho. Esta separación es necesaria, al no existir modificación de la actividad de la
enzima utilizada en el sistema, para poder evaluar el resultado del ensayo. Debido a que
estos EIE ocurren en dos fases diferentes, una sólida y otra líquida, es que reciben el nombre
de heterogéneos.
Se han usado diferentes tipos de fase sólida a las que se unen anticuerpos o antígenos,
entre ellas podemos citar microplacas y tubos de materiales poliméricos, esferas,
microparticulas y membranas.
Las microplacas y tubos de materiales poliméricos son ampliamente usados en los sistemas
de ELISA, por sus grandes posibilidades de automatización, utilizándose fundamentalmente
el poliestireno como material plástico, aunque también es usado el polivinilo y otros.
Las microplacas de 96 posiciones se han convertido en formato estándar en los ensayos
inmunoenzimáticos, debido a que la naturaleza hidrófobica del poliestireno con el cual están
conformadas éstas, permite una gran estabilidad a la unión de las moléculas de los
antígenos o anticuerpos a la superficie de las mismas, así como a las excelentes cualidades
ópticas de dicho material.
En la actualidad estas microplacas pueden ser utilizadas como un solo bloque o formadas
varias tiras de reacción con características similares.
En general los EIE heterogéneos o ELISA se caracterizan por su:
1- Elevada sensibilidad, detectabilidad y especificidad.15
2- Facilidad y bajo costo para su automatización.
3- Reproducibilidad y evaluación objetiva.
4- Adaptabilidad a procesos micro y ultramicroanálisis.
5- Posible estandarización con anticuerpos monoclonales.
Los enzimoinmunoensayos son clasificados por muchos autores en:
Competitivos
No Competitivos
Los EIE heterogéneos de tipo competitivo, son aquellos en los que se presenta el antígeno
o el anticuerpo conjugado a la enzima, estableciéndose una competencia entre éstos y los
antígenos o anticuerpos de la muestra por una cantidad limitada del anticuerpo o antígeno
específico fijado en la fase sólida. Cuanto más antígeno o anticuerpo sérico está presente en
la muestra menos antígeno o anticuerpo marcado se fija, por tanto la actividad enzimática
disminuirá. Estos ensayos se emplean para antígenos de pequeño peso molecular. Son
menos sensibles que los ensayos tipo “sándwich” aunque tienen buena especificidad. Los
componentes del suero pueden producir interferencia.
ELISA competitivo para la medición de antígeno
E
EE
E
EEEAntígeno en
la muestra
E Conjugado deantígeno conuna enzima
Anticuerpode captura
Incubación
Anticuerpode captura
ELISA competitivo para la medición de antígeno
E
EE
E
E EEAntígeno en
la muestra
E Conjugado deantígeno conuna enzima
Incubación
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ELISA competitivo para la medición de antígeno
Antígeno enla muestra
E Conjugado deantígeno conuna enzima
Anticuerpode captura
ELISA competitivo para la medición de antígeno
Antígeno enla muestra
Conjugado deantígeno conuna enzima
Anticuerpode captura
Sustrato
Producto de lareacción enzimática
Los ensayos competitivos en general se caracterizan por:
1- Tener menor sensibilidad.
2- Ser más específicos.
3- Ser relativamente más lentos.
4- Requerir cantidades de antígeno o anticuerpo de alta pureza.
5- Tener interferencia con los componentes del suero.
6- Detectar antígeno fundamentalmente.
7- Ser usados para detectar moléculas pequeñas.
Un ejemplo de este tipo de E.I.E lo tenemos en el UMELISA T4 y UMELISA 17-OH
Progesterona.
En los ensayos de tipo no competitivo, la fase sólida queda recubierta por el anticuerpo o
antígeno en exceso, a éstos se unen los antígenos o anticuerpos específicos presentes en la
muestra, posteriormente se realiza un lavado para eliminar a los que no se fijaron,
añadiéndose luego el anticuerpo marcado con la enzima, el cual después de un lavado se
añade el sustrato.
Este tipo de ELISA se caracteriza por:
1- Tener mayor sensibilidad y detectabilidad.
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2- Ser menos específicos.
3- Requerir anticuerpos puros y antisueros de elevado título.
4- Ser más rápidos.
5- No interferir con los componentes del suero.
Entre los distintos tipos de EIE heterogéneo no competitivo utilizados tenemos:
El de doble Anticuerpo o “Sándwich”.
En este E.I.E. la fase sólida es recubierta con anticuerpos específicos, a los cuales se unirá
el antígeno de la muestra luego de un tiempo de incubación que permite dicha unión, se
realiza un lavado para eliminar el resto del antígeno no unido, añadiéndose a continuación el
anticuerpo unido a la enzima que es lo que llamamos conjugado, el cual se unirá al antígeno
que previamente se había unido al anticuerpo de la fase sólida, posteriormente se lleva a
efecto una incubación, efectuándose un lavado después con el fin de eliminar el exceso de
conjugado que no se haya unido al complejo ya formado, y por último se añade el sustrato
correspondiente. Se obtendrá una señal dada por el producto de la acción de la enzima
sobre el sustrato, siendo ésta proporcional a la cantidad de antígeno presente en la muestra.
Anticuerpode captura
ELISA de doble anticuerpo para la medición de antígeno
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Anticuerpode captura
Antígeno enla muestra
ELISA de doble anticuerpo para la medición de antígeno
Anticuerpode captura
Antígeno enla muestra
-E -E -E -E
-E Conjugado deAc antígenoespecífico unidoa una enzima
ELISA de doble anticuerpo para la medición de antígeno
Ejemplos de este tipo de EIE los tenemos en el UMELISA TSH y UMELISA AFP.
ELISA Indirecto para la detección de anticuerpos
Los ELISA indirectos se caracterizan por unir a la fase sólida los antígenos, luego las
muestras se incuban fijándose los anticuerpos presentes en las mismas a dichos antígenos,
al realizar un lavado posterior se eliminan los componentes no fijados, quedando el complejo
antígeno-anticuerpo, luego se añade un anticuerpo del tipo de las inmunoglobulinas
antiespecie del anticuerpo de la muestra marcado con una enzima, posteriormente se realiza
un lavado para eliminar los anticuerpos marcados no fijados y se adiciona el sustrato. Se
obtendrá una señal dada por el producto de la acción de la enzima sobre el sustrato, siendo
ésta proporcional a la cantidad de anticuerpos presente en la muestra.
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Podemos citar como ejemplo de este tipo de E.I.E al UMELISA HIV 1+2 recombinant,
UMELISA HCV, UMELISA HTLV I/II, etc.
ELISA de captura para la detección de IgM.
Se caracterizan por unir a la fase sólida los anticuerpos de captura anti-IgM, luego se añade
la muestra que tiene IgM no dirigida al antígeno y puede tener IgM específica para el
antígeno los cuales se unen a los anticuerpos de captura, se realiza un lavado para eliminar
los componentes no fijados, posteriormente se añade el antígeno marcado con una enzima el
cual se une a la IgM específica para el antígeno, posteriormente se realiza un lavado para
eliminar los antígenos marcados no fijados y se adiciona el sustrato. Se obtendrá una señal
dada por el producto de la acción de la enzima sobre el sustrato, siendo ésta proporcional a
la cantidad de anticuerpos específicos para el antígeno presente en la muestra.
Estos ensayos se utilizan cuando es necesario diferenciar entre una infección reciente y
una anterior, o entre anticuerpos del niño y de la madre. Ej.: Dengue, Rubéola, Toxoplasma,
Sífilis.
No hay que eliminar previamente la IgG de la muestra como en los ensayos indirectos
para IgM.
Ejemplos de este tipo de EIE lo tenemos en el UMELISA Dengue IgM.
COLECTA DE LA MUESTRA DE SANGRE EN PAPEL DE FILTRO
Introducción
Los programas de Pesquisa Neonatal (Screening) se han convertido en uno de los aspectos
más aceptados de la medicina preventiva pediátrica actual. El interés por el Screening
neonatal fue creciendo desde sus comienzos en la década del 60 con los trabajos de Guthrie
sobre fenilcetonuria. La idea revolucionaria de Guthrie de que los constituyentes de la sangre
podrían ser estables en muestras de sangre secadas en papel de filtro fue un presagio de
que no sólo los aminoácidos sino también las hormonas, enzimas y anticuerpos podrían ser
fidedignamente detectadas y cuantificadas en muestras de sangre entera.
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Antecedentes
Guthrie, 1961: Desarrolla la metodología de la determinación de fenilalanina en
sangre seca sobre papel de filtro utilizando la prueba de inhibición bacteriana de
Guthrie.
Inhibición bacteriana de Guthrie: Método bacteriológico en el cual la presencia de inhibición
alrededor del disco indica la presencia de Phe en la muestra.
1961: Guthrie inicia el pilotaje de PKU en una localidad del estado de N. York. E.U.
1962:Se detecta el primer caso de hiperfenilalalinemia en los E.U. con este método,
después de estudiar 800 niños.
1963:Se incorporan otros programas neonatales en papel de filtro (galactosemia,
homocistinuria)
1963-1967: Se desarrolló el equipo ponchador de muestras de sangre seca en papel
de filtro
Ventajas de la colecta de sangre en papel de filtro.
Simplicidad de su colecta : No se requiere de punción venosa y la cantidad de sangre
necesaria es pequeña, no es necesario tubos, ni centrífugas)
NegativoPositivo
Placa con agar / beta 2 tienilalanina / glucosa / bacteria Bacillus Subtilus
21
Facilidad de su transportación: Simplifica el traslado de las muestras desde lugares
distantes hasta un laboratorio central sin necesidad de refrigeración ni cuidados
especiales.
Implica un menor riesgo biológico.
Fácil almacenamiento y conservación sin que se afecte la estabilidad.
Facilidad de procesada y manipulada en el laboratorio
Aplicaciones de las muestras de sangre seca en papel de filtro
1-Pesquisaje neonatal.
PKU
Hipotiroidismo congénito
Toxoplasmosis Congénita
Fibrosis quística
Biotinidasa
Hiperplasia Adrenal Congénita
Galactosemia
Homocistinuria
VIH
Ensayos de Genética Molecular
2-Pesquisaje con aplicación en la Vigilancia Epidemiológica.
Ac contra el VHC
Ac contra el VIH
HBsAg
Ac IgG Chagas
Ac IgM Dengue
Ac IgM Hansen
¿Cuando tomar la muestra de sangre para el pesquisaje neonatal?22
1. Pesquisaje de Hipotiroidismo Congénito
Suero de cordón: en el momento del nacimiento
Talón: A partir de las 48 horas de nacido.
2. Pesquisaje de Fenilcetonuria
Talón: A partir del 5to día de nacido.
Técnicas para la colección de la sangre sobre papel de filtro.
Punción del talón con aplicación directa sobre el papel.
Recolección de la sangre del talón en tubos estériles heparinizados y su posterior
adición en el papel.
Extracción de la sangre con una aguja de la vena dorsal de la mano o del dedo y
adición en el papel.
Instrucciones para la toma de muestra de sangre del talón y su colección en papel de
filtro.
