resumen -...
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I
RESUMEN
Con el crecimiento de la población, también ha aumentado la demanda de
alimento; siendo la acuacultura y primordialmente la de camarón, una de las
actividades utilizadas para cubrir la demanda, sin embargo tiene la desventaja de
generar grandes volúmenes de agua con microorganismos como las microalgas,
las cuales utilizan los compuestos nitrogenados y fosfatados para su crecimiento y
producción. Estas microalgas pueden ser utilizadas como materia prima para la
generación de biocombustibles. Por lo que el objetivo del presente trabajo de
investigación fue evaluar el cultivo de microalgas marinas Dunaliella salina y
Dunaliella tertiolecta en efluente de camarón a 20000 °K para la producción de
bioetanol a partir de los carbohidratos de la biomasa, así como la eficiencia de
remoción de compuestos nitrogenados y fosfatados en el efluente. El diseño
experimental consistió en un factorial general A x B x C a dos niveles cada uno (2
x 2 x 2) tomando como factores la especie de microalga utilizada, el medio de
cultivo y la fase de crecimiento, se realizaron ocho tratamientos con tres réplicas,
para obtener un total de veinticuatro unidades experimentales. D. salina cultivada
en el medio F2, presentó valores más altos de células (5.1X106 ± 84.87cél mL-1)
en ambas fases, respecto al contenido de carbohidratos, el mayor contenido
(46.06 ± 5.79%) se obtuvo en D. salina en medio F2 en fase estacionaria, mientras
que la producción de biomasa y carbohidratos, y productividad de carbohidratos,
se mostró mayor en D. salina en F2 durante fase estacionaria (173.17± 23.03 mg
L-1, 78.88 ± 0.44 mg L-1 y 9.86 ± 0.06 mg L-1 día -1, respectivamente). D. tertiolecta
presentó 95 y 8% de remoción de nitratos y amonio respectivamente. Con
respecto a la fermentación con S. cerevisiae, se obtuvo 0.049 g L-1 h-1 de
productividad, rendimiento de 0.132 g etanol/ g glucosa y un rendimiento de 0.11 g
etanol/ g biomasa. Cabe resaltar que Dunaliella salina mostró los mejores
resultados en cuanto a densidad celular, contenido, producción y productividad de
biomasa y carbohidratos. En cuanto a remoción de nitratos y amonio fue Dunaliella
II
tertiolecta quien tuvo valores más altos, capacidad que puede ser empleada para
tratar efluentes derivados del cultivo de camarón antes de ser vertidos a cuerpos
naturales. Se obtuvo etanol derivado de glucosa proveniente de carbohidratos
producidos por la microalga marina D. salina, sin embargo la producción de
carbohidratos fue baja.
III
ABSTRACT
With the rapid growth of the population, as increased the demand for food;
currently the aquaculture is an activity that is covering part of this need. On the
other hand, the generation of large volumes of effluent from aquaculture, has led to
seek recovery thereof; among the options is the cultivation of microalgae, which
can be used nitrogen and phosphate compounds for their growth and production,
such production can be used as raw material for the generation of biofuels. The
objective of this research work will be to evaluate the culture of marine microalgae
Dunaliella salina and Dunaliella tertiolecta in effluent from shrimp to 20000 °K for
the production of bioethanol from biomass carbohydrates, as well as the efficiency
of removal of nitrogenous and phosphate compounds in the effluent. The
experimental design is a factorial general A x B x C to three levels each (2 x 2 x 2)
taking such factors as the type of used microalga, the culture medium and growth
phase, will be eight treatments with three replicas, for a total of twenty four
experimental units. D. salina cultivated in the F2 medium, presented higher values
of cells (5.1X106 ± 84.87 cells mL-1) in both phases, with respect to the
carbohydrate content, the highest content (46.06 ± 5.79%) was obtained in D.
salina in medium F2 in stationary phase, while the production of biomass and
carbohydrates, and carbohydrate productivity, showed higher in D. salina in F2
during stationary phase (173.17± 23.03 mg L-1, 778.88 ± 0.44 mg L-1 and 9.86 ±
0.06 mg L-1 day -1, respectively). D. tertiolecta presented 95 and 8% nitrate and
ammonium removal, respectively. With respect to fermentation with S. cerevisiae,
0.049 g L-1 h-1 productivity was obtained, yield of 0.132 g ethanol/g glucose and a
yield of 0.11 g ethanol/g biomass. It should be noted that Dunaliella salina showed
the best results in terms of cell density, content, biomass and carbohydrate
production, and productivity. In terms of removal of nitrates and ammonium was
Dunaliella tertiolecta who had higher values, capacity that can be used to treat
effluents derived from shrimp farming before being discharged into natural bodies.
IV
Ethanol derived from glucose was obtained from carbohydrates produced by the
marine microalga D. salina however the production of carbohydrates was low.
V
DEDICATORIA
A mi esposo Juan Carlos Mendoza Morales, mi hijo Carlos Antonio Mendoza
Martínez, ya que siempre me apoyan incondicionalmente. Gracias por su amor,
comprensión y ánimos infinitos. Los amo.
A mi familia, mi papa hermanos y hermana, gracias por estar siempre conmigo.
VI
AGRADECIMIENTOS
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Conacyt) por la beca otorgada para
cursar la Maestría en Ciencias en Acuacultura, con la cual pude realizar este
proyecto de investigación.
A Dios por permitirme llevar a cabo esta etapa de mi vida.
A mi director de tesis, el Doctor Luis Alfredo Ortega Clemente por aceptarme
trabajar en su equipo, el apoyo académico, enseñanzas y consejos.
A la Dra. Beatriz Gutiérrez Rivera por el apoyo brindado en su laboratorio, así
como el asesoramiento académico.
A mis sinodales Dr. Carlos Iván Pérez Rostro y Dr. Ignacio Alejandro Pérez
Legaspi por sus asesoramientos académicos.
A mis suegros Esteban Mendoza Guzmán y Ángela Morales Ríos por todo el
cariño y apoyo brindado para realizar esta meta en mi vida.
A mi amiga Lesli quien me estuvo siempre acompañando y animando durante la
maestría, agradezco tu amistad y el apoyo.
A mis compañeros de laboratorio por su ayuda, sin duda un gran equipo: Ruth,
Mariana, América, Ely, Leo, Juve, Salim.
VII
ÍNDICE
RESUMEN……………………………………………………………………………….…I
ABSTRACT……………………………………………………………………………….III
DEDICATORIA……………………………………………………………………………V
AGRADECIMIENTOS…………………………………………………………………...VI
INDICE……………………………………………………………………………………VII
INDICE DE FIGURAS…………………………………………………………………….X
INDICE DE TABLAS…………………………………………………………………….XI
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA………………………………………………1
2. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………..…..2
2.1 Microalgas marinas Dunaliella tertiolecta y Dunaliella salina……………..6
2.1.1 Iluminación en microalgas……………………………………………...7
2.1.2 Temperatura cromática…………………………………………………8
2.2 Cultivo de camarón Litopeneaus vannamei………………………………...9
2.3 Población de granjas camaronícolas y su distribución nacional………..10
2.4 Efluentes residuales y su impacto ambiental……………………………...12
2.5 Combustibles fósiles y biocombustibles…………………………………...12
2.6 Biocombustibles de primera, segunda, tercera y cuarta generación…...14
I) Primera generación………………………………………………………...15
II) Segunda generación…………………………………………………...….16
III) Tercera generación……………………………………………….………16
IV) Cuarta generación………………………………………………………..17
VIII
2.7 Bioetanol y la importancia a nivel nacional y alternativa energética sustentable………………………………………………………………………..17
3. ANTECEDENTES…………………………………………………………………….22
3.1 Acuacultura…………………………………………………………………...22
3.2 Cultivo nacional de camarón……………………………………………….22
3.3 Experimentos en microalgas……………………………………………….22
4. JUSTIFICACIÓN……………………………………………………………………...25
5. HIPÓTESIS……………………………………………………………………………26
6. OBJETIVOS…………………………………………………………………………...26
7. ÁREA DE ESTUDIO………………………………………………………………….27
8. MATERIALES Y MÉTODOS………………………………………………………..28
8.1 Diseño experimental………………………………………………………...28
8.2 Desarrollo experimental…………………………………………………….29
I) Propagación de cepas………………………………………………...29
II) Diseño e implementación de fotobioreactores……………………..30
III) Preparación de medios de cultivo…………………………………..31
IV) Determinación de la densidad celular en los fotobioreactores….31
V) Filtrado de microalgas y determinación de peso seco……………32
VI) Determinación de carbohidratos totales (Dubois et al., 1956)…..32
VII) Hidrólisis acida (H2SO4)…………………………………………….35
VIII) Desarrollo de la reacción del DNS…………………...…………..36
IX) Curva patrón de glucosa…………………………………………….36
X) Sacarificación de carbohidratos de microalgas……………...…...37
XI) Fermentación de la glucosa en microalgas con S. cerevisiae…38
XII) Determinación de etanol por HPLC (High performance liquid
IX
chromatography)…………………………………………………………….38
XIII) Preparación de muestras para HPLC……………………………..38
9. RESULTADOS………………………………………………………………………40
10. DISCUSIÓN………………………………………………………………………….50
11. CONCLUSIÓN……………………………………………………………………….54
12. REFERENCIAS……………………………………………………………………...55
13. ANEXOS……………………………………………………………………………..60
X
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Producción acuícola mundial de peces comestibles y plantas acuáticas,
1990-2016 (FAO, 2018)…………………………………………………………………..3
Figura 2. Temperatura de color en la escala Kelvin ………………………………….9
Figura 3. Producción de bioetanol a partir de biomasa microalgal usando procesos
de conversión bioquímica ………………………………………………………….…..20
Figura 4. Ruta fermentativa de la glucosa ………………………………………...…21
Figura 5. Ruptura de los puentes glucosidicos; cada molécula de glucosa gana una molécula de agua ………………………………………………………………..…21
Figura 6. a) Instituto Tecnológico de Boca del Río, b) Instituto Tecnológico Superior de Tierra Blanca ………………………………………………………………27
Figura 7. Fotobioreactor tubular vertical de 8L ……………………………..……….30
Figura 8. Curva DNS concentración de glucosa y absorbancia a 540 nm………..37
Figura 9. Medición de pH durante el crecimiento de D. salina y D. tertiolecta en
efluente de cultivo de camarón………………………………………………………...42
Figura 10. Concentraciones de amonio (NH4) durante el crecimiento de D. salina y
D. tertiolecta en efluente de cultivo de camarón……………………………………..43
Figura 11. Concentraciones de nitrato (NO3) durante el crecimiento de D. salina y
D. tertiolecta en efluente de cultivo de camarón……………………………………..43
Figura 12. Concentraciones de nitrito (NO2) durante el crecimiento de las
microalgas D. salina y D. tertiolecta en efluente de cultivo de camarón…………..44
Figura 13. Concentraciones de fosfato (PO4) durante el crecimiento de las
microalgas D. salina y D. tertiolecta en efluente de cultivo de camarón………..…44
Figura 14. Comportamiento de S. cerevisiae durante el ensayo ……………….…48
Figura 15. Producción de bioetanol y consumo de glucosa por S. cerevisiae …..49
XI
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Unidades de producción acuícola por estado en 2011 …………………..11
Tabla 2. Principales tipos de biocombustibles …………………………………….…13
Tabla 3. Experimentos en microalgas..……………................................................23
Tabla 4. Diseño factorial general 2x2x2 …………………………………………..….28
Tabla 5. Variables de respuesta a evaluar en el ensayo ……………………...……29
Tabla 6. Absorbancia a 540 nm de muestras de concentración de azúcares
fermentables conocidas ………………………………………………………………...36
Tabla 7. Crecimiento celular, producción y productividad de biomasa y
carbohidratos en cultivos de D. salina y D. tertiolecta en efluente de cultivo de
camarón y medio F/2 Guillard a temperatura cromática 20000°K ……………..…41
Tabla 8. Determinación de parámetros (mg L-1) durante el crecimiento de
Dunaliella salina en efluente de cultivo de camarón ……………………………...…45
Tabla 9. Determinación de parámetros (mg L-1) durante el crecimiento de
Dunaliella tertiolecta en efluente de cultivo de camarón ………………………...….45
Tabla 10. Determinación de remoción de compuestos por D. salina y D. tertiolecta
en efluente de cultivo de camarón ………………………………………………….....46
Tabla 11. Concentraciones de hidrólisis ácida en Dunaliella salina y concentración
de glucosa (g L-1) ………………………………………………………………………..46
Tabla 12. Biomasa Saccharomyces cerevisiae medida en densidad óptica a 620
nm por 24 horas de cultivo …………………………………………………………..…47
1
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Actualmente la población continúa aumentando en número de habitantes, lo cual
conlleva a mayor demanda de alimentos, de consumo de agua, de utilización de
transporte y por consecuente, de uso de combustibles. La principal fuente de
combustible son los combustibles fósiles, los cuales se están agotando más cada
día, y que entre las desventajas que presentan es que es un recurso no renovable,
además de generar emisiones de gases invernadero. Aunque investigaciones
actuales y avances tecnológicos están permitiendo la generación de
biocombustibles como el bioetanol a partir de materiales de origen natural, como
son maíz, trigo, caña de azúcar, remolacha, etc., se encuentran en discusión, ya
que dichos cultivos podrían satisfacer la demanda de alimento en la población, y
son destinados para cubrir la demanda para la producción de biocombustibles.
