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PAMR Fecha: Agosto 2011 Versión: 02 Página 1 de 50

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RREEDD DDEE MMIICCOOLLOOGGIIAA

GGCCBBAA

Elaborado por: RNegroni, L.Guelfand, M.C.Perrone Fecha: 6 de mayo 2008 Version original

Aprobado por: Integrantes y Coordinador de la RM Fecha: Agosto 2011

Revisado por: A. Romeo, L. Guelfand Fecha: Julio 2011


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PAMR Fecha: Mayo 2011 Versión: 02 Página 2 de 50

INDICE

1.- REACTIVOS PARA OBSERVACION MICROSCOPICA 1.1 HIDRÓXIDO DE POTASIO (KOH) al 40%.....................................................................pág. 6 1.2 .a HIDRÓXIDO DE POTASIO CON TINTA PARKER....................................................pág. 6 1.2 .b HIDRÓXIDO DE POTASIO CON TINTA PARKER modificada…………………….. 1.3 HIDROXIDO DE POTASIO CON DIMETILSULFÓXIDO ...............................................pág. 7 1.4 BLANCO CALCOFLUOR...............................................................................................pág. 7 1.5 TINTA CHINA..................................................................................................................pág. 8 1.6 COLORACIÓN DE GIEMSA...........................................................................................pág. 9 1.7 GRAM............................................................................................................................pág. 10 1.8 AZUL DE METILENO ...................................................................................................pág. 12 1.9 KINYOUN .....................................................................................................................pág. 13 1.10 GRAM-WEIGERT .......................................................................................................pág. 14 1.11.a GROCOTT-METENAMINA PLATA .........................................................................pág.15 1.11.b COLORACIÓN ABREVIADA DE GROCOTT..........................................................pág.18 1.12 AZUL DE O TOLUIDINA modificado .........................................................................pág.19 1.13 INMUNOFLUORESCENCIA (para Pneumocystis spp) ...........................................pág.20 1.14 PAS (Acido periódico Schiff) ....................................................................................pág.21 1.15 MUCICARMIN DE MAYER..........................................................................................pág.23 1.16 ALCIAN BLUE DE LISON...........................................................................................pág.24 2.- LÍQUIDOS PARA MONTAR CULTIVOS 2.1 AZUL DE LACTOFENOL ..............................................................................................pág.25


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2.2 COLORANTE DE GUEGUEN .......................................................................................pág.26 3.- SOLUCIONES DE TRABAJO 3.1 SOLUCION MADRE DE ANTIBIÓTICOS .....................................................................pág.26 3.2 SOLUCIONES MADRES DE VITAMINAS ....................................................................pág.27 3.3 SOLUCIÓN MADRE DE CICLOHEXIMIDA ..................................................................pág.27 4.- MEDIOS DE CULTIVO 4.1 AGAR GLUCOSADO DE SABOURAUD......................................................................pág.28 4.2 AGAR SABOURAUD DEXTROSA ...............................................................................pág.28 4.3 AGAR MIEL DE SABOURAUD.....................................................................................pág.29 4.4 LACTRIMEL...................................................................................................................pág.29 4.5 AGAR BANANA-AVENA-LECHE.................................................................................pág.30 4.6 AGAR PAPA GLUCOSADO .........................................................................................pág.30 4.7 AGAR CEREBRO CORAZÓN.......................................................................................pág.30 4.8 AGAR V8........................................................................................................................pág.31 4.9 MEDIO DE GORODKOWA............................................................................................pág.31 4.10 MEDIO DE THAYER-MARTIN.....................................................................................pág.32 4.11 AGAR AGUA ...............................................................................................................pág.32 4.12 AGAR CZAPEK ...........................................................................................................pág.32 4.13 AGAR SABOURAUD CON CICLOHEXIMIDA Y CLORANFENICOL........................pág.33 4.14 AGAR PAPA- ZANAHORIA........................................................................................pág.33 4.15 AGAR DIXON Modificado ..........................................................................................pág.33 4.16 MEDIO Dermatophyte Test Medium (DTM) ..............................................................pág.34