1-Preparación de las condiciones
Lanceta estéril
Alcohol isopropanol al 70 %
Guantes estériles
Gasa estéril
Paños suaves
Tarjeta de recolección
2-Preparación del formulario.
Los datos requeridos en la tarjeta deben de llenarse a mano, con letra legible y
correcta antes de hacer la toma de sangre para evitar dañar la muestra y no ser
contaminada con agentes externos (rodillo de máquina de escribir, etc.).
Asegúrese de llenar la tarjeta sobre una superficie limpia y seca.
Las áreas dentro del papel de filtro no deben ser tocadas en ningún momento, ni
siquiera con guantes, ya que la grasa de la piel o talco de los guantes puede
contaminar y alterar el resultado.
23
Después de colectada la mancha de sangre, la misma no debe ser tocada, ni tener
contacto alguno con agua, alimentos soluciones antisépticas y otros materiales.
Datos que debe tener la tarjeta de recolección:
1. Nombre(s) y Apellidos del niño.
2. Número de Historia Clínica del paciente.
3. Fecha de nacimiento del niño y de colecta de la muestra
4. Sexo y peso del niño al nacer.
5. Status alimentario.
6. Dirección completa.
7. Tipo de parto y edad gestacional de la madre.
8. Fecha de llegada de la muestra al laboratorio.
3-Localización del sitio de punción
Áreas laterales mediales de la superficie plantar del talón
4- Preparación y limpieza del sitio de extracción.
El niño debe ser cargado de forma que sus piernas estén más bajas que el corazón
para que se incremente la presión venosa.
El sitio de punción se debe limpiar con una esponja o algodón con solución de alcohol
al 70 % (isopropanol/agua, 70/30 volumen).
El exceso de alcohol se debe eliminar con una gasa estéril y dejar secar al aire (si
quedara algún residuo de alcohol se puede diluir la muestra y afectar los resultados).
5-Punción
Requisitos para obtener sangre de talón:
Se debe utilizar una lanceta estéril con una profundidad de 2.0 a 2.4 mm.
La primera gota se debe eliminar con una gasa estéril y la siguiente es la que se debe
aplicar en el papel.
6-Aplicación directa sobre el papel
La gota de sangre debe caer dentro del área del círculo.
24
La gota debe ser lo más grande posible para garantizar el llenado del círculo y
embeber el papel de filtro de forma tal que la mancha de sangre se observe por
ambas caras del papel.
El papel se debe tocar suavemente con la gota y nunca presionarlo contra el talón
buscando una mancha mayor.
La sangre debe ser aplicada por una sola cara y asegurarse que la misma traspase el
papel.
Después que la sangre ha sido colectada del talón del recién nacido, el pie debe ser
elevado por encima del cuerpo y presionar con una gasa estéril o algodón contra el
sitio de punción hasta que deje de sangrar.
Recomendaciones
No se debe exprimir el sitio de punción porque puede causar hemólisis y además
mezcla de tejidos con la muestra.
La aplicación de sucesivas gotas sobre el mismo círculo causa sobrecapas y/o
concentraciones no uniformes de la sangre.
Si un círculo no ha sido llenado completamente con una gota, debe repetirse el
procedimiento con un nuevo círculo.
Precauciones durante el secado de la muestra de sangre en papel de filtro
1-Temperatura
Después de llenar todos los círculos, permita que la sangre se seque a temperatura
ambiente entre 15 y 22 grados C en posición horizontal.
Las manchas de sangre no deben estar expuestas al sol, calefactores, incubadoras,
ni sobre otras fuentes de calor, ya que puede ocurrir una desnaturalización de las
proteínas: La hemoglobina se fija al papel impidiendo la elución de la muestra y
subestimando el resultado.
2-Tiempo
El secado debe de ocurrir en posición horizontal durante 3 horas como mínimo, ya
que de lo contrario la humedad provoca la contaminación por microorganismos.
3-Contacto25
Las manchas de sangre no deben amontonarse ni tocar otra superficie durante el
proceso de secado, ya que puede ocurrir contaminación entre una u otra tarjeta.
Variantes para evitar la contaminación
Usar un sobre de papel para cada muestra.
Rotar las tarjetas 180º para garantizar que no coincidan las manchas de sangre.
Usar papel en blanco entre las muestras.
Precauciones durante la conservación
Utilizar preferiblemente sobres de papel, no usar sobres de nylon sin sílica gel ya que la
transpiración provoca la contaminación por microorganismos.
Estabilidad de la Phe y TSH en muestra de sangre colectada en papel de filtro ss 903
Estabilidad de los Anticuerpos IgG contra el VIH, HCV y HBsAg
AnalitoTemperatura de
conservaciónEstabilidad
Ac contra el VIH
Menos 20 grados C
4 a 8 grados C
20 a 25 grados C
37 grados C y Humedad
Relativa del 80 %
1 año
1 año
1 mes
15 días
Ac contra el HCV2 a 8 grados C
20 a 32 grados C
3 meses
15 días
HbsAg
Secado a 15 grados
Menos 20 y hasta 4
grados C
5 meses
26
AnalitoTemperatura de
conservaciónEstabilidad
TSH y Fenilalanina
Ambiente (20-25 Grados C) 1 semana
2 a 8 grados C 4 meses
-20 grados C 1 año
C y Humedad
Relativa de 55 %
20 a 25 grados C
36 grados C
2 meses
1 mes
HbsAg
Secado a 20 grados
C con Humedad
relativa de 89 %
Menos 20 grados C hasta
4 grados C.5 meses
Toma de la muestra
27
28
Muestras no válidas
1-La cantidad de la muestra es insuficiente para la ejecución de la prueba.
2-La muestra aparenta estar rayada ó desgastada.
3-La muestra no se secó antes del envío.
4-La muestra aparenta estar sobresaturada.
5-La muestra aparenta estar desteñida, diluida ó contaminada.
6-La muestra exhibe anillos de suero.
7-La muestra aparenta tener coágulos o capas sucesivas.
8-No hay sangre.
ELEMENTOS TÉCNICOS A TENER EN CUENTA AL EVALUAR MUESTRAS EN EL PESQUISAJE NEONATAL.
CRITERIOS PARA LA EVALUACIÓN
Tiempo entre la toma de muestra y procesamiento en el laboratorio: Las muestras no
deben ser procesadas si son recibidas en el laboratorio en un período mayor de 30 días,
después de haber sido colectadas.
Adecuación o suficiencia: Como mínimo una muestra debe permitir al menos 4 ponches
de 3 mm.
Apariencia: Criterio basado en las características que tiene la mancha de sangre.
MUESTRAS NO ÚTILES (Ver anexo 1)
Desgastadas.
Con coágulos.
Descoloridas.
Las gotas se encuentran superpuestas.
29
La muestra no fue secada antes de ser enviada al laboratorio.
La muestra fue recibida en bolsa plástica.
NATURALEZA DE LAS CAUSAS DE ERRORES QUE PUEDEN CONDUCIR A FALSOS
POSITIVOS O FALSOS NEGATIVOS
Los errores concernientes a las etapas:
Preanalíticas.
Analíticas.
Postanalíticas.
Errores accidentales, errores sistemáticos y errores de imprecisión.
CAUSAS DE FALSOS POSITIVOS
Etapa preanalítica.
Contaminación eventual.
Etapas analíticas.
Incumplimiento de las técnicas operatorias o protocolos de ensayo.
Anomalías en la medición de la señal.
Errores sistemáticos, fundamentalmente en la zona cercana al nivel de corte fijado.
Etapas post-analíticas.
Errores en la interpretación de los resultados.
Errores de cálculo.
Errores en la emisión de los datos.
CAUSAS DE FALSOS NEGATIVOS
En la maternidad:
Utilización de papel de filtro inadecuado.
Depósito de sangre defectuoso.
Error de identificación.30
Malas condiciones de almacenamiento y transporte.
En el lugar de recepción:
Error de identificación.
Malas condiciones de almacenamiento.
En el laboratorio:
Error de identificación.
Incumplimiento de las técnicas operatorias.
Error analítico
Elución incompleta de la muestra.
Error accidental relacionado con la medición de la señal.
Falta de algún elemento del estuche de reactivos.
Error de cálculo o mala interpretación de los resultados.
Error en la trascripción y emisión de los datos.
PROBLEMAS QUE DE MANERA GENERAL PUEDEN CONDUCIR A ERRORES
Tipo de papel de filtro usado.
Modalidad empleada en la colecta de sangre.
Demora en la realización de las pruebas.
Estabilidad de los analitos.
Selección de los reactivos.
Anexo 1
31
32
ENSAYOS INMUNOENZIMÁTICOS CUALITATIVOS
¿Qué es un inmunoensayo?
Es un ensayo basado en la reacción antígeno-anticuerpo.
¿Qué se entiende por enzimoinmunoensayos?
Son inmunoensayos que para la detección o cuantificación de la reacción antígeno-
anticuerpo requieren de una enzima.
Utilidad de los enzimoinmunoensayos
Son métodos utilizados para la detección o cuantificación de antígenos o anticuerpos
específicos en una muestra.
¿Qué se entiende por enzimoinmunoensayos cualitativos?
Son enzimoinmunoensayos para la DETECCIÓN de antígenos o anticuerpos en la muestra
de interés. Se caracterizan por cualificar a la muestra y por tanto los resultados se emiten
como:
- presenta o no presenta
- si o no
- positivo o negativo
¿Cuándo se emplean?
1. Para realizar la selección de materiales biológicos a emplear con fines de transplante,
transfusión, preparados vacunales u otro destino.
2. Para establecer o confirmar que un individuo ha estado en contacto con determinado
antígeno, lo cual es vital para el tratamiento o la conducta a seguir con el mismo.
EN AMBOS CASOS SÓLO INTERESA ESTABLECER LA EXISTENCIA DE UN
DETERMINADO ANTÍGENO O ANTICUERPO Y NO LA CANTIDAD EN QUE SE
ENCUENTRAN
Parámetros de calidad fundamentales en los enzimoinmunoensayos cualitativos: Valor de
corte, sensibilidad y especificidad.
33
Valor de corte: Es el valor que permite diferenciar la población de muestras negativas de la
población de muestras positivas.
Empleando los datos obtenidos con una prueba en evaluación y con otra prueba considerada
como referencia se calculan la sensibilidad y la especificidad.
Sensibilidad: Definida como la proporción de muestras positivas (reactivas) correctamente
identificadas por la prueba en evaluación. Su cálculo se realiza mediante la fórmula:
S = (VP / VP + FN) · 100
Donde:
VP: Son las muestras que fueron positivas tanto por la prueba de referencia como por la
prueba en evaluación.
FN: Son las muestras que por la prueba de referencia fueron positivas y por la prueba en
evaluación fueron negativas.
34
Especificidad: Definida como la proporción de muestras negativas (no reactivas)
correctamente identificadas por la prueba en evaluación. Su cálculo se realiza mediante la
fórmula:
E = (VN / VN + FP) · 100
Donde:
VN: Son las muestras que fueron negativas tanto por la prueba de referencia como por la
prueba en evaluación.