Por otro lado, una de las actividades que hoy en día están cubriendo gran parte de
la demanda alimentaria en la población, es la acuacultura, la cual, es una fuente
de alimentos rico en nutrientes y contenido proteico que benefician a la población
a precio considerablemente bajo, comparado con otras actividades, como la
ganadería. Sin embargo, el incremento de esta actividad por la demanda de
alimento de origen acuícola, se generan grandes volúmenes de efluentes
residuales que son descargadas en cuerpos acuíferos como ríos o lagunas, lo cual
conlleva a proliferación de materia orgánica, impidiendo la degradación natural del
cuerpo acuífero, por lo tanto, es necesario, implementar sistemas de recuperación
de los efluentes derivados de la acuacultura o tratamiento en los efluentes, que
permitan la reducción del contenido de materia orgánica, compuestos
nitrogenados y fosfatados.
2
2. INTRODUCCIÓN
La acuacultura ha sido definida como las formas de cultivos de animales y plantas
acuáticas en ambientes dulceacuícolas, salobres y marinos (Pillay, 1997). De otro
modo, implica la producción controlada de cualquier ser vivo en el medio acuático,
lo cual incluye la cultura del manejo del agua, siendo una opción como clave para
el combate contra el hambre, ya que constituye contribución importante para la
nutrición en muchas partes del mundo, debido a que las cosechas acuáticas son
principalmente cosechas de proteína y de bajo costo, la acuacultura crea empleos
y dinamiza la economía nacional. La acuacultura se podría convertir en un área
estratégica del sector primario para la producción de alimentos, para el área
agroindustrial, bio-energéticos y servicios ambientales (Platas y Vilaboa, 2014;
Bardach et al., 1986).
La producción acuícola mundial puede clasificarse en las categorías de acuicultura
en aguas continentales y cultivo marino. La primera, utiliza generalmente agua
dulce, algunas actividades de producción emplean agua salina en zonas interiores,
como en Egipto, y aguas interiores salino-alcalinas, como en China. El cultivo
marino comprende las actividades de producción en el mar y zonas intermareales,
aunque por otro lado también se consideran las que se realizan con estructuras e
instalaciones de producción de base terrestre (FAO, 2014).
De acuerdo a datos de la FAO, en 2016, la producción mundial de la acuicultura,
incluyendo plantas acuáticas, fue de 110,2 millones de toneladas, estimado en un
valor de primera venta de 243 500 millones de USD. Este valor de producción
incluye 80,0 millones de toneladas de peces comestibles (231 600 millones de
USD), 30,1 millones de toneladas de plantas acuáticas (11 700 millones de USD),
37 900 toneladas de productos no alimentarios (214,6 millones de USD). Cabe
mencionar que entre las plantas acuáticas cultivadas figuraban algas marinas y en
volumen de producción menor, las microalgas (Figura 1) (FAO, 2018).
3
Figura 1. Producción acuícola mundial de peces comestibles y plantas acuáticas,
1990-2016 (FAO, 2108).
La actividad acuícola en México comenzó a ser una actividad económicamente
importante a finales de los años setenta y principio de los ochenta. La producción
acuícola en 2005 según la FAO fue de 117,500 toneladas (Martínez-Córdova et
al., 2009).
Dentro de la acuacultura, se encuentra la camaronicultura, la cual incluye el cultivo
de camarón en cualquiera de los ambientes costeros utilizando aguas de tipo
salobre, marino e hipersalino, y se practica con las distintas tecnologías de
manejo. Ha alcanzado crecimiento acelerado en las áreas tropicales y
subtropicales costeras del mundo, entre las causas que explican este crecimiento
se encuentran: (a) La alta demanda del mercado, especialmente de Japón,
Estados Unidos y Europa; (b) El progreso tecnológico; y (c) La reducción de los
suministros procedentes de las poblaciones silvestres, muchas de las cuales se
4
hallan sobre-explotadas. Se estima que entre 1-1.5 millones de hectáreas (ha) de
la zona costera del mundo han sido convertidas en granjas camaronícolas,
principalmente en países como China, Tailandia, India, Indonesia, Filipinas,
Malasia, Ecuador, Honduras, Panamá, Nicaragua y México. En el ámbito
internacional, hay un consenso general de que las capturas de camarón silvestre
tanto de bahía y de altamar han alcanzado ya su máximo sostenible del orden de
1.6-2.2 millones de toneladas, y que la demanda de camarón puede solamente ser
satisfecha a través de la camaronicultura (Páez-Osuna, 2001).
La producción de camarón en México dió inicio en el Tecnológico de Monterrey,
Campus Guaymas, al experimentar con el camarón café (Farfantepenaues
californiensis) y con las investigaciones con camarón blanco (Litopenaeus
vannamei ), realizadas por la Universidad de Sonora a principios de la década de
los 70´s hasta la segunda mitad de la década de los 80´s, donde iniciaron los
cultivos comerciales, principalmente a lo largo de la costa Noroeste del Pacífico,
usando inicialmente la especie Litopenaeus stylirostris y posteriormente
Litopenaeus vannamei, por su fácil manejo (Carta Nacional Acuícola 2013). Desde
entonces, el volumen de producción se ha incrementado notablemente, así como
la capacidad instalada, principalmente en Sinaloa, Sonora y Nayarit. Es en los
estados del Noroeste de México (Sonora, Sinaloa, Baja California Sur, Baja
California Norte y Nayarit), donde la actividad registra mayor producción, tan sólo
en 2008 rebasó el 60% de la producción nacional total (pesquera y acuícola),
mientras que en la producción nacional de la camaronicultura ascendió
aproximadamente al 96 %, es decir, 114,317 tons en el mismo año. Aunado al
valor económico de su producción y la infraestructura empleada en su cultivo y
procesamiento, es la más importante de México (Carta Nacional Acuícola 2013;
Santiago et al., 2009).
Entre las ventajas con las que México cuenta para convertirse en uno de los
principales países de América y del mundo en cuanto a producción de organismos
por acuicultura y particularmente en el cultivo del camarón destacan; las amplias
superficies de tierras costeras no aptas para agricultura ni ganadería, pero sí para
5
acuicultura, la línea de costa de México es de 11,543 km, con más de 123 lagunas
costeras y un área aproximada de 12,555 km2, el área potencial disponible para la
acuicultura en México se calcula en alrededor de 236,000 ha. El clima adecuado
en gran parte de su territorio para el cultivo de muchas especies comerciales, la
cercanía al principal mercado mundial de productos pesqueros (EUA) y que
cuenta con especies nativas con excelentes características acuaculturales, como
el camarón blanco y el camarón azul (Martínez-Córdova et al., 2009).
Las microalgas son organismos microscópicos, unicelulares y fototróficos que se
encuentran bajo la clasificación (1) Diatomeas (Bacillariophyceae), (2) Algas
verdes (Chlorophyceae) y (3) Algas cafés (Chrysophyceae). Las cianobacterias
(Cyanophyceae) como Arthrospira platensis y Arthrospira maxima también son
referidas como microalgas. Las diatomeas son el grupo dominante en el
fitoplancton y probablemente representan el grupo más grande de productores de
biomasa sobre la tierra. Las algas verdes son encontradas mayormente en agua
dulce que en agua marina. Las algas cafés son similares a las diatomeas y
producen aceite y carbohidratos. Las microalgas tienen altas cantidades de
nitrógeno y fósforo, aproximadamente de 10 a 11 % respectivamente en base de
peso seco (Razzak et al., 2013), utilizan energía solar y nutrientes como carbono,
dióxido, nitrógeno, fósforo, etc., y sintetizan compuestos valiosos como lípidos,
proteínas, carbohidratos, pigmentos y otros metabolitos,). Tienen la capacidad de
alterar su composición en la biomasa bajo condiciones de estrés; acumulan lípidos
o carbohidratos, los cuales pueden ser usados para producción de
biocombustibles, incrementando así, su potencial para ser usadas como materia
prima (Markou y Nerantzis, 2013; Bharahiraja et al., 2015). Las microalgas han
sido consideradas recientemente como la tercer generación de materia prima para
la producción de biocombustibles (Ho et al., 2013).
Las algas verdes unicelulares del genero Dunaliella han sido propuestas como
materia prima para la generación de biocombustibles debido a su habilidad
remarcada por crecer en rangos amplios de ambientes extremos. Dunaliella es
uno de los organismos eucariotas más halotolerantes conocidos y es capaz de
6
soportar rangos de salinidad desde 0.05 a 5.5. M de NaCl. Esta alga es capaz de
tolerar niveles altos de irradiancia (1500 μEm−2s−1), bajas temperaturas (4 °C), y
también bajas concentraciones de nutrientes (Hathwaik, et al., 2015).
El uso de las microalgas atrae la atención debido a que tienen la habilidad de
remover eficientemente de las aguas residuales nutrientes como nitrógeno y
fósforo y metales tóxicos, además del dióxido de carbono durante el crecimiento,
por lo tanto, han sido conocidas por su potencial para el tratamiento de aguas
residuales tal como la estabilización de residuo en sistemas de estanques. Debido
a que las aguas residuales son ricas en nutrientes, esto permite ser utilizadas
como medios sustentables para cultivar biomasa de microalga para aplicaciones
transformadoras como producción de biocombustible y de este modo provee
viabilidad económica de remediación basada en algas y generación de
biocombustible mediante estrategias de doble uso de la biomasa. (Osundeko et
al., 2013; Razzak et al., 2013).
2.1 Microalgas marinas Dunaliella tertiolecta y Dunaliella salina
El género Dunaliella sp. puede producir diferentes compuestos como carotenoides
como protectores para sobrevivir dentro de un ambiente de condiciones
cambiantes, es la tercer microalga producida más importante industrialmente
hablando, en condiciones de peso seco. Una de las razones por la cual está
ganando interés este género es debido a la capacidad de acumular triglicéridos
como fuente potencial de biocombustible (Bonnefond et al., 2016).
Dunaliella tertiolecta es una alga verde unicelular eurihalina, crece en gran
variedad de ambientes, han sido usadas en la remoción de aguas residuales, ha
sido considerada como candidata potencial para la producción de biodiesel,
debido principalmente por la capacidad de responder a estímulos externos como
estrés de sal, reducción de nitrógeno, entre otros, con el incremento del contenido
de lípidos. El rápido crecimiento de las especies producen grandes cantidades de
lípidos y por lo tanto están bajo consideración como especie para la producción de
biocombustible (Georgianna et al., 2013).
7
Dunaliellla salina es una microalga verde halofílica biflagelada, ha adaptado su
metabolismo y ciclo celular a altas temperaturas y variaciones de luz a lo largo del
día, también ha sido reconocida como una fuente biológica eficiente de caroteno,
un pigmento con alta demanda y amplia variedad de aplicaciones en el mercado
como: agentes colorantes en alimentos, como provitamina A (retinol) en alimentos,
como aditivos en cosméticos, preparaciones multivitamínicas y en la última década
como un producto saludable bajo propiedad de antioxidantes (García-González et
al., 2005, Bonnefond et al., 2016). La relativa tasa alta de crecimiento y la
habilidad de producir lípidos y almidón bajo la carencia de nutrientes hace de esta
alga una materia prima potencial para la producción de biocombustible (Hathwaik
et al., 2015).
