PRÁCTICAS EN EL CENTRO DEL CÁNCER DE SALAMANCA

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ÍNDICE

1. Introducción -------------------------------------------------------------------------------- 2

2. Centro de investigación del cáncer ---------------------------------------------------- 2

3. Isidro Sánchez García -------------------------------------------------------------------- 2

4. Expresión del oncogén BCR-ABL en ratones --------------------------------------- 3

Introducción --------------------------------------------------------------------------------- 3

Estudio ---------------------------------------------------------------------------------------- 4

Técnicas -------------------------------------------------------------------------------------- 5

5. Análisis de ratones transgénicos -------------------------------------------------------- 6

Southern Blot -------------------------------------------------------------------------------- 6

PCR ------------------------------------------------------------------------------------------- 8

6. Obtención de ABL ------------------------------------------------------------------------- 10

Transformación de E.coli con el plásmido E1A2 ------------------------------------------------------------ 10

Obtención del plásmido E1A2 ------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 11

Purificación de ABL ------------------------------------------------------------------------ 13

7. Anatomía patológica ---------------------------------------------------------------------- 14

8. Actividades complementarias ----------------------------------------------------------- 15

9. Conclusión ---------------------------------------------------------------------------------- 15

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1. INTRODUCCIÓN

En este verano, durante los meses de julio y septiembre, realicé prácticas en el

Centro de Investigación del Cáncer de Salamanca. Dichas prácticas fueron dirigidas por

el investigador Isidro Sánchez García en el laboratorio 13. En esta memoria, expondré

mi experiencia personal y las principales técnicas realizadas durante este periodo de

aprendizaje.

2. CENTRO DE INVESTIGACIÓN DEL CÁNCER

El CIC es un centro de investigación integral del cáncer establecido en 1997 que,

respondiendo al modelo de los Comprehensive Cancer Center norteamericanos, se

caracteriza por integrar investigación competitiva y de excelencia sobre cáncer en

tres niveles distintos: básico, clínico y aplicado.

El CIC está constituido alrededor del Instituto de Biología Molecular y Celular del

Cáncer (IBMCC), que tiene carácter de Instituto Universitario Mixto, dependiente de

la Universidad de Salamanca (USAL) y el Consejo Superior de Investigaciones

Científicas (CSIC).

Sus principales objetivos son los siguientes:

1. Realizar investigación puntera en cáncer a nivel básico, aplicado y clínico.

2. Favorecer el trasvase bidireccional de información entre la ciencia biomédica

básica y la aplicada, para fomentar la sinergia de los tres tipos de

investigación y así mejorar la productividad.

3. Constituirse como un centro científico de excelencia capaz de competir en

igualdad de condiciones con otros centros internacionales.

4. Fomentar la conexión del CIC con redes temáticas de investigación

oncológica tanto nacionales como internacionales.

5. Potenciar la creación de riqueza y servicios que reviertan en el bienestar

social y desarrollo económico a nivel regional y nacional.

3. ISIDRO SÁNCHEZ GARCÍA

El Dr. Isidro Sánchez García es uno de los principales investigadores del CIC en

el marco de la Investigación Aplicada. Su laboratorio se encarga principalmente de la

generación de modelos genéticos animales para el estudio de tumorogénesis y

hematopoyesis, alteraciones cromosómicas en tumores hematopoyéticos y terapia

génica.

Su principal línea de investigación es la siguiente:

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“Aunque la mayor parte de los pacientes con cáncer responden a la terapia, tan sólo

una minoría son curados. Datos recientes que sugieren el origen de muchas

enfermedades en una población poco común de células responsables exclusivamente

de conservar la capacidad de auto-renovación y mantenimiento del tumor (es decir,