FP: Son las muestras que por la prueba de referencia fueron negativas y por la prueba en
evaluación fueron positivas.
Ejemplo de cálculo de sensibilidad y especificidad
Prueba en evaluación
Prueba de referencia
TotalResultados
positivos
Resultados
negativos
Resultados
positivos
995
VP
8
FP1003
Resultados
negativos
5
FN
992
VN997
Total1000 1000 2000
S = (995 / 1000) · 100 = 99,5 % E = (992 / 1000) · 100 = 99,2 %
Precisión: Es un parámetro relacionado con la ejecución de las pruebas. Se define como la
dispersión de los datos obtenidos para una muestra procesada varias veces.
35
Buena Regular Mala
Buena: Los diferentes datos de la muestra no difieren significativamente entre sí y se
encuentran muy cercanos del valor central. Ejemplo: 120, 124, 125 y 122.
Regular: Los diferentes datos de la muestra difieren poco entre sí y se encuentran
próximos al valor central. Ejemplo 100, 110, 115 y 120.
Mala: Los diferentes datos de la muestra difieren significativamente entre sí y se
encuentran distantes del valor central. Ejemplo: 50, 90, 140 y 170.
Componentes de los enzimoinmunoensayos
Fase sólida: fundamentalmente POLIESTIRENO y cloruro de polivinilo (PVC) como
placas de 96 pocillos.
Muestras: PLASMA, SUERO, ORINA, líquido cefalorraquídeo y material biópsico. Se
pueden utilizar puras, con una o varias diluciones.
Conjugado: formado de la unión química entre una enzima con un anticuerpo o con un
antígeno. Las enzimas más utilizadas son peroxidasa de rábano picante,
betagalactosidasa y la FOSFATASA ALCALINA.
Sustrato: sustancias transformadas por la acción de las enzimas que se encuentran
formando parte del conjugado. Pueden ser cromogénicos, FLUORESCENTES,
quimioluminiscentes o radioactivos.
Procesamiento de los datos: manual o AUTOMÁTICO.
Ejemplos enzimoinmunoensayos cualitativos de la tecnología SUMA
- Detección de antígeno: UMELISA HBSAg Plus, para detectar antígeno de superficie del
virus de la hepatitis B en muestras de suero. 36
En la figura aparecen representados los diferentes componentes anteriormente
mencionados.
Emisión de los resultados: La tecnología SUMA dispone de programas que realizan
automáticamente el procesamiento y emisión de los resultados.
- Detección de anticuerpo: UMELISA HCV, para detectar anticuerpos IgG contra la hepatitis
C en muestras de suero.
37
FFAAA
E
A B C D
Emisión de los resultados
A: Antígeno de hepatitis CB: Anticuerpos IgG en la muestraC: Conjugado anticuerpos anti IgG humana / FAD: Sustrato
38
Interpretación de los resultados en los ensayos cualitativos de la tecnología SUMA.
Interpretación de los resultadosInterpretación de los resultados
Zona Gris
Corte
Corte - 15 %
Fluorescencia
A B C D E F ResultadosA B C D E F Resultados
A A -- NegativoNegativoB B -- BLBLC C -- PositivoPositivoD D -- NegativoNegativoE E -- PositivoPositivoF F -- RepetirRepetir
Negativo: Muestra cuyo resultado se encuentra por debajo del valor de corte.
BL: Muestra cuyo resultado se encuentra en la frontera entre la población de negativos y
la población de positivos. A esta zona se le llama Zona Gris y a las muestras que caen
en ella se les denomina BL (border line) o dudosas, y a estas muestras por tanto no se
les puede definir el diagnóstico.
Positivo: Muestra cuyo resultado se encuentra por encima del valor de corte.
Repetir: Muestra evaluada por duplicado y cuyos resultados fueron discordantes, o sea,
estuvieron por encima y por debajo del nivel de corte. Constituye un ejemplo de mala
precisión.
ENSAYOS INMUNOENZIMÁTICOS CUANTITATIVOS.
Objetivos:
- Que el alumno sea capaz de dominar los conceptos Inmunógenos,
Antígenos, Anticuerpos, precisión, exactitud, especificidad, linealidad y límite de detección.
39
- Que el alumno conozca la importancia que tienen los enzimoinmunoensayos cuantitativos
en los pesquisajes.
Introducción:
Actualmente existe la necesidad de contar con sistemas de tamisajes económicos que
permitan estudiar a grupos relativamente grandes de población, para esto se cuenta con
métodos analíticos como son los sistemas cuantitativos y cualitativos en los cuales es
necesario tener en cuenta determinados factores como son:
* ¿Qué necesidad satisface?
* ¿Qué destino va a seguir?
* ¿Cuánto va a costar para ponerlo en marcha?
* ¿Qué beneficio reporta?
Desarrollo:
Conceptos básicos para llevar a cabo la cuantificación en una muestra:
Inmunógeno: Cualquier sustancia capaz de inducir una respuesta inmunitaria, ya sea de tipo
humoral o celular, o de ambas a la vez. La respuesta se denomina inmunogenicidad.
Antígenos: Aquellas sustancias a las que se les pueden unir específicamente una inmuno-
Globulina o un receptor de células T. Pueden ser o no inmunógenos.
Haptenos: Son sustancias muchas veces de bajo peso molecular, capaces de unirse con
anticuerpos específicos, pero que solo pueden inducir una respuesta inmunitaria si al
efectuarse la inmunización están unidos químicamente a una molécula portadora,
generalmente una proteína.
Anticuerpos: Son moléculas proteicas que poseen las propiedades de combinarse
específicamente con una sustancia que provoca su formación (Ag). Comprenden un grupo
heterogéneo de proteínas que constituyen aproximadamente el 20 % de las proteínas
plasmáticas totales y forman parte del mecanismo adaptativo del sistema inmune es decir 40
-F.A
que cuando el sistema inmune adaptativo se activa se produce una respuesta específica a
cada agente infeccioso.
Enzimoinmunoensayos heterogéneos
Estos ensayos transcurren en dos fases: la fase sólida en la cual se fija uno de los
componentes de la reacción, y la fase líquida en el que el resto de los reaccionantes se
añaden en solución. Este tipo de ensayo conlleva la realización de lavados intermedios para
separar los componentes que han reaccionado con la sustancia fijada en el soporte, de los
que no lo han hecho, debido a que no se afecta la actividad de la enzima utilizada en el
sistema. Debido a que estos EIEs ocurren en dos fases diferentes, es que reciben el nombre
de heterogéneos.
La introducción de fases sólidas en la reacción, basada en la adsorción de proteínas en las
superficies plásticas, le concede a los EIEs heterogéneos más facilidad en la ejecución y en
la automatización.
ELISA tipo Sandwich
(Cuantitativo) para la determinación
de antígenos.
Ensayos cuantitativos: es la estimación cuantitativa del analito.
41
Criterios a tener en cuenta para un sistema cuantitativo:
* Fáciles de llevar a cabo.
* Tiempos de incubación aceptables.
* Fácil manipulación sin riesgo a contaminación.
* Fácil interpretación de los resultados.
Estos ensayos presentan una curva de calibración la cual debe comprender todo el rango de valores normales y patológicos. La concentración de los controles debe estar en la zona de rango normal de la curva y éstos se procesan junto con la misma.
Para que un ensayo cuantitativo cumpla con las buenas prácticas de calidad debe seguir los parámetros siguientes: buena exactitud, linealidad, precisión, detectabilidad y especificidad.
Precisión: Dispersión de los datos obtenidos con respecto al valor central para una muestra
analizada repetidas veces.
Se usan muestras de concentración conocida (3 muestras cuyos niveles de concentración
cubran todo el rango analítico de la curva).
Se calculan la media aritmética (X), desviación estándar (S) y el coeficiente de variación
(CV).
Especificidad: Es la potencialidad de reactividad cruzada o interferencias por una diversidad
de sustancias, tanto de origen endógeno como fármacos que pueden ser administrados. Las
sustancias a explorar se determinarán en función del interés clínico.
Linealidad: Capacidad del método de responder de forma lineal y proporcional a cambios en
la concentración. El método es lineal si la pendiente es constante.
Límite de detección: Capacidad de un método para discriminar entre la presencia o ausencia
de analito en una muestra. Concentración de analito que puede diferenciarse de cero para un
coeficiente estadístico determinado.
Exactitud: Capacidad del método para dar el resultado más cercano a la concentración
verdadera del analito. Por ejemplo:42
Ensayo de Recuperación:
Se añaden cantidades conocidas del analito que se está analizando, para preparar muestras
con niveles de concentración bajo, medio y alto.
R= ( Valor obtenido - Valor endógeno / Valor añadido) x 100 %
Comportamiento
gráfico en un sistema
Cuantitativo.
Estos EIEs cuantitativos son aplicables en las determinaciones de analitos tales como
hormonas, drogas terapéuticas, marcadores tumorales, marcadores bioquímicos de interés y
de otras proteínas en general para la evaluación, tratamiento y pronóstico del paciente de
manera individual como por ejemplo tenemos:
UMELISA AFP ( para la determinación cuantitativa de alfa feto-proteína), UMELISA TSH
(para la determinación cuantitativa de la hormona estimulante del tiroide), UMELISA HCG
(para la determinación cuantitativa de la hormona gonadotropina coriónica humana),
UMTEST PKU (para la determinación cuantitativa de la fenilalanina), UMTEST GAL (para la
determinación cuantitativa de la galactosa 1-P uridil transferasa), entre otros.
0
0.0
25
0.0
5
0.1
0.2
0.4
0
50
100
150
200 A - C
A - D
B - C
B - D
hCG (UI/mL)
43
UMELISA HCG + UMELISA AFP
(Trisomía 21)
UMELISA AFP (Anencefalia Adrenal)
UMELISA AFP (Mielomeningocele
Lumbo-sacro y Hidrocefalia)
44
UMELISA TSH (Hipotiroidismo Congénito)
UMTEST PKU (niños fenilcetonúricos: de 6, 4 y 3 años de edad)
ASEGURAMIENTO DE CALIDAD EN EL LABORATORIO SUMA.
45
OBJETIVOS
1.- Introducción. Ejemplos, conceptos y definiciones relacionados con la Calidad.
2.- Buenas Prácticas de Laboratorio. Tipos de Control de Calidad.
3.- Aseguramiento de la calidad en un Laboratorio SUMA.
Los resultados del laboratorio son utilizados con tres propósitos fundamentales:
• Prevención de enfermedades
• Diagnóstico de enfermedades.
• Seguimiento de enfermedades.
Definición de Calidad:
Conjunto de propiedades o características de un producto o servicio que le confiere la aptitud
para satisfacer las necesidades expresadas o implícitas.
Tradicionalmente la calidad del producto o servicio ha sido establecida a partir del criterio del
que lo realiza sin tomar en cuenta la opinión del que lo recibe.
Hoy en día, es necesario compatibilizar y en última instancia subordinar el criterio del
suministrador (CREADOR-PRODUCTOR) al del cliente (RECEPTOR).