2.1.1 Iluminación en microalgas
La composición en las microalgas depende principalmente de la especie, de su
constitución genética, las condiciones físicas y químicas de cultivo, tales como la
fase de crecimiento, la disponibilidad y la clase de nutrientes, la salinidad, el tipo,
periodos e intensidad de luz, la temperatura, el pH (Garibay, 2009).La intensidad
luminosa y tipo de iluminación, son factores que influye notablemente en la
composición química y bioquímica de las microalgas en general, como es, el
contenido de pigmento, así como también en la actividad fotosintética (Loera-
Quezada, 2010, Pavón-Suriano et al., 2017).
Las altas intensidades luminosas son otra de las condiciones que favorecen
sustancialmente la acumulación de triglicéridos con un elevado perfil de
saturación, mientras que intensidades luminosas bajas a su vez, promueven la
síntesis de lípidos polares (fosfolípidos y glucolípidos) altamente insaturados,
estructural y funcionalmente asociados con las membranas celulares (Garibay,
2009; Loera-Quezada, 2010; Pavón-Suriano et al., 2017).
8
2.1.2 Temperatura cromática
La temperatura cromática ó temperatura de color de una fuente de luz, se define
comparando su color dentro del espectro luminoso con el de la luz que emitiría un
cuerpo negro calentado a una temperatura determinada. Cuando la temperatura
aumenta, se obtiene una mayor proporción de azul en el espectro de luz. Por esta
razón, la temperatura de color es expresada en grados Kelvin, aunque no muestra
específicamente una medida de temperatura, ya que ésta es una medida relativa
(Draper, 1847; Mahan, 2004; Pavón-Suriano et al., 2017).
Casi todas las fuentes de luz artificial tienen una temperatura de color entre 2000 y
6000°K. La del cielo azul con sol es de 6000 °K aproximadamente, y llega a unos
10000°K cuando se nubla (Figura 2). El efecto cromático que emite la luz a través
de fuente luminosa depende de su temperatura. La temperatura es una
característica del color, la cual se divide en colores fríos y colores cálidos.
Amarillo, naranja y rojo son los colores cálidos; el verde, el azul y el violeta
representan los colores fríos (Hoyos, 2001). Si la temperatura es baja, se
intensifica la cantidad de amarillo y rojo contenida en la luz, pero si la temperatura
de color se mantiene alta habrá mayor número de radiaciones azules (Hoyos,
2001; Pavón-Suriano et al., 2017).
El color es un atributo que percibimos de los objetos cuando hay luz. La luz es
constituida por ondas electromagnéticas que se propagan a unos 300,000 km s-1.
Esto significa que nuestros ojos reaccionan a la incidencia de la energía y no a la
materia en sí. Las ondas forman, según su longitud de onda, distintos tipos de luz,
como infrarroja, visible, ultravioleta o blanca. Las ondas visibles son aquellas cuya
longitud de onda está comprendida entre los 380 y 770 nanómetros. Pavón-
Suriano et al. (2017), mencionan que la temperatura cromática es un factor
determinante para la producción de lípidos y carbohidratos en las microalgas.
9
Figura 2. Temperatura de color en la escala Kelvin.
2.2 Cultivo de camarón Litopeneaus vannamei
El cultivo de camarón generalmente se clasifica de acuerdo al grado de
intensificación del manejo de las estanquerías. El termino intensificación se refiere
al proceso por el que se incrementa la carga metabólica y la biomasa por unidad
de área de cultivo, y usualmente involucra incrementos en el flujo de agua y
suministro de oxígeno (Páez-Osuna, 2001).
En los sistemas extensivos, las especies cultivadas subsisten con base a la
disponibilidad de los nutrientes que se presentan naturalmente. Los nutrientes se
reciclan entre los productores y los consumidores, a varios niveles dentro de la
cadena trófica hasta alcanzar a la especie objetivo del cultivo (Páez-Osuna, 2001).
Los sistemas intensivos tienen el objetivo de maximizar la cosecha por unidad de
área de cultivo, en ellos se promueve una actividad metabólica colectiva tan
10
importante que se producen grandes cantidades de desperdicios, por lo que tales
desechos deben retirarse para evitar que se generen condiciones tóxicas en el
sistema. Por esta razón se requieren elevadas tasas de recambio de agua, y en
tales condiciones, es poco factible tanto el desarrollo de tramas alimenticias como
el establecimiento del equilibrio de nutrientes que necesita el cultivo. Los
requerimientos de nutrientes de las especies cultivadas deben ser satisfechos
exógenamente, aplicando alimento de alta calidad. Los sistemas intensivos
requieren de un alto grado de manejo de desechos y de una tecnología de
dosificación de nutrientes tal que permita minimizar el desperdicio de los
alimentos. Esto es crítico, dado que no solamente es costoso el alimento de alta
calidad, sino que la descomposición del alimento contribuye a la demanda de
oxígeno, al crecimiento microbiano y a la acumulación de productos
potencialmente peligrosos como los compuestos nitrogenados (NH3, NH4+, NO2
- y
NO3-) o sulfurosos (H2S, HS) (Páez-Osuna, 2001).
En la camaronicultura, la ruta principal de entrada del fósforo y nitrógeno en los
sistemas de cultivo está representada por el suministro del alimento, por lo cual, la
ruta de salida más importante de nitrógeno y fósforo en las estanquerías de
camarón es a través de los efluentes de descarga, de la volatilización del amonio y
la denitrificación, así como la acumulación del nitrógeno en los sedimentos. Entre
más se intensifica el cultivo de camarón, es mayor la cantidad de nitrógeno y
fósforo involucrado (Páez-Osuna, 2001). Esto conlleva a utilizar los efluentes de la
camaronicultura como medio de cultivo para microalgas, del cual aprovechan los
nutrientes contenidos, permitiendo su crecimiento, así como la remoción de los
mismos.
2.3 Población de granjas camaronícolas y su distribución nacional
De acuerdo a la Carta Nacional Acuícola publicada en septiembre de 2013, con
datos correspondientes a 2011; Sinaloa, Sonora, Nayarit, Tamaulipas y Tabasco,
en orden descendientes, son los cinco estados con mayores hectáreas de
superficies cultivadas de camarón. Cabe mencionar que Sinaloa cuenta 626
11
unidades de producción acuícola, Sonora con 168, Nayarit con 227, Tabasco con
41 y Guerrero con 20, ubicándose Veracruz en el lugar 9 de 14 estados
contemplados (Tabla 1).
Se colocan Sinaloa, Sonora y Nayarit como los estados con mayor producción
acuícola de camarón blanco del Pacífico por entidad federativa 2011 (Carta
Nacional Acuícola 2013).
Tabla 1. Unidades de Producción Acuícola por Estado en 2011. Carta Nacional Acuícola
2013.
Estado No. de
granjas
Comerciales
No. de
granjas de
Autoconsumo
Superficie
cultivada (ha)
*Baja California 0 36 125.00
Baja California Sur 5 2 NR
Campeche 1 0 150.00
Chiapas NR* NR NR
Colima 15 0 159.49
Guerrero 20 0 64.00
Jalisco 8 0 12.00
Nayarit 227 0 4,488.47
Sinaloa 626 4 38,249.00
*Sonora 168 0 25,462.55
Tabasco 41 0 296.00
Tamaulipas 15 0 726.00
Veracruz 1 NR 5.80
Yucatán 1 4 12.00
*NR. No reportado.
12
2.4 Efluentes residuales y su impacto ambiental
Las cantidades de nutrientes liberados a partir de las actividades camaronícolas
son pequeñas en comparación con aquellas que se relacionan con la agricultura y
los desechos domésticos. Sin embargo, hay una diferencia substancial entre las
actividades mencionados en cuanto a la manera de descargar los nutrientes, la
mayoría de los efluentes agrícolas y municipales, lo hace sobre la planicie costera
a distancias a veces considerables, que pueden modificar significativamente los
flujos, mientras que la camaronicultura descarga todos sus efluentes directamente
en las aguas costeras adyacentes. Durante su recorrido, los desechos municipales
y agrícolas, van a sufrir diversos procesos que van a reducir la carga original
liberada, lo cual hace que comúnmente el impacto provocado por la agricultura y
las aguas municipales pase desapercibido, a diferencia de la camaronicultura.
Esta última, sin embargo, por liberar las descargas directamente sobre las áreas
costeras los nutrientes y la materia orgánica pueden localmente provocar efectos
adversos significativos en los ecosistemas costeros vulnerables (Páez-Osuna,
2001).
2.5 Combustibles fósiles y biocombustibles
Actualmente, los combustibles fósiles y la energía nuclear proporcionan cada año
alrededor del 90% de la energía que se utiliza en el mundo. Debe mencionarse
que las reservas de combustibles fósiles son limitadas y, en mayor o menor grado,
contaminantes. A diferencia de los combustibles fósiles, que provienen de la
materia orgánica acumulada durante enormes períodos de tiempo, los
biocombustibles provienen de una fuente renovable, la biomasa. La biomasa es la
materia orgánica que constituye todos los seres vivos, sus productos y desechos.
La energía de la biomasa deriva del material vegetal y animal (Serna et al., 2011).
Se dice que es una fuente de energía renovable porque su formación no lleva
miles de años, y por lo tanto la tasa de utilización no es mucho mayor a la de su
formación. Pueden ser líquidos, sólidos o gaseosos, y su finalidad última es liberar
13
la energía contenida en sus componentes químicos mediante una reacción de
combustión (Tabla 2)(Álvarez, 2009).
Tabla 2. Principales tipos de biocombustibles.
Sólidos Líquidos Gaseosos
Paja Alcoholes Gas de gasógeno
Leña Biohidrocarburos Biogas
Astillas Aceites vegetales y esteres derivados Hidrógeno
Briquetas Aceites de pirólisis
Carbón vegetal
El incremento de la demanda de los combustibles fósiles y su contribución a la
emisión de gases de invernadero han creado mayor interés en formas alternativas
de energía incluyendo los biocombustibles. Las microalgas tienen el potencial para
generar altas cantidades de biomasa y aceite que pueden ser utilizados para
conversión química o biológica a combustibles bioetanol, biodiesel o biometano
(Osundeko et al., 2013).
Los carbohidratos basados de microalgas pueden ser materia prima adecuada
para la producción de bioetanol. El dióxido de carbono producido del proceso de
fermentación del bioetanol puede ser recuperado totalmente para el crecimiento
de la microalga para la acumulación de carbohidratos. El resultado de la biomasa
de microalga rica en carbohidratos es usada después como materia prima para la
producción de bioetanol a través del proceso de fermentación (Chen et al., 2013).
En años recientes el etanol ha sido una alternativa de combustible o sustituto de
combustible. El combustible bioetanol permite reducir sulfuros, CO y emisiones de
partículas. El etanol usado como combustible en Brasil redujo emisiones de
14
carbón de 9.56-106 tons, contribuyendo a la reducción de 15% del total de
emisiones de Brasil. El bioetanol puede ser producido usando microalgas como
materia prima para fermentación, bacterias o levaduras para fermentar los
carbohidratos, como son glucosa y almidón en microalgas (Bahadar y Bilal, 2013).
En años recientes las microalgas han sido consideradas como fuente prometedora
de biodiesel debido a su alta tasa de reproducción y alto contenido de lípidos (50-
70%); los lípidos son transesterificados a ésteres metil (Bahadar y Bilal, 2013).
El biobutanol también puede ser producido por los carbohidratos basados de
microalga como una alternativa de combustible. El butanol contiene más energía,
es menos corrosivo y es soluble en el agua, lo que hacen a este compuesto
adecuado para el uso, la distribución de la infraestructura, el transporte de
combustibles basados de petróleo (Chen et al., 2013).
Además de la producción de biocombustibles líquidos de los carbohidratos
basados de microalgas, están los biocombustibles gaseosos como el metano y
biohidrógeno, los cuales también pueden ser producidos a través del proceso de
fermentación aeróbica o anaeróbica usando carbono como fuente de la biomasa
microalgal. El biohidrógeno puede ser producido también directamente a través del
metabolismo en cadena de la microalga, pero la eficiencia de producción del
biohidrógeno es bajo (Chen et al., 2013).
2.6 Biocombustibles de primera, segunda, tercera y cuarta generación
Existen varios tipos de biocombustibles, a los cuales se les clasifica de acuerdo al
insumo o materia prima y a la tecnología empleada para producirlos. Gracias a los
avances en la tecnología, esta clasificación se realiza por generaciones (Álvarez,
2009). Debido a los problemas de costo, tierra, requerimientos de agua dulce,
competencia de alimentos, preocupación por el ambiente, la materia prima para la
producción de biocombustibles ha sido cambiada desde el azúcar o cultivos
basados en almidón, llamados materia prima de primera generación, a los
materiales lignocelulósicos denominados materia prima de segunda generación y
15
después a las microalgas nombradas materia prima de tercera generación (Chen
et al., 2013).