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5.- MÉTODOS DE PRESERVACIÓN DE CULTIVOS 5.1 MÉTODO DE SABOURAUD .........................................................................................pág.35 5.2 MÉTODO DE CASTELLANI O DEL AGUA DESTILADA ............................................pág.36 5.3 PRESERVACIÓN DE CEPAS POR CONGELACIO.....................................................pág.36 6.- PRUEBAS PARA IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES FÚNGICAS 6.1 PRUEBA DEL TUBO GERMINATIVO (TG)..................................................................pág.37 6.2 AGAR HARINA DE MAIZ CON TWEEN 80..................................................................pág.37 6.3.a AGAR CROMOGÉNICO PARA LEVADURAS..........................................................pág.38 6.3.b AGAR CROMOGÉNICO MODIFICADO (CMA)………………………………………..pág.38 6.3.c AGAR CREMOPHOR EL (EL SLANT)………………………………………………… pág.39 6.3.d AGAR TWEEN ESCULINA (TE SLANT)……………………………………………… pág.39 6.4 AGAR LECHE CON TWEEN 80....................................................................................pág.39 6.5 AGAR SEMILLA DE GIRASOL.....................................................................................pág.40 6.6. a AGAR TABACO .......................................................................................................pág.41 6.6. b AGAR TABACO Modificado ....................................................................................pág42 6.7 AGAR DE STAIB (Guizotia abyssínica) ...................................................................pág.42 6.8 MEDIO DE SALKIN ......................................................................................................pág.43 6.9 MEDIO CGB...................................................................................................................pág.44 6.10 MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DE UREASA......................................................pág.44 6.10.1 UREA DE CHRISTENSEN .......................................................................................pág.45 6.10.2 TEST DE UREA RAPIDO.........................................................................................pág.45 6.10.3 TABLETAS DE UREA (Rosco) ..............................................................................pág.45 6.11 ASIMILACION DE TREHALOSA RAPIDA .................................................................pág.46


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7.- HEMOCULTIVOS 7.1 TUBOS PARA LA RECOLECCIÓN DE HEMOCULTIVOS..........................................pág.46 8.- REACTIVOS PARA INMUNODIAGNÓSTICO 8.1 MEDIO PARA INMUNODIFUSIÓN (ID) ........................................................................pág.46 8.2 AGAROSA PARA CONTRAINMUNOELECTROFORESIS (CIE) ................................pág.47 9.- MEDIOS PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD ANTIFÚNGICA 9.1 MEDIO DE SHADOMY Modificado ..............................................................................pág.48 9.2 MUELLER HINTON CON GLUCOSA Y AZUL DE METILENO ...................................pág.48 9.3 MEDIO RPMI PARA REALIZAR CIM ...........................................................................pág.49


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1.- REACTIVOS UTILIZADOS PARA OBSERVACION MICROSCOPICA 1.1 HIDRÓXIDO DE POTASIO (KOH) al 40% Principio El KOH disuelve la queratina y aclara la preparación sin afectar la morfología de los elementos fúngicos, permitiendo una mejor visualización de los mismos. Preparación del reactivo Hidróxido de potasio (lentejas) ------------------------------ 40 g * Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml Conservar a temperatura ambiente. Para la obtención de preparaciones más duraderas, agregar glicerina al 10% que reduce la evaporación. Control de Calidad Colocar una gota del reactivo entre porta y cubre, observar con 400x, chequear ausencia de esporas de hongos y bacterias. Descripción de la técnica Colocar una gota de KOH 40% en el centro de un portaobjetos limpio, ubicar la muestra en el KOH y cubrir con cubreobjetos. Dejar digerir 10 min. El efecto aclarante se acelera calentando la preparación suavemente a la llama hasta el desprendimiento de las primeras burbujas. Resultado Los dermatofitos se observan como hifas hialinas, tabicadas y ramificadas de 4 a 6 µm de diámetro. Las levaduras se visualizan como elementos esféricos u ovalados (blastosporos) que pueden presentar brote y/o seudohifas. Los hongos miceliales se ven como hifas hialinas o pigmentadas, tabicadas o no, de diámetro irregular según el hongo al que corresponde. Nota: Se puede utilizar concentraciones de OHK de 10 al 40%, para ello solo se debe pesar 10, 20 o 30 gr y asi obtener una solucion de OHK al 10%, 20% o 30%. 1.2.a HIDRÓXIDO DE POTASIO CON TINTA PARKER SUPER QUINK de PARKER (azul negro permanente)


