MANUAL DE QUÍMICA

AREA TÉCNICA QUÍMICA

4. ÁREA TÉCNICA DE QUÍMICA

4.1 GLUCOSA

4.1.1. Tipo de Muestra. Suero, Plasma o LCR.

4.1.2. Principio del método. La glucosa transformada por la glucosa oxidasa (GOD) en ácido glucónico y peróxido de hidrógeno el cual, en presencia de peróxido (POD), oxida el cromógeno (4aminofenazona/fenol) convirtiéndolo en un compuesto de color rojo.

4.1.3. Preparación de un reactivo. Añadir el contenido de un vial 1 en un frasco 1A. Agitar hasta su completa disolución.

4.1.4. Metodología.

- En un tubo de ensayo adiciono 1ml del reactivo.

- Coloco 10 landas de muestra - Incubo 10 minutos a temperatura 37°C

- Después de ese tiempo leo en el equipo espectronic20 520nm mido absorbancia.

- Hago cálculos y le resto el blanco así:

Cálculos ABS de la muestra ------------------------ por concentración del estándar (100) ABS del estándar

Expresión del resultado. Mg/dl

Valores de referencia. 60 a 100 Mg/dl

4.2 COLESTEROL

4.2.1 Tipo de muestra. Suero o Plasma

4.2.2 Principio del Método: Los esteres del colesterol son hidrolizados por la colesterol ester hidrolasa a colesterol libre y a ácidos grasos. El colesterol ñibre de existente, conjuntamente producido por esta reacción, es oxidado por la colesterol oxidasa a 4-colestenona y peróxido de hidrogeno este último en presencia de peoxidasa ó Oxida de Cromógeno (4- aminofenazona/fenol) a un compuesto de color rojo.

4.2.3 Preparación de Reactivo:

Solución 1: Disolver de una botella con 125ml de agua destilada.

Solución 2: El contenido de la botella 2 esta listo para ser utilizado.

Solución 3: Mezclar un volumen de la solución 1 con un volumen del reactivo (o mezclar el contenido de una botella

de solución 1 con el de una botella 2) guardar en una botella oscura.

4.2.4. Metodología.

- En tubo de ensayo adiciono 1 ml de reactivo

- Coloco 10 landas de muestra

- Incubo 10 minutos a temperatura de 37°C

- Después de ese tiempo leo en el equipo Espectronic20 520nm mido absorbencia.

Hago cálculos y le resto el blanco así:

Cálculos ABS de la muestra ------------------------- por concentración del estándar (200) ABS del estándar

4.2.5 Expresión del resultado. Mg/dl

4.2.6 Valores de referencia. Hasta 200 mg/dl

4.3 TRIGLICÉRIDOS

4.3.1 Tipo de muestra. Suero o Plasma

4.3.2 Principio del método. El glicerol liberado en la hidrólisis de los triglicéridos cataliza por la lipoproteínlipasa, se convierte, mediante la glicerolquinasa en glicerol 3 fosfato que se oxida a dihidroxiacetona y peróxido de hidrógeno oxida al cromógeno (ácido 3,5-dicloro-2-hidroxibencenosulfonico/4-aminofenazona) a un compuesto de color rojo.

4.3.3 Metodología.

- En un tubo de ensayo adiciono 1 ml de reactivo

- Coloco 10 landas de muestra

- Incubo 10 minutos a temperatura de 37°C

- Después de ese tiempo leo en el equipo espectronic20 520nm la absorbencia.

- Hago cálculos y resto el blanco.

Cálculos ABS de la muestra ------------------------- por la concentración del estándar (100) ABS del estándar

4.3.4 Expresión del resultado. Mg/dl

4.3.5 Valores de referencia. Hasta 200 mg/dl

4.4 COLESTEROL HDL.

4.4.1 Tipo de muestra. Suero o Plasma

4.4.2 Principio del método. Las lipoproteínas de alta densidad (HDL) se separan de los quilomicrones, de las lipoprtoteínas de muy baja densidad (VLDL) y de las lipoproteínas de baja densidad (LDL) por la adicción de un reactivo de precipitación (ácido fosfotungstico-cloruro de magnesio) al suero o Plasma. Después de centrifugar, se determina el contenido de colesterol enzimático utilizando colesterol esterasa, colesterol oxidasa, peroxidasa y un sistema cromógeno 2-4.