I) Primera generación
Los biocombustibles de primera generación utilizan cultivos específicos como
materias primas. Algunos de los insumos son de procedencia agrícola y están
conformados por las partes alimenticias de las plantas, las cuales tienen un alto
contenido de almidón, azúcares y aceites. Ejemplos de estas materias son el jugo
de la caña de azúcar, granos de maíz, jugo de la remolacha o betabel, aceite de
semilla de girasol, aceite de soya, aceite de palma, aceite de ricino, aceite de
semilla de algodón, aceite de coco, aceite de maní o cacahuate, entre otros. Los
biocombustibles son producidos empleando tecnología convencional como la
fermentación (para azúcares y carbohidratos), transesterificación (para los aceites
y grasas), y la digestión anaerobia (para los desperdicios orgánicos). De estos
procesos se obtiene etanol, metanol y n-butanol (a partir de azúcares), biodiesel (a
partir de los aceites), y biogás (mezcla de metano y anhídrido carbónico, también
conocidos como gas natural y dióxido de carbono respectivamente, obtenida a
partir de los desperdicios orgánicos), aunque los más ampliamente difundidos son
el biodiesel y el bioetanol. Este último representa más del 90% del total de
biocombustibles que se utilizan actualmente en el mundo. En Brasil, Suecia y
Estados Unidos existen 6 millones de vehículos circulando que pueden aceptar
mezclas etanol/gasolina de hasta 85%. Las ventajas de estos biocombustibles
son su facilidad de procesamiento, sus bajas emisiones de gases de efecto
invernadero (excepto en el caso del maíz, donde el balance de estas emisiones es
casi nulo) y un balance positivo en dichas emisiones, pero tienen como
desventajas; la competencia de tierras arables para producción de alimentos,
nutrientes y agua, además que los cultivos terrestres requieren meses de
crecimiento para poder producir cultivos óptimos (Álvarez, 2009; Serna et al.,
2011; Lyon et al., 2015).
16
II) Segunda generación
La tendencia es hacia los biocombustibles de segunda generación, ya que el uso
de cultivos agrícolas destinados a biocombustibles no suple las necesidades
energéticas de bajo costo que hoy día logran el petróleo y sus derivados. Los
insumos son residuos agrícolas y forestales compuestos principalmente por
celulosa. Ejemplos de ellos son el bagazo de la caña de azúcar, el rastrojo de
maíz (tallo, hojas y olote), paja de trigo, aserrín, hojas y ramas secas de árboles,
etc. Los procesos de producción tienen un nivel de complejidad más alto que los
de primera generación, y como ejemplos destacan la sacarificación fermentación y
el proceso Fischer-Tropsch. Este último proceso también recibe los nombres de
proceso GTL y proceso BTL, cuyas Siglas en inglés provienen de “Gas-To-Liquids”
y “Biomass-To-Liquids” respectivamente, los cuales consisten en la gasificación
del carbón y de la materia lignocelulósica de la biomasa, para después sintetizar
algún combustible líquido como el etanol. Mediante los procesos de segunda
generación se fabrica etanol, metanol, gas de síntesis (mezcla de anhídrido
carbonoso, mejor conocido como monóxido de carbono, e hidrógeno), biodiesel,
2.5-dimetilfurano (DMF), entre otros. La ventaja principal en la producción de estos
biocombustibles es la inexistencia de desviaciones de alimentos provenientes de
la agricultura hacia el sector energético, así no se rivaliza además por el uso de
los recursos naturales, pero su desventaja es la poca ganancia en disminución de
las emisiones de gases de efecto invernadero durante el procesamiento de los
insumos, respecto a los biocombustibles de primera generación (Serna et al.,
2011; Álvarez, 2009).
III) Tercera generación
Los insumos son vegetales no alimenticios de crecimiento rápido y con una alta
densidad energética almacenada en sus componentes químicos, por lo que se les
denomina “cultivos energéticos”. Entre estos vegetales están los pastos perennes,
árboles y plantas de crecimiento rápido, y las algas verdes y verde-azules. Los
procesos de obtención de biocombustibles se encuentran en fase de desarrollo,
17
sin embargo, se ha logrado producir biodiesel y etanol a nivel planta piloto. Las
ventajas de estos biocombustibles son el secuestro de anhídrido carbónico (CO2)
para la producción de los insumos y un balance positivo en la emisión de gases de
efecto invernadero, pero su desventaja es la utilización de tierras de cultivo de
alimentos para sembrar los insumos, con excepción de las algas verdes (Álvarez,
2009).
IV) Cuarta generación
Los biocombustibles son producidos a partir de bacterias genéticamente
modificadas, las cuales emplean anhídrido carbónico (CO2) o alguna otra fuente
de carbono para la obtención de los biocombustibles. A diferencia de las
generaciones anteriores, en las que también se pueden emplear bacterias y
organismos genéticamente modificados como insumo o para realizar alguna parte
de los procesos, en la cuarta generación, la bacteria es la que efectúa la totalidad
del proceso de producción de los biocombustibles. Actualmente esta generación
de biocombustibles se encuentra en fase teórica, sólo se conoce la posible ruta de
síntesis del etanol a partir de anhídrido carbónico, sin embargo, depende
totalmente de la información genética de una bacteria artificial y puede tener
limitaciones termodinámicas importantes (Álvarez, 2009).
2.7 Bioetanol y la importancia a nivel nacional y alternativa energética
sustentable
El aumento de los costos de los combustibles fósiles, al igual que el impacto de los
gases efectos invernadero, la energía renovable es la mejor opción para la
producción de biocombustibles. México y otros países Latinoamericanos
actualmente son exportadores de petróleo, pero las reservas probadas y la calidad
del petróleo están disminuyendo. Hoy en día, es imperante que se desarrollen
planes para la implementación y desarrollo de tecnologías para la obtención de
energías renovables. Varías de estas tecnologías ya llevan un gran avance en el
desarrollo tecnológico (eólicas, solar, mareomotriz), así como la obtención de
18
biocombustibles a partir de caña y granos. En el caso de los biocombustibles, se
deben desarrollar tecnologías que sean sustentables, es decir, que respondan a
las necesidades y realidades de los países Latinoamericanos. Los biocombustibles
a partir de algas son tecnologías que permitirán dar respuesta a las necesidades
de combustibles líquidos de forma sustentable y contribuir a la seguridad
energética nacional (Fernández-Linares et al., 2012).
El bioetanol es un biocombustible de origen vegetal que se produce a partir de la
fermentación de materia orgánica rica en azúcar como caña, remolacha o vino, así
como de la transformación en azúcar del almidón presente en los cereales. La
producción tradicional de bioetanol involucra el uso de azúcar de caña o
remolacha y levaduras. Como fuente de glucosa se utilizan materiales muy
diversos, actualmente se consideran otras fuentes de carbohidratos, como el maíz,
o los materiales celulósicos, tales como residuos agroindustriales forestales e
incluso los residuos sólidos municipales, sorgo, patatas, trigo, entre otros
(Fernández-Linares et al., 2012).
El bioetanol puede ser considerado como una alternativa de combustible de
quema limpia, debido a que es amigable con el ambiente, con productos de
combustión y gases de invernadero con bajos efectos comparado con los
combustibles fósiles. Hoy la producción comercial de bioetanol proviene
principalmente de productos de la agricultura como maíz, arroz, trigo, mandioca,
caña de azúcar, remolacha y sorgo dulce, a través de procesos termoquímicos o
bioquímicos (Oncel, 2013).
La producción rentable del bioetanol que se obtiene de la lignocelulosa vía la
hidrólisis enzimática aumentaría la variedad y la disponibilidad de material de base
y, por lo tanto, ampliaría la producción de biocombustibles sin afectar la seguridad
y la soberanía alimentaria (Serna et al., 2011).
Todas estas alternativas pueden ser complementarías; sin embargo el uso de
granos y de caña hacen competir a los energéticos con el alimento para la
población humana o por tierras de cultivo, haciéndolos no sustentables
(Fernández-Linares et al., 2012).
19
Las microalgas han sido reconocidas como una alternativa, y son llamadas como
materia prima de la tercera generación, las cuales no compiten por tierras arables
o agua potable, incluso, las especies de microalgas marinas crecen en agua de
mar, lo cual reduce el consumo de agua dulce. Además, los carbohidratos de las
microalgas tienen bajos contenidos de lignina (altos azúcares fermentables) y su
sacarificación es mucho más fácil, haciéndolas fuente de biomasa prometedora y
sustentable para la producción de bioetanol (Chen et al., 2013).
La fermentación es un proceso usado comercialmente en gran escala en varios
países para producir etanol de los cultivos de azúcar y almidón (Figura 3). El maíz
es la materia prima principal en la industria mundial del almidón a bioetanol. Por
otro lado, las algas pueden ser utilizadas como materia prima para la producción
de etanol de acuerdo al siguiente proceso: en el primer paso, el almidón de las
microalgas es liberado de las células con ayuda de equipo mecánico o una
enzima. Cuando las células comienzan a degradarse, la levadura Saccharomyces
cerevisiae es agregada a la biomasa para comenzar la fermentación, obteniendo
etanol como producto. El etanol es drenado de los tanques y bombeado a tanque
de almacenamiento para ser suministrado a una unidad de destilación. El etanol
es producido con fotosíntesis microalgal y fermentación anaeróbica intracelular
(Razzak et al., 2013).
La reacción química incluye hidrólisis enzimática de la sacarosa seguida de la
fermentación de azúcares simples. La fermentación de la sacarosa es realizada
usando levadura comercial como la Saccharomyces. cerevisiae; primero la enzima
invertasa cataliza en la levadura la sacarosa de la hidrólisis para convertirla en
glucosa y fructosa. Segundo, la zymasa, otra enzima también presente en la
levadura, convierte la glucosa y la fructosa en etanol. La enzima gluco-amilasa
convierte el almidón en D-glucosa. La hidrólisis enzimática es seguida después
por la fermentación, la destilación y deshidratación para producir bioetanol anhidro
(Razzak et al., 2013).
20
Figura 3. Producción de bioetanol a partir de biomasa microalgal usando procesos de
conversión bioquímica (adaptada de Razzak et al., 2013).
En la Figura 4, se muestra la ruta fermentativa de la glucosa una vez hidrolizado
el almidón contenido en el grano de maíz o en la celulosa. En la primera fase,
cada molécula de glucosa se trasforma en dos moléculas de piruvato, a partir de
aquí, solo las rutas que conducen al etanol y butanodiol son activadas por
levadura, las restantes rutas alternativas son activadas por bacterias aeróbicas o
anaeróbicas, algunas de estas bacterias están presentes en el caldo de
fermentación (Gracia, 2011).
Biomasa
microalgal
Conversión
bioquímica
Interestirificación
Biodiesel
Fermentación
Etanol, acetona, butanol
Digestión
anaeróbica
Metano,
hidrógeno
21
Figura 4. Ruta fermentativa de la glucosa (adaptado de Gracia, 2011).
Las moléculas de almidón están constituidas por puentes glucosídicos que
mantienen unidas dos moléculas de glucosa deshidratadas. La hidrólisis consiste
en la ruptura de los puentes glucosídicos; cada molécula de glucosa gana una
molécula de agua (Figura 5). De la fermentación de la glucosa se obtiene etanol y
una fracción menor de otros bioalcoholes (Gracia, 2011).
De acuerdo con la siguiente ecuación de reacción simplificada, los rendimientos
estequiométricos son 0.51 kg de etanol y 0.49 kg de CO2, por kg de azúcar de
carbono, es decir, glucosa (Singh y Gu, 2010).
C6H12O6 → 2CH3CH2OH + 2CO2
Figura 5. Ruptura de los puentes glucosídicos; cada molécula de glucosa gana una
molécula de agua.