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Principio Ídem 1.1. La tinta azul negra pigmenta la pared de los hongos y permite una mejor visualización de los mismos. Preparación del reactivo Hidróxido de potasio al 40% ----------------------------------10 ml Tinta azul negra permanente* (Quink de Parker)--------10 ml Conservar a temperatura ambiente (*) Puede ser otro color de tinta, pero debe ser como “Permanente” y Quink-Parker Control de Calidad Colocar una gota del reactivo entre porta y cubre, observar con 400x, chequear ausencia de esporas de hongos y bacterias. Descripción de la técnica Ídem 1.1 Resultado Los filamentos y levaduras toman la tinta y aparecen color azul. Es particularmente útil para la detección de Malassezia spp en escamas cutáneas. 1.2.b HIDRÓXIDO DE POTASIO CON TINTA PARKER SUPER QUINK de PARKER modificado Principio Ídem 1.2.a. Para mantener los preparados por varios dias, se debe incluir glicerina Preparación del reactivo Solución I: Hidróxido de potasio al 20% ------------------------------- 100 ml Glicerina--------------------------------------------------------- 10 ml Mantener a temperatura ambiente por 1 año. Solución de trabajo: Solución I------------------------------------------------------------ 1,5 ml Cartucho de Tinta negra permanente(Quink Parker)---- 1,0 ml


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Conservar a temperatura ambiente (*) Puede ser otro color de tinta, pero debe ser como “Permanente” y Quink-Parker Control de Calidad Ídem 1.2.a Descripción de la técnica Ídem 1.2.a Resultado Ídem 1.2.a 1.3 HIDROXIDO DE POTASIO CON DIMETILSULFÓXIDO (DMS) Principio Ídem 1.1. El agregado de DMS reduce o elimina la necesidad de calentar el preparado Preparación del reactivo Hidróxido de potasio --------------------------------------------- 20 g Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml Dimetilsulfóxido al 40% -------------------------------------- 100 ml Conservar a temperatura ambiente en frasco color caramelo. Control de Calidad Colocar una gota del reactivo entre porta y cubre, observar con 400x, chequear ausencia de esporas de hongos y bacterias. Descripción de la técnica Ídem 1.1 realizando la primera observación, sin calentar el preparado a la llama. Resultado Ídem 1.1 1.4 BLANCO CALCOFLUOR (Calcofluor white) (CFW)


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Principio El CFW es un colorante fluorocrómico no específico, que se une a la quitina y celulosa de la pared de los hongos. Tiene el inconveniente de exigir para la observación del preparado, la utilización de un microscopio de fluorescencia. Ha sido recomendado para el estudio de las muestras poco parasitadas. De los diversos fluorocromos usados, el Blankophor tiene la ventaja de disolverse con facilidad en el KOH. Preparación del reactivo Solución A: Calcofluor white MR2 ---------------------------------------- 100 mg Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml Calentar suavemente. Conservar en frasco color caramelo Solución B: Hidróxido de potasio 10%-40% Control de Calidad Seguir el procedimiento utilizando una Candida albicans ATCC. Se debe observar una fluorescencia brillante de las células de levaduras. Colocar una gota del reactivo entre porta y cubre, observar con 400x, chequear ausencia de esporas de hongos y bacterias. Descripción de la técnica Mezclar una gota de solución A con una gota de solución B sobre un portaobjetos, ubicar la muestra y colocar un cubreobjetos. Calentar suavemente sobre la llama, incubar de 5 a 10 min y observar el preparado con microscopio de fluorescencia, bajo luz UV, rango 300 a 440nm (según la marca del microscopio empleado). Resultado Las formas fúngicas exhiben en su perímetro fluorescencia azul brillante 1.5 TINTA CHINA (TCH) Principio La TCH es útil para observar la presencia de la cápsula de Cryptococcus spp (Cn), basada en la coloración negativa. La cápsula repele las partículas de carbón de la TCH dando un halo claro, bien demarcado alrededor de cada célula capsulada.