Resultados de encuestas realizadas en países desarrollados:
- Sólo uno de cada diez clientes que han quedado insatisfechos repite la compra.
- Cada cliente insatisfecho lo comenta con una docena de personas como promedio.
- Sólo cuatro de cada cien clientes insatisfechos se lo comunica al suministrador.
Diagnosticador.
Cualquier producto que consista en un reactivo, juego de reactivos, sistema, calibrador,
controlador o medio de cultivo, destinado por un fabricante a ser utilizado en el estudio in
46
vitro de muestras procedentes del cuerpo humano, incluidas las donaciones de sangre y
tejidos, con el objetivo de proporcionar información:
- relativa a un estado fisiológico o patológico
- relativa a una anomalía congénita
- para determinar la seguridad y compatibilidad con receptores potenciales
- para supervisar medidas terapéuticas.
Aseguramiento de la Calidad.
Parte de la gestión de la calidad (todas las actividades planificadas y sistemáticas
aplicadas en el marco del sistema de la calidad y demostradas como necesarias)
orientada a proporcionar confianza en el cumplimiento de los requisitos de la calidad.
Control de la Calidad.
Parte de la gestión de la calidad
(Técnicas y actividades de carácter operativo) orientada a la satisfacción de los requisitos
de la calidad.
BUENAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO (BPL).
Principios que identifican, definen y describen la organización y las condiciones bajo las
cuales se debe llevar a cabo la planificación y ejecución de los ensayos del laboratorio,
incluyendo registro de datos, la preparación de informes y el aseguramiento de la calidad de
estas actividades. Las BPL forman parte de los sistemas de calidad.
ASPECTOS DE LAS BPL:
Personal
Facilidades / Instalaciones / Organización
Reactivos
Documentación
Métodos analíticos. Validación47
Muestreo. Procesamiento de muestras
Equipos. Mantenimiento. Calibración
Materiales de referencia
Seguridad
REQUISITOS DEL PERSONAL:
• Personal suficiente y calificado.
• Programa de capacitación. Educación, adiestramiento y experiencia
en las tareas quede ejecutar.
Conocimientos en BPL.
Procedimientos normalizados de operación.
Entrenamiento continuo o periódico.
• Hábitos correctos relacionados con la higiene y la salud.
Garantizar el aseo, vestuario e higiene del personal.
Presencia y aspecto personal.
Chequeos médicos
• Reglamentada prohibición de fumar, comer y beber.
• Participación en actividades y decisiones.
• Programa de entrenamiento.
Causas más frecuentes de errores humanos:
.- Limitaciones físicas del individuo.
.- Fatiga o aburrimiento.
.- Descuido.
.- Pobre entrenamiento.
.- Predisposición, prejuicios, parcialidad.
MOTIVACION.
Fuerza interna que se da en el individuo y va a dirigir y orientar su conducta para realizar una
actividad determinada encaminada a satisfacer una necesidad.
SEGURIDAD EN EL LABORATORIOS:
48
.-En la zona de laboratorio no se permitirá al personal, comer, beber, fumar, guardar
alimentos ni aplicar cosméticos.
.-No se permite pipetear con la boca.
.-Mantener el laboratorio limpio y aseado, retirando del mismo cualquier material que no
tenga relación con el trabajo.
.-La superficie de trabajo se descontaminará al menos una vez al día, y se desinfectará en
caso de derramamiento de sustancias potencialmente infecciosas.
.-Todos los procedimientos técnicos se practicarán de manera que se evite en lo posible la
formación de aerosoles.
.-En el laboratorio se utilizarán batas, uniformes u otras prendas apropiadas, no se llevará
ropa de laboratorio fuera de este.
.-Siempre que sea necesario, proteger los ojos y la cara de salpicaduras mediante el uso de
dispositivos de protección.
.-Debe existir un programa de lucha contra insectos y roedores.
PRINCIPIOS BASICOS DE BIOSEGURIDAD APLICADOS A LOS LABORATORIOS
BASICOS. NORMAS GENERALES.
Las reglas más importantes se enumeran a continuación:
1.- No se permitirá pipetear con la boca.
2.- En la zona de trabajo de laboratorio no se permitirá al personal comer, beber, fumar,
guardar alimentos ni aplicar cosméticos.
3.- Habrá que mantener el laboratorio limpio y aseado, retirando de él cualquier material que
no tenga relación con el trabajo.
4.- La superficie de trabajo se descontaminará al mes una vez al día, y se desinfectará en
caso de derramamiento de sustancias potencialmente infecciosas.
5.- Los miembros del personal se lavarán las manos después de haber manipulado los
materiales, así como al abandonar el laboratorio.
6.- Todos los procedimientos técnicos se practicarán de manera que se evite en lo posible la
formación de aerosoles.
7.- Todos los líquidos o sólidos contaminados se descontaminarán antes de eliminarlos o de
volver a utilizarlos; los que se vayan a reutilizar deben esterilizarse en autoclaves y los que
se eliminarán se incinerarán fuera del laboratorio.
49
8.- En el laboratorio se utilizarán batas, uniformes u otras prendas apropiadas, no se llevará
ropa de laboratorio fuera de este; se desinfectarán las prendas contaminadas por los
procedimientos apropiados.
9.- Siempre que sea necesario proteger los ojos y la cara de salpicaduras mediante el uso de
dispositivos de protección.
10.-Sólo se autorizará el paso a la zona de trabajo del laboratorio, a las personas que
laboren en él y que hayan sido informadas sobre los posibles riesgos satisfaciendo así los
requisitos que se exijan para su entrada. No se permitirá la entrada de niños en dicha zona.
11.- Habrá que utilizar guantes en todos los trabajos que entrañen un contacto accidental
directo con sangre, materiales infecciosos o animales infectados. Los guantes se deben
quitar asépticamente y esterilizar en autoclaves antes de proceder a su eliminación. Si no se
dispone de guantes de un sólo uso se utilizarán guantes reutilizables limpiándolos y
desinfectándolos después de haberlos usado y antes de volverlos a utilizar.
12.- Todos los derramamientos como los accidentes y exposición a materiales infecciosos se
notificarán inmediatamente al jefe de laboratorio, quien habrá de llevar a cabo un protocolo
escrito para tal efecto, previendo una evaluación, vigilancia y tratamiento médico apropiado.
13.- El director del establecimiento se ocupará de que el personal reciba una preparación o
formación apropiada sobre seguridad en el laboratorio. Habrá que adoptar un manual de
seguridad y de operaciones en el que se identifiquen los riesgos o potencia y se indiquen las
prácticas o procedimientos adecuados para reducir al mínimo o eliminar tales riesgos. Al
personal se le informará sobre la existencia de riesgos especiales y se le pedirá que lea y
observe las instrucciones sobre las prácticas y los procedimientos establecidos.
PRINCIPALES DIFICULTADES PRESENTADAS EN LOS LABORATORIOS.
1. Experimentos mal diseñados y ejecutados con resultados inexactos.
2. Personal técnico no consciente de ajustarse a protocolos, a exactitud de las
observaciones y registro incorrecto de los resultados.
3. Falta de revisión crítica de los datos por parte de los responsables.
4. Imposibilidad de conocer detalles y poder rastrear el problema a partir de resultados
(documentos deficientes).
50
ENSAYO INMUNOENZIMATICO.
Inmunoensayo en el cual la detección del compuesto a determinar es realizado al evaluar los
cambios de concentración en el producto de una reacción enzimática o de los componentes
que en ésta participen (cofactores, grupos prostéticos, etc.).
CALIDAD EN LOS LABORATORIOS SUMA
TIPOS DE CONTROL DE CALIDAD
• Control de Calidad Interno.
• Análisis Externo del Control Interno.
• Control de Calidad Externo.
CONTROL DE CALIDAD INTERNO:
ETAPAS DEL EXAMEN:
1. POBLACIÓN EN ESTUDIO
(pacientes, embarazadas, recién nacidos,etc.)
2. PREPARACIÓN PARA EL EXAMEN
(ayuna, dieta previa, etc.)
3. TOMA DE MUESTRAS
(venosa, capilar, conservación y transportación, etc.)
4. ANÁLISIS
(Procedimiento analítico)
5. VALIDACIÓN E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
Conceptos y definiciones empleados en las técnicas de Control de la Calidad
aplicadas en el laboratorio.
Precisión: Dispersión de valores entorno a un Valor Central(VC) cuando se procesa una
muestra varias veces.
Exactitud: Identidad entre el valor obtenido y el valor real de la muestra.51
Error: Desviación no intencional.
Error Aleatorio: Desviación no intencional, fortuita, casual, generalmente “no evitable”.
Error Sistemático: Desviación no intencional, generalmente “evitable”, se relaciona
estrechamente con la falta de exactitud.
Error Grosero: Equivocación “absolutamente evitable”.
Calibrador: Referencia utilizada para asignar los valores a las muestras.
Controlador: Referencia utilizada para la detección de errores evitables en los procedimientos
analíticos.
Límites de Control: Valores límites (a ambos lados del Valor Central) que delimitan en el
intervalo de valores posibles del controlador para considerar el procedimiento analítico bajo
control. Se establece por métodos estadísticos.
CONTROL DE CALIDAD INTERNO.
“Calidad antes que Control de la Calidad”.
Es responsabilidad de cada laboratorio individualmente y tiene como objetivo fundamental
garantizar la confiabilidad de los resultados brindados.
Debe concebirse cumpliendo las siguientes
Etapas secuentes:
• Medidas Preventivas: Evitar resultados erróneos o deficientes.
• Técnicas de Control Detectar resultados erróneos o deficientes.
• Medidas Remediales Eliminar las causas de los resultados erróneos o deficientes
(Acciones correctivas).
52
Es imposible evitar y eliminar las causas de los resultados deficientes, sin conocer con
profundidad todas las etapas del examen del laboratorio que aspira a controlar.
1-Medidas Preventivas: Deben establecerse de forma clara e inequívoca para cada una de
las etapas enunciadas anteriormente.
Ejemplos:
- Control y Calibración de los diferentes equipos e instrumentos.
- Control de las condiciones ambientales que tengan influencia en la ejecución de los
ensayos (Ejemplos: temperatura, humedad, vibraciones, ruidos, etc)
- Control de la conservación de los reactivos, diagnosticadores y muestras.
- Medidas organizativas generales.
- Entrenamiento adecuado de los analistas.
- Control y utilización adecuados de la documentación (Procedimientos Normalizados de
Operación, Registros de Trabajo y los Informes de Resultados)
TECNOLOGÍA SUMA. CONCEPTO Y APLICACIÓN (UMELISA Y UMTEST).
Tecnología: Conjunto de los conocimientos propios de un oficio mecánico o arte industrial.
SUMA: Sistema Ultra Micro Analítico.
Tecnología SUMA: Sistema integral que incluye equipos, reactivos y software.
¿Por qué surge la Tecnología SUMA?
La situación de la mortalidad infantil cubana había experimentado cambios significativos en la
década de los años 70, como consecuencia de la aplicación de un plan de medidas
sanitarias y preventivas, e innumerables inversiones en centros asistenciales, así como el
establecimiento de un sistema médico preventivo y asistencial.
