obtenciÓn de inulina y oligosacÁridos ... -...
TRANSCRIPT
OBTENCIÓN DE INULINA Y OLIGOSACÁRIDOS DERIVADOS DE
LA ALCACHOFA TRABAJO DE FIN DE GRADO
LORENA FRAGOSO JARILLO 4°CURSO GRADO EN QUÍMICA, UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE
MADRID. TRABAJO REALIZADO EN EL INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN EN
CIENCIAS DE LA ALIMENTACIÓN (CIAL-CSIC)
TUTOR ACADÉMICO: JUAN JOSÉ LUCENA. TUTORES DE EMPRESA: ANTONIA MONTILLA Y FRANCISO
JAVIER MORENO.
ÍNDICE
1 ABSTRACT .......................................................................................................................................... 1
2 INTRODUCCIÓN .................................................................................................................................. 2
2.1 GESTIÓN DE RESIDUOS DE LA INDUSTRIA CONSERVERA DE LA ALCACHOFA (IMPORTANCIA
MUNDIAL Y EN ESPAÑA). COMPOSICIÓN DE LOS RESIDUOS. ............................................................... 2
2.1.1 LA ALCACHOFA COMO FUENTE DE INULINA. ..................................................................... 2
2.2 LA INULINA ................................................................................................................................. 3
2.2.1 BIOSÍNTESIS Y BIODEGRADACIÓN DE LA INULINA EN LAS PLANTAS. ................................. 4
2.2.2 ESTRUCTURA DE LA INULINA. ............................................................................................. 4
2.2.3 OBTENCIÓN DE INULINA Y OLIGOFRUCTOSA. .................................................................... 5
2.2.4 PROPIEDADES BIOLÓGICAS DE LA INULINA Y LA OLIGOFRUCTOSA. .................................. 7
3 OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO ....................................................................................................... 9
4 MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................................... 10
4.1 REACTIVOS Y MUESTRAS. ......................................................................................................... 10
4.2 EXTRACCIÓN DE INULINA ......................................................................................................... 11
4.3 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD INULINASA DE LOS PREPARADOS ENZIMÁTICOS
COMERCIALES. ..................................................................................................................................... 12
4.3.1 HIDRÓLISIS DE LA INULINA PRESENTE EN LOS EXTRACTOS .............................................. 12
4.4 MÉTODOS ANALÍTICOS ............................................................................................................. 12
4.4.1 MEDIDA DEL pH................................................................................................................. 12
4.4.2 EXTRACTO SECO. ............................................................................................................... 12
4.4.3 MÉTODO MILLER. .............................................................................................................. 13
4.4.4 MÉTODO DE BRADFORD PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA ................................ 13
4.4.5 MÉTODO DEL FENOL-SULFÚRICO ..................................................................................... 14
4.4.6 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS ....................................................................................... 14
4.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO ............................................................................................................. 16
5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................................................. 17
5.1 PROCESO DE EXTRACCIÓN DE INULINA ................................................................................... 17
5.2 CARACTERIZACIÓN DE LOS EXTRACTOS DE ALCACHOFA ......................................................... 18
5.2.1 CARACTERIZACIÓN GENERAL ............................................................................................ 18
5.2.2 CARACTERIZACIÓN DE LA FRACCIÓN DE CARBOHIDRATOS ............................................. 20
5.3 CUANTIFICACIÓN DE LA INULINA ............................................................................................. 25
5.3.1 HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA ................................................................................................... 25
5.3.2 CUANTIFICACIÓN DE LA INULINA PRESENTE EN LOS EXTRACTOS. ................................... 26
6 CONCLUSIONES FINALES ................................................................................................................. 27
7 BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................................. 28
1
OBTENCIÓN DE INULINA Y OLIGOSACÁRIDOS DERIVADOS DE LA
ALCACHOFA
1 ABSTRACT
Inulin is the most important natural storage carbohydrate in plants after starch. It is the main reserve
carbohydrate in global artichoke, an edible vegetable widely consumed in the Mediterranean diet. The
non-digestibility, low caloric value and fermentability properties of inulin are of great interest in food
and pharmaceutical fields.
The main objective of this work is the characterization and quantification of inulin from raw and
processed (blanched) artichoke industrial by-products, focusing on the effect of ultrasound in the
extraction.
Extraction of inulin was similar using either conventional or US extraction, although the latter was less
time-consuming (60 min vs. 15 min) and need lower temperature (80 °C vs. 60 °C) . The parameters
considered to evaluate the quality of extracts from these artichoke by-products were pH, protein, total
carbohydrates and reducing sugar content. As expected, both total carbohydrates and protein content
was lower for blanched samples. Moreover, Size-exclusion chromatography used to inulin
characterization showed a decrease in the low molecular weight carbohydrates content for blanched
samples, and the most abundant fragments derived from raw material had an estimated Mw lower
than 10 kDa. In addition, gas chromatography (GC) was also used for the analysis of the low Mw
carbohydrates (mono-, di-, tri-, tetra- pentasaccharides and poly-alcohols) present. At last, hydrolysis
of inulin with NS-22013 (with a previous test, it is proved that this enzyme had inulinase activity vs.
other enzymes which had only cellulase activity) was carried out to attempt to quantify the inulin
present in the extracts. GC was also used for the analysis of the released fructose and glucose to
evaluate the hydrolysis. However the selected enzyme or hydrolysis conditions were not adequate.
The main conclusion is that both extraction conditions are equally effective and a subsequent step of
purification is necessary.
2
2 INTRODUCCIÓN
2.1 GESTIÓN DE RESIDUOS DE LA INDUSTRIA CONSERVERA DE LA ALCACHOFA
(IMPORTANCIA MUNDIAL Y EN ESPAÑA). COMPOSICIÓN DE LOS RESIDUOS.
La alcachofa (Cynara scolymus L.) es un vegetal comestible, muy considerado desde épocas
prehistóricas por su sabor y propiedades terapéuticas para la salud humana, característico de la región
Mediterránea. El cultivo de alcachofa está ampliamente distribuido, con un área de cultivo de más de
120.000 Ha, y una producción de más de 1.000.000 t, la mayor parte, concentradas en la región
Mediterránea, con una producción anual de aproximadamente 670.000 t (Ruiz-Cano y col., 2014).
La parte comestible de la alcachofa, que supone entre el 10 y el 40% del peso total, es denominada
capitulum o cabeza, y se encuentra protegida por las brácteas (hojas carnosas). Éstas junto a los tallos,
que son descartados para el consumo humano, constituyen la mayor parte de los residuos, que en la
actualidad se utilizan para la obtención de energía renovable (Lattanzio y col., 2009; Pandino y col,
2011), y, en menor medida, en la industria farmacéutica y alimentaria, donde se lleva a cabo la
extracción de inulina y de otros principios activos como ácidos fenólicos, ácido clorogénico y/o
derivados flavonoides. Por este motivo, estos residuos constituyen un recurso valioso y renovable de
biopolímeros y componentes bioactivos. Esto hace que su utilización pueda contribuir, no sólo a
reducir la contaminación, sino también puede suponer un valor añadido para la producción de este
vegetal (Fissore y col., 2014).
2.1.1 LA ALCACHOFA COMO FUENTE DE INULINA.
La inulina es el carbohidrato de reserva más importante en la alcachofa. La alcachofa sintetiza
moléculas de inulina con una longitud de cadena de hasta 200 unidades, siendo el más alto grado de
polimerización (GP) conocido para la inulina en las plantas (Lattanzio y col, 2009). López-Molina y col.
(2005) extrajeron una alta cantidad de inulina en los residuos de las brácteas de la alcachofa, el cual
estaba en disolución acuosa y fue filtrado, concentrado (ultrafiltración, 10000 NMWCO), precipitado y
separado por filtración, obteniendo así un GP medio de 46, más alto que el encontrado en otras
plantas que contienen inulina como la alcachofa de Jerusalén (Heliantus tuberosus), la achicoria
(Cichorium intybus), la dahlia (Dahlia pinnata) y yacón (Polymnia sonchifolia).
3
La inulina extraída de la alcachofa es moderadamente soluble en agua (máximo un 5% a temperatura
ambiente), tiene un sabor suave, neutro, sin ningún flavor1 ni regusto y es poco dulce. Además, se
combina fácilmente con otros ingredientes sin modificar flavores (Lattanzio y col, 2009).
2.2 LA INULINA
Valentin Rose, científico alemán, fue el primero en aislar un carbohidrato procedente de las raíces de
la Inula helenium, a la que debe su nombre, a principios del siglo XVIII. Esta sustancia fue llamada
inulina, en 1817, por un científico británico, Thomson (Apolinário y col., 2014).
La inulina se encuentra en especies perteneciente a la familia Asteraceae, incluyendo especies muy
bien estudiadas, y nombradas anteriormente, como la achicoria, la alcachofa de Jerusalén, la
alcachofa, dandelion (Taxacum officinale) y yacón (Moser y Wouters, 2014).
La inulina es considerada el carbohidrato de reserva más abundante, después del almidón (Singh Ram
S. y Singh Rupinder S., 2010), y es altamente soluble en agua, lo que permite que en las plantas sea
una alternativa de almacenamiento de carbohidratos en las vacuolas, llegando a representar
aproximadamente el 15% de las plantas (Lattanzio y col., 2009). Presenta las siguientes características:
es no digerible, con bajo poder calórico y mientras su poder edulcorante y su solubilidad son variables
dependiendo de su masa molecular. Por sus características se considera parte de la fibra alimentaria
soluble y gran número de estudios avalan su carácter prebiótico.