Eliminado: ¶


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Preparación del reactivo Puede prepararse con o sin el agregado de Tween 80 y solución de mertiolate comercial o preparada, que se utiliza para inhibir el desarrollo de microorganismos. Tinta china---------------------------------------------------------- 5 ml Solución fisiológica ----------------------------------------------- 5 ml Tween 80 ---------------------------------------------------------0.1 ml Solución de mertiolato-borato de sodio -------------- 0.1 ml (*) (*) Solución de mertiolato-borato de sodio: Mertiolato de sodio -------------------------------------------------1 g Borato de sodio -------------------------------------------------- 1.4 g Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml Disolver primero el borato de sodio y luego el mertiolato. Conservar a temperatura ambiente. Control de Calidad Colocar una gota del reactivo entre porta y cubre, observar con 400x, chequear ausencia de esporas de hongos y bacterias. Descripción de la técnica Colocar una gota de TCH y luego una gota del sedimento (fluido corporal, orina, LCR) en un portaobjetos limpio, mezclar y cubrir con cubreobjetos. Examinar al microscopio con objetivo de 10x, 20x y confirmar con 40x. Resultados La presencia de levaduras con o sin brote, con halo claro alrededor de la célula fúngica que indica presencia de cápsula. Se debe tener en cuenta que los glóbulos blancos pueden repeler las partículas de carbón de la TCH, pero presentan un halo irregular con granulaciones internas y membrana nuclear, y la imagen no se observa tan nítida como la pared del Cn. 1.6 COLORACIÓN DE GIEMSA (GI) Principio Esta coloración es útil para búsqueda de levaduras intracelulares, como la fase tisular del Histoplasma capsulatum (Hc) y Penicillium marneffei (Pm); observar los


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cuerpos intraquísticos (CI) (ascosporos) de Pneumocystis jirovecii (Pj), describir la citología de las muestras clínicas y para descartar infecciones virales producidas por Herpes, Citomegalovirus (CMV) y Molluscum contagiosum. Preparación del reactivo Metanol 100%, Giemsa diluído 1/10 con agua destilada o agua de la canilla. La preparación debe realizarse en el momento de usar. Control de Calidad No está estandarizado, sin embargo puede utilizarse un frotis de sangre y observar la coloración de los glóbulos blancos que tendrán un citoplasma celeste claro (mononucleares) y violeta rosado (polimorfonucleares) con sus granulaciones características Descripción de la técnica Fijar la muestra con metanol por 1 min., luego inundar el extendido con la dilución de Giemsa por 20 min. Lavar el preparado con abundante agua de la canilla y dejar secar al aire. Resultado Permite observar levaduras pequeñas y ovales en el interior de los macrófagos. En el caso de Hc las levaduras se tiñen en casquete de color azul, con un halo claro debido a que la pared del hongo no se colorea con este colorante. En Pm las células fúngicas presentan en su interior un tabicamiento transversal. En los pacientes inmunosuprimidos graves, se pueden observar estos elementos fuera de los macrófagos. Para Pj esta coloración tiñe solamente los cuerpos intraquísticos (CI) (ascosporos) o formas tróficas, observándose el citoplasma de color celeste y pequeños núcleos de color rojo-púrpura. La pared del quiste (asco) no se tiñe y se ve un halo claro alrededor de los CI, observándose generalmente en grupos o “clusters” y ocasionalmente en macrófagos. El porcentaje de sensibilidad de esta técnica para detectar Pj varía del 70 al 92% según diferentes autores y dependiendo del material respiratorio analizado. 1.7 GRAM (Modificado por Hucker) Principio Esta coloración es utilizada para clasificar microorganismos en base a su tamaño, forma, morfología celular y reacción de Gram.


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Preparación del reactivo Solución A-1 (Cristal violeta) Cristal violeta ---------------------------------------------------------2g Alcohol etílico (95%) --------------------------------------------10 ml Disolver el colorante en el alcohol Agua destilada---------------------------------------------------100ml Filtrar por papel Solución A-2 (Oxalato de amonio) Oxalato de amonio --------------------------------------------------4g Agua destilada---------------------------------------------------400ml Mezclar Solución A-1 con A-2 Solución B (Lugol) Yodo --------------------------------------------------------------------1g Yoduro de potasio ---------------------------------------------------2g Disolver completamente en 5 ml de agua destilada Agua destilada c.s.p ----------------------------------------- 240 ml Bicarbonato de sodio 5% --------------------------------------60 ml Conservar en botella de vidrio color caramelo Solución C (Decolorante) Etanol 95% --------------------------------------------------------70 ml Acetona ------------------------------------------------------------30 ml Solución D (Contracolor) Safranina O (*) -------------------------------------------------------1g Etanol 95% --------------------------------------------------------40 ml Disolver el colorante en el alcohol Agua destilada-------------------------------------------------- 400 ml (*) se puede reemplazar por fucsina fenicada diluída 1/50 Como alternativas de las soluciones A-1 y A-2 puede emplearse la siguiente solución: Cristal violeta --------------------------------------------------------5 g Fenol ----------------------------------------------------------------- 20 g Etanol Absoluto --------------------------------------------------10 ml Agua destilada c.s.p.---------------------------------------- 1000 ml