Las enfermedades infecciosas y diarreicas agudas, así como las infecciones perinatales en
general, mostraron disminuciones sostenidas y comenzaron entonces a hacerse evidentes
otras causas de enfermedad y de muertes, que por su relativa baja frecuencia habían
53
resultado menos importantes como es el caso de las malformaciones congénitas y de las
enfermedades hereditarias y genéticas.
Sin embargo, para enfrentar esta nueva problemática de salud se requería del
establecimiento de un efectivo sistema de atención primaria, y de la realización de estudios a
escala masiva, con el objetivo de detectar y/o evitar de manera precoz las enfermedades que
de una u otra manera afectan la calidad de vida del ser humano,
Para nuestro país resultaba casi imposible pensar en la adquisición de la tecnología
disponible en el mercado para abordar esta nueva problemática de salud, de ahí la
necesidad de buscar soluciones tecnológicas propias, adaptadas a nuestras condiciones de
desarrollo económico y social, cuyas características permitieran su extensión y aplicación en
primer lugar al estudio de las malformaciones congénitas que ya en ese momento habían
pasado a ocupar la tercera causa de mortalidad infantil.
Así, en 1979, se inició el desarrollo de una técnica que permitiría estudiar un gran número de
muestras, con el más bajo costo posible, conjugando las ventajas de los métodos ELISA pero
utilizando ultra micro volúmenes (10 microlitros de muestras y reactivos).
Para llevar a cabo esta tarea fue necesario desarrollar placas especiales, con una nueva
geometría, a las que se denominó placas de ULTRAMICROELISA, teniendo en cuenta el
pequeño volumen a utilizar, para las que se adaptaron los instrumentos necesarios que
permitieran la lectura, el cálculo y la interpretación de los resultados.
Placa de Micro y Ultra Micro Elisa.
54
El desarrollo a escala de laboratorio de un ultra micro método de inmunoensayo de 10
microlitros para la cuantificación de AFP en el suero de las gestantes y del instrumental
necesario, condicionaron el surgimiento, desarrollo y aplicación de lo que posteriormente
sería la tecnología SUMA como un sistema de diagnóstico integral basado en las técnicas de
inmunoensayo.
En 1982 se realizó el primer pilotaje con reactivos a granel para la determinación de la AFP a
5000 gestantes de Ciudad de La Habana para esta tarea se utilizó el equipo KAPPA de
fabricación alemana, pero con adaptaciones para ultramicroensayos realizados por un grupo
multidisciplinario del CNIC. En la actualidad en el CIE se diseñan y se producen todos los
equipos necesarios para llevar a cabo los programas de pesquisaje con la mejor calidad y a
un costo mínimo.
55
APLICACIÓN DE LA TECNOLOGIA SUMA
Con la metodología establecida y partiendo del modelo inicial del UMELISA-AFP
se desarrollaron más de 20 ensayos diferentes, los cuales se aplican en diversos
programas de salud.
El desarrollo y aplicación de la tecnología SUMA en los últimos 17 años ha estado
orientada fundamentalmente a programas o aplicaciones de salud en tres líneas
de trabajo principales:
Materno - Infantil: Diagnóstico prenatal
Diagnóstico neonatal
Certificación de la sangre
Vigilancia epidemiológica
AFP
TSH
HCG
IgET4TSH
NEONATALT4
NEONATALUMTEST
PKUUMTEST
BIOTINIDASA17 OH P
UMTEST GAL
Diagnóstico NeonatalDiagnóstico Neonatal
Materno-Infantil
Diagnóstico PrenatalDiagnóstico Prenatal
Vigilancia Epidemiológica
HIV 1+2 CHAGASHBsAg PLUS
HBsAg Confirm
ANTIHBsAg
ANTIHBc
HCVDENGUEIgM PLUS
DENGUEIgG
HANSEN
Certificación de la sangre
HIV 1+2CHAGASHBsAg PLUS
HBsAg Confirm
ANTIHBc
HCV
Algunos de estos diagnosticadores como el UMELISA AFP y el UMELISA HCG,
además el UMELISA PSA se utilizan también como Marcadores Tumorales en el
56
diagnóstico y seguimiento de algunas enfermedades como el cáncer de la
próstata, el hepatocarcinoma, el coriocarcinoma, la mola hidatiforme, etc.
Tanto los UMELISAs como los UMTESTs pueden ser cuantitativos o cualitativos
en dependencia del objetivo para el cual fue diseñado el ensayo:
UMELISA cuantitativo: UMELISA AFP para la determinación cuantitativa de
AFP en el suero humano y líquido amniótico.
UMELISA cualitativo: UMELISA HIV 1+2 Recombinant para la detección de
anticuerpos al VIH 1 y 2 en suero humano, plasma o sangre seca sobre
papel de filtro.
57
Procedimiento del UMELISA HI V 1+2 Recombinant
30 min.Temp. amb.
Lectura, validación einterpretación de los
resultados con el PR 521
Tira de reacción(Ag. rec. y síntetico)
10 µL de Conjugado(anti-IgG
h/FA) 10 µL sustrato
10 µL de muestra
Incubación 30 min a 37 °CLavado
EEE E
Incubación 30 min 37 °CLavado
UMTEST cuantitativo: UMTEST PKU. Prueba fluorescente para la
cuantificación de phe en sangre seca sobre papel de filtro.
EXTRACCI ÓN70 µL Etanol 70 %
discos de 3 mm Calibradores y Muestras
60 min TA
10 µL El uato 60 min a 60 °C
REACTIVO .................. 10 µL3 Ninhi dri na 60 mM1 L-Leucil-L-Alani na 50 mMTampón Succinato 0,22M pH 5,8
Reacti vo de Cobre…. 10 µLCu SO4 1,2 mM
5 - 15 min TA
Lectura e interpretación de resultados
PROCEDI MI ENTO DEL UMTEST PKU
58
UMTEST cualitativo: UMTEST Biotinidasa. Prueba colorimétrica para la
detección de biotinidasa en sangre seca sobre papel de filtro.
Incubación 16 h (37°C)
Transferencia(10 L)
TCA
Discosde 3 mm
Vitamina K6(10 L)
Sulfamatode amonio
(10 L)
Nitrito de sodio(10 L)
Sustrato(40 L)
Placas de reacci ón
Esperar 10 min.
Esperar 3 min.
Esperar 3 min.
Esperar 10 min.
PROCEDI MI ENTO DEL UMTEST BI OTI NI DASA
En la actualidad existen 176 laboratorios instalados en nuestro país que utilizan la
tecnología SUMA (Red Nacional de Laboratorios SUMA) ya sea en Hospitales
Maternos, Banco de Sangre, policlínicos como en Centros de Higiene y
Epidemiología, destinados a servir a toda la población en general y su buen
funcionamiento depende no sólo de la calidad de los equipos y reactivos, sino
también de la capacitación del personal que en ellos labora, constituyendo un
modelo de organización para pesquisajes masivos en países en vías de
desarrollo. Además nuestra tecnología se utiliza en otros países como Venezuela,
Brasil, Argentina, México, Colombia y China.
El Equipamiento de la Tecnología SUMA abarca los siguientes Equipos e Instrumentos:
1. EQUIPO LECTOR DE PLACAS2. EQUIPO LAVADOR DE PLACAS
59
3. Ponchador
1. EQUIPO LECTOR DE PLACAS. Modelos: PR-521 y PR-621
PR-621 PR-521
DESCRIPCIÓN GENERAL
El Lector de Placas (PR-521 o PR-621) es un Fotómetro-fluorímetro, diseñado para realizar lecturas de fluorescencia y absorbancia en placas y tiras UMELISA y MICROELISA.La lectura se realiza en sets que contienen entre 1 y 12 tiras de 8 pozos. El tiempo de lectura de un set no excede los 9 segundos. Los sets leídos son almacenados en la memoria del equipo, para su posterior procesamiento. La capacidad de la memoria es de 24 sets de 12 tiras y la información se conserva aún después de desconectada la alimentación durante un período de 72 horas como mínimo.
El procesamiento de la información se puede realizar directamente en el equipo, mediante funciones establecidas en el o a través de una computadora acoplada vía RS-232, permitiendo el uso de programas más diversos y especializados, suministrados por el fabricante.
PARTES FUNDAMENTALES (La ubicación de las partes es igual para los dos modelos.)
Vista frontal Vista posterior
j
g k
ih
f
e
d
c
b
a
60
a- Puerta de entrada/salida de la placab- Teclado alfanumérico y de funcionesc- Pantalla de visualización de la informaciónd- Compartimiento para filtros de interferencia (absorbancia)e- Compartimiento para el filtro secundario de fluorescenciaf- Interruptor de encendido / apagado del equipo
g- Porta-fusiblesh- Toma de entrada de alimentacióni- Conector para Impresoraj- Conector para la comunicación serie (norma RS-232C) con la
computadorak- Ventilador-extractor para el refrescamiento interior
FUNCIONES DE LAS TECLAS
READ - Leer un set de tiras en fluorescencia o absorbancia almacenando los resultados en memoria.
PROG - Permite programar los valores de concentración de los puntos de la Curva estándar, el factor de dilusión de las muestras y el valor de referencia de la lectura. Estos valores se utilizan para el cálculo de los resultados en las técnicas cuantitativas de fluorescencia.
TIME - Permite actualizar la fecha y la hora en el equipo.
61
MEM - Da información sobre la memoria disponible y los sets almacenados en memoria.
DISP - Calcula y muestra por el display los resultados de la muestra.
PRINT - Calcula e imprime los resultados.DEL - Borra todo el contenido de la memoria o el último set almacenado.
0 al 9 y “.” Estas teclas permiten introducir datos al equipo.
C- La tecla C se utiliza para la corrección de datos erróneos.
ESC - Es usada para retornar al menú anterior o para salir de alguna pantalla con entrada de datos manteniendo activo el dato anterior que fue programado.
ENTER / START - Se utiliza para configurar los datos introducidos por el usuario o una opción de menú que sea seleccionada.
Se utilizan en las pantallas donde el operador requiere buscar en una lista de datos, almacenada en la memoria del lector. Permiten además introducir y extraer el soporte donde se colocan los sets de tiras para ser leídos.
MODOS DE MEDICIÓN.
Este equipo posee dos modos de medición. Fluorescencia y Absorbancia.
En la medición de fluorescencia, una lámpara fluorescente emite luz ultravioleta (365nm) que incide sobre la muestra y la excita. La señal resultante es captada por los detectores.
En la medición de absorbancia una lámpara de alógeno emite luz que incide sobre un filtro de interferencia cuya longitud de onda selecciona el usuario. La luz monocromática proveniente del filtro atraviesa la muestra llegando a los detectores.
62
ESQUEMA ÓPTICO GENERAL
63
HIPOTIROIDISMO CONGÉNITO
El Hipotiroidismo Congénito (HC) es una enfermedad producida principalmente por
disgenesia de la glándula tiroides y constituye la causa más frecuente de retraso
mental evitable en la infancia. Se caracteriza por el déficit en la producción o
utilización de las hormonas tiroideas lo cual se expresa por disminución de la
actividad metabólica, retraso en la maduración ósea, retardo del crecimiento y
deficiencia mental; su detección precoz y el inicio temprano de una tratamiento
sustitutivo con hormonas tiroideas posibilita un desarrollo psicomotor normal en los
niños afectados. La incidencia aproximada a nivel internacional es de 1: 4000
recién nacidos.