En cuanto a sus aplicaciones, además de como ingrediente prebiótico, en la industria alimentaria
puede servir como sustituto a los azúcares y grasas, con un menor poder calórico y un mayor
contenido en fibra, lo que contribuye a mejorar el funcionamiento del sistema gastrointestinal
(Apolinário y col., 2014). En la industria farmacéutica es administrada como fármaco oral para
problemas en el colon al disminuir la velocidad de absorción de drogas, lo que mitiga los efectos
adversos de las mismas en el estómago y para el tratamiento de los primeros síntomas en
enfermedades como el cáncer (Barclay y col., 2012).
1Flavor: es la impresión sensorial sobre gusto y olfato de los alimentos u otras sustancias, y se determina mediante análisis
sensorial.
4
2.2.1 BIOSÍNTESIS Y BIODEGRADACIÓN DE LA INULINA EN LAS PLANTAS.
La inulina es sintetizada a partir de una molécula de sacarosa (disacárido formado por glucosa y
fructosa). Edelman y Jefford (1986) identificaron dos fructosiltransferasas, las cuales actúan de forma
conjunta para producir inulina: la primera es una sacarosa: sacarosa-1-fructosiltransferasa (1-SST) que
transfiere una unidad de fructosa de la sacarosa a otra sacarosa, produciendo 1-kestosa (G-F-F) y
glucosa. Para alargar la cadena de inulina, es necesaria la actividad de la segunda fructosiltransferasa.
Así la fructano: fructano 1-fructosiltransferasa (1-FFT) cataliza la reacción reversible para transferir una
unidad de fructosa de una molécula de inulina a otro fructano tipo inulina.
La tercera enzima en juego, es la encargada de la biodegradación de la inulina: Fructano-1-
exohidrolasa (1-FEH), que cataliza la hidrólisis de la inulina. En este caso, la molécula aceptora es el
agua y se produce la hidrólisis del enlace entre dos fructosas (Moser y Wouters, 2014).
2.2.2 ESTRUCTURA DE LA INULINA.
La inulina presenta una estructura simple, ya que es una cadena formada por un número variable
unidades de fructosa, unidas por enlace β-(21), normalmente terminadas en una unidad de glucosa
unida a través de un enlace α-D-glucopiranosil (12), formando una molécula de sacarosa
(Apolinário y col., 2014).
Figura 1. Estructura de la inulina: a) β-D-glucopiranosil (molécula de glucosa terminal) y b) β-Fructopiranosil (molécula de fructosa).
Es el enlace β-(21), descrito anteriormente, el más importante en la estructura de la inulina, ya que
es responsable de la no digestibilidad de la inulina y, por tanto, bajo poder calórico, y de su carácter
prebiótico.
5
El GP, es decir, la longitud de la cadena de inulina, depende de diferentes factores como son el tipo de
planta, las condiciones de crecimiento de ésta, el estado de madurez y el tiempo de almacenamiento
después de la cosecha. Por ejemplo, la inulina de la achicoria tiene un GP relativamente bajo, los más
altos grados de polimerización son los encontrados en la alcachofa, el cardo (Echinops ritro L.) y la
Viguiera discolor. Este factor influye en las propiedades de esta sustancia. Las fracciones cortas
(oligofructosa) presentan una mayor solubilidad y son más dulces que la inulina natural y fracciones
largas, siendo estás además más viscosas y termoestables que la inulina natural (sin fraccionamiento),
ya que en el producto extraído están presentes cadenas de distinto GP. Otras propiedades físico-
químicas que se ven influidas por el GP son el punto de fusión, la temperatura de transición vítrea, la
capacidad de formación de gel y la consistencia de los mismos (Apolinário y col., 2014).
2.2.3 OBTENCIÓN DE INULINA Y OLIGOFRUCTOSA.
La extracción, fraccionamiento y caracterización de la inulina sigue siendo un reto de investigación.
Por una parte, se estudian fuentes alternativas de inulina y, por otra, muchas investigaciones han sido
desarrolladas para optimizar la extracción, estudiando los factores más importantes, como son la
temperatura, el tiempo de extracción y la proporción de disolvente/sólido (Apolinário y col., 2014).
2.2.3.1 Métodos físico-químicos.
Los métodos más usados para la extracción de la inulina utilizan agua caliente como disolvente, con
pequeñas diferencias de temperatura (80-85°C), durante tiempos de extracción que suele ser de 1
hora, aunque este factor depende de la planta de la que se extrae, el tamaño de partícula, etc. Para la
alcachofa, se utiliza agua destilada a 80°C a un pH de 6.8 para evitar la hidrólisis de la inulina que
puede tener lugar a valores de pH inferiores a 6 (Saengthongpinit y Saijaanantakul, 2005).
Por otra parte, recientemente se ha desarrollado un método de extracción asistido por ultrasonidos
para mejorar la recuperación de esta sustancia. Las variables independientes que influyen con esta
técnica de sonicación, son la frecuencia, la potencia, la amplitud y el tiempo de tratamiento. No
obstante, algunos fragmentos de bajo peso molecular, pueden ser formados directamente por la
acción de los ultrasonidos ocasionando cambios en la composición química de la inulina. El uso directo
con sonda es el que produce una mayor despolimerización de la inulina, por lo que puede ser más
adecuado llevar a cabo una sonicación en un baño de ultrasonidos (Apolinário y col., 2014).
6
Después de la extracción, se lleva a cabo la recuperación de la inulina, precipitándola, para ello se baja
la temperatura o se usan diferentes disolventes. No obstante, hay varios métodos, entre los que se
pueden destacar, a continuación, dos de ellos:
i) el extracto de inulina, previamente concentrado por evaporación y a baja temperatura, se
enfría o congela, se centrifuga y el precipitado se seca rápidamente;
ii) el extracto de inulina se precipita mediante disoluciones acuosas de disolventes orgánicos.
(Apolinário y col., 2014).
2.2.3.2 Métodos enzimáticos.
Las inulinasas han sido objeto de estudio debido a que se usan para la producción de jarabe de
fructosa de etanol, acetato, butano, pululanos, glucosa, ácido glucónico y sorbitol. Actualmente
despiertan especial interés para la obtención de oligofructosa. La inulina puede ser parcialmente
hidrolizada por endoinulinasas para producir estos oligosacáridos que son más solubles y dulces que el
polisacárido de partida, mientras mantienen las propiedades prebióticas. El conjunto de estas
propiedades hace que estas sustancias tengan gran interés y sea necesario desarrollar procesos
eficientes para la obtención de las mismas (Singh Ram y Singh Rupinder, 2010).
Los fructooligosacáridos (FOS) representan una de las principales clases de oligosacáridos
bifidogénicos (oligosacáridos que estimulan selectivamente el crecimiento y/o actividad de
bifidobacterias y lactobacilos en el colon). Los desarrollos en enzimología industrial hacen posible la
producción a gran escala de FOS por síntesis enzimática.
A escala industrial, son producidos por dos procesos que dan lugar a productos finales con pequeñas
diferencias:
1) Mediante reacciones de transferencia entre moléculas de sacarosa. Las enzimas encargadas son las
β-fructosidasas, con actividad fructosiltransferasa (FTases). En este tipo de reacción la sacarosa actúa
como fructosa donadora y aceptora (Rastall, 2010) y es necesaria una alta concentración inicial de
sustrato para que la reacción sea eficiente (Balken y col., 1991; Hyashi y col.; 1993; Park y col., 1991).
La primera reacción de la β-fructosidasa con dos moléculas de sacarosa da lugar a una kestosa y una
glucosa. La siguiente reacción con la kestosa, produce nistosa y así se va ampliando la cadena
sucesivamente.
7
2) Mediante la hidrólisis de la inulina por endoinulinasas, estas actúan de forma aleatoria hidrolizando
los enlaces β-2,1 de la inulina para producir FOS que contienen una mezcla de β-D Fructosa (21)-[β-
D-Fru-(21)-]n, donde n=1-9, y α-D-Glu-(12)-[β-D-Fru-(21)-]n, donde n=2-9. Estos últimos tienen
la misma estructura que los obtenidos mediante transfructosilación de la sacarosa mediante FTases
(Sangueetha y col., 2005). Sin embargo, la longitud de la cadena de los FOS es más larga, cuando se
forman por hidrólisis con la inulinasa que cuando se producen por el proceso de transfructosilación.
(Rastall, 2010).
2.2.4 PROPIEDADES BIOLÓGICAS DE LA INULINA Y LA OLIGOFRUCTOSA.
No digerible:
Las enzimas humanas no pueden hidrolizar los enlaces β-(2-1) de la inulina. Como resultado, estos
ingredientes alcanzan el colon, formando parte del complejo de fibra dietética soluble. Esto se probó
en estudios con humanos, mediante el modelo de ileostomía2 (Ellegard y col., 1997) y con una técnica
de intubación que se llevó a cabo en voluntarios (Molis y col., 1996). En el modelo de ileostomía,
fueron administradas cantidades de 17 g de inulina u oligofructosa pura con una recuperación del 88%
y 89% respectivamente. En el modelo de intubación, fueron ingeridos 20 g de oligofructosa y se
obtuvo un 89% de recuperación en el íleon distal3. La pequeña pérdida del 10% puede ser debida a la
hidrólisis de los enlaces entre la glucosa y la fructosa de la molécula de sacarosa, una muy limitada
absorción de las cadenas pequeñas y/o una mínima fermentación de inulina y oligofructosa por la
población microbiana en el íleon. (Roberfroid, 2005a).