?células stem cancerígenas?) podrían explicar la paradoja de que respuesta y

supervivencia no siempre van unidas. En este contexto, una pequeña población de

células cancerígenas adquiriría propiedades características de células stem. En

algunos casos, las células stem cancerígenas (CSC) podrían derivar directamente de

las células stem normales de un tejido. En cualquiera de las situaciones el resultado

final sería el mismo, conduciendo a las CSC como células diana en el desarrollo de

terapias moleculares y farmacéuticas para el tratamiento y prevención del cáncer

humano. Este podría representar un nuevo paradigma en el tratamiento del cáncer,

alejado del tratamiento dirigido a las células blásticas y orientado a las CSC. El

desafío para esta nueva aproximación es encontrar una forma de atacar

específicamente estas CSC sin que sea tóxica para las células normales. En este

sentido, nuestro laboratorio se sirve de la genética y genómica del ratón para

diseccionar los mecanismos moleculares y procesos biológicos que gobiernan el papel

de las CSC en la biología tumoral y en la Oncología Translacional. Con este objetivo

hemos desarrollado los siguientes programas de investigación:

a) Identificación y caracterización de las células stem cancerígenas en varios tipos de

tumor.

b) Atlas genómico de las CSC: genética y epigenética.

c) Biología Celular y de sistemas de las células stem cancerígenas (Análisis funcional

de los genes Slug y Snail en el desarrollo y mantenimiento de la célula stem

cancerígena).

d) Modelos animales para el Estudio de la Célula Stem Cancerígena.

e) Aplicaciones diagnósticas y pronósticas del Estudio de la Célula Stem Cancerígena

(Imagen Molecular).

f) Identificación y evaluación de dianas terapéuticas en las células stem cancerígenas.

g) Descubrimiento y desarrollo de inhibidores selectivos de las CSC.”

4. EXPRESIÓN DEL ONCOGÉN BCR-ABL EN

RATONES:

INTRODUCCIÓN:

La leucemia linfoblástica aguda (LLA) es un tipo de cáncer en el cual se

reduce el número de linfocitos, leucocitos y plaquetas debido al exceso de células

anormales en la sangre y medula ósea. Generalmente este cáncer es diagnosticado en

estados avanzados. Se han diseñado modelos animales para estudiar la leucemia, saber

sus causas y encontrar algún tratamiento para combatirlo y reducir el número de células

dañinas. Este gen se forma cuando fragmentos de los cromosomas 9 y 22 se rompen y

cambian de posición. El gen ABL del cromosoma 9 se une al gen BCR del cromosoma

22 para formar el gen de fusión BCR-ABL. El cromosoma 22 alterado que contiene el

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gen de fusión se llama cromosoma Filadelfia. El gen de fusión de BCR-ABL se

encuentra en la mayoría de los pacientes con leucemia mielógena crónica (LMC) y en

pacientes con leucemia linfoblástica aguda (LLA) o leucemia mielógena aguda (LMA).

ESTUDIO:

El oncogén BCR-ABL p190 se asocia con el desarrollo de la leucemia

linfoblástica de células B en humanos. Este oncogén confiere a las células tumorales B

diversas propiedades biológicas como resistencia a la apoptosis. Sin embargo, su

inhibición mediante inhibidores específicos no es capaz de revertir la leucemia en

humanos, sugiriendo que otras propiedades pueden también contribuir a la génesis y

mantenimiento del fenotipo tumoral. Con el fin de identificar estas propiedades todavía

desconocidas, generamos ratones modificados genéticamente con el “cassette” BCR-

ABLp190-IRES-tk con expresión restringida a Sca1 (cell stem antigen1). Estos ratones

son fértiles y se desarrollan con normalidad. El análisis de la composición del sistema

hematopoyético mediante técnicas de histología y de citometría de flujo utilizando

anticuerpos monoclonales específicos, no puso de manifiesto ninguna alteración en

ratones menores de un año de edad. Sin embargo, los ratones BCR-ABLp190-IRES-tk

mayores de un año de edad desarrollan de forma específica leucemia linfoblástica de

células B. Estos resultados ponen en manifiesto:

1. Una nueva función no descrita hasta ahora para el oncogén BCR-ABL:

reprogramación de las celular Sca1 (cell stem antigen1) para dar lugar a una

leucemia linfoblástica de células B.