22
3. ANTECEDENTES
3.1 Acuacultura
De acuerdo a Estadísticas de Pesca y Acuicultura de la Organización de las
Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura (FAO) 2016, la producción
mundial de acuacultura por aguas continentales y marítimas en 2016, incluyendo
peces, crustáceos, moluscos, etc., tuvo 80,030,862 tons, con valor de USD
231,584,120, 000 en cuanto a la producción de plantas acuáticas; 30,139,389
tons, con valor de USD 11,673,942,000. Lo cual hace total de 110,170,252 tons y
valor de USD 243,258,062,000. Mientras que la producción mundial de
acuacultura por divisiones de la CEIUAPA (Clasificación Estadística Internacional
Uniforme de los Animales y Plantas Acuáticos), la producción de crustáceos fue de
7,862,016 tons, con valor de USD 57,078,984,000. Especificando al camarón
Penaeus vannameii; 4,155,827 tons, con valor de USD 24,404,810,000, ocupando
el sexto lugar esta especie de la producción mundial.
3.2 Cultivo Nacional de camarón
De acuerdo al Anuario Estadístico de Acuacultura 2017 (CONAPESCA), Sinaloa
se encuentra en primer lugar de producción de camarón con 84,426 toneladas,
Sonora con 83,194 toneladas, seguido de Nayarit con 20,837 toneladas, mientras
que Tamaulipas y Baja California Sur presentan 13,210 y 9,081 toneladas
respectivamente. Cabe mencionar que éstos datos incluyen; la producción en mar
abierto, esteros y bahías, así como la acuicultura.
3.3 Experimentos en microalgas.
Diferentes investigaciones realizadas en el cultivo de microalgas, como alternativa para la
remoción de nutrientes nitrogenados y fosfatados, así como en la obtención de
carbohidratos y lípidos como materia prima para producción de biocombustibles están
basados principal mente en la diferentes condiciones de cultivo. (Tabla 3).
23
Tabla 3. Experimentos en microalgas
Referencia Microalga Experimento Resultado
Shifa et al, (2016)
D. salina Analizó crecimiento en tres medios de cultivo y dos fuentes de luz.
Crecimiento más alto en medio de cultivo Walne Jepara y LED rojo, densidad de 8.504 x 10
4
celmL-1
Mayorga et al, (2017)
D. salina Evaluó crecimiento en cultivador tipo raceway en condiciones bajo techo.
Los días 9, 12 y 15 presentaron valores de crecimiento de células más altos con promedios de 7.15 x 10
6 cel/mL
y de masa seca de 1.11 g/mL.
Pavon-Suriano et al, (2017)
D. salina Nannochloropsis oculata
Evaluó efecto de temperatura de color
Mayor contenido y producción de carbohidratos (25% y 38 mgL
-1) en D. salina a 20000°K
en fase estacionaria y exponencial respectivamente.
Osundeko, (2013)
Parachlorella hussi y Chlorella luteoviridis
Aislaron cepas provenientes de aguas residuales municipales.
Remoción de mas de 80% de NH4
+-N y PO4
3-P por ambas
microalgas después del día 5 de cultivo. Productividad de biomasa de 0.77 gL
-1d
-1.
Contenido de lípidos totales de 35.7% 27.7 % por peso de biomasa seca.
Li, (2011) Chrolella kessleri Chlorella protothecoides
Remoción de nutrientes en aguas residuales y producción de biodiesel
Acumulación de biomasa neta 2.01 gL
-1
1.31 gL-1
Amini et al, (2019)
D. salina
Evaluaron la eficiencia de remoción de nitratos y fosfatos en aguas residuales.
La mayor eficiencia de remoción de nitratos y fosfatos fue de 54% y 82% respectivamente, obtenidos en pH7, biomasa 0.05gL
-1 y
concentración inicial de nitrato y fosfato de 350 mgL
-1
El Arroussi et al, (2015)
Dunaliella tertiolecta
1ra. Fase ácido 2,4-Dicloropenoxiacetico 2da. fase aumentó NaCl 0.5M a 2M.
Acumulación biomasa 40%. Lípidos desde 24% a 70%.
Dillschenider et al, (2013)
Phaeodactylum tricornutum
Cultivos en lote con diferentes concentraciones de nitrato
2.48 % a 5.65%, por incremento de nitrógeno disponible. Carbohidratos de 0.3 a 1.7 gL
-1. Lípidos
aumentaron 0.4 a 3.2 gL-1
.
24
Roleda et al, (2013)
Thalassiosira pseudonana, Odontella aurita, Nannochloropsis oculata, Isochrysis galbana, Chromulina ochromonoides y D. tertiolecta
Efecto de dos temperaturas, 10 y 20°C, y dos regímenes de nutrientes; reducción y lleno, en la producción de biomasa y lípidos.
N. oculata fue la especie más robusta, aumentó la acumulación de lípidos bajo régimen lleno.
Hernández et al, (2015)
Chlorella sorokiniana y Nannochloropsis gaditana Scenedesmus almeriensis
Combinación de hidrólisis ácida e hidrólisis enzimática Después de hidrólisis con ácido sulfúrico
Concentración de monosacárido por g de peso seco de microalga. 128 mg/g 129 mg /g 88 mg/g
Ho et al, (2013)
Chlorella vulgaris FSP-E
Estrategias de hidrólisis y procesos de fermentación para producción de bioetanol
La hidrólisis ácida diluida con ácido sulfúrico de 1%, rendimiento de glucosa casi del 93.6% en una concentración inicial de biomasa de 50 g L
-1
25
4. JUSTIFICACIÓN
Los efluentes acuícolas son una fuente rica de materia orgánica, compuestos
nitrogenados y fosfatados derivados del alimento que no fue consumido por
organismos en cultivo y que permanecen disueltos en el medio y en
descomposición por otros microrganismos como bacterias, que se convierten en
un problema de calidad de agua en las granjas. No obstante, estos compuestos
pueden ser aprovechados como una fuente de nutrientes para el crecimiento,
desarrollo y producción de las microalgas. Las microalgas son organismos que se
encuentran en todos ambientes acuáticos, son de rápido crecimiento y capaces de
sobrevivir en condiciones de estrés. Ésta característica particular le dá muchas
ventajas de uso sobre otro tipo de organismos acuáticos. Adicionalmente, son
organismos que en su composición celular presentan alto contenido de lípidos y
carbohidratos según especie y condición de cultivo. El cultivo de microalgas en
efluentes residuales acuícolas puede ser una alternativa sustentable y económica
para producción de material de origen natural, sin afectar la demanda de alimento
de origen agrícola que actualmente parte de ella está destinada para producción
de biocombustibles. Entre las ventajas que ofrece la producción de bioetanol
derivado de los carbohidratos de la biomasa microalgal es que el almidón que se
encuentra en las paredes de las microalgas es de fácil fermentación, comparada
con las plantas superiores.
Por otro lado, una buena iluminación como condición de cultivo puede ser
favorable para estimular en la microalga el incremento en la producción de
carbohidratos. Por lo tanto, el cultivo de microalgas en efluente residual acuícola y
bajo una adecuada condición de iluminación, puede representar una alternativa
para la producción de biomasa natural rica en carbohidratos de fácil fermentación
para la producción de bioetanol que satisfagan la demanda de biocombustible, así
como el tratamiento de los efluentes acuícolas; generando doble beneficio para la
sociedad.
26
5. HIPÓTESIS
El cultivo de Dunaliella salina y Dunaliella tertiolecta en efluente de cultivo de
camarón será una alternativa sustentable para la generación de carbohidratos de
fácil fermentación para la producción de bioetanol y en el tratamiento de los
efluentes.
6. OBJETIVOS
6.1 General
Evaluar el cultivo de microalgas marinas en efluente de camarón a 20000 K para
la producción de bioetanol a partir de los carbohidratos de la biomasa y la
eficiencia de remoción de compuestos nitrogenados y fosfatados en el efluente.
6.2 Específicos
1. Evaluar la densidad celular, producción y productividad de biomasa y
carbohidratos en cultivos de Dunaliella salina y Dunaliella tertiolecta en
efluente de cultivo de camarón y medio Guillard F2.
2. Determinar la eficiencia del cultivo de microalgas en la remoción de
compuestos nitrogenados y fosfatos en el efluente de cultivo de
camarón.
3. Comparar la eficiencia de la hidrólisis ácida para la obtención de
azúcares fermentables.
4. Evaluar el rendimiento en la producción de bioetanol por gramo de
biomasa en la fermentación.
27
7. ÁREA DE ESTUDIO
El presente trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio de Biotecnología de
Microalgas y Bioenergías, el cual se encuentra ubicado en las instalaciones del
Instituto Tecnológico de Boca del Río, en el Km. 12, carretera Veracruz-Córdoba,
Boca del Río, Veracruz, así como también en el Laboratorio de Biotecnología
Enzimática y de Fermentaciones, ubicado en el Instituto Tecnológico Superior de
Tierra Blanca, en Av. Veracruz S/N Esq. Héroes de Puebla, Colonia Pemex, del
municipio de Tierra Blanca, Veracruz.
Figura 6. a) Instituto Tecnológico de Boca del Río, b) Instituto Tecnológico Superior de Tierra Blanca.
28
8. MATERIALES Y MÉTODOS
8.1 Diseño experimental
Se realizó un diseño factorial general A x B x C a dos niveles cada uno (2 x 2 x 2)
tomando como factores el tipo de microalga utilizada, el medio de cultivo y la fase
de crecimiento. El diseño factorial se ve representado en la Tabla 3, se realizaron
ocho tratamientos con tres réplicas, para obtener un total de veinticuatro unidades
experimentales.
Tabla 4. Diseño factorial general 2x2x2.
Tipo de
microalga
Medio de cultivo Fase de crecimiento
Medio
Guillard F/2
(MG)
Efluente de
cultivo de
camarón (Ecc)
Exponencial
(Exp)
Estacionaria
(Est)
Dunaliella salina
(Ds)
Ds/MG Ds/Ecc Ds/MG/Exp
Ds/Ecc/Exp
Ds/MG/Est
Ds/Ecc/Est
Dunaliella
tertiolecta (Dt)
Dt/MG Dt/Ecc Dt/MG/Exp
Dt/Ecc/Exp
Dt/MG/Est
Dt/Ecc/Est
En la tabla 5, se presenta el seguimiento y análisis de variables de respuesta a la
densidad celular, contenido de carbohidratos, producción y productividad de carbohidratos
y biomasa, azúcares reductores totales y producción de bioetanol.
29
Tabla 5. Variables de respuesta a evaluar en el ensayo.
Tratamiento Densidad
celular
(cel ml-1
)
Contenido de
carbohidrato
s
(%)
Producción Productividad ART*
(g
glucosa
L)
Producción
de bioetanol
(g /g
biomasa)
Biomasa
(mg L-1
)
Carbohidratos
(mgL-1
)
Biomasa
(mgL-1
)
Carbohidratos
(mgL-1
)
Ds/MG/Exp
Ds/Ecc/Exp
Dt/MG/Exp
Dt/Ecc/Exp
Ds/MG/Est
Ds/Ecc/Est
Dt/MG/Est
Dt/Ecc/Est
Nota: * ART Azúcares reductores totales.
8.2 Desarrollo experimental
Para el cumplimiento del objetivo general se plantearon cuatro objetivos
específicos los cuales se desarrollaron en cuatro actividades planteadas.
Actividad 1. En esta actividad se llevó a cabo el mantenimiento y propagación de
cepas para inóculo, así como el arranque de los fotobioreactores experimentales
(tratamientos).
I) Propagación de cepas
Las cepas de Dunaliella salina DUS1 y Dunaliella tertiolecta DUT2 fueron
provenientes del Centro de Investigación Científica y de Educación Superior de
Ensenada, Baja California.
Se inició con inóculos de las microalgas D. salina y D. tertiolecta a un volumen de
50 ml en medio Guillard F/2 (Guillard y Ryther, 1962); bajo condiciones de
30
temperatura de 20 ± 2°C y una intensidad lumínica de 20000 °K a 100 µmolm-2s-2,
posteriormente se realizó el desdoble de las cepas a diferentes volúmenes de
medio (200 ml, 500 ml y 1000 ml), llevando a cabo conteos de densidad celular
utilizando un hematocitómetro (cámara de Neubauer) por el método Pica-
Granados et al. (2004) para realizar el inóculo en los fotobioreactores en fase de
crecimiento exponencial siguiendo con una densidad celular de 5x105 celmL-1
utilizando la siguiente fórmula:
Cálculo para determinar inóculo:
𝑉2 =𝐶1𝑉1
𝐶2 ………………………………………… Ec.1
Donde:
V1: Volumen de operación en matraz
C1: Densidad celular inicial en el matraz (5x105 celmL-1)
C2: Densidad celular del inóculo en el momento de realizar la inoculación al matraz
(celmL-1)
V2: Volumen de inóculo requerido para el matraz (mL)
II) Diseño e implementación de fotobioreactores
Se realizó el diseño de un sistema de fotobioreactor tubular de cristal con 49 cm
de alto y 15 cm de diámetro, capacidad de 8 L (Figura 5), para el cultivo de las
microalgas Dunaliella salina y Dunaliella tertiolecta en un volumen de cultivo de 3
L.