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Control de calidad Gram Negativo: Escherichia coli ATCC 25922 Gram Positivo: Staphylococcus aureus ATCC 25923 Descripción de la técnica Preparar extendidos delgados. Fijar el material con calor ó metanol. Colorear con la Solución A por 30 segundos, lavar con agua corriente. Inundar con la Solución B, dejar 30 segundos y lavar con agua corriente. Decolorar 10 segundos con Solución C, dependiendo del grosor del preparado, lavar con agua corriente. Teñir con Solución D durante 30 segundos, lavar con agua corriente. Secar el extendido al aire. Resultado Gram positivo: Azul violeta Gram negativo: Fucsia (de rosa a rojo) Los hongos son Gram positivos (Ej. Candida spp) pero algunos se colorean parcialmente (Ej. Cryptococcus neoformans), otros se observan como Gram variable (Ej. Blastomyces dermatitidis) ó Gram negativo (Ej. Pneumocystis spp y Zygomycetes). 1.8 AZUL DE METILENO (AM) Principio El AM tiñe la pared del hongo permitiendo una fácil visualización. Se utiliza para la búsqueda de Malassezia spp. Preparación del reactivo Azul de Metileno ----------------------------------------------------1 g Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml Conservar a temperatura ambiente Control de Calidad Colorear una preparación con células siguiendo el procedimiento y observar con 400x. Se observan células teñidas de azul (núcleos y citoplasma) con un fondo celeste claro Descripción de la técnica


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Preparar el extendido con el producto del raspado de la lesión y suero para pegar las escamas. Dejar secar al aire. Inundar el preparado lentamente (para no despegar el material) con el colorante AM, dejar durante 1 minuto. Lavar el extendido suavemente por inmersión en agua, dejar secar al aire y observar con objetivo de 40x y de inmersión. Se observan filamentos flexuosos, tabicados y cúmulos de blastosporos esféricos de 3 a 8 µm de diámetro de color azul. 1.9 KINYOUN (Modificado para Nocardia) Principio Se utiliza para la detección de los microorganismos ácido-resistentes (Ej. Nocardia spp) y permite diferenciarlos de otros Actinomycetes. Preparación del reactivo Solución A: Fucsina fenicada Fucsina básica ------------------------------------------------------4 g Fenol cristalizado ------------------------------------------------- 8 ml Alcohol etílico 95% ----------------------------------------------20 ml Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml Disolver el colorante en el alcohol y luego agregar el agua y el fenol Solución B: Decolorante Acido sulfúrico concentrado------------------------------------ 1 ml Agua destilada----------------------------------------------------99 ml Agregar el ácido al agua, no viceversa Solución C: Contracolor Azul de metileno ------------------------------------------------- 2.5 g Etanol 95% ------------------------------------------------------ 100 ml Descripción de la técnica Preparar el extendido y fijarlo a la llama, cubrir luego con papel de filtro. Inundar el portaobjeto con la solución A durante 5 minutos. Volcar el exceso de colorante y lavar con agua corriente. Decolorar con la solución B y lavar con agua. Colocar la


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solución C por 1 minuto, lavar con agua corriente y dejar secar al aire. Observar con objetivo de inmersión (100x). Resultado Los microorganismos ácido resistentes se tiñen de color rosa a rojo. Sirve también para detectar esporas sexuadas en los cultivos de levaduras. 1.10 GRAM-WEIGERT (GW) Principio Tiñe las paredes de los quistes (ascos) de Pneumocystis spp y de otros hongos. Esta coloración es muy útil en la detección de Actinomycetes anaerobios (Actinomyces spp) y aerobios (Nocardia, Actinomadura, Streptomyces, Nocardiopsis, Rhodococcus, Arachnia y Dermatophylus) Preparación del reactivo Solución A: Eosina Eosina Y --------------------------------------------------------------1 g Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml Solución B: Cristal Violeta B1 Anilina --------------------------------------------------------------- 2 ml Agua destilada----------------------------------------------------88 ml B2 Cristal Violeta --------------------------------------------------------5 g Etanol 95% --------------------------------------------------------10 ml Mezclar solución B1 y B2. Filtrar antes de utilizar. Estable por 3 meses. Solución C: Yodo Yodo ----------------------------------------------------------------- 1 g Yoduro de potasio ------------------------------------------------ 2 g Disolver completamente en 5 ml de agua destilada Agua destilada c.s.p. -------------------------------------------------300 ml Solución D: Anilina Aceite de anilina -------------------------------------------------- 5 ml