Fermentabilidad:
Una vez que la inulina y la oligofructosa alcanzan el colon, órgano donde tienen lugar los procesos de
fermentación, son metabolizados por la microbiota sacarolítica, predominante en la parte ascendente
o próxima al colon. Como parte de esta microbiota se incluyen las bifidobacterias y los lactobacilos,
microorganismos beneficiosos considerados probióticos. La fermentación de la inulina origina un
incremento de producción de ácidos grasos de cadena corta (AGCC). Esto se ha podido comprobar en
distintos estudios in vitro, en modelos animales (Kleessen y col. ,2001; Nilsson y Nyman, 2005) y en
2 Se desviaron las heces fecales a través de una abertura del íleon creada mediante cirugía. El desecho se recolecta en una
bolsa unida a la piel mediante un adhesivo especial. 3Es la parte final del intestino delgado.
8
humanos (Beards y col, 2010; Stewart y col., 2008,). La velocidad de fermentación depende de la
longitud de la cadena, siendo más rápida en cadenas cortas (Baeten, 1999; Stewart y col., 2008).
Efecto prebiótico
El concepto de prebiótico fue introducido por los profesores Gibson y Roberfroid en el año 1995,
actualizado en 2004 (Gibson y col., 2004b) y volvió a ser revisado en 2010 (Gibson y col., 2010).
Atendiendo a estas definiciones, se conoce como prebiótico a aquellos “ingredientes que producen
una estimulación selectiva del crecimiento y/o actividad(es) de uno o de un limitado número de
géneros/especies de microorganismos en la microbiota intestinal confiriendo beneficios para la salud
del hospedador” (Corzo y col., 2015).
Atendiendo al consenso científico sobre prebióticos, se indica que para que un ingrediente alimentario
o alimento sea prebiótico es necesario que cumpla ciertos requerimientos como son:
i) No ser hidrolizado o absorbido en el tracto gastrointestinal (TGI) superior (esófago,
estómago y duodeno) y, por lo tanto, ser resistente a la acidez gástrica, a la hidrólisis por
enzimas digestivas y no absorberse en el intestino delgado;
ii) Ser fermentado selectivamente por bacterias beneficiosas de la microbiota intestinal.
iii) Ser capaz de inducir efectos fisiológicos beneficiosos para la salud.
Es esta función prebiótica la que ha despertado un creciente interés por la inulina, ya que hace
que tenga efectos positivos en la salud, semejantes a los que presentan la fibra dietética, lo que
supone una disminución de los niveles lipídicos y glucosa en sangre y una mejora del tránsito
intestinal. Además, también presenta un incremento de la absorción de minerales a nivel del
intestino grueso, probado en investigaciones con ratas y humanos, donde se ha detectado un
incremento en la absorción de calcio y otros minerales (como magnesio), cuando se usa inulina y
sus derivados en la dieta, con consecuencias positivas en el contenido en calcio de los huesos y en
la densidad de los mismos (Greger, 1999; Robertfroid, 2002). Además, se ha demostrado en
modelos animales (ratas) que la administración de prebióticos disminuye el desarrollo del cáncer
de colon. Aunque el mecanismo de acción no está elucidado, esta capacidad
preventiva/terapeútica podría deberse a dos factores: el aumento de los AGCC
(fundamentalmente, butirato) y la disminución de la proliferación de las enzimas envueltas en la
9
patogénesis del cáncer (Pietro y col., 2002). También, se ha observado una inhibición del cáncer
mamario en ratas, cuyas dietas han sido suplementadas por inulina (Taper y Robertfroid, 1999).
Además, también ha sido demostrado un efecto anti melanoma por el consumo de inulina
(Delzenne y Williams, 2002). Todo esto hace que la inulina sea recomendada como factor
adyuvante en las terapias de tratamientos del cáncer (Robertfroid, 2005). Finalmente, existen
otras posibles funciones positivas de la inulina como son el aumento a la resistencia a infecciones
intestinales, atenuación de enfermedades inflamatorias del intestino, o estimulación del sistema
inmune con la consecuente resistencia a infecciones (Robertfroid, 2005).
3 OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO
La gestión de un gran volumen de subproductos generados en la industria conservera de la
alcachofa, que representa más del 60% de la parte comestible, supone un problema importante,
económico y medioambiental. Estos subproductos podrían ser fuentes muy adecuadas para la
obtención de inulina, polisacárido de reconocido carácter prebiótico, con alto valor añadido, que
permitiría su revalorización sostenible. Por otro lado, el mercado global de alimentos funcionales,
donde este carbohidrato tiene grandes posibilidades, está creciendo considerablemente
representando una gran oportunidad para desarrollar ingredientes funcionales derivados de la
alcachofa. El auge de este tipo de alimentos se debe al aumento de la incidencia de algunas
enfermedades crónicas de cierta gravedad relacionadas con la ingesta excesiva de calorías y los
hábitos de vida sedentarios. Por todo ello, conseguir ingredientes bioactivos que tenga un
impacto positivo en la salud podría reducir el uso de fármacos y suponer un avance en el campo
de la alimentación.
En este sentido, el objetivo principal del trabajo es la obtención, cuantificación y caracterización
de inulina a partir de subproductos industriales del procesado de alcachofa y el efecto de los
ultrasonidos sobre dicha extracción.
Para alcanzar este objetivo, se desarrolla el siguiente plan de trabajo, presentado de
forma esquemática en la Figura 2:
En primer lugar, se extrae la inulina a partir de subproductos de la alcachofa cruda o sometida a
un pretratamiento de escaldado, con o sin asistencia de ultrasonidos.
10
Se realiza la caracterización de los extractos, determinando su contenido en: i) carbohidratos
totales, ii) carbohidratos de baja masa molecular, iii) inulina incluyendo su masa molecular y su
composición monomérica.
Por último, se desarrolla un método de cuantificación de la inulina extraída. Para ello será
necesario evaluar la actividad inulinasa de diversos preparados multienzimáticos comerciales.
Figura 2. Plan de trabajo llevado a cabo en la presente memoria.
4 MATERIALES Y MÉTODOS
4.1 REACTIVOS Y MUESTRAS.
En el presente trabajo, se utilizan los siguientes reactivos: Raftiline (Beneo ORAFTI, Active food
ingredients), como inulina comercial; reactivos para la preparación del Bradford (Bio-Rad,
Laboratorios Gmbh, Múnich, Alemania); fosfato monosódico y fosfato disódico; utilizados para la
preparación del tampón buffer (pH 6,5; 0,05 M) y D-fructosa (Sigma Aldrich).
Los preparados enzimáticos, procedentes de Novozymes, utilizados durante este trabajo fueron: NS-
22013 (inulinasa); Celluclast, procedente de Trichoderma reesei (β-glucosidasa, xilanasa); Ultraflo,
11
procedente de Humicola insolens (enduglucanasa, celulasa, xilanasa); Viscozyme Barley, procedente
de Aspergillus sp. (amilasa, celulasa) y pectinasa, procedente de Aspergius niger.
Como muestras se utilizan distintos subproductos de alcachofa (brácteas externas y tallo)
procedentes de alcachofa cruda, una adquirida en 2015 en un comercio de Madrid (ACC15), otra
procedente de una industria conservera (Gutarra®, Villafranca, Navarra) de 2016 (ACI16), y de
alcachofas escaldadas de la misma industria de dos temporadas, 2015 (AEI15) y 2016 (AEI16). Todas
las muestras son previamente liofilizadas y conservadas en congelación hasta su uso.
4.2 EXTRACCIÓN DE INULINA
Para la extracción de inulina las muestras anteriormente indicadas se muelen en un molino de
cuchillas (Retsch Grindanix, 3 minutos, 10000 rpm) y se tamizan seleccionando las partículas con un
tamaño inferior a 500 µm.
Como se refleja en el plan de trabajo la extracción de inulina se realiza en buffer fosfato (0,05 M, pH
6,5) a una concentración de sólidos de 50 mg/mL (p/v), utilizando dos sistemas:
Extracción en placa calefactora y agitadora: El buffer se mantiene a 80°C durante 10 minutos y
se añade a la muestra en las cantidades adecuadas, para tener una concentración de sólidos
de 50 mg/mL (p/v). La extracción se realiza a esa temperatura durante 60 min y con agitación
de 500 rpm.
Extracción asistida por ultrasonidos (US): El efecto de los US sobre la extracción se estudia en
un baño de US, con una frecuencia de 45 kHz, densidad de frecuencia 0.04 W/cm3 (Gamboa-
Santos y col., 2012) y con control de temperatura (60 ± 1°C) (Sonica Sweep System EP 2200,
Soltec, Italia). Se realiza un precalentamiento del buffer a 60°C, durante 10 minutos, se añade
a la muestra y se deja en el baño durante 15 minutos, a 60°C, controlando continuamente la
temperatura.
Las muestras una vez extraídas se dejan enfriar en agua-hielo, y se centrifuga (7000 rpm, 10 minutos),
recogiendo el sobrenadante que es utilizado para las diferentes determinaciones analíticas.
12
4.3 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD INULINASA DE LOS PREPARADOS
ENZIMÁTICOS COMERCIALES.
La actividad inulinasa se determina mediante el método Miller o método del ácido 3,5-
dinitrosalicícilico (DNS), el cual mide el incremento del poder reductor producido durante la hidrólisis
de la inulina. El fundamento del método será tratado posteriormente (4.4.3).