2. Y que la expresión permanente del oncogén no es necesaria para el

mantenimiento del fenotipo tumoral.

En conclusión, al analizar ratones de distintas edades, nuestros resultados reflejan que

el desarrollo de leucemia linfoblástica aguda (LLA) en células B, no es una condición

que esté ligada al nacimiento del ratón. La leucemia linfoblástica aguda (LLA) no está

presente en las etapas juveniles de los ratones estudiados. Cada ratón tiene un desarrollo

totalmente normal y luego, mientras mayor edad va adquiriendo, comienza a desarrollar

(LLA) a causa del oncogén que poseen. Hasta el momento, los ratones mayores a un

año de edad, son los que tienen presente la enfermedad y los ratones menores a un año

de edad no presentan ningún tipo de síntoma de LLA y son sumamente similares a los

controles utilizados. Eventualmente, como consecuencia del desarrollo de leucemia

linfoblástica aguda algunos de los ratones desarrollan anemia y mueren. En conclusión,

los resultados en este estudio indican, que hay una nueva función que no ha sido

descrita hasta el momento para el oncogén BCR-ABL y que la expresión permanente

del oncogén no es necesaria para el mantenimiento del fenotipo tumoral.

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TÉCNICAS:

Las técnicas utilizadas para el estudio anterior fueron las siguientes:

HEMAVET (HV950FS):

Es un sistema hematológico que proporciona una separación superior de células

para realizar análisis precisos y exactos utilizando la tecnología enfocada „‟Flow

Technology‟‟ para analizar muestras de sangre con fines de investigación

científica. Tiene una serie de parámetros establecidos para analizar muestras de

ratones en ciclos de dos minutos.

BECMAN COULTER Z2:

Analiza las concentraciones y cuenta el número de células presentes en un

cultivo y provee un tamaño de la distribución de la población celular. Utiliza una

zona eléctrica para detectar las células y esta técnica ofrece precisión, velocidad

versatilidad y reproducibilidad. Para llevar a cabo el conteo de células se añaden

9mL de ISOTON + 100uL de cada muestra + 900uL de PBS con 1% de Fetal

Calcium Serum. Se calcula el número de células totales: N° cél / mL x Vol.

Falcón x 100 = Número de células totales.

FACscalibur FLOW CITOMETER:

La citometría de flujo es una técnica que se utiliza para el análisis celular. Esta

mide las características de dispersión de luz y fluorescencia que poseen las

células al pasar a través de un rayo de luz o láser. Para el análisis de citometría

de flujo, las células deben encontrarse suspendidas en PBS + 1% Fetal Calcium

Serum al momento de llevar a cabo el análisis y conteo de células en el

citómetro. Las células sanguíneas pueden analizarse de forma directa, sin

embargo, las células de tejidos sólidos deben primero dispersarse. Al momento

de extraer las muestras de

los ratones enfermos

sacrificados, las muestras

de tejidos sólidos son

procesados a través de un

filtro de nylon de 70uL, y

de esta forma las células

quedan suspendidas en

PBS + 1% Fetal Calcium

Serum. Las células pueden

hacerse pasar a muy altas velocidades, incluso pueden llegar a alcanzarse

velocidades cercanas a las 100,000 células por segundo. Al atravesar el rayo de

luz, las células interaccionan con este causando dispersión de la luz, basándose

en la difracción de la luz en sentido frontal, se puede evaluar el tamaño de las

células que pasan y al medir la reflexión de la luz de manera lateral se evalúa la

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complejidad de estas. Además de la dispersión de la luz, previamente las

muestras de los cultivos celulares fueron colocadas en presencia de anticuerpos

monoclonales marcados con moléculas fluorescentes, para poder evaluar qué

células poseen los antígenos complementarios a los anticuerpos monoclonales

usados.