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Xileno ---------------------------------------------------------------- 5 ml Descripción de la técnica Fijar los frotis y secar al aire. Colorear con Solución A por 5 minutos y lavar con agua corriente. Teñir con Solución B 5 minutos y lavar con la Solución C, dejar el yodo 5 minutos. Lavar con agua y absorber el extendido con papel secante, secar al aire. Decolorar con Solución D, moviendo el portaobjeto suavemente hasta que no salga color púrpura. La utilización de una segunda decoloración ayuda a la evaluación de la coloración. Enjuagar con xileno, secar al aire y examinar el preparado con objetivo de inmersión (100x). Resultados Las paredes de los quistes (ascos) de Pneumocystis spp y el resto de los hongos, se tiñen de color azul-violeta irregular. Los quistes se observan como estructuras circulares o en forma de taza, de 5µm de tamaño. Las estructuras internas no se colorean. El fondo aparece de color rosado y los núcleos celulares se tiñen de rosa, pero algunos pueden retener el cristal violeta y confundirlos con quistes (ascos) de (Pj). En nuestra experiencia, el porcentaje de sensibilidad con esta técnica es semejante a la coloración de Giemsa. 1.11.a GROCOTT-METENAMINA PLATA (GMP) Principio Colorea la pared del hongo por la afinidad con los polisacáridos. Tiene la ventaja de teñir a los hongos muertos, situación que no ocurre con el PAS y otras coloraciones histológicas. Preparación del reactivo A) Soluciones de stock Pueden conservarse por tiempo indefinido Solución I: Metenamina (Hexametilentetramina ó Urotropina) ---------3g Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml Solución II: Nitrato de plata ------------------------------------------------------5 g Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml


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Solución IIl: Acido crómico--------------------------------------------------------5 g Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml Solución IV: Bórax ( uso fotográfico) -------------------------------------------5 g Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml Solución V: Bisulfito de sodio----------------------------------------------------1 g Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml B) Solución madre de metenamina-plata Solución I (Metenamina 3%)-------------------------------- 100 ml Solución II (Nitrato de plata 5%) ------------------------------ 5 ml Se forma un precipitado blanco que desaparece por agitación. Es conveniente prepararla cada vez que se realice la coloración C) Solución de trabajo de metenamina-plata Solución madre de metenamina - plata --------------------50 ml Solución IV (Bórax 5%) ----------------------------------------- 6 ml Agua destilada c.s.p.--------------------------------------------50 ml Esta solución de trabajo debe prepararse siempre en el momento de realizar la coloración D) Soluciones para los pasos optativos: Solución VI: Cloruro de oro ---------------------------------------------------- 0.1 g Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml Solución VII: Tiosulfato de sodio (Hipo) ------------------------------------- 2.5 g Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml Solución VIII:


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Verde luz S.F. (amarillo) --------------------------------------- 0.2 g Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml Ácido acético glacial -------------------------------------------0.2 ml En el momento de usar diluir 10 ml de la solución VIII en 50 ml de agua destilada. Solución IX Alumbre de hierro1 g Agua destilada c.s.p.100 ml Control de Calidad Colorear un preparado de Candida spp. Descripción de la técnica Si se utilizan cortes histológicos, se deben desparafinar. Oxidar con el ácido crómico (Solución III) por 1 hora, este paso se realiza colocando los portaobjetos sobre varillas y la droga no debe recuperarse luego de su uso. Lavar durante 10 minutos con agua corriente, cuidadosamente para evitar el desprendimiento del material (utilizar un vaso de Coplin y que el agua caiga sobre la parte trasera del portaobjetos). Enjuagar con agua destilada. Colocar las preparaciones sobre varillas y agar agar bisulfito de sodio (Solución IV) durante 1 minuto, lavar con agua corriente (en vaso de Coplin) por 10 minutos, enjuagar varias veces con agua destilada. Colorear con la solución de trabajo de metenamina plata durante 1 hora aproximadamente en estufa a 50 º C hasta que los cortes tomen un color pardo dorado. Este paso es clave para el resultado de la técnica, por lo tanto es necesario controlar cada 15 minutos para evitar la sobrecoloración. Enjuagar repetidas veces con agua destilada, deshidratar pasando por xilol y montar. Pasos optativos 1) Virado: se puede efectuar el virado con colururo de sodio (Solución VI) durante 3 minutos y luego Hiposufito de sodio (Solución VII) por 2 minutos. Deshidratar, pasar por xilol y montar. 2) Coloración de fondo: Se puede teñir con cualquier coloración que se desee, incluso con colorantes azules ó violáceos, ya que producen buen contraste con el negro. Pero para diagnósticos difíciles, es preferible no realizar coloración de fondo ó utilizar una coloración monocromática como el verde luz (Solución VIII) durante 30-45 minutos, deshidratar pasando por xilol y montar