Etiología del Hipotiroidismo Congénito
El Hipotiroidismo Congénito (HC) es la endocrinopatología infantil más frecuente,
se caracteriza por el déficit en la producción o utilización de las hormonas
tiroideas, lo cual se expresa en: la disminución de la actividad metabólica basal,
afectación del sistema nervioso central, atraso en la maduración ósea, retardo del
crecimiento y deficiencia mental, por lo que su detección precoz y el inicio de una
terapéutica temprana con hormonas tiroideas evita que se produzcan estas
afectaciones, lográndose un desarrollo psicomotor normal en los niños afectados.
La casi totalidad de los recién nacidos afectados no presentan signos
clínicos apreciables para ser diagnosticados por examen físico, solo el 5 %
puede ser identificado y diagnosticado al nacer.
Aproximadamente el 85 % de los casos son esporádicos debido a disgenesia
de la glándula tiroides y el resto se debe a factores hereditarios originados
por errores en la síntesis de tiroxina o por la presencia de anticuerpos
maternos.
1- HIPOTIROIDISMO PERMANENTE
a) DEBIDO A ANORMALIDADES TIROIDEAS (HIPOTIROIDISMO PRIMARIO)
DEFECTOS DEL DESARROLLO
64
AGENESIA TIROIDEA
HIPOPLASIA TIROIDEA
TIROIDES ECTÓPICO
DISHORMONOGÉNESIS
b) DEBIDO A ANORMALIDADES EXTRA TIROIDEAS
CAUSAS HIPOTÁLAMO – HIPOFISARIAS
(HIPOTIROIDISMO SECUNDARIO O TERCIARIO)
2- HIPOTIROIDISMO NEONATAL TRANSITORIO
HIPOTIROXINEMIA TRANSITORIA
HIPOTIROIDISMO TRANSITORIO PRIMARIO
3- DEFICIENCIA DE YODO
Mecanismo de regulación de la biosíntesis de las hormonas tiroideas
Existen dos factores que juegan un papel importante en esta regulación:
El mecanismo autoregulador (retroalimentación negativa) a través del eje
hipotálamo-hipófisis-tiroides.
Aporte de yodo.
Los numerosos datos experimentales obtenidos de las observaciones endocrino y
neuroendocrinológicas, han proporcionado la evidencia de la secreción por parte
de la hipófisis de un estimulador tiroideo (TSH) y la secreción por parte del
hipotálamo de un estimulador de la hipófisis (TRH), siendo comprendida la función
del complejo como un sistema de retroalimentación negativa clásica que responde
a la disponibilidad de hormonas tiroideas.
En la actualidad se conoce que la regulación de la secreción de TSH, es el
resultado de una compleja interacción fundamentalmente localizada en la hipófisis,
mediante la cual la TRH actúa estimulando primero la liberación de la TSH y más
65
tarde su síntesis, mientras que las hormonas tiroideas actúan inhibiendo estas
funciones.
TBG unida a T3/ T4
T3 /T4 libre
T3T4
Hipotálamo
Hipófisis
T4 + T3
TRH
TSH
T3 y T4 libre
El tejido hipofisiario contiene receptores de alta afinidad y de capacidad limitada
localizados en el núcleo celular que se unen a la T3 y con menor afinidad a la T4.
La inhibición por retroalimentación negativa de la secreción de TSH es
aparentemente, mediada a nivel nuclear, ya que el pretratamiento con inhibidores
de la síntesis proteica previene el efecto inhibitorio de las hormonas tiroideas
sobre la TSH, esto concuerda con el efecto demostrado de las hormonas tiroideas
en la estimulación de la síntesis de ácidos nucleicos y de proteínas en otros
tejidos.
FUNCIONES DE LAS HORMONAS TIROIDEAS.
Las funciones de las hormonas tiroideas son:
Controlan el desarrollo y aseguran la regulación de la actividad metabólica.
Son esenciales para la diferenciación y maduración del tejido óseo y cerebral
durante el período fetal y perinatal.
Regulan el metabolismo basal.
66
Aumentan el consumo de oxígeno y la producción de calor (termo-regulación)
en el organismo.
El continúo desarrollo anatómico y funcional de la glándula tiroides después que
han comenzado estas funciones y aún antes es dependiente de la TSH.
Manifestaciones Clínicas
NO SIGNOS CLINICOS AL NACER (SOLO EL 5 %)
AFECCIONES DEL SNC:
Retraso mental profundo
Espasticidad
Incoordinación
Ataxia
Estrabismo
Disminución de la audición.
RETARDO EN LA MADURACION OSEA.
RETARDO DEL CRECIMIENTO.
DISMINUCION DE LA ACTIVIDAD METABOLICA BASAL.
ESTRATEGIAS PARA EL PESQUISAJE DE HIPOTIROIDISMO CONGÉNITO
Determinación de T4 como prueba inicial y cuantificación de TSH en la
confirmación de los casos positivos.
Determinación de TSH como prueba inicial y cuantificación de T4 en la
confirmación.
Determinación simultánea de TSH y T4 en todas las muestras como prueba
inicial.
Tipo de muestra
Cordón umbilical: Suero o sangre total colectada en papel de filtro.
67
Talón: Sangre total colectada en papel de filtro.
Las muestras en papel de filtro deben conservarse preferiblemente en
refrigeración (4-8 °C) en su defecto en lugares frescos, y sin exposición a la
luz solar. Las muestras de suero deben conservarse congeladas (-20 °C),
deben evitarse sucesivas descongelaciones.
Momento de la toma de muestra
Cordón: En el momento del nacimiento.
Talón: Entre el 5to y 7mo día del nacimiento.
Confirmación
Los casos con un resultado “ELEVADO” deben ser evaluados por un pediatra
entrenado o, preferiblemente, un endocrinólogo pediatra, para la posible
identificación de signos de HC y obtención de una segunda muestra del talón
(preferiblemente suero). Se recomienda iniciar tratamiento preventivo con L-
tiroxina (entre 12-15 g/kg/día).
En la segunda muestra del talón se miden las concentraciones de TSH (UMELISA
TSH) y T4 (UMELISA T4). Si el valor de TSH es superior a 10 mUI/L y el valor de
T4 es inferior a 80 nmol/L, se ratificará el diagnóstico presuntivo de Hipotiroidismo
Congénito.
Cuando fuera posible se realizarán estudios complementarios que incluyen
evaluación de indicadores de la función tiroidea, ecografía del tiroides, captación
de Tc99 y estudios radiográficos.
Tratamiento y Seguimiento evolutivo.
Una vez ratificado el diagnóstico presuntivo de HC se mantendrá el tratamiento
con L-tiroxina.
El seguimiento se basa en la evaluación periódica del paciente. En todas las
consultas se debe valorar el ritmo de crecimiento y desarrollo y se indicará el
análisis cuantitativo de las hormonas TSH y T4. La dosis de L-Tiroxina debe
ajustarse, para mantener los niveles séricos de TSH por debajo del límite superior
68
normal (6 mUI/L) y el nivel sérico de T4 sobre el 50 percentil de la distribución de
la población normal. Es importante instruir a los padres para que conozcan la
enfermedad y la importancia de mantener ininterrumpidamente el tratamiento.
Al término del tercer año de edad, de no haberse llegado previamente a una
confirmación diagnóstica definitiva, se evalúa el caso suspendiendo el tratamiento
durante un mes y midiendo los niveles séricos de TSH y T4. Los pacientes con
valores de TSH superior a 10 mUI/L y T4 inferiores a 80 nmol/L se ratifican como
hipotiroideos permanentes y mantiene el tratamiento de por vida. Los casos que
presentan niveles normales de TSH y T4 se considera que fueron hipotiroideos
transitorios, no se reinicia el tratamiento, se recomienda mantener la evaluación
periódica por un año.
Evaluación neurocognitiva.
Como parte de un seguimiento integral de los pacientes se recomienda la
intervención de un psicólogo y la realización de pruebas psicométricas acordes
con la edad del niño.
Para la evaluación neurocognitiva de los niños, a partir de los 7 años de edad, se
dispone del programa SESH que incluye un paquete de pruebas computarizadas,
específicamente diseñada para la exploración de las áreas básicas cognitivas y
evaluación del desarrollo del sistema nervioso, que posibilitan la detección de
alteraciones subclínicas, permitiendo optimizar el tratamiento de estos pacientes.
ENSAYOS UMELISA DISPONIBLES
UMELISA TSH NEONATAL (para la determinación de TSH en sangre seca
colectada en papel de filtro)
UMELISA TSH (para la determinación de TSH en suero)
69
UMELISA T4 NEONATAL (para la determinación de T4 en sangre seca colectada
en papel de filtro)
UMELISA T4 (para la determinación de T4 en suero)
UMELISA TSH NEONATAL
El UMELISA TSH NEONATAL es un ensayo heterogéneo inmunoenzimático tipo
sandwich, en el cual se utiliza como fase sólida, placas de tiras con pocillos
revestidos previamente con anticuerpos monoclonales Anti cadena Beta de la
TSH, lo cual garantiza la especificidad del ensayo.
Las muestras, los calibradores y el control en manchas de sangre seca se eluyen
con un conjugado Anti TSH Humana (Carnero)/Fosfatasa Alcalina (F.A.). Este
eluato se deposita en los pocillos de las tiras, permitiendo la formación del
complejo anticuerpo/TSH/anticuerpo-enzima. La realización de un lavado posterior
elimina los componentes no fijados. Al añadir un sustrato fluorigénico (4-
Metilumbeliferil fosfato) en los pocillos de las tiras, éste resultará hidrolizado por la
enzima del conjugado y la intensidad de la fluorescencia emitida será proporcional
a la concentración de TSH presente en la muestra.
MATERIALES Y REACTIVOS (UMELISA TSH NEONATAL)
Solución Tampón 25 X.
Placas sensibilizadas con anticuerpos anti cadena b de la hTSH.
Suero de Carnero. Solución al 20 %.
Conjugado anti cadena a de la TSH/F.Alcalina
Calibradores en sangre seca.
Sustrato 10X.
Tampón Sustrato.
PLACAS DE REACCIÓN
(Placas de 96 posiciones con capacidad máxima de 30 µL)
Tipo de fase sólida: Poliestireno.
70
Conservación: 2-8 °C
CONJUGADO
Método de conjugación: Glutaraldehído
Enzima: Fosfatasa Alacalina
Anticuerpos: Anti cadena alfa TSH
Conservación: 2-8°C
CALIBRADORES Y CONTROLES EN SANGRE SECA
Sangre humana: Ajustada a 55 % de hematocrito (negativa a las pruebas de
detección de Anti-VIH 1+2, HBsAg y Anti- VHC).
Papel de filtro: Schleicher and Schuell 903™.