4.4.3 Preparación del reactivo. El reactivo de precipitación: viene listo para las demás soluciones son las mismas del colesterol total.

4.4.4. Metodología. Esta técnica consta de dos pasos: uno: que es de precipitación y el otro paso es el de la técnica de determinación del colesterol.

PASO I. En un tubo de ensayo se adicionan 100 landas de muestra junto con 100 landas de reactivo de precipitación.

Se centrifuga a 1500 RPM por 10 minutos

Después de esto queda un sobrenadante del cual se toman 50 landas.

PASO II. En un tubo de ensayo diferente se colocan:

1cc de reactivo de trabajo con 50 landas de sobrenadante.

Se incuba 10 minutos a temperatura 37°C

Después de ese tiempo leo en el equipo a 520nm la absorbencia es medida.

Hago cálculos y le resto el blanco.

Cálculos ABS de la muestra ------------------------ por la concentración del estándar (50) ABS del estándar

4.4.5 Expresión del resultado. Mg/dl

4.4.6 Valores de referencia. Hombres: mayor de 35 Mujeres : mayor de 45

4.5 ACIDO URICO.

4.5.1 Tipo de muestra. Suero plasma u orina (diluída 1:10 con NaOH 001N)

4.5.2 Principio del método. El ácido urico es convertido por la uricasa en alantoina y peróxido de hidrógeno el cual en presencia de peróxidasa oxida el cromógeno (4-aminofenazona 3-Hidroxi 2,4,6 ácido triyodobenzoico) formando un compuesto.

4.5.3 Preparación del reactivo. Solución 1: añadir 30 ml de reactivo 1ª a un vial de reactivo 1 (o llenar hasta la marca) mezclar muy bien.

4.5.4 Metodología.

- 1cc de reactivo de ácido urico más 50 landas de muestra.

- Se espera 10 minutos a temperatura de 37°C

- Después de ese tiempo leo en el equipo a 520nm mido la absorbencia.

- Hago cálculos y le resto el blanco.

Cálculos ABS de la muestra ----------------------- por concentración del estándar (6) ABS del estándar

4.5.5 Expresión del resultado. Mg/dl

4.5.6 Valores de referencia: 2.4 a 7.0 en suero 250 a 750 mg en 24 horas (ORINA)

CÁLCULO EN ORINA LO SACO ASÍ:

En la orina el valor que me da el equipo lo multiplico por 10 luego, esto está en 100ml en el volumen total de la orina de 24 horas cuanto habrá. Así:

Ejemplo:

Volumen orina: 200ML 2mg x 20mg

20mg 100mlx 200ml x= 400mg/24 horas

4.6 CREATININA Y DEPURACIÓN

4.6.1Tipo de muestra. Suero o Plasma u orina (diluida 1:50 con agua destilada).

4.6.2Principio del método. La creatinina reacciona con el pocrato alcalino (reacción de Jaffé) produciendo un cromógeno rojo.

4.6.3Preparación del reactivo. Los reactivos vienen listos para su uso.

4.6.4 Metodología. En las mismas cubetas adiciono:

- 0.2ml de muestra con 1ml de reactivo (este último se prepara con iguales cantidades del reactivo 1 y 2)

- A los 30 segundos hago la primera lectura y la anoto a los 2 minutos (o sea a los 1 minutos 30 segundos de haber hecho la primera lectura) hago la segunda lectura y la anoto.

- Este mismo proceso hago con el estándar y hago los cálculos.

- Esta lectura se hace a 510nm

Cálculos. Abs de la muestra entre la Abs del estándar y multiplico por 2.

4.6.5 Expresión del resultado. Mg/dl

4.6.6 Valores de referencia. Mujeres 0.5 – 1.0 Hombres 0,7 – 1,2

4.7 UREMIA.

4.7.1Tipo de muestra. Suero o Plasma

4.7.2Principio del método. La ureasa descompone específicamente a la urea produciendo dióxido de carbono y amoniaco; este reacciona con el fenol y el hipoclorito en medio alcalino produciendo azul de indofenol que se determina fotoclorimetricamente.

4.7.3Preparación del reactivo. Vienen listos para usar.