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3) Sobreimpregnación: En caso de sobrecoloración argéntica, se puede decolorar con un baño de alumbre de hierro (Solución IX) y controlar visualmente; cuando se obtenga el tono deseado, lavar con agua destilada, deshidratar, pasar por xilol y realizar el montaje o la coloración de fondo. Resultados Los hongos se colorean de pardo dorado u oscuro debido a la impregnación argéntica. Esta técnica ha sido tradicionalmente considerada “Gold Standard” para la visualización de los quistes (ascos) de Pj, los cuales se colorean de marrón oscuro a negro y se observan con un pliegue interno (doble coma) de color negro. Las bacterias y algunos elementos tisulares (especialmente fibras elásticas) pueden teñirse de negro o gris. Los cuerpos amiláceos, frecuentemente en los materiales respiratorios, también son argentófilos y pueden confundirse con Cryptococcus y Paracoccidioides. En caso de utilizar “virado”, todos los hongos se tiñen de negro y el resto de los tejido se decoloran ligeramente. 1.11.b COLORACIÓN ABREVIADA DE GROCOTT Principio Idem 1.11.a Preparación del reactivo Solución I: Agua destilada----------------------------------------------------50 ml Bórax al 5% (p/v) ------------------------------------------------- 6 ml Solución II: Madre de Metenamina-plata Metenamina al 3% (p/v)----------------------------------------50 ml Nitrato de plata al 10% (p/v) ------------------------------- 1.25 ml Solución de trabajo: Mezclar partes iguales de solución I y solución II Solución de verde luz: Contracolor Verde luz--------------------------------------------------------------2 g Ácido acético-----------------------------------------------------0.2 ml Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml


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Control de Calidad Colorear un preparado de Candida spp. Descripción de la técnica Fijar el preparado con metanol hasta secado al aire (no lavar). Colocar ácido crómico al 10% sobre la muestra durante 15 minutos, luego lavar con agua corriente. Si se utilizan cortes histológicos parafinados, oxidar con ácido crómico al 5% (p/v) durante 1 hora, posteriormente lavar 10 minutos con agua corriente y enjuagar con agua destilada. Si se observa la muestra de color amarillo, agregar bisulfito de sodio al 1% (p/v) durante 1 minuto, esto es para eliminar el exceso de ácido crómico. Lavar con agua destilada 4 ó 5 veces. Sumergir en la solución colorante de metenamina-plata y calentar en microondas a una potencia de 60% durante 20 segundos, 5 ó 6 veces hasta que la muestra tome color pardo. Si no se dispone de microondas agregar solución colorante sobre la muestra y calentar con hisopo hasta color pardo- dorado. Lavar con agua corriente, agregar tiosulfato de sodio al 2% durante 2 a 5 minutos, para eliminar el exceso de plata, finalmente lavar con agua corriente y contracolorear con solución de verde luz diluído 1/20 durante 5 minutos. Se puede elegir otros contrastes como los azules ó rojos, pero este es el recomendado, deshidratar, pasar por xilol 10 segundos secar y montar. Luego observar con objetivo de 40x ó 100x. 1.12 AZUL DE O TOLUIDINA modificado (OT) Principio Colorea la pared del hongo por la afinidad con los polisacáridos. Preparación del reactivo Solución A ( reactivo de sulfatación) Ácido acético glacial --------------------------------------------90 ml Ácido sulfúrico concentrado-----------------------------------30 ml En un erlenmeyer sumergido en agua fría (no más de 10ºC), colocar el ácido acético glacial y agregar lentamente el ácido sulfúrico. Conservar esta solución a temperatura ambiente al abrigo de la luz. Cuando toma color deberá descartarse. Solución B: Azul de O-toluidina ---------------------------------------------0.64 g Agua destilada----------------------------------------------------30 ml Ácido clorhídrico fumante--------------------------------------- 1 ml


