“Oligosacáridos de ácido hialurónico inducen el clivado de CD44 y promueven la migración celular

en células tumorales que expresan CD44”

INTRODUCCIÓN

HA (ácido hialurónico)

•El ácido hialurónico (HA )es un glicosaminoglicano (GAG) lineal no sulfatado que consiste en la repetición de unidades disacarídicas formadas por D-ácido glucurónico y N-acetil glucosamina.

•En condiciones normales HA usualmente se encuentra como un componente de la matriz extracelular de alto peso molecular

•Hay evidencias de que HA no solo actúa como un componente de la matriz extracelular sino que participa en numerosos eventos fisiológicos tales como la adhesión, migración y proliferación celular.

•Se halló que en condiciones celulares patológicas, tales como inflamación y tumores, HA se encuentra en una forma de bajo peso molecular. A demás se ha reportado una síntesisaumentada de HA en varios tumores malignos

•Se encontraron altos niveles de actividad hialuronidasa en tumores de próstata y vejiga sugiriendo una degradación autorregulatoria de HA en tejidos tumorales que provocaría la invasión tumoral y la metástasis.

INTRODUCCIÓN

Receptor de superficie celular CD44

•CD44 es una molécula de adhesión que sirve como receptor de superficie celular de varios componentes de la matriz extracelular que incluye el ácido hialurónico.

• Se encuentra ampliamente distribuída y participa en varios procesos biológicos tales como:1)Migración de células tumorales e invasión2)Lynphocyte rolling

•El dominio extracelular de CD44 es clivado proteolíticamente, se sugiere que este clivaje tendría un rol importante en la migración de células tumorales.

•Se ha reportado un mayor nivel de clivaje del receptor CD44 en tumores invasivos tales como gliomas, carcinomas en colon y en ovarios, entre otros.

•El clivaje proteolítico de CD44 puede ser inducido por ciertos estímulos como el phorbol éster y anticuerpos anti-CD44 in vitro, sin embargo se desconocía el inductor fisiológico de CD44 in vivo

El OBJETIVO

Fué demostrar que pequeños oligosacáridos HA, y no polímeros largos, inducen eficientemente el clivaje de CD 44 y también promueven la migración de lacélula tumoral en una forma dependiente de CD44.

En células tumorales se encontró:

- Por un lado, una proteólisis aumentada del receptor CD44

- y por otro lado, formas de ácido hialurónico (HA) de bajo peso molecular (oligosacáridos)

Entónces..

FIG. 1. Las células MIA PaCa-2 (línea celular de carcinoma pancreático humano)expresan una forma activa de CD44 y muestran un clivaje de CD44 incrementado bajo tratamientocon phorbol ester (PMA).

1) Incuban las células con y sin fluoresceína isotiocianato conjugada al anticuerpoBRIC235 (éste se une al dominio extracelular de CD44)

2) Incuban las células con y sin fluoresceína isotiocianato conjugada a HA (FL-HA)

3) Incuban las células con y sin fluoresceína isotiocianato conjugada a HA (FL-HA) y a demás con el anticuerpo anti-CD44 o un control isotipo IgG de ratón

Expresión de CD44 Unión de HAUnión de HA a CD44 con anticuerpo anti-CD44

Continuación FIG. 1.

Clivaje de CD44 con PMA

Las células tumorales se incubaron ON 37 °C con MG132 para inhibir el clivaje secundario del domino intracelular de CD44 Las celulas fueron incubadas con y sin PMA por 30 min a 37 °C Las celulas fueron lisadas con solucion SDS.Se realizó un inmunoblotting con anti CD44 cyto pAb y con anti beta tubulina mAbPara detectar las bandas usan el sistema de peroxidasa.

Se midió la fracción soluble al incubar células tumorales con o sin PMA mediante ELISA

FIG. 2. El clivado de CD44 es incrementado por fragmentos HA pero no porHA de 200-KdA

Ha de 200 K-da fue digerido con hialuronidasa

y los productos fueron analizados por HPLC

Inmunoblotting para detectar el producto de clivaje de CD44 al incubar con una frHA

Corroboran que se produce clivaje por frHA y no por HA de alto PM

FIG. 3. La digestión de los fragmentos de HA hasta disacáridos anula su efecto inductor sobre el clivaje de CD44

A,B: Digestión de la mezcla frHA con hialuronidasa SD intacta o inactivada.

C:Inmunoblotting para un ensayo de clivaje de CD44

“El efecto inductor se debía a frHA y no a moléculas contaminantes presentes en la mezcla”

FIG. 4. El clivaje de CD44 es inducido por oligosacáridos pequeñosde tamaño uniforme pero no por largos polímeros.