Calibrados con el Patrón internacional (2da preparación de referencia 80 558
de la OMS).
Estas son las concentraciones aproximadas que deben tener los
calibradores del ensayo, en cada lote se determinan las concentraciones de
los mismos.
Calibrador A: 0 mUI/L de sangre total
Calibrador B: 8-12 mUI/L de sangre total
Calibrador C: 21-29 mUI/L de sangre total
Calibrador D: 42-58 mUI/L de sangre total
Calibrador E: 85-115 mUI/L de sangre total
Calibrador F: 135-165 mUI/L de sangre total
Control CB: Control del ensayo.
Conservación: 2-8°C.
71
CARACTERÍSTICAS FUNCIONALES DEL ENSAYO
Tiempo de duración del ensayo: 4 horas totales.
Tipo de Muestra: Muestras de sangre seca colectadas en pape de filtro S&S
903™, obtenidas por punción del talón entre 5to y el 7mo día de nacido o de
sangre del cordón umbilical. No interferencia con EDTA o Citrato.
Límite de Detección: La concentración mínima detectable es de 1,3 mUI/L. Se
define como la concentración calculada para la fluorescencia equivalente al
Calibrador A + 2 DE.
72
CLASIFICACIÓN E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS SEGÚN EL
TIEMPO DE COLECTA DE LA MUESTRA
En el momento del nacimiento o antes de las 24 horas: Elevado (>30 mUI/L).
Después de las 24 horas: Elevado (>15 mUI/L).
5to y 7mo día: Elevado (>10 mUI/L).
Teniendo en cuenta los factores genéticos y ambientales que actúan sobre las
poblaciones de diferentes localizaciones geográficas, se recomienda que cada
laboratorio establezca sus propios valores de referencia, a partir de la distribución
de TSH en la población normal de recién nacidos, empleando inicialmente un valor
de corte correspondiente al 99 percentil de la distribución.
PROBLEMAS QUE SE PUEDEN PRESENTAR EN EL UMELISA TSH
NEONATAL
Problemas Posibles Causas
Baja señal de fluorescencia de la
curva de calibración y el control
del ensayo
- Tiempo de incubación incorrecto
- Temperatura de incubación de la
inmurreacción inferior a los 37 °C.
- Preparación inadecuada de la
dilución de conjugado
Blancos con señal de fluorescencia
elevada
- Lavado ineficiente de las placas
- Sustrato hidrolizado
- Temperatura de incubación de las
placas muy superior a los 37°C.
- Evaporación de la solución de
elución.
73
UMELISA T4 NEONATAL
El UMELISA T4 NEONATAL es un ensayo inmunoenzimático competitivo para la
determinación de Tiroxina total en sangre seca colectada en papel de filtro, donde
el antígeno natural y el antígeno marcado con una enzima compiten por una
cantidad limitada de sitios de unión al anticuerpo. En este ensayo se utiliza como
fase sólida tiras de ultramicroELISA presensibilizadas con anticuerpos Anti-T4, lo
cual garantiza la especificidad del ensayo.
Las manchas de sangre seca se eluyen con la solución que contiene el conjugado
T4/Fosfatasa Alcalina (F.A.) y el eluato se deposita en los pocillos de las tiras de
reacción. Se procede a la incubación de las mismas para permitir la formación del
complejo anticuerpo-antígeno-enzima. La realización de un lavado posterior
elimina el conjugado no fijado y los otros componentes de la muestra. Al añadir el
sustrato fluorigénico (4-Metilumbeliferil fosfato), éste resultará hidrolizado por la
enzima del conjugado y la intensidad de la fluorescencia emitida será
inversamente proporcional a la concentración de tiroxina presente en la muestra.
MATERIALES Y REACTIVOS (UMELISA T4 NEONATAL)
Solución Tampón 25 X.
Placas sensibilizadas con anticuerpos anti-T4
Tampón Conjugado
Conjugado anti-T4/F.Alcalina
Calibradores en sangre seca.
Sustrato 10X.
Tampón Sustrato.
PLACAS DE REACCIÓN
(Placas de 96 posiciones con capacidad máxima de 30 µL)
Tipo de fase sólida: Poliestireno.
74
Conservación: 2-8°C
CONJUGADO
Método de conjugación: Glutaraldehído
Enzima: Fosfatasa Alacalina
Anticuerpos: Anti -T4
Conservación: 2-8°C
CALIBRADORES Y CONTROLES EN SANGRE SECA
Sangre humana: Ajustada a 55 % de hematocrito (negativa a las pruebas de
detección de Anti-VIH 1+2, HBsAg y Anti- VHC).
Papel de filtro: Schleicher and Schuell 903™.
Estas son las concentraciones aproximadas que deben tener los calibradores del
ensayo, en cada lote se determinan las concentraciones de los mismos.
Calibrador A: 0 nmol de T4/L de suero
Calibrador B: 21 - 29 nmol de T4/L de suero
Calibrador C: 47 - 63 nmol de T4/L de suero
Calibrador D: 85 - 115 nmol de T4/L de suero
Calibrador E: 170 - 230 nmol de T4/L de suero
Calibrador F: 340 - 460 nmol de T4/L de suero
Control CB: Control del ensayo.
Factor de Conversión: nmol/L x 0.078= µg/dL µg/dL x 12.87= nmol/L.
Conservación: 2-8°C.
75
CARACTERÍSTICAS FUNCIONALES DEL ENSAYO
Tiempo de duración del ensayo: 4 horas totales.
Tipo de Muestra: Muestras de sangre seca colectadas en papel de filtro S&S
903™, obtenidas por punción del talón entre 5to y el 7mo día de nacido o de
sangre del cordón umbilical.
Límite de Detección: La concentración mínima detectable es de 17 nmol de T4/L
Suero. Se define como la concentración calculada para la fluorescencia
equivalente al Calibrador A - 2 DE.
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CLASIFICACIÓN E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
Después de haber solicitado una segunda muestra, si el valor de TSH es superior
a 10 mUI/L y el valor de T4 es inferior a 80 nmol/L, se ratificará el diagnóstico
presuntivo de Hipotiroidismo Congénito.
PROBLEMAS QUE SE PUEDEN PRESENTAR EN EL UMELISA T4 NEONATAL
Problemas Posibles Causas
Imprecisión en el ensayo - Lavado ineficiente
- Contaminación del material
utilizado con suero humano.
- Mala manipulación del
analista
Exactitud del ensayo - Preparación inadecuada de
la dilución del conjugado
- Calidad de las muestras
CONSIDERACIONES PRÁCTICAS.
Las muestras deben ser colectadas según el procedimiento descrito en:
Blood collection on Filter Paper for neonatal Screening Programs-second
edition. NCCLS Document LA4-A2 Vol 12 N°13 (1992).
Una transfusión de sangre o el tratamiento con suero o plasma al recién
nacido, previa a la toma de la muestra, puede alterar los resultados de la
prueba por tanto la muestra debe obtenerse antes de la transfusión.
Es importante obtener muestras de recién nacidos que fueron transferidos a las
Unidades de Cuidados Intensivos Neonatales y no se les tomó la muestra
previamente. En estos casos y aquellos con bajo peso, se recomienda tomar
una segunda muestra a los 15 días de nacido.
77
Los criterios relativos al nivel de corte, confirmación, tratamiento y seguimiento
constituyen solo recomendaciones de referencia. Los organizadores del
programa de pesquisaje definirán los criterios definitivos a utilizar en cada
caso.
Las muestras deben conservarse preferiblemente en refrigeración (4-8 °C) o
en su defecto en lugares frescos, y sin exposición a la luz solar.
FENILCETONURIA
La fenilcetonuria, llamada frecuentemente PKU (siglas en inglés) es un error
innato del metabolismo con una alta incidencia (1:5000) que afecta al aminoácido
fenilalanina. Este trastorno es producido por la disminución o deficiencia del
complejo enzimático presente en el hígado, denominado fenilalanina hidroxilasa, el
cual cataliza la conversión de fenilalanina a tirosina. Este defecto enzimático,
desde el punto de vista bioquímico, provoca la acumulación de la fenilalanina
(Phe) en la sangre y en otros líquidos y tejidos orgánicos, así como una ligera
disminución de los niveles de tirosina.
La concentración de Phe en el recién nacido con fenilcetonuria puede ser normal
hasta el cuarto día de vida, pero aumenta con rapidez al comenzar la alimentación
proteica. Si no se inicia el tratamiento en el período neonatal o al menos bastante
temprano durante la lactancia, aparecen los signos clínicos de la enfermedad,
entre los que se encuentran retraso mental irreversible, anormalidades
neurológicas y defectos en la piel y en su pigmentación. De ahí que sea muy
importante el diagnóstico temprano y la aplicación de una dieta deficitaria de Phe
antes de la tercera o cuarta semana de vida, con la cantidad suficiente de este
aminoácido para el crecimiento normal del niño. Cuando las concentraciones de
Phe han sido controladas por el empleo de las dietas especiales no aparecen los
síntomas de la enfermedad, ni ninguna manifestación de retraso mental o lesión
cerebral.
78
Metabolismo de la fenilalanina.
La fenilalanina es un aminoácido cetogénico y gluconeogénico ya que puede ser
degradado en múltiples intermediarios como el acetil CoA, dando origen a cuerpos
cetónicos y/o piruvato o intermediarios del ciclo del ácido cítrico, llegando así con
la vía de la glucosa a la formación de fosfoenolpiruvato .
La degradación de la Phe se lleva a cabo cuando este aminoácido y el producto
de su oxidación, la tirosina, originan dos fragmentos, los cuales pueden entrar al
ciclo del ácido cítrico.
La primera enzima de la ruta de la Phe es la fenilalanina hidroxilasa, la cual
cataliza la hidroxilación de la Phe a tirosina. Esta enzima inserta uno de los dos
átomos de oxígeno en la Phe para formar el grupo hidroxilo de la tirosina. El otro
átomo de oxígeno se reduce formando agua por el NADH.
La Phe hidroxilasa requiere un cofactor denominado la tetrahidrobiopterina o BH ,
durante la reacción el BH4 se oxida a dihidrobiopterina reduciéndose otra vez por
la enzima dihidrobiopterina reductasa en una reacción que requiere de NADH.
La tetrahidrobiopterina es además un cofactor para la tirosina hidroxilasa y el
triptofan hidroxilasa, enzimas esenciales para la formación de neurotransmisores
catecolamínicos, dopamina, noradrenalina, adrenalina y serotonina. La
disminución de esos neurotransmisores lleva a un deterioro neurológico con
dificultades como hipotonía, ataques y muerte.
79
Genética de la enfermedad.
Los genes para la fenilcetonuria son hereditarios, y su patrón de herencia es
autosómico recesivo, es decir que cada progenitor lleva un gen defectuoso y uno
normal, lo cual los hace portadores; el individuo en condición recesiva porta dos
genes defectuosos para tener el desorden. Cuando esto ocurre existe un cuarto de
probabilidades de que se produzca un niño afectado por cada embarazo.
Los individuos con afectación en el gen para la enzima presentan esta con
actividad parcial o no detectable.