Para estos ensayos, se utiliza inulina comercial conocida como Raftiline®, preparada al 10% (p/v) en
tampón fosfato 0,05 M, pH 6.5.
En primer lugar se realiza una determinación cualitativa de la actividad de los preparados enzimáticos
nombrados en el apartado 4.1, para ello a 1 mL de Raftiline se le añaden 10 μL del enzima, se incuba a
50 °C durante 1 hora y se inactivan en agua en ebullición durante 5 minutos.
A continuación, la determinación cuantitativa de la actividad inulinasa se lleva a cabo en las enzimas
que en el ensayo anterior la habían presentado: NS-22013 y Viscozyme Barley. Esta determinación
presenta ciertas variaciones. Se toma 1 mL de Raftiline, se mantiene a 50°C durante 15 minutos y se
añaden 10 μL de enzima, se incuba a 50°C, durante 2 y 5 minutos e inmediatamente se añaden 1 mL
de DNS para parar la reacción de forma instantánea.
4.3.1 HIDRÓLISIS DE LA INULINA PRESENTE EN LOS EXTRACTOS
A 1 mL de los extractos de alcachofa obtenidos se añaden 50 µL de enzima inulinasa (NS-22013), y se
incuban a 50°C durante 24 h, para que la hidrólisis de la inulina sea máxima. Tras este período de
incubación, la enzima inulinasa se inactiva en agua en ebullición durante 5 minutos.
4.4 MÉTODOS ANALÍTICOS
4.4.1 MEDIDA DEL pH.
La medida del pH de los extractos se lleva a cabo mediante la utilización de un pH-metro equipado
con un electrodo Mettler (Toledo, inLab® 420).
4.4.2 EXTRACTO SECO.
Para esta determinación se pesan exactamente 200 ± 5 mg de las cuatro muestras y se lleva a
sequedad a 102°C en una estufa hasta peso constante (3 días). Esta determinación se lleva a cabo por
duplicado.
13
4.4.3 MÉTODO MILLER.
El método Miller o método del ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS), es utilizado en este caso para medir el
poder reductor producido durante la extracción de la inulina y la determinación de la actividad
inulinasa de las enzimas.
Los azúcares reductores poseen un grupo carbonilo libre que, en medio alcalino, es capaz de reducir
un grupo nitro del DNS (reactivo que tiene color amarillo), para dar lugar al ácido 3-amino-5-
nitrosalicílico (de color rojo ladrillo) cuya formación puede determinarse espectrofotométricamente a
560 nm.
El procedimiento experimental de este método es el siguiente:
1°) Se toman 100 µL de la reacción enzimática y se añaden 100 µL de DNS4. Se agita con vortex, para
asegurarnos que se mezcla bien y se centrífuga brevemente.
2°) Se desarrolla la reacción durante 5 minutos con agua en ebullición y se produce el cambio de color
amarillo a rojo si hay azúcares reductores presentes.
3°) Se enfría rápidamente con hielo y se añaden 750 µL de agua (o la cantidad correspondiente a 7,5
volúmenes de reactivo DNS). Para evitar la interferencia en muestras turbias se vuelve a centrifugar (2
min, 10000 rpm). Se ponen 300 µL de muestra en una placa multipocillos y se determina
espectrofotométricamente (KC Junior, DNS 560).
En todos los casos se prepara una muestra control en las mismas condiciones. Y la cuantificación se
realiza utilizando una recta de calibrado con patrones de fructosa, con un intervalo de
concentraciones entre 0,05-5,00 mg/mL. Los ensayos se realizan por duplicado
4.4.4 MÉTODO DE BRADFORD PARA LA DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA
El método Bradford consiste en la utilización de un colorante hidrofóbico (azul de Coomassie, BioRad
Proteín Assay Dye Reagent), cuyas disoluciones acuosas en presencia de ácido fosfórico tienen un
color pardo y que, al encontrarse en el entorno hidrofóbico al unirse a la proteína, origina un color
azul intenso que se puede medir a 595 nm (Bradford, 1976).
4 Las cantidades son orientativas, lo importante es que las proporciones entre la muestra y el reactivo sean las adecuadas,
en este caso, 1:1.
14
En primer lugar, se lleva a cabo una preparación de patrones de seroalbúmina bovina (BSA), en un
intervalo de concentraciones de entre 0,08-1,60 mg/ml de la que se obtiene una recta de calibrado
que se utiliza como referencia para extrapolar las concentraciones de las muestras.
La determinación se realiza tomando 30 µL de patrón o muestra y se añaden 600 µL de reactivo
Bradford (realizando blancos en cada caso). La reacción se desarrolla durante 5 minutos en oscuridad.
La lectura se realiza en una placa multipocillos a 595 nm (Lector KC Junior, Biotek).
Hay que tener en cuenta que el Bradford se degrada con la luz, y el color es estable 1 hora.
4.4.5 MÉTODO DEL FENOL-SULFÚRICO
Para la determinación de los carbohidratos totales, se lleva a cabo el método del fenol sulfúrico
siguiendo el método de Dubois y col. (1956) modificado por Chow y col. (2004). Se realiza una dilución
1:30 de las muestras, debido a que el intervalo de sensibilidad del método es de 10-100 µg/mL, si se
sale de este intervalo, los datos de absorbancia obtenidos serán raros y no fiables. A continuación, se
toma 0,2 ml de muestra, se añaden 0,4 ml de fenol al 2% (muestras) o de agua (blancos) y se añade
lentamente 1 ml de H2SO4 concentrado. Se deja enfriar durante un tiempo aproximado de 30 minutos
y se pone en una placa multipocillos (3 pocillos por muestra) y se mide la absorbancia a 480 nm (KC
Junior, Turbidez 480). La cuantificación se realiza construyendo una recta de calibrado con fructosa a
concentraciones entre 10-100 µg/mL.
4.4.6 MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS
Cromatografía de líquidos de exclusión molecular (HPLC-SEC):
o Con detección por índice de refracción (HPLC-SEC-RID):
La determinación de la masa molecular (Mw) de los carbohidratos presentes en las muestras se
realiza mediante HPLC-SEC en un equipo Agilent 1200 Infinity LC System 1260 con detector de índice
de refracción (RID, Boeblingen, Alemania). Se utilizan dos columnas en serie, una TSKgel G5000PWXL
de dimensiones 7,8 mm x 30 cm y fase estacionaria polimetacrilato hidroxilado, con un tamaño de
partícula de 10 µm y otra TSKgel G2500PWXL semejante a la anterior, pero con un tamaño de
partícula de 6 µm (Tosoh Bioscience Stuttgart, Alemania). La fase móvil empleada, donde se disuelven
las muestras, es cloruro sódico (NaCl) 0.1 M a un flujo de 0,5 mL/min. Para evitar interferencias
durante el análisis cromatográfico, al ser muestras que presentan color se pretratan con reactivo
15
clarificante Carrez, con este fin se añaden 20 µL de Carrez I, 20 µL de Carrez II, 360 µL de H2O y 400 µL
de muestra, se agita y se deja reposar 30 minutos, se centrifuga durante 5 minutos a 10000 rpm. Estas
disoluciones se hacen pasar por un filtro PVFD de 0.45 µm (Agilent Technologies Inc.), inyectándose
posteriormente 50 µL en el sistema cromatográfico. La adquisición y el procesado de datos se llevan a
cabo utilizando el software Agilent ChemStation (Agilent Technologies, Boeblingen, Alemania).
Para el cálculo de la Mw de las muestras, se utiliza como referencia una mezcla de patrones de
pululanos (Sigma) de Mw 805, 212, 47,3, 10,0, 13,2 y 0,342 kDa. A partir de estos patrones, utilizando
el volumen de elución (mL) y el logaritmo de Mw se obtiene una recta de calibrado, mediante la cual
se puede estimar la Mw de los compuestos presentes en las muestras de alcachofa.
o Con detector evaporativo de dispersion de luz (HPLC-SEC-ELSD):
Las mismas muestras, diluidas 1/10 en la fase móvil, se analizan en el mismo sistema cromatográfico
sustituyendo el detector RID por un detector ELSD (Agilent 1290). La fase móvil empleada es acetato
amónico (AcNH4) 0,01 N de pH neutro a un flujo de 0,5 mL/min.
Cromatografía líquida de interacción hidrofílica (HILIC):
Para determinar el contenido en fructosa y glucosa de los extractos obtenidos se puede utilizar la
cromatografía en modo HILIC. El equipo utilizado fue el mismo del apartado anterior con detector RID.
La columna utilizada en este caso es Kromasil NH2 con unas dimensiones de 250 mm x 4,6 mm con
tamaño de partícula 5 µm (Alltech). La elución de los carbohidratos, se utiliza en isocrático y la fase
móvil utilizada es acetonitrilo/agua (75:25) a un flujo de 1 mL/min. Las muestras se diluyen a la mitad
con acetonitrilo, con una concentración final de 25 mg/ml, se filtran como en el caso anterior,
utilizando filtros de PVDF de 0,45 µm, inyectándose posteriormente en el cromatógrafo 50 µL. Los
datos se procesan en el software Agilent ChemStation.
Cromatografía de gases (GC)
La técnica de GC se utiliza para determinar en los extractos tanto los carbohidratos presentes con un
grado de polimerización < 6 como los niveles de fructosa y glucosa liberadas tras la hidrólisis
enzimática de inulina. El cromatógrafo de gases utilizado, GC7890A está provisto de un detector de
ionización de llama (FID) y un inyector automático 7693A (Agilent Technologies Inc., Palo Alto,
California, USA).