Inmunoblotting para un ensayo de clivaje de CD44

Análisis densitométrico de la banda de 25 KDa

“Sólo fragmentos de cierto tamaño pueden incrementar el clivaje de CD44”

FIG. 5. Los fragmentos HA de 6.9-kDa (de efecto inductor) se unen al receptor CD44 de superficie celular.

¿Los fragmentos HA regularán el clivaje de CD44 a través de la unión al receptor?

Pretratamientos (HA de distintos tamaños sin marcar)

Pico punteado:

sin pretratamiento y sin FL-HA

Pico sin sombrear:

Sin pretratamiento y con FL-HA

Pico sombreado:

Con pretratamiento y con FL-HA

1.con o sin FL-HA

2.anti- CD44 y FL-HA

FIG. 6. El clivado de CD44 inducido por fragmentos HA es bloqueado por unanticuerpo anti-CD44 mAb BRIC235 (frag. Fab).

Inmunoblotting para un ensayo de clivaje de CD44

El clivaje inducido por HA se debe a la interacción entre los fragmentos HA y el receptor CD44

FIG. 7. HA de 6.9-kDa induce la formación de filopodios.

Anti-CD44cyto pAb

Rhodamine-conjugated phalloidin

Microscopía

de inmunofluorescencia

FL-goat anti- rabbit IgG

FIG. 8. HA de 6.9-kDa induce una migración celular y ésta es inhibidapor un anticuerpo bloqueante anti-CD44 .

“HA de bajo PM no sólo induce el clivado de CD44 sino también la migración celular dependiente de CD44”

Boyden-type chamber assay

Conclusiones

• Fragmentos de HA inducen el clivaje del receptor CD44 en células de carcinoma pancreático humano

• La digestión a disacáridos de los fragmentos de HA anula su efecto inductor sobre el clivaje de CD44

• Sólo fragmentos de HA de cierto tamaño pueden inducir el clivaje de CD44 (particularmente aquéllos que poseen entre 6 y 36 monómeros). Estos oligosacáridos constituyen probablemente el inductor fisiológico del clivaje de CD44.

• El clivaje inducido por HA se debe a la interacción entre los fragmentos HA y el receptor CD44

• Los fragmentos de HA de 6.9 KDa (de 36 monómeros principalmente) promueven la migración de células de carcinoma de una manera que depende de CD44

“El tamaño de la molécula de ácido hialurónico sería clave en su función, atribuyéndole particulares actividades biológicas”

Discusión

¿Por qué sólo fragmentos pequeños están capacitados para inducir el clivajede CD44?

En principio, la ocupación del sitio de unión de HA en el receptor CD44 no parece ser, por símisma, suficiente para inducir el clivaje, ya que se pudo observar que los fragmentos masgrandes de HA eran capaces de unirse al receptor pero no de gatillar el efecto biológico.

Por otro lado, dado que polímeros largos de HA se unían a CD44 con mayor avidez que lospequeños oligosacáridos, probablemente no sea importante la cantidad de uniones de losfragmentos HA al receptor.

Tampoco parece determinante la valencia de la unión, ya que presumiblemente fragmentos tanpequeños como los de 6 a 12 sacáridos sólo se unan de forma monovalente al receptor y aún asíhay inducción del clivaje (esta especulación se ve apoyada en el hecho de que la mayoría delos anticuerpos contra el receptor CD44 no son capaces de inducir clivaje)

A pesar de esto, la interacción con el receptor es necesaria, aunque quizás deben considerarse otrosfactores.Por ejemplo, HA es incorporado por las células vía CD44 y los fragmentos HA de diferentestamaños probablemente difieran en la facilidad con que son endocitados, lo cual pueda afectardiferencialmente la señalización intracelular.En cualquier caso el mecanismo por el cual los fr HA de determinado tamaño pueden inducirdiferencialmente el clivaje de CD44 debe ser investigado más.

• Otros científicos reportaron que las células MIA Paca-2 se despojan de CD44 espontáneamente por 2 mecanismos diferentes, uno mediado por metaloproteasas unidas a membrana y otro mediado por una serina proteasa. A juzgar por el tamaño del producto de clivado (aprox. 25 KDa), MT1-MMP estaría probablemente involucrada en parte en el clivaje de CD44.

El clivaje de CD44 inducido por pequeños oligosacáridos HA puede tener una importante relevancia en la biología tumoral. Los oligosacáridos pequeños de HA pueden promover la invasión tumoral no sólo por inducción de angiogénesis sino también por servir como una molécula señal a CD44, incrementando el despegue de la célula tumoral del tejido primario e induciendo el pegado de la células tumorales a las células endoteliales e incrementando la motilidad celular.