4.7.4 Metodología. En un tubo de ensayo adiciono:

- una gota de agua destilada a cada tubo de blanco, muestra y estándar, luego,

- 10 landas de muestra o estándar

- 1 gota de la ureasa tanto al estándar y a la muestra como al blanco.

- Incubo a 37°C por 5 minutos.

- Después de ese tiempo adiciono 0.5 ml de reactivo 1 y 0.5 ml del reactivo 2.

- Incubo por 5 minutos a 37°C

- Adiciono 5ml de agua destilada.

- Se lee a 546nm llevando a cero con el blanco del reactivo.

Cálculos: la absorbencia que de la muestra por un factor, el factor sale de 0.60 entre la absorbencia del estándar.

Nota: si quiero saber el BUN hago lo siguiente: divido 0.20 entre la absorbencia estándar y ese factor lo multiplico por la absorbencia de la muestra.

4.7.5Expresión del resultado. Mg/dl tanto para la urea como para el BUN.

4.7.6 Valores de referencia. BUN: 8 – 18 UREA: 20- 40

4.8 PROTEINAS TOTALES

4.8.1 Tipo de muestra. Suero

4.8.2 Principio del método. Los enlaces peptidicos de las proteínas reaccionan con el ion cúprico, en el medio alcalino, para dar un complejo color violeta, con máximo de absorción a 540nm, cuya intensidad es proporcional a la concentración de proteínas totales en la muestra.

4.8.3 Preparación del reactivo. Ya vienen listos para su uso.

4.8.4 Metodología. En un tubo de ensayo coloco:

3.5ml del reactivo50 landas de la muestraEspero 15 minutos a 37°C.

Leo la absorbencia frente al blanco del mismo reactivo; con anterioridad se ha hecho lo mismo con el estándar de proteínas y me da un factor o la absorbencia.

Hago cálculos así: Abs de la muestra ---------------------- x concentración Abs del estándar

4.8.5 Expresión del resultado. gr/dl

4.8.6 Valores de referencia. 6.1 a 7.9

4.9 ALBUMINA

4.9.1 Tipo de muestra. Suero

4.9.2 Principio del método. La albúmina reacciona específicamente sin separación previa con la forma aniónica de al Bromocresolsufonftaleina (BCF) en la presencia de un exceso de colorante en medio tamponado a PH 3.8 el aumento de la absorbencia a 625nm respecto al blanco del reactivo es proporcional a la cantidad de albúmina presente en la muestra.

4.9.3 Preparación de reactivos. Ya vienen listos para su uso.

4.9.4 Metodología. En un tubo de ensayo coloco

3.5 ml del reactivo

10 landas de la muestra

Espero 15 minutos a temperatura ambiente.

Leo a 620nm contra blanco de reactivo. Con anterioridad he hecho lo mismo con el estándar y he sacado mi factor o su absorbencia.

Los cálculos se hacen así: Abs de la muestra ---------------------- x concentración del estándar Abs del estándar

4.9.5 Expresión del resultado. gr/dl

4.9.6 Valores de referencia. 3.5 a 4.8

4.10 BILIRRUBINAS

4.10.1 Tipo de muestra. Suero plasma

4.10.2 Principio del método. La bilirrubina reacciona con el ácido sulfanilico diazotado para formar un compuesto azóico cuyo color es proporcional a la concentración de bilirrubina.

4.10.3 Preparación de reactivos. Los reactivos ya vienen listos para su uso.

4.10.4 Metodología. Pipetear en tubos de ensayo así:

TOTAL DIRECTA BLANCO MUESTRA BLANCO MUESTRA

Reactivo 1. ------------ 50 landas ------------ 50 landas Reactivo 2. 100 landas 100 landas 100 landas 100 landas

Reactivo 3. 0.5 ml 0.5 ml ------------- ----------

S. Salina ------------ ------------- 1ml 1ml

Muestra 100 landas 100 landas 100 landas 100 landas Mezclar y dejar reposar 5 min. mezclar y dejar reposar A T ambiente. Exactamente 5 min. a T. Ambiente. Leer inmediatamente contra el

blanco. Hago cálculos así:

abs x 14,5 Reactivo 4. 0.5 ml 0.5ml Mezclo y leo la absorbencia Contra blanco y hago cálculos

Cálculos: la bilirrubina total se lee a 578nm y la absorbencia que dé se multiplica por 10,7.