16
La baja volatilidad de los carbohidratos hace necesario realizar un pretratamiento de derivatización.
En este caso, se preparan los trimetilsilil derivados de las oximas de los carbohidratos. Para preparar
estos derivados, previamente, se toman 200 µL de la muestra preparada con una concentración de 50
mg/mL, se añaden 0,2 mg de β-fenil-glucósido, utilizado como patrón interno y se evaporan hasta
sequedad en rotavapor a 40 °C. Para la formación de oximas, siguiendo el método de Brobst y Lott
(1966), a la muestra evaporada se le añaden 250 µL de disolución de cloruro de hidroxilamina al 2,5 %
en piridina, y se mantiene a 70 °C en estufa durante 2 etapas de 15 minutos con agitación al finalizar
cada una. Posteriormente, para formar los trimetilsilil derivados, se añaden 250 µL de
hexadimetildisilazano (HMDS) y 25 µL de ácido trifluoroacético (TFA), manteniéndose a 50 °C durante
30 minutos. Finalmente, las muestras se centrifugan durante 2 minutos a 10000 rpm recogiendo el
sobrenadante en un vial para su posterior análisis por GC.
El análisis de los carbohidratos se lleva a cabo utilizando una columna capilar de sílica DB-5HT (15 m x
0,32 mm x 0,10 µm) (J&W Scientific, Folson, California, USA). La temperatura del inyector y detector
son 280 y 380 °C, respectivamente. La temperatura inicial del horno 180°C con una rampa de
temperatura de 3°C/min hasta 200°C para las muestras hidrolizadas con inulinasa, y hasta 380°C
manteniéndose a esta temperatura durante 5 minutos para las muestras de extracción. La inyección
de la muestra se realiza en modo Split 1:30. El gas portador utilizado es N2 a un flujo de 1 mL/min.
El análisis cuantitativo se realiza mediante el método de patrón interno calculando los factores de
respuesta de los distintos carbohidratos respecto al β-fenil-glucósido, utilizado como patrón interno.
Para ello se preparan disoluciones de patrones de glucosa, fructosa, sacarosa, rafinosa y estaquiosa
como mono, di, tri y tetrasacárido y se realizan mezclas a distintas concentraciones (entre 0.02 a 2
mg/mL). La preparación de estas mezclas y el análisis por GC se realiza por duplicado. La adquisición y
el procesado de los datos se realiza con el software Agilent ChemStation en todos los casos. Los
factores de respuesta obtenidos fueron fructosa y glucosa 0,68; sacarosa 0,93; rafinosa 1,53 y
estaquiosa 1,63.
4.5 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los resultados se evaluaron estadísticamente mediante análisis de varianza (ANOVA) que calcula si
hay diferencias significantes entre grupos, y Turkey, que indica que grupos tienen estas diferencias
cuando P < 0,05 (IBM SPSS Statistics, 2014).
17
5 RESULTADOS Y DISCUSIÓN
5.1 PROCESO DE EXTRACCIÓN DE INULINA
Para determinar la eficacia del proceso de extracción de forma simple y comparativa se cuantifican los
carbohidratos extraídos de las muestras de alcachofa en las dos condiciones de extracción, mediante
la determinación de los azúcares reductores con el método del ácido 3,5-dinitrosalicícilico (DNS). Con
el método utilizado, como se ha indicado anteriormente, se determina únicamente el poder reductor
de los azúcares presentes y, según la composición de la alcachofa (Muir y col. 2007), resulta adecuado
hacer una valoración en base a la concentración de fructosa (Fr). Para ello, previamente se lleva a
cabo la preparación de una recta de calibrado en un intervalo de concentraciones de 0,05 a 5,00
mg/ml:
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 (𝐴) = 0,21 ∙ [𝐶𝑐 𝐹𝑟 (𝑚𝑔
𝑔)] − 0,004 (R2=0,998)
Figura 3.Datos de azúcares reductores extraídos expresados como equivalentes de fructosa (mg/g) para las distintas muestras de alcachofa extraídas con agitación o con ultrasonidos (US). Muestras con la misma letra (a-d) no presentan diferencias significativas con
un nivel de confianza del 95.0%
Según los datos obtenidos se puede observar que la extracción asistida por ultrasonidos (US) es igual
de eficaz que la extracción con agitación, aun cuando el tiempo de reacción (15 min con US y 60 min
con agitación) y la temperatura (60 °C con US y 80 °C con agitación), sean menores. Se obtienen datos
de concentración muy cercanos e incluso superiores a los obtenidos por agitación de placa, sin que
existan diferencias significativas. Si bien, una desventaja del US es que se requiere de un aparato con
ACC ACI16 AEI15 AEI16
Agitación 57,4 74,4 42,9 70,6
US 54,1 74,5 47,1 64,6
0,0
10,0
20,0
30,0
40,0
50,0
60,0
70,0
80,0
90,0
EQU
IVA
LEN
TES
FRU
CTO
SA (
MG
/G)
MUESTRAS DE ALCACHOFA
a
b
c
d
18
un diseño especial para evitar los puntos ciegos, aquellos espacios donde el US no llegan (Barba y col.,
2014).
Por otra parte, se puede apreciar que las mayores diferencias se observan según la muestra de la que
se trata, así las muestras de la industria del 2016, pertenecientes ambas al mismo lote de procesado
en la empresa, son las que presentan valores más altos, siendo ligeramente inferiores los de la
escaldada, por la posible pérdida de azúcares de bajo peso molecular (Gamboa Santos y col., 2012).
Melilli y col. (2013) observaron que el contenido en azúcares solubles en la planta de alcachofa podía
variar de 100 a 300 mg/g de materia seca a lo largo del ciclo de desarrollo de la misma y también
influía, aunque en menor medida, la variedad de alcachofa.
5.2 CARACTERIZACIÓN DE LOS EXTRACTOS DE ALCACHOFA
5.2.1 CARACTERIZACIÓN GENERAL
5.2.1.1 Extracto seco total (EST)
Aunque esta no es una determinación propia del extracto sino de la alcachofa liofilizada y molida, el
extracto seco total (EST) se va a utilizar para corregir los datos obtenidos en las demás
determinaciones y que se expresarán, en casi todos los casos, por gramo de EST. Los datos obtenidos
se muestran en la Tabla 2.
Tabla 2. Porcentaje de extracto seco de la alcachofa.
Porcentaje de EST (%)
ACC15 97,1±0,2 ACI16 96,8±0,0 AEI15 95,4±0,5 AEI16 95,6±0,5
5.2.1.2 Medida del pH.
La medida del pH es una propiedad físico-química importante en la caracterización básica de
cualquier extracto. Como se puede observar en la Tabla 3 el pH de la alcachofa en agua es
ligeramente ácido, con un pH próximo a 6, salvo la muestras escaldada del 2015 (AEI15), pudiendo ser
este menor valor debido a la adición de algún acidulante suave como puede ser el ácido ascórbico,
utilizado por esta empresa como antioxidante (http://comerverduras.com/producto/alcachofas-
gvtarra/).
19
Según diversos estudios (Apolinário y col, 2014), durante la extracción la inulina a elevadas
temperaturas se puede degradar cuando el pH es inferior a 5. Para evitar esta degradación se emplea
tampón fosfato sódico (0,05 M, pH 6,5) como solución extractante. De esta forma, se consigue que el
pH se mantenga casi inalterado en todos los casos, salvo en la muestra AEI15 en la que se consigue
que el pH se mantenga superior a 5, por lo que es de esperar que no haya degradación de la inulina
(Tabla 3). Por otra parte, aunque las diferencias son mínimas, se observa en todas las muestras
extraídas con US un valor menor, probablemente debido a una mayor extracción de ácidos orgánicos
en dichas muestras.
Tabla 3. Datos de pH para los extractos de alcachofa en buffer fosfato (agitación y US) y en agua (agitación).
Disolvente Agua Buffer fosfato sódico
pH Agitación (25°C, 10’) Agitación (80°C,60’) US (60°C,15’) ACC15 6,0±0,0 6,0±0,0 5,9±0,2 ACI15 5,8±0,2 5,8±0,2 5,7±0,1 AEI15 4,9±0,0 5,7±0,0 5,2±0,3 AEI16 6,2±0,0 6,1±0,0 6,0±0,3
5.2.1.3 Cuantificación del contenido de proteínas.
Se lleva a cabo la determinación de la proteína para las dos condiciones de extracción, en este caso se
trataría de una interferencia ya que lo que se pretende extraer es únicamente inulina. Como se
muestra en la Tabla 4, el contenido en proteína de las muestras es prácticamente igual,
independientemente del método de extracción, excepto como se comprueba posteriormente con la
estadística igual que en el apartado 5.1. Lo que sí se observa es que el contenido en proteína es
mucho menor en las muestras escaldadas, esto se corresponde con los datos de la USDA y, aunque
puede parecer alto, hay que considerar que el contenido en proteína de la alcachofa varía entre el 22
y el 18% respecto a EST según se trate de alcachofas crudas o cocidas
(https://ndb.nal.usda.gov/ndb/search/list?new).
Tabla 4. Datos de concentración de proteína para los extractos de alcachofa para las dos condiciones de extracción.
Cc proteína (mg/g EST) Agitación* US**
ACC15 24,1±2,6a 22,3±3,1a
ACI16 26,6±3,1a 26,9±3,2a
AEI15 12,3±1,1b 10,0±0,9c
AEI16 13,3±1,9b 13,0±2,2b
20
*𝑨 = 𝟎, 𝟓𝟔 [𝑪𝒄 𝒑𝒓𝒐𝒕𝒎𝒈
𝒈] + 𝟎, 𝟎𝟕 (R
2=0,967).