Figura 7. Fotobioreactor tubular vertical de 8L (en la derecha se observa el diseño del
fotobioreactor).
Fotobioreactor tubular de cristal
Suministro de oxígeno
Toma de muestra
31
III) Preparación del medios de cultivo (F2, efluente de cultivo de
camarón)
Se procedió a la colecta del efluente de cultivo de camarón de cultivos en
estanques abiertos de la granja “Aquanópolis” localizada en la comunidad de
Salinas, Municipio de Alvarado, Veracruz, y se determinaron los parámetros
fisicoquímicos iniciales (pH, NH4, NO3, NO2, PO4) mediante un equipo multi-
paramétrico marca HANNA Modelo HI83099, para poder conocer los parámetros
iníciales. El efluente colectado se filtró a través de una columna compuesta por
una malla para fitoplancton de 100 µm, algodón y fibra de poliéster (guata) para
remover la materia orgánica del efluente.
Después de filtrar el efluente se colocaron dos litros en cada fotobioreactor, y se
añadió hipoclorito de sodio (0.8 ml/L) durante tres horas con aireación constante
como método para eliminar algún organismo presente en el efluente.
Pasado el periodo de cloración, se neutralizó con tiosulfato de sodio (0.75 g/L)
durante dos horas con aireación constante.
IV) Determinación de la densidad celular en los fotobioreactores
Para el cultivo en fotobioreactores se tomó el inóculo inicial de los cultivos
continuos de 1000 ml en su fase exponencial.
El volumen del inóculo se determinó por medio de conteo celular mediante la
cámara de Neubauer (Pica Granados et al., 2004), utilizando la siguiente
ecuación:
𝑽𝟐 =𝑪𝟏.𝑽𝟏
𝑪𝟐 ………………………………………… Ec.2
Donde:
V1: Volumen de operación en el reactor (3000 mL)
C1: Densidad celular inicial en el reactor (5x105 celmL-1)
V2: Volumen de inóculo requerido para el reactor (mL)
C2: Densidad celular del inóculo en el momento de realizar la inoculación al reactor
(celmL-1).
32
V) Filtrado de microalgas y determinación de peso seco
Se comenzó pesando una membrana (papel filtro) de 110 mm de diámetro marca
Whatman, que previamente fue secada en estufa a 60°C por 24 horas, y se tomó
registro del peso constante (peso membrana seca, Pms en mg).
Se tomó una muestra de 400 ml de todos los tratamientos (control y efluente de
cultivo de camarón) en la fase exponencial y estacionaria correspondiente a la
cinética de crecimiento y fueron filtradas en las membranas secas.
Se pesaron las membranas con las microalgas filtradas y se hizo el registro del
peso (peso de membrana más microalgas filtradas, Pmm en mg).
La membrana se colocó a la estufa a 60°C por 24 horas, y se registró el peso de la
membrana (peso seco con microalgas, Pmms en mg).
Se aplicaron las siguientes ecuaciones (Ec. 3 y Ec. 4) para determinar la biomasa
en base húmeda (BH) y en base seca (BS) en mg/mL.
BH =[Pmm (mg ) – Pms (mg)]
400 ml ………………………….…………… Ec. 3.
BS =[Pmms (mg ) – Pms (mg)]
400 ml …..……………………..……………. Ec. 4.
VI) Determinación de carbohidratos totales (Dubois et al., 1956)
Todo el material ocupado, se lavó con ácido clorhídrico al 10%, enjuagado
suficientemente con agua destilada y secado en estufa.
Se utilizaron muestras filtradas de 400 ml de cada cultivo, se determinó el peso
seco de la biomasa. Posteriormente, el filtro con la biomasa se colocó en un tubo
de ensayo con tapón de rosca.
Se agregó 1 ml de H2SO4, 1.0 M (Whyte, 1987) y se mantuvo a temperatura
ambiente hasta que todos los tubos contenían el ácido.
Se maceró el filtro con una varilla limpia, y se llevó al sonicador durante 5 min.
33
Posteriormente se agregaron 4 ml de H2SO4 1.0 M (en total son 5 ml de H2SO4
1.0 M).
Se colocaron los tubos tapados individualmente con papel aluminio en un termo-
baño a 100°C durante 1 h.
Se procedió a retirar los tubos del baño y se dejaron en reposo hasta que
alcanzaron temperatura ambiente.
Una vez a temperatura ambiente los tubos fueron centrifugados a 4000 rpm/10°C
por 15 min.
Se separó el extracto ácido con una pipeta Pasteur limpia, teniendo cuidado de no
resuspender la pastilla celular adherida al fondo del tubo, se midió el volumen total
y se colocó en un tubo limpio.
Se tomó 1 ml del extracto ácido.
Se agregó 1 ml de fenol al 5% y se mezcló.
Se dejó reposar 40 minutos.
Posteriormente se agregaron lentamente 5 ml de H2SO4 concentrado en una
campana de extracción. NOTA: El tubo se inclina al agregar el ácido concentrado
y es necesario mezclar con una varilla de vidrio para que no exista pérdida por
evaporación (López-Elías et al., 1992). Se dejó enfriar a temperatura ambiente.
Se tomó lectura a 490 nm, calibrando el espectrofotómetro con un blanco que fue
preparado de la misma manera, sustituyendo el extracto ácido de la muestra con 1
mL de H2SO4 1M.
Ecuaciones para determinar el porcentaje de carbohidrato (CHO) en una
muestra de microalgas
Los cálculos necesarios para obtener el contenido total absoluto ( µm/mL) o
relativo (% de peso seco) se realizan considerando los datos de peso de la
muestra de microalga liofilizada, el volumen total del extracto ácido, el volumen del
extracto ácido utilizado para la cuantificación de los carbohidratos y la ecuación de
la recta de calibración.
34
Datos importantes para el cálculo:
a) Peso seco (biomasa liofilizada) (Ps)
b) Volumen extracto ácido (VE)
c) Volumen muestra (Vm)
d) "m"
f) A490nm
La ecuación para la cuantificación de carbohidratos es la siguiente:
% Carbohidratos = [[(m • A490nm) /Vm]•VE] I Ps• 100
Actividad 2. Determinación de la eficiencia del cultivo de microalgas en la
remoción de compuestos nitrogenados y fosfatos en el efluente camarón.
Se tomaron muestras de efluente de los cultivo de microalgas en los
fotobioreactores cada 2 días y se analizaron los parámetros fisicoquímicos
(temperatura, pH, NH4, NO3, NO2, PO4) mediante un equipo multi-paramétrico
marca HANNA Modelo HI83099, para determinación del comportamiento dinámico
y la eficiencia de remoción de contaminantes en los sistemas por parámetro.
Para determinar la eficiencia de remoción específica de contaminantes se utilizó la
ecuación 5.
𝜂 (%) =(𝑃𝑖−𝑃𝑓)
(𝑃𝑖)𝑥 100 ……..………………………………………………………………Ec. 5.
Donde:
Pi= Valor inicial del parámetro.
Pf= Valor final del parámetro.
η (%): Eficiencia de remoción específica.
Actividad 3. Determinación de la eficiencia de la hidrólisis ácida para la obtención
de azúcares fermentables.
35
VII) Hidrólisis ácida (H2SO4)
Se llevó a cabo la hidrólisis ácida de la biomasa microalgal de D. salina, se usó
H2SO4 (pureza mayor al 98 %) a diferentes concentraciones; 4%, 6%, y 8 % en
muestras de 1:8 m/v, se pesaron 3 g de biomasa seca (Bs) para cada muestra y
se le adicionaron 24 mL de H2SO4 a la concentración deseada.
Preparación de las distintas concentraciones:
25 mL H2SO4 al 4% 4% concentracion buscada
98% pureza del ácido
(25𝑚𝐿)(4%)
98%= 1.02 mL de H2SO4 en
23.98 mL de agua
25 mL H2SO4 al 6% 6% concentracion buscada
98% pureza del ácido
(25𝑚𝐿)(6%)
98%= 1.53 mL de H2SO4 en
23.47 mL de agua
25 mL H2SO4 al 8% 8% concentracion buscada
98% pureza del ácido
(25𝑚𝐿)(8%)
98%= 2.04 mL de H2SO4 en
22.95 mL de agua
Los ensayos se llevaron a cabo en frascos de vidrio con tapa de 250 mL, la
concentración del H2SO4 y la temperatura fueron seleccionados de acuerdo a
Harun y Danquah, (2011) y Ho et al. (2013). La solución se colocó en el autoclave
a 121 ºC 15 psi por 30 minutos. . Posteriormente se dejó enfriar para neutralizar
pH a 6.5 ó 7 con hidróxido de sodio. Fue necesario centrifugar la muestra a 5,000
rpm por 10 minutos.
Se ensayó también un control usando H2SO4 seguido por tratamiento en autoclave
(121 ºC, 15 psi por 30 min). Dicha biomasa hidrosoluble o licor fue tratada según
el método DNS (3,5-dinitrosalicilato) para determinar la concentración de azúcares
reductores totales (ART).
36
VIII) Desarrollo de la reacción del DNS
En tubo de ensaye se colocaron 0.5 mL de la muestra con 0.5 mL del reactivo
DNS (3,5-dinitrosalicilato), se mezclaron utilizando vórtex.
Se llevaron a baño María (100°C) por 5 minutos y se dejó enfriar a temperatura
ambiente.
Se agregaron 5 mL de agua destilada fría, se agitó en vórtex.
Se realizó lectura en el espectrofotómetro a 540 nm.
El blanco se preparó sustituyendo la muestra por 0.5 mL de agua destilada y se
siguió el mismo tratamiento.
NOTA: las muestras debían estar en un rango de 0.200 y 0.800 nm. Si las
muestras se observaban oscuras, es decir, color rojo intenso, se debía hacer
diluciones, ya que mayor coloración indica presencia de más azúcares.
IX) Curva patrón de glucosa
Se preparó la solución patrón de glucosa a las siguientes concentraciones: 0.2,
0.4, 0.6, 0.8 y 1.0 g L-1. Se desarrolló la reacción con el reactivo DNS según
método.
Tabla 6. Absorbancia a 540 nm de muestras de concentración de azúcares
fermentables conocidas.
Concentración de muestras
g L-1 (Glucosa)
Promedio lectura 540
nm
0.2 0.094±0.0042
0.4 0.199±0.0042
0.6 0.320±0.0042
0.8 0.422±0.0014
1.0 0.537±0.0028
37
Figura 8. Curva DNS concentración de glucosa y absorbancia a 540 nm.
Una vez que el almidón se transformó en glucosa, maltosa y dextrina, se introdujo
la levadura para la fermentación y transformación de los azúcares en etanol.
Actividad 4. Evaluación del rendimiento en la producción de bioetanol por gramo
de biomasa en la fermentación.
X) Sacarificación de carbohidratos de microalgas
El almidón de la microalga se liberó de las células por la acción de un equipo de
ruptura celular como los homogenizadores de alta presión, en este caso, la
hidrólisis ácida. La concentración seleccionada con mayor rendimiento fue H2SO4
al 8%.
y = 0.5545x - 0.0183 R² = 0.9995
0.000
0.100
0.200
0.300
0.400
0.500
0.600
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
Ab
sorb
anci
a 5
40
nm
Concentración de glucosa (g L-1)
38
XI) Fermentación de la glucosa en microalgas con Saccharomyces
cerevisiae
Para la fermentación de la biomasa hidrosoluble o licor, se utilizó la levadura
Saccharomyces cerevisiae, cepa obtenida del laboratorio de alimentos del Instituto
Tecnológico Superior de Tierra Blanca.
Se prepararon 70 mL de medio para levadura.
Se esterilizó en autoclave 15 minutos a 121°c. Se dejó enfriar.
La biomasa hidrosoluble, fue inoculada con el pre-cultivo de levadura y cultivada
anaeróbicamente a 31 ºC, 150 rpm por 24 h. Para la determinación de etanol,
azúcares totales y contenido de glucosa en el caldo de fermentación se tomaron
muestras cada tres horas (Guo et al., 2013).