La bilirrubina directa se lee a 546nm y la absorbencia que de se multiplica por 14,3

4.10.5 Expresión del resultado. mg/dl

4.10.6 Valores de referencia. B Total Hasta 1

B. Directa Hasta 0.25

4.11 CALCIO

4.11.1 Tipo de muestra. Suero plasma

4.11.2 Principio del método. El calcio reacciona con la cresolftalein complexona (Cfx) a Ph 11, dando un complejo de adicción color magenata que se mide fotocolorimetricamente a 570nm.

4.11.3 Preparación de reactivos. Los reactivos ya vienen listos para su uso

4.11.4 Metodología. Se trabaja directamente en las cubetas del equipo así:

3.5ml de Buffer tanto como para la muestra como para el estándar.

50 landas de Cfx tanto a muestra como a estándar

Leer la absorbencia de estos a 550nm

Luego se le adicionan 20 landas tanto de la muestra como de la estándar

Se mezcla bien y luego esperamos 10 minutos a T. Ambiente

Leer la absorbencia. Se resta la primera lectura a la segunda y con estas trabajamos.

4.11.5 Cálculos Abs de la muestra ----------------------- x concentración del estándar Abs del estándar

4.11.6 Expresión del resultado. mg/dl

4.11.7 Valores de referencia. Suero: 8.5 a 10.5

4.12 AMILASA

4.12.1 Tipo de muestra. Suero plasma

4.12.2 Principio del método. El sustrato de almidón tamponado se incuba con la muestra, podruciéndose la hidrólisis enzimática. Esta se detiene por el agregado de reactivo de yodo, que al mismo tiempo produce color con el remanente de almidón hidrolizado. La disminución de color respecto de un sustrato color (sin muestras) es la medida de la actividad enzimática, que se expresa en unidades Amiloliticas (Smith & Roe)/dl

4.12.3 Preparación de reactivos. Los reactivos vienen listos para usar.

4.12.4 Metodología. Marco dos tubos uno como control y otro como muestra y procedo así:

- A ambos adiciono 0.5ml de sustrato.

- 10 landas de muestra al tubo marcado como muestra.

- Incubo los dos tubos a 37°C por 7 minutos y 30 segundos.

- Luego adiciono 0.5ml del yodo a los dos.

- 4ml de agua destilada a los dos.

- Leo la absorbencia a 620nm leyendo primero el control y anotando y luego si la muestra y procedo a hacer el cálculo así:

4.12.5 Cálculos Abs control-Abs muestra --------------------------------- x 100 Absor Control

Se hace lo mismo con la orina. Con respecto a la técnica la diferencia radica en una dilución que se le hace a la orina, llevando el volumen miccionado (después de 2 horas de la determinación en sangre) a 200ml.

4.12.6 Expresión del resultado. Unidades amiloliticas por decilitro (U.A/dl)

4.12.7 Valores de referencia. Suero Menor de 120, Orina menor de 260.

4.13 FOSFATASA ALCALINA

4.13.1 Tipo de muestra. Suero o plasma

4.13.2 Principio del método. P-Nitrofenilfosfato por medio de la fosfatasa alcalina produce P-nitrofenol más fosfato que se lee espectofotometricamente.

4.13.3 Metodología.

- En un tubo de ensayo adiciono 2ml de reactivo de trabajo.

- Mezclo y adiciono 5 landas de muestra.

- Incubo 10 minutos a 37°C.

- Adiciono 100 landas de muestra.

- Se mete en el equipo se lee a 546nm la absorbencia, le resto el blanco de reactivo y hago cálculos.

4.13.4 Cálculos.

Abs de la muestra por un factorEl factor se saca de la división de la concentración del estándar sobre la absorbencia del mismo.

Nota: la absorbencia del estándar es de 200.

4.13.5 Expresión del resultado. Unidades por litro (U/L).

4.13.6 Valores de referencia.

Adultos 50-250Recién nacidos 150-60014 a 15 años 170 a 970 Varones

4 a 15 años 170 a 480 Mujeres

4.14 TRANSAMINASAS

4.14.1 Principio del Método: La GOT cataliza la siguiente reacción: L-aspartato más alfacetoglutarato por acción de la GOT se convierte en glutamato más oxaloacetato.