** 𝐴 = 0,66 [𝐶𝑐 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑚𝑔
𝑔] + 0,05 (R
2=0,960).
Muestras con la misma letra (a-d) no presentan diferencias significativas con un nivel de confianza del 95.0%
5.2.1.4 Medida de los carbohidratos totales.
El objetivo de esta determinación es conocer de forma aproximada la cantidad de carbohidratos que
se extraen de la alcachofa y poder relacionarlo con la inulina extraída para tener una idea sobre la
pureza de la misma y determinar si sería necesaria una fase posterior de purificación. Dado que sólo
es una estimación y que se trata de un método no muy preciso únicamente se hizo la determinación
en las muestras en las que se lleva a cabo la extracción mediante agitación en placa.
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 = 0,0033 · [𝐶𝑜𝑛𝑐 (𝑚𝑔
𝑔)] + 0,0487 (R2= 0,9903)
Figura 4 .Concentración de carbohidratos totales (mg/g EST) para las muestras de alcachofa extraídas mediante agitación en placa. Muestras con la misma letra (a-d) no presentan diferencias significativas con un nivel de confianza del 95.0%.
Según los datos obtenidos se puede observar, como era de esperar, que los extractos procedentes de
alcachofas crudas contienen más cantidad de carbohidrato que los de alcachofas escaldadas.
5.2.2 CARACTERIZACIÓN DE LA FRACCIÓN DE CARBOHIDRATOS
5.2.2.1 Estimación y distribución de la masa molecular de los carbohidratos extraídos (SEC).
Con objeto de estudiar la distribución de la masa molecular de los carbohidratos presentes en los
extractos obtenidos con agitación en el apartado interior, de alcachofa cruda y escaldada, se analiza
por HPLC-SEC con dos detectores distintos, en primer lugar con un detector de índice de refracción
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
140,00
160,00
180,00
200,00
ACC ACI16 AEI15 AEI16CA
RB
OH
IDR
ATO
S TO
TALE
S (M
G/
G E
ST)
MUESTRAS DE ALCACHOFA
CARBOHIDRATOS TOTALES
b
c c
a
21
(RID) y posteriormente con un detector evaporativo de dispersión de luz (ELSD). Los extractos
obtenidos con US no se analizan ya que en tratamientos de pectinas, con el mismo baño y condiciones
y duración de 1 h, no se producía incremento significativo de azúcares reductores y el grado de
despolimerización (inferior al 10%) puede considerarse dentro del error del método (Muñoz-Almagro,
2015 ).
Por otra parte, Lingyun y col. (2007) al estudiar la extracción de inulina de la alcachofa de Jerusalén
observaron que el proceso en baño de US era más adecuado que con sonda de US ya que ésta
producía una degradación parcial del polisacárido, disminuyendo ligeramente el grado de
polimerización (GP), a diferencia del baño. Esta disminución del GP con la sonda de US puede ser
explicada por la menor frecuencia del tratamiento y su mayor densidad de potencia lo que origina un
efecto de cavitación más intenso, fenómeno caracterizado por la formación de burbujas que crecen y
colapsan liberando gran cantidad de energía puntual (Chemat y col., 2011; Roselló-Soto y col., 2015;
Veillet y col., 2010; Vilkhu y col., 2008).
Con la técnica SEC utilizada la asignación a cada uno de los picos de su masa molecular media (Mw) se
realiza mediante una recta de calibrado con patrones de pululanos, analizada cada día. Según los
perfiles cromatográficos obtenidos (Figura 5) se puede comprobar que existe una gran diferencia
entre las muestras de alcachofa cruda y escaldada.
Figura 5. Perfil cromatográfico obtenido por HPLC-SEC-RID de la alcachofa cruda, ACC15 (azul), una escaldada, AEI15 (roja).
min20 22.5 25 27.5 30 32.5 35 37.5
nRIU
0
5000
10000
15000
20000
25000
RID1 A, Refractive Index Signal (SEC_260216_NEREA_CARLOS_LORENA_1 2016-02-29 09-28-28\LORENA_1.D) RID1 A, Refractive Index Signal (SEC_260216_NEREA_CARLOS_LORENA_1 2016-03-02 17-38-43\LORENA_A.D)
min20 22 24 26 28 30 32 34 36 38
nRIU
-1000
0
1000
2000
3000
RID1 A, Refractive Index Signal (SEC_260216_NEREA_CARLOS_LORENA_1 2016-02-29 09-28-28\LORENA_1.D) RID1 A, Refractive Index Signal (SEC_260216_NEREA_CARLOS_LORENA_1 2016-03-02 17-38-43\LORENA_A.D)
0,9 kDa
0,2 kDa 13,0 kDa
0,7+0,5
kDa
0,3
kDA
37,8kDa 611kDa
1,5
kDa
Tiempo (min)
2,8 kDa
22
En la Figura 5, de color azul, se representa el perfil obtenido por SEC-RID de alcachofa cruda (ACC15)
en el que se observan cuatro zonas, una con una Mw de 2,8 kDa, que corresponde a un grado de
polimerización (GP) medio de 17 y representa un 7%; otro de Mw 1,5 kDa GP medio 9, que es el
mayoritario, representando un 65%; un tercero, que no llega a resolverse, representa el 13%, con una
Mw de 0,9 kDa, GP medio 5 y el cuarto con el 15% de área, corresponde a 0,2 kDa y debe representar
a mono y disacáridos. El color rojo corresponde a una muestra de alcachofa escaldada (AEI15) donde
se puede ver, que hay mayor número de picos, de mayor Mw, pero mucha menor área, siendo sus
respectivos Mw y porcentaje de área como siguen: 611 kDa, 3%; 37,8 kDa, 15%; 13,0 kDa, 43%; 0,7
kDa, 20%; 0,5 kDa, 11% y 0,3 kDa, 8%. Durante el escaldado, como ya se ha comentado antes parece
que se pierde buena parte de los carbohidratos de baja masa molecular. Además, y como ya se
comentó en la introducción (2.1.1.), el máximo grado de polimerización para la inulina en la alcachofa
es de 200 unidades (Lattanzio y col., 2009), lo que equivale a unos 33 kDa, por lo que cabe la
posibilidad de que los picos de mayor Mw correspondan a otros compuestos presentes en la
alcachofa que no sean inulina.
En cuanto al análisis utilizando el detector ELSD en la Figura 6 aparecen los perfiles de la alcachofa
cruda, ACI16, y alcachofa escaldada, AEI16, con la asignación de los valores estimados de Mw para
cada pico definido y los datos obtenidos en el análisis se recogen en la Tabla 5.
Figura 6. Perfil cromatográfico obtenido del HPLC-SEC-ELSD para la alcachofa cruda, ACI16 (azul) y alcachofa escaldada, AEI16 (rojo). Recta de calibrado utilizada: Log Mw= Velución (ml) · (-0,47) + 11,46(R.5). * Pico con Mw asignada fuera del rango de patrones de pululanos disponibles.
min20 25 30 35 40
mV
58
60
62
64
66
68
70
72
74
ELS1 A, ELSD Signal (ELSD_170616_NEREA_CALIBRADO_GIRASOL_HNO3 2016-06-17 16-24-20\DD_LORE.D) ELS1 A, ELSD Signal (ELSD_170616_NEREA_CALIBRADO_GIRASOL_HNO3 2016-06-17 16-24-20\HH_LORE.D)
591 kDa
0,2+0,1
kDa 533 kDa
12206 kDa
11462
kDa
*
4,2 kDa
0,2 kDa
4,0 kDa
23
Tabla 5. Datos de Peso molecular y su correspondiente relación de áreas para las 4 muestras de alcachofa.
Mw, kDa (% Área)
ACC15 13276 (10%)
667 (7%)
6,1 (6%)
4,2 (35%)
0,2 (42%)
ACI16 12206 (10%)
591 (8%)
12,9 (4%)
6,0 (6%)
4.3 (33%)
0,2 (38%)
AEI15 12160 (18%)
525 (8%)
106 (13%)
4,3 (42%)
0,3 (19%)
AEI16 11462 (23%)
533 (16%)
4,0 (28%)
2,1 (7%)
0,2 (25%)
Según se puede observar, como en el caso anterior, hay una gran diferencia entre ambos tipos de
muestra, claramente el área para la alcachofa cruda es mayor, lo que vuelve a indica que en el
escaldado hay pérdida de compuestos solubles, especialmente de Mw inferior a 10 kDa. Por otra
parte, la mayor sensibilidad del ELSD permite detectar en las muestras de alcachofa cruda fragmentos
de mayor Mw, al igual que en el caso de las escaldadas. Esta mayor sensibilidad también se puede ver
fácilmente en los cromatogramas, los picos del perfil obtenidos con el ELSD son más agudos y se
distinguen mejor que en el caso de los picos del perfil del RID que son más anchos.
En cuanto a los datos recogidos en la tabla 5 se aprecia en todas las muestras que los compuestos
mayoritarios tienen una Mw media entre 6 y 2 kDa, mientras los correspondientes a mono y
disacáridos son más abundantes en las muestras crudas y, proporcionalmente, en las muestras
escaldadas tienen mayor peso los compuestos de Mw superior a 500 kDa que, como ya se ha dicho
posiblemente pertenezcan a otro tipo de compuestos que no sea inulina. Fissore y col. (2014) al
estudiar un extracto acuoso de alcachofa observó que además de inulina también se extraían
sustancias pécticas.