XII) Determinación de etanol por HPLC (High performance liquid
chromatography- Cromatografía líquida de alto rendimiento)
La concentración de etanol se determinó por Cromatografía de líquidos, utilizando
un equipo HPLC Waters e2695 alliance, flujo 0.8 mL/min, 40 °C. Se empleó una
columna BioRad, Aminex hpx-87h. El equipo mencionado y utilizado pertenece al
laboratorio de alimentos del Instituto Tecnologico Superior de Tierra Blanca.
Productividad= cantidad máxima de etanol
tiempo en horas gL−1h−1
Rendimiento= etanol final−etanol inicial
glucosa inicial−glucosa final
XIII) Preparación de muestras para HPLC
Las muestras fueron congeladas hasta el momento de realizar el pretratamiento.
Se descongelaron las muestras, posteriormente fueron centrifugadas a 5,000 rpm
por 10 minutos, el sobrenadante fue colocado en tubo limpio.
Se agregaron 0.24 g de sulfato de zinc y 0.23 g de óxido de bario (los compuestos
fueron añadidos en el orden mencionado), para preparar 5 mL de solución 0.3 M.
39
Se dejó reposar 10 minutos para propiciar la precipitación. Fue centrifugado una
vez mas para tomar 1 mL de sobrenadante y colocarlo en un tubo limpio.
Se hicieron diluciones con 1 mL de muestra y 3 mL de agua purificada, obteniendo
así dilución 4. Si las muestras se observaban amarillas, se procedía a hacer
diluciones mayores.
Análisis estadístico
Se realizó un Análisis de Varianza (ANOVA) con un Intervalo de confianza del
95% (α=0.05), utilizando el Software: StatSoft® Statistica V 7.0.
40
9. RESULTADOS
Los resultados que se presentan a continuación corresponden al cumplimiento de
cada uno de los objetivos específicos.
a) Evaluación de la densidad, producción y productividad de biomasa y
carbohidratos en cultivos de Dunaliella salina y Dunaliella tertiolecta en
efluente de cultivo de camarón y medio Guillard F/2.
Se observó que el medio F2 es el que produjo la mayor densidad celular,
independientemente de la especie; sin embargo al comparar la densidad celular
entre ambas microalgas en el medio F2, se observó que D. salina presentó la
mayor densidad (5.1X106 cél mL-1) durante las dos fases de crecimiento
En el medio F2 el contenido de carbohidratos (46%) fue mayor en D. salina en
fase estacionaria, pero similar a D. tertiolecta (41%) en fase exponencial. En
ambos medios (F2 y ECC) y durante la fase exponencial D. salina no presentó
diferencia significativa en el contenido de carbohidratos.
Con respecto a la producción de biomasa, D. salina en medio F2 fue
significativamente superior a D. tertiolecta para ambas fases de crecimiento,
siendo mayor en D. salina (173 mg L-1), durante la fase estacionaria.
Es importante mencionar que en la producción de carbohidratos hubo notable
diferencia significativa entre las dos microalgas en medio F2 durante la fase
estacionaria, obteniendo 79 mg L-1 para D. salina (Tabla 7).
En la productividad de biomasa D. salina mostró diferencia significativa con
respecto D. tertiolecta en medio F2 en ambas fases de crecimiento; sin embargo
D. salina no presenta diferencias significativas en ambas fases de crecimiento (23-
22 mg L-1 día -1).
41
Tabla 7. Crecimiento celular, producción y productividad de biomasa y carbohidratos en cultivos de D. salina y D. tertiolecta en efluente de cultivo de camarón y
medio F/2 Guillard a temperatura cromática 20000°K.
Nota: a: dato de mayor valor en D. salina, b: dato de mayor valor en D. tertiolecta.
Microalga Medio de
cultivo
Fase de crecimiento
Promedio
(cél mL-1
)
% de carbohidratos
Producción de biomasa
(mg L-1
)
Producción de
carbohidratos
(mg L-1
)
Productividad de biomasa
(mg L-1
d-1
)
Productividad de
carbohidratos
(mg L-1
d-1
)
Dunaliella
salina Medio
F/2 Guillard
Exponencial 4.1X106 ± 87.09 35.89 ± 0.55 115.25 ± 8.85 66.79 ± 0.90 23.05± 1.77
a 6.36 ± 0.18
Estacionaria 5.1 X106 ± 84.87
a 46.06 ± 5.79
a 173.17 ±23.03
a 78.88 ± 0.44
a 21.65 ± 2.88 9.86 ± 0.06
a
Efluente de cultivo
de camarón
Exponencial 6.5 X105 ± 46.37
6.71 ± 2.15 21.25 ± 1.39 1.42± 0.40 4.25 ± 0.28 0.28 ± 0.08
Estacionaria 6.8 X105 ± 46.86 7.94 ± 1.53 35.33 ± 4.13 2.77 ± 0.35 4.42 ± 0.52 0.35 ± 0.04
Dunaliella tertiolecta
Medio F/2
Guillard
Exponencial 3.3 X106 ± 43.22 40.63 ± 2.612
b 44.17 ± 14.22 17.76 ± 4.91
b 8.83 ± 2.84
b 3.55 ± 0.98
b
Estacionaria 3.7 X106 ± 65.53
b 25.30 ± 2.404 67.08 ± 34.19
b 16.52 ± 6.98 8.39 ± 4.27 2.07 ± 0.87
Efluente de cultivo
de camarón
Exponencial 7.7 X105 ± 51.61 6.46 ± 1.414 35.83 ± 2.53 2.33 ± 0.60 7.17 ± 0.51 0.47 ± 0.12
Estacionaria 8.6 X105 ± 53.71 9.79 ± 2.82 39.25 ± 9.97 3.66 ± 0.15 4.91 ± 1.25 0.46 ± 0.02
42
b) Determinar la eficiencia del cultivo de microalgas en la remoción de
compuestos nitrogenados y fosfatos en el efluente de cultivo de camarón.
En general, no se encontraron diferencias significativas entre los días de
crecimiento para las variables evaluadas en cada una de las especies. Se observó
que en Dunaliella salina los parámetros evaluados presentaron mayor variación y
valores promedio más altos que en el cultivo de D. salina. Al parecer la especie
que mejor removió los nitratos fue D. tertiolecta ya que al día 10 de crecimiento, el
valor fue de 0.60±0.34 mientras que D. Salina presento un valor de 14.77±2.48.
El pH fue un parámetro que se estuvo monitoreando durante el cultivo de las
microalgas en efluente de cultivo de camarón, en general, en ambas microalgas
fue neutro, terminando con diferencia significativa entre D. salina y D. tertiolecta
en el día ocho y diez (Figura 9). Por otro lado, la determinación de amonio mostró
diferencia significativa en los días cuatro y seis, resultando mayor en D. tertiolecta
(Figura 10).
Figura 9. Medición de pH durante el crecimiento de D. salina y D. tertiolecta en efluente
de cultivo de camarón.
Microalga*Días de crecimiento; LS Means
Wilks lambda=.05637, F(25, 75.799)=3.5435, p=.00001
Vertical bars denote 0.95 confidence intervals
Microalga
D. salina
Microalga
D. tertiolecta0 2 4 6 8 10
Días de crecimiento
7.0
7.2
7.4
7.6
7.8
8.0
8.2
8.4
pH
43
Figura 10. Concentraciones de amonio (NH4) durante el crecimiento de D. salina y D.
tertiolecta en efluente de cultivo de camarón.
En la Figura 11, se observa la concentración de nitratos, la cual, no mostró
diferencia significativa durante los diez días de cultivo entre ambas microalgas.
Figura 11. Concentraciones de nitrato (NO3) durante el crecimiento de D. salina y D.
tertiolecta en efluente de cultivo de camarón.
Microalga*Días de crecimiento; LS Means
Wilks lambda=.05637, F(25, 75.799)=3.5435, p=.00001
Vertical bars denote 0.95 confidence intervals
Microalga
D. salina
Microalga
D. tertiolecta0 2 4 6 8 10
Días de crecimiento
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
NH
4 (
mg
L-1
)
Microalga*Días de crecimiento; LS Means
Wilks lambda=.07922, F(25, 75.799)=2.9680, p=.00015
Vertical bars denote 0.95 confidence intervals
Microalga
D. salina
Microalga
D. tertiolecta0 2 4 6 8 10
Días de crecimiento
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
NO
3 (
mg
L-1
)
44
Cabe señalar que en la concentración de nitritos no hubo diferencia significativa
durante todos los días de cultivo (Figura 12).
Figura 12. Concentraciones de nitrito (NO2) durante el crecimiento de las microalgas D.
salina y D. tertiolecta en efluente de cultivo de camarón.
Respecto a la concentración de fosfato, no hubo diferencia significativa entre
ambas microalgas (Figura 13).
Figura 13. Concentraciones de fosfato (PO4) durante el crecimiento de las microalgas D.
salina y D. tertiolecta en efluente de cultivo de camarón.
Microalga*Días de crecimiento; LS Means
Wilks lambda=.07922, F(25, 75.799)=2.9680, p=.00015
Vertical bars denote 0.95 confidence intervals
Microalga
D. salina
Microalga
D. tertiolecta0 2 4 6 8 10
Días de crecimiento
-0.01
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
NO
2 (
mg
L-1
)
Microalga*Días de crecimiento; LS Means
Wilks lambda=.07922, F(25, 75.799)=2.9680, p=.00015
Vertical bars denote 0.95 confidence intervals
Microalga
D. salina
Microalga
D. tertiolecta0 2 4 6 8 10
Días de crecimiento
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
PO
4 (m
g L
-1)
45
En las tablas 8 y 9 se muestran los parámetros determinados durante el cultivo de
D. salina y D. tertiolecta en efluente de cultivo de camarón.
Tabla 8. Determinación de parámetros (mg L-1) durante el crecimiento de Dunaliella salina
en efluente de cultivo de camarón.
Parámetros en el crecimiento de Dunaliella salina en efluente de cultivo de camarón
Días de crecimiento pH Amonio (NH4) Nitratos (NO3) Nitritos (NO2) Fosfatos (PO4)
0 7.93± 0.02 1.22±0.03 14.80±4.36 0.02±0.01 0.35±0.01
2 8.00±0.00 0.73±0.01 15.10±1.42 0.02±0.00 0.32±0.09
4 8.03±0.04 1.06±0.02 10.87±3.27 0.04±0.00 0.24±0.04
6 7.93±0.07 1.09±0.01 8.60±2.37 0.03±0.00 0.65±0.06
8 8.03±0.04 1.21±0.03 6.70±1.52 0.03±0.00 0.66±0.02
10 7.57±0.05 1.32±0.07 14.77±2.49 0.02±0.00 0.47±0.08
Promedio 7.92±0.04 1.11±0.03 11.81±2.57 0.03±0.00 0.45±0.05
Tabla 9. Determinación de parámetros (mg L-1) durante el crecimiento de Dunaliella
tertiolecta en efluente de cultivo de camarón.
Parámetros en el crecimiento de Dunaliella tertiolecta en efluente de cultivo de camarón
Días de crecimiento pH Amonio (NH4) Nitratos (NO3) Nitritos (NO2) Fosfatos (PO4)
0 7.93±0.02 1.20±0.02 13.70±4.03 0.02±0.01 0.34±0.00
2 7.90±0.00 0.84±0.01 11.10±3.21 0.01±0.00 0.11±0.02
4 7.73±0.02 1.60±0.04 0.10±0.06 0.03±0.01 0.25±0.06
6 7.70±0.00 2.05±0.02 0.00±0.00 0.04±0.00 0.84±0.05
8 7.60±0.03 1.54±0.13 2.43±1.40 0.03±0.00 0.43±0.03
10 7.27±0.02 1.10±0.00 0.60±0.35 0.03±0.00 0.48±0.03
Promedio 7.69±0.02 1.39±0.04 4.66±1.51 0.03±0.00 0.41±0.03
Los porcentajes de remoción de D. salina y D. tertiolecta son mostrados en la
Tabla 10
46
Tabla 10. Determinación de remoción de compuestos por D. salina y D. tertiolecta en
efluente de cultivo de camarón
Porcentaje de eficiencia de remoción específica de D. salina y D. tertiolecta
cultivadas en efluente de cultivo de camarón
D. salina D. tertiolecta
Amonio (NH4) 0 8.33
Nitratos (NO3) 0.22 95.62
Nitritos (NO2) 0 0
Fosfatos (PO4) 0 0
Actividad 3. Determinación de la eficiencia de la hidrólisis ácida para la obtención
de azúcares fermentables.
a) Hidrólisis ácida (H2SO4)
Se utilizaron concentraciones de ácido sulfúrico de 4, 6 y 8 % para determinar
concentración de glucosa de D. salina, obteniendo mayor en 8% (Tabla 11).