5. ANÁLISIS DE RATONES TRANSGÉNICOS:

(SOUTHERN-BLOT)

Para comprobar si un ratón transgénico es positivo en un determinado gen, es

necesario hacer una genotipificación. Para ello, podemos utilizar la técnica del Southern

Blot. Ésta técnica es usada para verificar la presencia o ausencia de una secuencia

nucleotídica específica, así como para identificar el tamaño del fragmento de restricción

que contiene dicha secuencia.

Los pasos a seguir son los siguientes:

1) Trituramos los fragmentos de las colas de ratón con unas tijeras dentro de un

eppendorf con una solución que contiene FORNACE, SDS 10%, EDTA 0,5 M y

Proteinasa K (PK). Esta solución va a digerir la muestra favoreciendo así la

absorción de DNA. Se deja toda la noche a 55ºC.

2) Al día siguiente se realiza un spin y se añaden 450 μl de fenol por Eppendorf.

3) Mix y centrifugación a 12000 rpm. A continuación, se pasa la fase superior a un

nuevo eppendorf con 500 μl de cloroformo.

4) Tras la centrifugación, la fase superior se pasa a otro eppendorf con 1000 μl de

etanol 100%.

5) Se centrifuga y se decanta el etanol. Añadimos 500 μl de etanol 70 % y de nuevo

centrifugamos y decantamos. Eliminamos el resto del etanol por pipeteo y

secado.

6) Se resuspende en 70 μl MPW y se deja 30 minutos a temperatura ambiente.

7) Se prepara la digestión con los siguientes reactivos por eppendorf:

27 μl DNA

4 μl DTT

4 μl S

4 μl 10x Carlos

1 μl enzima

8) Se incuba durante 4 horas a 37 ºC

9) Hacemos geles de agarosa al 1% con AGB1x como Buffer.

10) Se cargan las muestras en los pocillos y se corre a 35 Voltios durante 12 horas.

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11) Al día siguiente se pasa el gel a unas cubetas y con una pipeta Pasteur se añaden

unas gotas de Bromuro de Etidio, dejándolo actuar durante 5 minutos. A

continuación se lava el gel con agua destilada.

12) Se revela en la cámara ultravioleta.

13) Se realizan los siguientes lavados:

Con solución desnaturalizante durante 45 minutos

Con agua destilada

Con solución neutralizante durante 45 minutos

Con agua destilada

14) Se realiza la transferencia a una membrana. Para ello realizamos el siguiente

montaje:

Bandeja

Cristal

Filtros Whatman que

estarán en contacto

con la solución

Gel

Membrana de Nylon

Toallas absorbentes

Cristal

Peso

15) Al día siguiente, se someten las membranas a UV crosslink para fijar así el DNA

a su superficie.

16) Se realiza una prehibridación con 250 μl de esperma de salmón, 250 μl de Tris y

45 ml de Solución de Hibridación. Es necesario que el esperma esté a alta

temperatura para que se hibride con todo el DNA y así compita con la sonda

(con unión más específica). Para ello, se colocan los tubos en un horno a 65ºC

con rotores cilíndricos, en la que la

membrana está en contacto con la

solución de forma homogénea gracias

a la agitación constante.

17) Tras dos horas se añaden 250 μl de la

sonda a cada tubo de hibridación y se

deja durante toda la noche.

18) Al día siguiente se lava la membrana

con solución de lavado.

19) Se coloca la membrana en un casette

para que tenga lugar la exposición

durante varios días a temperaturas

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bajo cero. En el casette la radiactividad de la sonda se va a ir pasando a la

película fotográfica.

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En conclusión, la realización completa de esta técnica es bastante larga (cinco días),

pero tiene una alta eficacia.

PCR (Polimerase Chain Reaction)

Otra forma de comprobar si un ratón transgénico es positivo es mediante una

PCR. La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica cuyo objetivo es obtener un

gran número de copias de un fragmento de ADN específico, partiendo de un mínimo o

de una sóla copia de ese fragmento original. Por tanto, esta técnica nos permite

amplificar una secuencia concreta de ADN y así, determinar si un ratón es wild type

(+/+), heterocigoto o (-/-) para dicha secuencia.