5.2.2.2 Mono, di y oligosacáridos presentes en los extractos.
A continuación se lleva a cabo, mediante la cromatografía de gases, la identificación (Figura 7) y
cuantificación (Tabla 6) de los mono, di y oligosacáridos presentes en los extractos. Como se pueden
observar en las Figura 7, los perfiles cromatográficos correspondientes a la muestra cruda (ACC15) y
muestra escaldada (AEI15), respectivamente, son complejos y cualitativamente muy semejantes. En
ellos se puede identificar, por comparación con patrones analizados en las mismas condiciones
cromatográficas, los siguientes compuestos: fructosa (Fr), glucosa (Glu), mio-inositol (Mio), sacarosa
(Sac), kestosa (Kst), nistosa (Nis) y fructosil-nistosa (Fr-Nis). La inulobiosa (Inb), compuesto formado
24
por 2 moléculas de fructosa unidas por un enlace β-(2-1), esta únicamente presente en las muestras
escaldadas, quizás liberada durante el proceso de escaldado de la muestra en la industria.
Figura 7. Perfil cromatográfico obtenido por gases de la alcachofa cruda de comercio 2015, ACC15 (azul) y de la alcachofa escaldada de industria 2015, AEI15 (rojo). (ACI16).
En cuanto a los datos de composición (Tabla 6), y en correspondencia con lo observado previamente,
se observa, en general, un menor contenido de los compuestos determinados en este análisis de lo
que se espera, al tratarse todos de compuestos de bajo peso molecular, muy solubles en agua. Así,
mientras en las muestras crudas se cuantifica un total de 68 y 63 mg/g de alcachofa, en las muestras
escaldadas este valor desciende a 22 y 48 mg/g de extracto. Esta gran diferencia en los valores
obtenidos para la alcachofa escaldada podría deberse a que el tratamiento fuera algo distinto para
ambas muestras, a un tiempo menor o con una temperatura del agua más baja, ya que las
concentraciones de estos azúcares son más propios de alcachofa cruda que de escaldada, si bien no
se tiene constancia ya que la empresa no ha facilitado información. Se obtienen los siguientes datos:
Tabla 6. Concentraciones de las fracciones de FOS (mg/g EST) para las cuatro muestras de alcachofa.
Fr Glu Mio Sac Inb Kst Nis Fr-Nis Azúcares
TOTALES
ACC15 14,6±0,3 32,4±0,2 2,2±0,3 7,9±0,2 0,0 6,4±1,3 3,1±1,1 1,0±0,8 67,6±3,2
ACI16 14,7±0,8 24,0±3,1 1,1±0,5 14,4±1,5 0,0 5,1±0,2 3,3±0,5 0,0 62,6±4,3
AEI15 5,7±0,6 3,8±0,1 0,7±0,5 1,6±0,0 2,7±0,5 2,7±0,3 3,6±0,2 0,9±0,0 21,7±1,6 AEI16 13,6±1,8 13,8±1,3 0,9±0,1 9,5±1,0 7,8±0,1 1,3±0,1 0,7±0,1 0,0 47,6±4,3
25
5.3 CUANTIFICACIÓN DE LA INULINA
5.3.1 HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA
5.3.1.1 Evaluación de la actividad inulinasa.
En primer lugar, para evaluar la inulina total presente en los extractos, se estudia la actividad
inulinasa de unos preparados enzimáticos comerciales que por su múltiple actividad podrían ser
adecuados para los ensayos posteriores. En primer lugar, se lleva a cabo el estudio con 5 preparados
enzimáticos frente a Raftiline®, inulina comercial, según se indica en el apartado 4.1, así que midiendo
el incremento de poder reductor con la prueba de DNS se puede saber si tienen actividad inulinasa y
puede hidrolizar la inulina liberando fructosa y glucosa. Según los datos obtenidos, las únicas enzimas
que presentan actividad inulinasa son NS-22013 y Viscozyme Barley, con una actividad de 19,0 y 25,6
µmol/min por ml o mg de enzima. A continuación, se lleva a cabo la determinación cuantitativa de la
actividad inulinasa de estas dos enzimas, con este fin se realizan las medidas a tiempos más cortos: 2
y 5 minutos (Tabla 7).
Tabla 7. Actividad inulinasa cuantitativa de NS-22013 y viscozyme barley.
Tiempo de incubación
(min)
A ABSORBANCIA CC FRUCTOSA
(mg/ml)
µmol/minuto µmol/minuto por ml o mg de
enzima
NS-22013
2 1,95 1,08 5,08 14,10 1410
5 0,85 0,68 3,21 3,57 357
VISCOZYME BARLEY 2 1,43 0,66 3,11 8,62 861 5 1,39 0,61 2,88 3,20 320
Con estos datos, se puede concluir que para las dos enzimas hay una mayor actividad inulinasa para
un tiempo de incubación de 2 minutos, transcurridos 5 minutos la actividad disminuye, esto indica
que la curva de actividad del enzima pierde la linealidad.
Por otra parte, comparando la actividad de ambos enzimas se puede considerar más adecuada la NS-
22013 para determinar la cantidad de inulina extraída, al ser mayor su actividad.
26
5.3.2 CUANTIFICACIÓN DE LA INULINA PRESENTE EN LOS EXTRACTOS.
5.3.2.1 HPLC-RID, columna amino:
Para la cuantificación de la inulina inicialmente, por ser un método más simple, se utiliza la
cromatografía en modo HILIC con una columna amino. Sin embargo, según se puede comprobar no es
un método adecuado ya que la fructosa (Fr) coeluye con un compuesto presente en la enzima, como
se aprecia en la Figura 8. Por esta razón se pasa a utilizar la CG, técnica que, por su mayor resolución,
permite separar la fructosa y glucosa del compuesto interferente.
Figura 8. Cromatograma de la ACC (rojo) y de la enzima NS-22013 (azul).
5.3.2.2 GC: estimación del grado de polimerización
Con la hidrólisis enzimática de la inulina utilizando una inulinasa (4.3.1) se espera la ruptura selectiva
y total de este polisacáridoy el aumento de la cantidad de fructosa y glucosa debe corresponder al
contenido en inulina de las muestras. Con la diferencia entre la cantidad de estos monosacáridos
antes y después de la hidrólisis, se calcula el grado de polimerización (GP) mediante la fórmula 1
(Ronkart y col., 2011):
𝐺𝑃 = [𝐹𝑟 ℎ𝑖𝑑𝑟𝑜𝑙𝑖𝑧𝑎𝑑𝑎]−[𝐹𝑟 sin ℎ𝑖𝑑𝑟𝑜𝑙𝑖𝑧𝑎𝑟]
[𝐺𝑙𝑢 ℎ𝑖𝑑𝑟𝑜𝑙𝑖𝑧𝑎𝑑𝑎]−[𝐺𝑙𝑢 sin ℎ𝑖𝑑𝑟𝑜𝑙𝑖𝑧𝑎𝑟] (Fórmula 1)
Tabla 8. Medida del grado de polimerización (GP) a partir de la cantidad de fructosa y glucosa (mg/g EST) para la extracción en placa. (No se llevó a cabo la determinación para extracción mediante US por falta de tiempo). H (hidrolizado), SH (sin hidrolizar).
Muestras Fr Gl GP
SH H SH H Inulina FrH-FrSH GluH-GluSH ACC15 14,6 76,7 32,4 56,8 86,5 62,1 24,3 2,6 ACI16 14,7 119,9 23,5 46,3 128,0 105,3 22,8 4,6 AEI15 5,7 59,9 3,8 16,5 66,9 54,2 12,7 4,3 AEI16 13,6 68,4 13,8 45,9 86,9 54,8 32,1 1,7
Fr
Glu
27
Se puede observar que, aunque el contenido en inulina puede ser adecuado según los datos
encontrados en la bibliografía, el grado de polimerización calculado es muy bajo que tiene un valor
medio de 46 (Lattanzio y col., 2009).
Esto podría indicar que el enzima o las condiciones de ensayo no son adecuadas, ya que parece que se
está produciendo también una liberación de glucosa mayor que la correspondiente sólo a la inulina y
que podría provenir de la celulosa. Para elegir de forma adecuada el enzima no es suficiente medir su
actividad inulinasa, también es necesario comprobar que no presente actividad celulasa. No obstante,
y de forma positiva, se puede observar un incremento de la cantidad de ambos monosacáridos
cuando se produce la hidrólisis, teniendo un valor mayor para las alcachofas crudas y escaldada de
2016, esta última muestra como ya se ha dicho en otras ocasiones, presenta un comportamiento más
similar al de las alcachofas crudas que a la escaldada del año anterior.
6 CONCLUSIONES FINALES
Ambas condiciones de extracción resultan igual de eficaces, aunque la extracción con
ultrasonidos requiere un menor tiempo y temperatura que la extracción convencional, si bien
requiere un equipo algo más complejo.
Las diferencias principales entre la alcachofa cruda y la alcachofa escaldada se deben al
pretratamiento que se le da a ésta, presentando una menor cantidad de carbohidratos totales,
azúcares reductores, fructooligosacáridos, y especialmente de mono y disacáridos.
En referencia a lo anterior, las alcachofas escaldadas de ambos años presentan diferencias
significativas entre ellas, siendo más similar la alcachofa escaldada de la temporada 2016 a las
alcachofas crudas, quizás porque el tratamiento de escaldado haya sido menos intenso.