Tabla 11. Concentraciones de hidrólisis ácida en Dunaliella salina y concentración de
glucosa (g L-1).
Concentración % de H2SO4
Biomasa seca (g)
Relación m:v g:ml
Promedio lectura 540 nm
Promedio
concentración
de glucosa (g
L-1)
4 3 1:8 0.272±0.0014 1.0849±0.0536
4 3 1:8 0.293±0.0057
6 3 1:8 0.2775±0.0078 1.2690±0.2196
6 3 1:8 0.213±0.0014
8 3 1:8 0.288±0.0141 2.3142±0.1479
8 3 1:8 0.317±0.0014
47
Actividad 4. Evaluación del rendimiento en la producción de bioetanol por gramo
de biomasa en la fermentación.
a) Sacarificación de carbohidratos de microalgas
La biomasa de S. cerevisiae fue medida por densidad óptica en el
espectrofotómetro, obteniendo mayor dato a las 24 horas de cultivo (Tabla 12 y
Figura 14).
Tabla 12. Biomasa Saccharomyces cerevisiae medida en densidad óptica a 620 nm por
24 horas de cultivo.
Tiempo (h) Biomasa (Do)
0 0.622±0.00
0.5 0.617±0.01
1 0.608±0.00
2 0.599±0.02
3 0.611±0.01
4 0.603±0.00
6 0.645±0.00
8 0.693±0.01
11 1.002±0.11
14 1.456±0.15
17 2.628±0.33
21 4.095±0.33
24 5.270±0.41
48
Figura 14. Comportamiento de S. cerevisiae durante el ensayo.
b) Determinación de etanol por HPLC (High performance liquid
chromatography-Cromatografía Líquida de Alta Eficacia) en la fermentación
de glucosa microalgal con S. cerevisiae.
Durante la fermentación de glucosa microalgal con S. cerevisiae, la mayor
producción de bioetanol fue a las 17 h, mientras que la glucosa fue consumida en
su totalidad a las 21 h (Figura 15)
La productividad obtenida fue 0.049 g L-1 h-1, mientras que el rendimiento fue de
0.132 g L-1 etanol/ g L-1 glucosa. Considerando que por cada 3 g de biomasa la
concentración de glucosa es de 2.3 g (Tabla 11), el Rendimiento de g etanol/g de
biomasa fue de 0.11
0.000
1.000
2.000
3.000
4.000
5.000
6.000
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Bio
mas
a (D
o)
Tiempo (h) S. cerevisiae
49
Figura 15. Producción de bioetanol y consumo de glucosa por S. cerevisiae.
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
5.00
6.00
7.00
8.00
0 3 6 8 11 14 17 21
Co
nce
ntr
ació
n (
g L-1
)
Tiempo (hr)
Glucosa Etanol
50
10. DISCUSIÓN
a) Evaluación de la densidad, producción y productividad de biomasa y
carbohidratos en cultivos de Dunaliella salina y Dunaliella tertiolecta en
efluente de cultivo de camarón y medio Guillard F/2.
Respecto a la densidad celular, D. salina cultivada en el medio F2, quien presentó
valores más altos de células (5.1X106 cél mL-1) en ambas fases (exponencial y
estacionaria). Es importante señalar que la preparación del medio F2 de acuerdo
Guillard y Ryther, 1962, incluye compuestos nitrogenados y fosfatados como el
nitrato de sodio y fosfato de sodio monobásico dihidrato, respectivamente, además
de solución de metales traza y vitaminas, por lo que cuentan con todos los
nutrientes necesarios para el crecimiento celular de la microalga, lo que no sucede
con el efluente de cultivo de camarón, ya que se tuvo que agregar solución de
metales traza y vitaminas, y compuestos nitrogenados y fosfatos dependieron de
la cantidad presente en el efluente. Lo anterior pudo haber afectado que el
desempeño de las algas en este medio de cultivo haya sido menor, Páez Osuna
(2001), menciona en los sistemas de cultivo de la camaronicultura la ruta de salida
más importante de nitrógeno y fosforo es a través de los efluentes de descarga,
pero también se da a través de la volatilización del amonio, la denitrificación y la
acumulación del nitrógeno en los sedimentos, por lo que puede haber una
carencia de estos elementos. Por otro lado, como lo menciona Marín (2003), los
fosfatos son indispensables para la vida de algas y plantas acuáticas, siendo
habitualmente factor limitante en su crecimiento, en la medición de dicho
compuesto al inicio y durante el cultivo, el efluente de cultivo de camarón no
mostró presencia del mismo, por lo cual, ésta ausencia, pudo afectar la densidad
celular de las microalgas.
Respecto al contenido de carbohidratos, el mayor contenido (46%) se obtuvo en
D. salina en medio F2 en fase estacionaria, este dato fue por arriba del resultado
por Pavón-Suriano (2017) quien cultivó la misma microalga en medio F2 a
temperatura cromática 20000°K pero en fotobioreactores hexagonales de acrílico
51
de 8L, obteniendo 25.37%, por lo cual se observa que pueda deberse a la
diferencia en el diseño y material del fotobioreactor.
Por otro lado, la producción de biomasa y carbohidratos y productividad de
carbohidratos, se mostró mayor en D. salina en F2 durante fase estacionaria (173
mg L-1, 79 mg L-1 y 10 mg L-1 día -1), nuestro valor de producción de carbohidratos
fue mayor al de Neri-Gallardo (2015), quien cultivó D. salina en medio F2 con
LEDs y obtuvo 54.37 mg L-1, con lo cual nuestra investigación refleja la mejora de
esta producción con la temperatura cromática a 20000°K, asimismo, nuestra
productividad de carbohidratos fue mayor a la obtenida por Ji, et al (2015), quienes
obtuvieron 5.15 mg L-1 día -1 con Scenedesmus obliquus, utilizando agua residual
municipal con la adición de 5% de CO2 artificial en su cultivo.
b) Determinar la eficiencia del cultivo de microalgas en la remoción de
compuestos nitrogenados y fosfatos en el efluente de cultivo de camarón
Una de las fuentes de la presencia de nitratos en aguas es debido a la
descomposición de materiales vegetales y animales, aunque la formación del ión
nitrato representa que se ha completado el ciclo de nitrógeno, ya que éstos son
consumidos por el fitoplancton de agua dulce o agua salada (Marín, 2003), por
esto, es importante mencionar que el efluente de cultivo de camarón procedía de
estanques de camarones reproductores, los cuales se encontraban en
mantenimiento, es decir, la alimentación no se enfoca a engordar a los organismos
sino mas bien, a mantener su peso y tamaño, por lo cual la presencia de
compuestos como nitratos pudo verse reflejada en bajas concentraciones de los
mismos, sin embargo, el comportamiento de las microalgas varió, mostrando a D.
tertiolecta con alta capacidad de remoción, mientras que D. salina no mostró
remoción.
Chlorella vulgaris es una de las microalgas experimentadas para la remoción de
compuestos nitrogenados, como lo mencionan Kim et al (2010), quienes utilizaron
esta microalga para remover nitrógeno en forma de amoniaco e iones amonio
provenientes de efluente de aguas residuales, mientras que Gutwinski y Cema
(2016), mostraron que C. vulgaris fue eficiente en la remoción de nitrógeno y
52
fosforo en agua de desecho, aunque Hee-Jeong y Seung-Mok (2013) refieren que
al utilizar la microalga mencionada en la remoción en aguas residuales con
concentraciones bajas de nitrógeno amoniacal; ésta es completa, pero al
aumentar la concentración de dichos compuestos, la remoción disminuyó a 50, e
incluso a 32%. Con lo anterior, C. vulgaris, es una de las microalgas de ambiente
dulceacuícola generalmente empleada para remoción de compuestos ya sea
nitrogenados o fosfatados mayormente en aguas residuales, sin embargo, también
se generan grandes cantidades de efluentes de aguas marinas, como son los
provenientes de la camaronicultura, por lo cual, proponer microalgas salinas que
pueden remover compuestos es de suma importancia, como fue la investigación
realizada por, Chinnasamy et al (2010), en la cual utilizaron agrupación de 15
algas nativas, tanto dulceacuícolas como marinas, entre ellas, D. tertiolecta,
obtenidas de la carpeta industrial de aguas residuales, con las cuales, removieron
96% de nutrientes (fosfatos y nitratos) en 72 horas, por lo cual D. tertiolecta, al ser
microalga marina y mostrarnos que pudo remover 95 % de nitratos en efluente de
cultivo de camarón, nos da opción para aprovechar y remover los nutrientes
contenidos en dicho efluentes antes de ser vertidos a cuerpos acuíferoscomo el
mar o lagunas costeras, dando como resultado efluentes con menores
concentraciones de compuestos y ayudando al cuerpo acuífero a mantener
equilibrio natural .
c) Evaluación del rendimiento en la producción de bioetanol por gramo de
biomasa en la fermentación.
En este trabajo, la concentración inicial de glucosa fue de 7 g L-1 alcanzando 7.49
g L-1 como mayor concentración, mostrando declive de la misma a las 14 horas,
por otro lado, se presentó 1.04 g L-1 como concentración más elevada de etanol,
el cual disminuyó marcadamente a las 24 horas, al no haber presencia de sustrato
(glucosa), obteniendo productividad de 0.049 g L-1 h-1 y rendimiento de 0.132 g
etanol/ g glucosa y un rendimiento de 0.11 g etanol/ g biomasa. De acuerdo a
Faife Perez et al (2012), la acumulación de lípidos en D. salina va de 9.2 a 47.2%,
aunque en este trabajo se obtuvo producción de carbohidratos para obtención de
53
etanol, ésta producción fue baja, confirmando que para esta microalga es mucho
menor la acumulación de carbohidratos si se compara con lípidos. Garatachia
(2018) obtuvo 1.46 g L-1 de etanol a las 10 horas de fermentación, 0.167 g etanol/g
biomasa de rendimiento en C. vulgaris utilizando también S. cerevisiae, aunque se
tratan de dos microalgas de diferentes ambientes, las condiciones de hidrólisis
fueron semejantes en el tiempo y ácido utilizado, y los resultados de etanol tienen
similitudes, aunque varían los tiempos en que se presentaron. Por otro lado, Ho, et
al (2013) evaluó el potencial de carbohidratos de Chlorella vulgaris FSP-E como
materia prima de carbohidratos para producción de bioetanol empleando
Zymomonas mobilis, con la hidrólisis ácida diluida de ácido sulfúrico al 1%,
teniendo 50 g L-1 de concentración inicial de biomasa algal, obteniendo; 23.6 g L-1
de glucosa, 11.66 g L-1 de etanol y 0.233 de rendimiento de etanol, con lo anterior
se puede atribuir actividad superior de Z. mobilis por mayor afinidad a los sustratos
o por el metabolismo propio comparado con S. cerevisiae, es importante hacer
mención que las concentraciones de etanol pueden variar de acuerdo a las
condiciones empleadas en la hidrólisis.
54
11. CONCLUSIÓN
Dunaliella salina mostró los mejores resultados en cuanto a densidad celular,
contenido, producción productividad de biomasa y carbohidratos .
Dunaliella tertiolecta mostró los valores más altos de remoción de nitratos y
amonio, capacidad que puede ser empleada para tratar efluentes derivados del
cultivo de camarón antes de ser vertidos a cuerpos naturales.
Se obtuvo etanol derivado de glucosa proveniente de carbohidratos producidos
por la microalga marina D. salina, sin embargo la producción de carbohidratos es
baja.
55
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13. ANEXOS
Anexo 1. Medio YPD para levaduras
SALES CANTIDAD
Sulfato de amonio- (NH4)2SO4 5 g
Fosfato monopotásico- KH2PO4 8 g
Sulfato de magnesio- MgSO4.7H2O 1 g
Extracto de levadura 2 g
Glucosa 100 g
Cantidades para volumen de 1L en agua destilada.
Esterilizar
Anexo 2. Constancia de participación en 2do. Simposium Internacional de
Acuacultura, “Aquadaca 2017”.