Esta técnica se basa en la propiedad natural de las ADN polimerasas para replicar

hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas,

para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y,

a continuación, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para que vuelvan a duplicarlas.

Para que tenga lugar la replicación es necesario usar unos cebadores o primers

específicos. Estos primers son una pareja de oligonucleótidos sintetizados de

manera que sean complementarios a cada uno de los extremos del fragmento de ADN

que se desea amplificar.

Un ejemplo es la amplificación del gen Flpe en la que los reactivos utilizados son los

siguientes:

2,5 μl oligo Flpe-Fw

2,5 μl oligo Flpe-mu

2,5 μl dNTPs

2,5 μl MgCl2

2,5 μl Buffer

0,2 μl Taq polimerasa

11,3 μl MPW

1 μl DNA

Durante la reacción en cadena de polimerasa se distinguen varias etapas:

_ Inicialización. En esta etapa se produce la activación de las ADN polimerasas por

calor. Consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 ºC que se mantiene

durante 1-9 minutos.

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_Desnaturalización. Se separan las dos hebras del ADN aplicando una determinada

temperatura (94-95 ºC). La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalización

depende de la proporción de G+C que tenga la hebra, como también de su tamaño.

_ Alineamiento del cebador. El cebador se une a su secuencia complementaria en el

ADN molde. Para ello, es necesario bajar la temperatura a 50-65ºC durante 20-40

segundos, permitiendo así el alineamiento. La polimerasa une el híbrido de la cadena

molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN.

_ Extensión de la cadena. La ADN polimerasa, actúa tomando el ADN molde para

sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial

necesario para la síntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de

ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los dNTP‟s complementarios en

dirección 5'→ 3'. Para la Taq polimerasa, la temperatura de máxima actividad está en

75-80 ºC (comúnmente 72ºC). El tiempo de extensión depende tanto de la ADN

polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar.

_ Elongación Final. Se trata de una etapa única que se lleva a cabo a una temperatura de

70-74 ºC durante 5-15 minutos tras el último ciclo de PCR. Con ella se asegura que

cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado.

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Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean

técnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN generados en función de

su carga y su longitud.

En conclusión, esta técnica se puede realizar en un mismo día, aunque es menos eficaz

que el Southern Blot.

6. OBTENCIÓN DE ABL:

ABL es un proto-oncogén que codifica la proteína citoplasmática y nuclear

tirosín quinasa. Esta proteína está implicada en procesos de diferenciación celular,

división celular, adhesión celular y respuesta a estrés. Las mutaciones en este gen están

asociadas con la leucemia mielógena crónica (LMC). En la LMC se produce una

translocación cromosómica en la que se produce un nuevo gen de fusión BCR-ABL,

que codifica una quinasa desregulada que permite a las células proliferar sin un control

de las citocinas, lo cual da lugar a un evento canceroso.

TRANSFORMACIÓN DE E.coli CON EL PLÁSMIDO E1A2

El plásmido E1A2 presenta el protooncogén BCR-ABL p190 y un gen de resistencia

a ampicilina. Los pasos a seguir para la transformación de E.coli son los siguientes:

1) Sacar células competentes de E.coli del congelador y dejarlas a temperatura

ambiente o darle calor con las manos.

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2) Añadir 200 µl de células competentes a un eppendorf con 1 µl de plásmido. Lo

enfriamos durante treinta minutos en hielo para se enfríe lo suficiente y así

favorecer el choque térmico.

3) Dos minutos de choque de calor a 42 ºC, tras los cuales lo dejamos a

temperatura ambiente.

4) Se añade 400 µl de medio 2XTY y lo incubamos a

37 ºC durante treinta minutos.

5) Sembramos 5 µl y25 µl de células transformadas en

dos placas con ampicilina respectivamente.

6) Se incuban las placas a 37 ºC durante toda la noche.