En referencia a los cromatogramas obtenidos de HPLC-SEC se puede decir, que los extractos
obtenidos necesitan una posterior purificación, ya que además de inulina, presenta otros
polisacáridos y componentes interferentes
Por último será necesario optimizar el proceso de hidrólisis para la cuantificación de la inulina.
28
7 BIBLIOGRAFÍA
Apolinário, A. y col. (2014): Inulin-type fructans: A review on different aspects of biochemical and pharmaceutical technology. Carbohydrate polymers, 101: 368-378.
Balken y col. (1991): Production of 1-ketose with intact mycelium of Aspergillus phoenics containing sucrose-1F fructosyltransferase, Appl. Microbiol. Biotechnol, 35: 216-221.
Barba, F.J. y col. (2015): Evaluating the potential of cell disruption technologies for green selective extraction of antioxidant compounds from Stevia rebaudiana Bertoni leaves. J Food Eng, 149: 222–228.
Barclay, T. y col. (2012): Analysis of the hydrolysis of inulin using real time 1H NMR Spectroscopy. Carbohydrate Research, 352: 117-125.
Baeten, J. (1999): Invloed van inulin-type fructanen op de darmflora: Simulaties door middle van in vitro batchfermentaties met fecale slurry. Free University Brussels, Faculty of Science; Thesis Bio-Engineer.
Barba y col. (2014): Impact of pulsed electric fields and high voltage electrical Beards, E. y col. (2010): Bacterial, SCFA and gas profiles of a range of food ingredients
following in vitro fermentation by human colonic microbiota. Anaerobe, 16: 420–425. Bradford, M.M. (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 72: 248-256.
Brobst, K.M. y Lott, C.E. (1966): Determination of some components in corn syrup by gas-liquid chromatography of trimethylsilyl derivatives. Cereal Chemistry, 43(1): p. 35-&.
Chemat, F. y col (2011): Applications of ultrasound in food technology: Processing, preservation and extraction. Ultrasonics Sonochemistry, 18(4):813–835.
Chow, P.S. y col. (2004): A method for routine measurements of total sugar and starch content in woody plant tissues. Tree physiol., 24(10): 1129-1136
Corzo, N. y col. (2015): Prebióticos; concepto, propiedades y efectos benefiniciosos. Nutrición hospitalaria, 31 (Supl. 1): 99-118.
Club Gutarra, desde 1910: http://comerverduras.com/producto/alcachofas-gvtarra. Delzenne, N. y Williams, C. (2002): Prebiótics and lipid metabolism. Curr. Opin Lipidol, 13: 61-
67. Dubois y col. (1956): Colorimetric method for determination of sugar and related substances.
Analytical Chemistry, 28: 350–356. Edelman, J. and Jefford, T.G. (1968): The mechanism of fructan metabolism in higher plants as
exemplified in Helanthus tuberosus L. New Phytologist 123: 15–24. Ellegärd, L. y col. (1997): Inulin and oligofructose do not influence the absorption of
cholesterol, or the excretion of cholesterol, Ca, Mg, Zn, Fe, or bile acids but increases energy in ileostomy subjects. European Journal of Clinical Nutrition, 51: 1–5.
Fissore, E. y col. (2014): Upgrading of residues of bracts, stems and hearts of Cynara cardunculus L. var. scolymus to functional fractions enriched in soluble fiber. Royal Society of Chemistry, 5: 463-470.
Gamboa-Santos y col. (2012): Effects of conventional and ultrasound blanching on enzyme inactivation and carbohydrate content of carrots. European Food Research and technology, 234 (6): 1071-1079.
29
Gibson, G. y col. (2004b): Dietary modulation of the human colonic microbiota: updating the concept of prebiotics. Nutrition Research Reviews 17, 259–275.
Gibson, G. y col. (2010): Dietary prebiotics: current status and new definition. Food Science and Technology Bulletin: Functional Foods 7: 1–19.
Greger, J. (1999): Nondigestible carbohydrate and mineral bioavailability. J. Nutr, 129: 1434-1435.
Hyashi, S. (1993): Properties of Aspergillus japonicus β-fructofuranoside immobilized on porous silica. World J. Microbiol. Biotechnol, 9: 216-220.
Kleessen, B. (2001): Oligofructose and long-chain inulin: influence on the gut microbial ecology ofrats associated with a human faecal flora. British Journal of Nutrition, 86: 291–300.
Lattanzio, V. y col. (2009): Globe artichoke: A functional food and source of nutraceutical ingredients. Journal of Functional Foods, 1(2): 131-144.
Lingyun, W. y col. (2007): Studies on the extracting technical conditions of inulin from Jesuralem artichoke tubers. Journal of food engineering, 79: 1087-1093.
López-Molina, D. y col.(2005): Molecular properties and prebiotic effect of inulin obtained from artichoke (Cynara scolymus L.). Phytochemistry, 66: 1476-1484.
Melilli, M.G. y Raccuia, S.A. (2013): Influence of Shading on Flowering Induction and Inulin Metabolism in Roots of Cynara cardunculus L., Consiglio Nazionale delle Ricerche (Italy): 415-420.
Molis y col.(1996): Digestion, excretion,and energy value of fructooligosaccharides in healthy humans. American Journal of Clinical Nutrition,64: 324–328.
Moser, M. y Wouters, R. (2014): Nutritional and Technological Benefits of Inulin-Type Oligosaccharides. Prebiotics in Food Formulation, 457-469.
Moser, M. (2014): Production and bioactivity of oligosaccharides from chicory roots. Prebiotics in Food Formulation, 55-75.
Muir J.G. y col. (2007): Fructan and free fructose content of common Australian vegetables and fruit.J Agric Food Chem, 55(16): 6619-6627.
Muñoz-Almagro, N. (2015): Obtención y caracterización de pectinas modificadas mediante tratamientos físicos y químicos. Trabajo de Fin de Máster, Universidad Autónoma de Madrid: 36-37.
Nilsson, U. y Nyman, M. (2005) Short-chain fatty acid formation in the hindgut of rats fed oligosaccharides varying in monomeric composition, degree of polymerization and solubility. British Journal of Nutrition ,94: 705–713.
Pandino, G. y col. (2011): Profile of polyphenols and phenolic acids in bracts and receptacles of globe artichoke (Cynara Cardunculus var. scolymus) germplasm. Journal of food composition and Analysis, 24(2): 148-153.
Park, Y.K. y col. (1991): Production of fructooligosaccharides from surcrose by a transfructosylase from Aspergillus niger. World J. Microbiol. Biotechnol, 7: 331-334.
Pietro, A. y col. (2002): Antitumorigenic activity of the prebiotic inulin enriched with oligofructose in combination with the probiotics Lactobacillus rhamnosus and Bifidobacterium lactis on azoxymethane induce colon carcinogenesis in rats. Carcinogenesis, 23: 1438-1441.
Rastall, R.A. (2010): Functional oligosaccharides: Application and manufacture. Ann. Rev. Food Sci. Technol, 1: 305-309.
Robertfroid, M. y col. (2002): Dietary chicory inulin increases whole-body mineral density in growing male rates. J Nutr, 132: 3599-3602.
30
Robertfroid, M. (2005): Inulin-Type Fructans: Functional Food Ingredients. Boca Raton, USA: CRC Press, 370 pp.
Roberfroid, M. (2005a): Inulin-type fructans as non-digestible oligosaccharides. In: Inulin-Type Fructans. Functional Food Ingredients,CRC Press, Boca Raton, pp. 64–71.
Roselló-Soto y col. (2015a): Clean recovery of antioxidant compounds from plant foods, by-products and algae assisted by ultrasounds processing. Modeling approaches to optimize processing conditions. Trends in Food Science & Technology, 42(2): 134–149.
Roselló-Soto, E. y col. (2015b): Emerging opportunities for the effective valorization of wastes and byproducts generated during olive oil production process: Non-conventional methods for the recovery of high-added value compounds. Trends in Food Science & Technology, 45(2): 296–310.
Ruiz-Cano, D. y col. (2014): Chemical and functional properties of the different by-products of artichoke (Cynara scolymus L.) from industrial canning processing. Food Chemistry, 160: 134-140.
Saengthongpinit, W. y Saijaanantakul, T (2005): Influence of harvest time and storage temperature on characteristics of inulin from Jerusalem artichoke (Helianthus tuberosus L.) tubers. Postharvest Biology and Technology, 37, 93–100.
Sangeetha, P.T.y col. (2005): Recent trends in microbial production, analysis, and applications of fructooligosaccharides, Trends Food Sci. Technol. 16:442–457.
Singh, Ram y Singh, Rupinder (2010): Production of fructooligosaccharides from Inulin by Endoinulinases and their prebiotic potential.
Stewart, M.L. y col. (2008): Fructooligosaccharides exhibit more rapid fermentation than long-chain inulin in an in vitro fermentation system. Nutrition Research, 28: 329–334.
Taper, H. y Robertfroid, M. (1999): Influence of inulin and oligofructose on breast cancer and tumor growth. J. Nutr, 129: 1488-1491.
United States Department of Agriculture Agricultural Research Service, USDA Food Composition Databases (2016): https://ndb.nal.usda.gov/ndb/search/list?new
Veillet, S. y col. (2010): Ultrasound assisted maceration: An original procedure for direct aromatisation of olive oil with basil. Food Chemistry, 123(3): 905–911.
Vilkhu, K. (2008): Applications and opportunities for ultrasound assisted extraction in the food industry. A review.Innovative Food Science & Emerging Technologies, 9(2): 161–169.