La GPT cataliza la siguiente reacción: L-alanina más lafacetoglutarato se convierte por medio de la GPT en glutamato más piruvato.

El piruvato formado (en oxaloacetato es inestable y se transforma en piruvarto) reacciona con la 2.4 adinitrofenilhidracina produciéndose, en medio alcalino, un compuesto coloreado que se mide a 546nm .

4.14.2 Preparación de los Reactivos: El único que no prevee listo para usar es el diluyente para enzimas que se prepara diluyendo a un litro con agua destilada según las inidicaciones del rótulo.

4.14.3 Metodología: En un tubo de ensayo adiciono:

0.25cc de reactivo de GOT o GPT.

50 landas de muestra.

Incubo a 37ºC por 30 minutos.

Después de ese tiempo le adiciono el 2.4 dinitrofenil, 0.25ml.

Luego incubo por 10 minutos a 37ºC.

Después de ese tiempo leo en el equipo la absorbancia a 546nm.

Le resto el blanco (que se monta de la misma forma que se monta la muestra).

Y busco de esa lectura que me da en una tabla que viene con los reactivos, dicha lectura corresponde a la cantidad de actividad de la enzima.4.14.4 Tabla

4.14.5 Expresión del Resultado: U/L .

4.14.6 Valores de Referencia: Hasta 12.

4.15 HIERRO

4.15.1 Tipo de Muestra: Suero.

4.15.2 Principio del Método: El hierro sérico se libera de su unión con su proteina y transportadora específica, la transferrina, en Buffer succinato de Ph 3.7 y en

presencia de un reductor, el ácido mercaptoacetico posteriormente reacciona con en reactivo de color, PIRIDIL BIS FENIL TRIAZINA SULFONATO (PBTS)dando un complejo color magenata que se mide a 560nm .

4.15.3 Preparación de Reactivos: Listo para su uso.

4.15.4 Metodología: En tubos de ensayo adiciono:

500 landas de suero o estándar.

2ml de Buffer reductor.

Mezclo y leo esos blancos contra agua destilada a 546nm los anoto.

Agrego entoces una gota de reactivo PBTS a cada tubo.

Hacemos la lectura a 546nm antes que pasen 10 minutos contra blanco de agua destilada.

Hago cálculos.

Nota: Estos tubos deben ser limpios.

4.15.5 Cálculos: Se le restan los respectivos blancos a la determinación ya sea estándar y se multiplican por un factor.

El factor sale de la división de la concentración del estándar que es 100 entre su densidad óptica.

4.15.6 Expresión del Resultado: Microgramos por decilitro (ug/dl).

4.15.7 Valores de Referencia: Varones 114.6 Mujeres 103.3

4.16 FOSFORO

4.16.1 Tipo de Muestra: Suero.

4.16.2 Principio del Método: El fosfato inorgánico reacciona en medio ácido con el molibdato para dar fosfomolibdato, que es reducido por el ácido ascórbico a azul de molibdeno, desarrollándose el color en medio arsenito/citrato. Este último se combina con el exceso de molibdato impidiendo su reacción posterior con el fosfato liberado de los esteres labilies. El color obtenido se mide entre 620 y 650.

4.16.3 Preparación de los Reactivos: Viene listos para su uso.

4.16.4 Metodología: En tubo totalmente limpio colocar:

20 landas de muestra y estándar.

1 ml de reactivo 1 a los tubos blancos muestra o estándar.

Dejo pasar más o menos 30 segundos y adiciono el reactivo No.2 (1ml)

Dejo pasar más o menos 30 segundos y adiciono el reactivo No.3 (1.5ml)

Entre reactivo y reactivo se debe mezclar.

Después de pasados 10 minutos retiro del baño serológico (ellos están metidos en el baño desde el inicio).

Leo a 620nm contra el blanco.

Luego si hago los cálculos.

4.16.5 Cálculos: Multiplico la densidad que me da la muestra por un factor.

Dicho factor sale de la división de la concetración del patrón que es de 4mg/dl sobre su densidad óptica.4.16.6 Expresión del Resultado: Mg/dl

4.16.7 Valores de Referencia: adultos 2.5 a 4.5 mg/dl Niños 4.0 a 6.5 mg/dl