OBTENCIÓN DEL PLÁSMIDO E1A2

Para obtener una mayor cantidad del plásmido E1A2 se lleva a cabo el protocolo

“Plasmid Midi-Preps”:

1) Inocular una colonia en 100 ml de medio 2XTY conteniendo 100 µg/ml de

ampicilina y crecer O.N. a 37ºC.

2) Centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente en 2 tubos

Falcon (50 ml/tubo). Decantar.

3) Resuspender el pellet en 10 ml totales de Lysis Solution (5 ml/tubo)

4) Añadir inmediatamente 10 ml/tubo de SDS alcalino. Mix por inversión hasta

que la solución aparezca homogénea. Incubar en hielo durante 5 minutos.

5) Añadir 7,5 ml/tubo de high salt solution (3M NaAc pH 4,8). Mix por inversión.

Incubar durante 5 minutos en hielo. El acetato sódico precipita en ADN

bacteriano, quedando así el ADN plasmídico en solución.

6) Centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente.

7) Filtrar el sobrenadante a través de un filtro de muslina doble. Cada sobrenadante

lo filtramos en un Falcon que contiene 1 volumen de isopropanol (20 ml).

Mezclar e incubar 15-20 minutos a temperatura ambiente.

8) Centrifugar a 3000 rpm durante 10 min a temperatura ambiente. Disolver los dos

pellets en 5ml totales de TE, de manera que juntamos los 2 pellets.

9) Añadir 5 ml 5M LiCl e incubar 15 minutos en hielo. El LiCl precipita en RNA

de alto peso molecular.

10) Centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos a temperatura. Añadir el

sobrenadante en un Falcon conteniendo un volumen de isopropanol (10 ml).

Incubar 15-20 minutos a temperatura ambiente.

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11) Centrifugar a 3000 rpm durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Resuspender el pellet en 850 µl de TE. Transferir a un tubo Eppendorf.

12) Añadir 4 µl de RNAasa 10 mg/ml. Incubar 15 min a 37 ºC.

13) Añadir ½ volumen (500 µl) de 2,5M NaCl/20% PEG. Mezclar bien e incubar en

hielo durante 5 minutos.

14) Centrifugar a 12000 rpm durante 5 min. Decantar y volver a centrifugar.

Eliminar el sobrenadante con punta amarilla. Resuspender con los dedos el

pellet en 500 µl TE o agua. Dejar 30 minutos a 37 ºC para resuspender mejor.

15) Extracción fenol, fenol-cloroformo, cloroformo:

a) Añadir 500 µl de fenol y

centrifugar a 12000 rpm durante 5

minutos.

b) Pasar la fase acuosa a Eppendorf

con 250 µl fenol/250 µl cloroformo

y centrifugar a 12000 rpm durante

5 minutos.

c) Pasar la fase acuosa a Eppendorf

con 500 µl cloroformo, y centrifugar a 12000 rpm durante 5 minutos.

16) Pasar la fase acuosa a un eppendorf con 1 ml Etanol/3M NaAc (24:1). Mix por

inversión.

17) Centrifugar a 12000 rpm durante 5-10 minutos y decantar. Lavar con 500 µl de

etanol al 70 %. Spin, retirar el etanol con una punta amarilla y dejar secar 10

min. Resuspender en 250-500 µl de agua en función de la cantidad de plásmido

obtenida.

18) Medir la densidad óptica a 260 nm y correr electroforesis en un gel de agarosa

al 1%. Para asegurar que tenemos plásmido, en el gel deberíamos observar tres

bandas pertenecientes al DNA relajado, enrollado y superenrollado. Otra forma

de medir la concentración sería con el uso de un Nanodrop.

19) Para comprobar la midi realizamos la siguiente digestión:

4 μl DNA

2 μl DTT

2 μl S

2 μl 10x Carlos

1 μl enzima MST II

9 μl MPW

Se incuba a 37ºC durante dos horas, tras las cuales se para la digestión

añadiendo 5 μl de LB 5x.

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20) Se carga en un minigel de agarosa al 1% y se corre a 60 V durante una hora.