Formas Clínicas.
A pesar de que las cifras normales en suero de la Phe pueden variar
discretamente según el origen étnico de la población, internacionalmente se han
considerado como normales, niveles alrededor de 1 mg/dL (60 µmol/L sangre).
Teniendo en cuenta el nivel en suero, la tolerancia a la ingesta del mismo, la
actividad residual de la enzima y la mutación que la originan, las
Hiperfenilalaninemias (HFA) pueden clasificarse en:
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HFA transitoria : Se produce secundariamente a inmadurez hepática que
conlleva a una enzima fenilalanina hidroxilasa funcionalmente deficiente de
manera transitoria, observándose niveles de Phe en suero entre 4-10 mg/dL
(240-600 µmol/L sangre) que tienden a normalizarse a los seis meses. Los
niveles de tirosina son normales y se detecta una actividad de la enzima de
aproximadamente el 50% de los controles. La HFA transitoria se observa
generalmente en los recién nacidos prematuros y/o con íctero, sin
traducción genética en la mayoría de los casos, excepto en la que se
produce por déficit de la enzima Carbamilfosfato deshidratasa.
HFA Persistente o Benigna : Se presenta con niveles en suero de Phe que
pueden ir desde 4 hasta 19 mg/dL (240-1140 µmol/L sangre), sin
presentarse manifestaciones clínicas por lo cual de manera general no
requieren tratamiento. Tiene una actividad enzimática entre el 3 y el 50 % y
se tolera una ingesta de FA por encima de los 50 mg/Kg/día. Los niveles de
tirosina suelen ser normales.
Fenilcetonuria o FC clásica : Se presenta con niveles de Phe por encima
de 20 mg/dL (1200 µmol/L sangre) y de tirosina menores de 1.8 mg/dL
(normales o bajos). Muestra un cuadro clínico característico con retraso
mental severo y convulsiones, disfunción neurológica y alteración del
encefalograma. Se distingue un olor a ratón, característico de la piel, pelo,
orina y tendencia a la hipopigmentación y eccema. La actividad enzimática
está por debajo del 5 o 6 % y se tolera una ingesta del aminoácido inferior a
20 mg/Kg/día.
FC atípica : Los niveles de Phe encontrados generalmente están entre 10-
20 mg/dL (600-1200 µmol/L sangre) con un cuadro clínico variable, mucho
menos severo que la forma clásica. Generalmente son más tolerantes a la
ingestión de Phe.
81
FC maligna : Se debe a defectos en las enzimas relacionadas con el
cofactor y es por ello que a pesar que los niveles altos de Phe sean
tratados nutricionalmente, no se produce respuesta a dicho tratamiento,
desarrollando daño neurológico precoz. Los niveles de Phe pueden ser
variables y van desde 4-40mg/dL (240-2400 µmol/L).
En la mayoría de los países desarrollados los niños son pesquisados para
Fenilcetonuria por medición de la Phe en sangre durante el período neonatal,
empleando técnicas microbiológicas y fluorimétricas.
En Cuba, desde el año 1984 se inició el Programa Nacional de Prevención de
Hiperfenilalaninemias en los recién nacidos de Ciudad de la Habana, utilizando
sangre seca en papel de filtro para medir la concentración de Phe por el método
de Guthrie-Susi, que se extendió a todo el país a partir del año 1986.
En la actualidad este pesquisaje ha sido descentralizado en todas las provincias,
utilizándose el UMTEST PKU, diseñado y producido por el Centro de
Inmunoensayo, para la determinación de los niveles de Phe en muestras de
sangre en papel de filtro.
Tratamiento y Seguimiento.
Como la Phe es un aminoácido esencial, el tratamiento consiste en la restricción
dietética de la Phe. Se dispone comercialmente formulaciones lácteas y de otros
alimentos, especialmente diseñados para este padecimiento.
Es importante la participación de un nutricionista entrenado para tratar a estos
pacientes, además se debe instruir a los padres para que conozcan la enfermedad
y la importancia de mantener ininterrumpidamente el tratamiento.
En los niños con valores de Phe 10 mg/dL (600 mol/L), la ingestión de Phe
deberá ser ajustada, en cada caso, para mantener los niveles séricos de Phe entre
2 y 6 mg/dL (120-360 mol/L) en los primeros años de edad, en niños mayores se
puede permitir hasta 8 mg/dL (480 mol/L).
El seguimiento se basa en la evaluación periódica del paciente.
82
Evaluación neurocognitiva.
Como parte de un seguimiento integral de los pacientes se recomienda la
intervención de un psicólogo y la realización de pruebas psicométricas acordes
con la edad del niño.
Para la evaluación neurocognitiva de los niños, a partir de los 7 años de edad, se
dispone del programa SESH que incluye un paquete de pruebas computarizadas,
específicamente diseñada para la exploración de las áreas básicas cognitivas y
evaluación del desarrollo del sistema nervioso, que posibilitan la detección de
alteraciones subclínicas, permitiendo optimizar el tratamiento de estos pacientes.
PRINCIPALES MÉTODOS UTILIZADOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE PKU.
- Inhibición bacteriana (Guthrie).
- Fluorimétricos (modificaciones de McCaman y Robins).
- Espectrofotométricos.
- Enzimáticos.
- HPLC.
UMTEST PKU.
Como método para la determinación cuantitativa de Phe se utiliza el UMTEST
PKU, un ultramicroensayo fluorescente para la cuantificación de Phe en sangre
seca sobre papel de filtro obtenida del talón de recién nacidos.
La prueba se basa en la reacción de la Phe presente en la muestra con la
Ninhidrina, en condiciones óptimas de pH y temperatura, formando un complejo
poco fluorescente. Con la adición de iones cobre, se produce la amplificación de la
fluorescencia, aumentando su intensidad por la previa adición de L-Leucil-L-
Alanina a la mezcla de reacción. La intensidad de la fluorescencia emitida es
proporcional a la concentración de Phe presente en la mezcla.
MATERIALES Y REACTIVOS (UMTEST PKU)
Placas de elución.
Placas de reacción.
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Calibradores en sangre seca.
Tampón Succinato (pH 5.8).
Ninhidrina (liofilizado).
L-Leucil- Alanina (liofilizado).
Reactivo de Cobre (listo para el uso).
CALIBRADORES Y CONTROLES EN SANGRE SECA
Sangre humana: Ajustada a 55 % de hematocrito (negativa a las pruebas de
detección de Anti-VIH 1+2, HBsAg y Anti- VHC).
Papel de filtro: Schleicher and Schuell 903™.
Estas son las concentraciones aproximadas que deben tener los calibradores y
control del ensayo. En cada lote se determinan las concentraciones de los
mismos.
Calibrador A (disco de papel): 0 µmol de Fenilalanina/L de sangre total
Calibrador B: 160-200 µmol de Fenilalanina/L de sangre total
Calibrador C: 320-400 µmol de Fenilalanina/L de sangre total
Calibrador D: 650-800 µmol de Fenilalanina/L de sangre total
Calibrador E: 1300-1580 µmol de Fenilalanina/L de sangre total
Calibrador F: 2590-3170 µmol de Fenilalanina/L de sangre total
Control CB (Control del ensayo): 800 – 1000 µmol de Fenilalanina/L de sangre
total
Factor de conversión: 1mg/dL= 60.54 µmol/L.
Conservación: 2-8°C.
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CARACTERÍSTICAS FUNCIONALES DEL ENSAYO
Tiempo de duración del ensayo: 2 Horas.
Tipo de Muestra: Muestras de sangre seca colectadas en papel de filtro S&S
903™, obtenidas por punción del talón entre 5to y el 7mo día de nacido.
Límite de Detección: La concentración mínima detectable es de 30 µmol/L. Se
define como la concentración calculada para la fluorescencia equivalente al
Calibrador A + 2 DE.
CLASIFICACIÓN E INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS
El resultado se considera “ELEVADO” cuando la concentración de Phe supera los
240 µmol/L (4 mg/dL).
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PROBLEMAS QUE SE PUEDEN PRESENTAR EN EL UMTEST PKU
Problemas Posibles Causas
Baja señal de fluorescencia de la
curva
de calibración y el control del ensayo
- Temperatura de incubación de la reacción
química es inferior a 60°C.
Señales de fluorescencia muy bajas,
a
nivel del blanco del ensayo, tanto
para
la curva de calibración como para las
muestras y el control
- No hubo desproteinización, posiblemente
debido a que el etanol no está al 70 %.
- El pH al cual ocurrió la reacción no es el
adecuado.
Valores de fluorescencia muy altos
para
la curva de calibración y el control del
ensayo
- Temperatura de incubación de la reacción
superior a 62°C.
- Las cámaras de incubación no tienen la
cantidad de agua suficiente para propiciar
un ambiente húmedo que impida la
evaporación de las muestras.
Evaporación de la mezcla de reacción - La cámara de incubación quedó abierta y
esto provoca la evaporación de las
muestras.
- Interacción del agua de la cámara con la
placa ultramicroelisa, esto provoca la
evaporación de las muestras.
Confirmación.
Los casos con un resultado “ELEVADO” deben ser evaluados con una segunda
muestra de sangre del talón en papel de filtro (se recomienda, cuando sea posible,
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la determinación de fenilalanina en suero). De acuerdo con la concentración de
Phe en la segunda muestra el caso puede clasificarse como sigue:
Hiperfenilalaninemia benigna: 4-10 mg/dL (240-600 mol/L). Con tirosinemia
normal
Hiperfenilalaninemia persistente: 10-20 mg/dL (600-1200 mol/L)
Fenilcetonuria Clásica: > 20 mg/dL (1200 mol/L)
Cuando sea posible se recomiendan estudios complementarios que incluyen la
medición en suero de la tirosina y de la actividad de fenilalanina hidroxilasa.
Consideraciones prácticas.
Las muestras deben ser colectadas según el procedimiento descrito en: Blood
collection on Filter Paper for neonatal Screening Programs-second edition.
NCCLS Document LA4-A2 Vol 12 N°13 (1992).
Una transfusión de sangre o el tratamiento con suero o plasma al recién
nacido, previa a la toma de la muestra, puede alterar los resultados de la
prueba, por tanto la muestra debe obtenerse antes de la transfusión.
Es importante obtener muestras de recién nacidos que fueron transferidos a las
Unidades de Cuidados Intensivos Neonatales y no se les tomó la muestra
previamente. En estos casos y aquellos con bajo peso, se recomienda tomar
una segunda muestra a los 15 días de nacido.
Las muestras procedentes de sangre del cordón umbilical no pueden ser
empleadas para el pesquisaje de Fenilcetonuria. Los recién nacidos deben
tener al menos 24 horas de vida y alimentación previa con leche antes de la
determinación de Phe. Si la muestra es tomada antes de las 24 horas, debe
repetirse la prueba a los 7 días de nacido, independientemente del resultado
de la primera muestra.
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Los criterios relativos al nivel de corte, confirmación, tratamiento y seguimiento
constituyen solo recomendaciones de referencia. Los organizadores del
programa de pesquisaje definirán los criterios definitivos a utilizar en cada
caso.
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