PURIFICACIÓN DE ABL

Tras la digestión con MST II, obtenemos varias bandas de diferentes tamaños.

La banda que nos interesa es la que tiene un tamaño de 863 pb y que se corresponde con

el gen ABL. Este gen lo vamos a utilizar como sonda para el Southern Blot y así

genotipar a los ratones que han sido transformados con el protooncogén BCR-ABL

p190.

Para separar la banda de DNA del gel de agarosa se utiliza un kit comercial de

purificación. El protocolo del kit es el siguiente:

1) Cortar la banda de DNA del gel y transferirla a un eppendorf.

2) Incubar a 50ºC durante 10 minutos y agitar cada 3 minutos.

3) Añadir 250 µl de Binding Enhancer y mezclar. Pasar 800 µl de muestra a un

Spin Filter y centrifugar a 12000 rcf durante 1 minuto.

4) Añadir 500 µl de Wash Buffer y centrifugar durante 30 seg a 8000 g. Repetir

este paso.

5) Transferir el Spin Filter a un nuevo eppendorf y añadir 20 µl de Elution Buffer

directamente en el centro del Spin Filter. Incubar a temperatura ambiente 5-10

minutos y centrifugar 1 minuto a 8000 g.

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6) A continuación, comprobamos en un gel de agarosa al 1% que tenemos la banda

de interés purificada.

7. ANATOMÍA PATOLÓGICA:

Consiste en observar la presencia de tumores en ratones modificados

genéticamente que son utilizados como modelos de enfermedad de humanos. En primer

lugar, se observa macroscópicamente el aspecto de los distintos órganos y se cogen

muestras de todos ellos (bazo, riñón, hígado, intestino delgado, testículos, pulmón,

corazón, timo…). Estas muestras se ponen en Falcons con formaldehido para analizar

posteriormente microscópicamente.

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8. ACTIVIDADES COMPLEMENTARIAS

_ Seminarios:

Durante mi estancia en el laboratorio pude asistir a varios seminarios organizados por el

laboratorio13 y por el departamento de fisiología animal. Estos seminarios se realizaban

la mayoría de los viernes con una duración aproximada de 1 o 2 horas. En ellos, un

miembro del equipo de Isidro exponía los últimos resultados obtenidos de sus proyectos

de investigación. A continuación, los investigadores debatían sobre el tema expuesto e

intercambiaban sus diferentes opiniones de cómo mejorar los posibles fallos.

_ Journal Club:

Esta actividad consistía en una reunión semanal en la que los estudiantes que estuvimos

realizando prácticas en el laboratorio 13 comentábamos nuestro punto de vista sobre un

determinado artículo científico. Normalmente, Isidro elegía un artículo relacionado con

su línea de investigación y nos lo daba con una semana de anterioridad. En otras

ocasiones, fuimos nosotros los que escogimos el tema del artículo.

Los artículos que tratamos fueron los siguientes:

Cancer as a reprogramming-like disease: Implications in tumor development

and treatment

Cancer induction by restriction of oncogene expression to the stem cell

compartment

Retrospective birth dating of cells in humans

Increased cell proliferation and neurogenesis in the adult human Huntington’s

disease brain

9. CONCLUSIÓN:

La realización de estas prácticas me ha supuesto un gran enriquecimiento a nivel

personal y profesional. He llevado a cabo un gran número de técnicas que ya conocía y

otras que no, pero también he podido realizar miniproyectos que el doctor Isidro

delegaba en mi persona. Además, he aprendido a trabajar en un grupo de trabajo muy

bien organizado. Gracias a estas prácticas he podido conocer cómo es el mundo de la

investigación desde dentro.

Quería agradecerle al doctor Isidro la oportunidad que me dio de poder realizar estas

prácticas en su laboratorio durante este verano. Además, también estoy muy agradecido

a todo su equipo de trabajo que me han transmitido muchos de sus conocimientos y que

han hecho que me integrara rápidamente en su laboratorio.