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Etanol absoluto---------------------------------------------------70 ml Colocar en un frasco color caramelo y bajo campano el azul de O- toluidina y el agua, agitar vigorosamente hasta disolver el colorante y agregar en este orden: 1 ml de ácido clorhídrico y 70 ml de etanol absoluto. Esta solución se mantiene estable durante 1 año a temperatura ambiente. Control de Calidad Colorear un preparado con suspensión de Candida albicans, observar a 40x las células de levaduras se observan de color violeta-púrpura Descripción de la técnica Fijar los extendidos con alcohol etílico absoluto durante 1 minuto, secar 5 minutos. Sumergir los vidrios en la Solución A durante 10 minuto homogeneizar cada 5 minutos para mezclar) y lavar suavemente con agua fría durante 5 minutos. Cubrir los extendidos con la Solución B durante 12 minutos y luego lavar con metanol 95% por 10 segundos, pasar los extendidos por etanol absoluto otros 10 segundos, aclarar con xilol 10 segundos, secar al aire y examinar con objetivo de inmersión (100x). Resultados La pared quística (asco) del Pneumocystis se colorea de violeta-púrpura y se observa un pliegue interno (doble coma) teñido de violeta oscuro. 1.13 INMUNOFLUORESCENCIA (para Pneumocystis spp) Principio Utiliza anticuerpos monoclonales marcados con isotiocianato de fluoresceína: técnica de IFD (inmunofluorescencia directa). Estos anticuerpos están dirigidos contra la pared celular y antígenos del microorganismo. Se debe utilizar un microscopio de Inmunofluorescencia para su observación. Preparación del reactivo Según instrucciones del fabricante del reactivo comercial Control de Calidad Según instrucciones del fabricante del reactivo comercial Descripción de la técnica


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Colocar el material sobre un portaobjeto y secar al aire, luego sumergir en acetona fría durante 15 minutos, finalmente dejar secar al aire y realizar la coloración según instrucciones del fabricante. Resultado Se observa la morfología característica del Pneumocystis en color verde manzana fluorescente y el fondo del preparado se observa rojizo. La sensibilidad de la técnica para esputos inducidos es del 90% aproximadamente. 1.14 PAS (Ácido periódico Schiff) Principio Colorea la pared del hongo por afinidad a las mucoproteínas y mucopolisacáridos. Preparación del reactivo Solución A: Ácido periódico Ácido periódico --------------------------------------------------- 0.4 g Alcohol 95%-------------------------------------------------------35 ml Disolver y agregar Acetato de sodio 0.2 M------------------------------------------ 5 ml (27.2 g en 1000 ml de agua destilada) Conservar y usar a temperatura ambiente (22-25ºC), si toma color pardo desechar. Solución B: Baño reductor Ioduro de potasio ---------------------------------------------------1 g Tiosulfato sódico ----------------------------------------------------1 g Alcohol 96%-------------------------------------------------------30 ml Agua destilada----------------------------------------------------20 ml Se forma un depósito de azufre que puede despreciarse. Conservar a temperatura ambiente (22-25ºC). No dura más de 14 días. Solución C: Reactivo de Schiff Fucsina básica ------------------------------------------------------1 g Agua destilada-------------------------------------------------- 400 ml


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En un erlenmeyer colocar el agua y se calienta hasta ebullición. Se disminuye la llama y cuando desaparece el burbujeo, se añade la fucsina. Enfriar a 50ºC y filtrar. Agregar: Cloruro de tionilo-------------------------------------------------- 1 ml Mantener en la oscuridad por 12 horas Aclarar mediante agitación durante 1 minuto con: Carbón activado-----------------------------------------------------2 g Filtrar, guardar en la oscuridad a 0-4 º C. Utilizar a temperatura ambiente y en la oscuridad. Solución D: Azul de celestino Alumbre de hierro------------------------------------------------ 2.5 g Agua destilada----------------------------------------------------50 ml Disolver y dejar en reposo toda la noche a temperatura ambiente, luego agregar: Azul de celestino R---------------------------------------------0.25 g Hervir durante 3 minutos, filtrar una vez frío y agregar 7 ml de glicerol Solución E: Anaranjado G Anaranjado G --------------------------------------------------------2 g Ácido fosfotúngstico sol. acuosa 5%---------------------- 100 ml Dejar en reposo y utilizar el sobrenadante. Descripción de la técnica Lavar los cortes en alcohol 70%, sumergirlos en Solución A 5 minutos y lavar con alcohol 70%. Llevarlos al baño reductor con la Solución B 1 minuto y lavar con alcohol 70%. Sumergir en Solución C durante 20 minutos y lavar con agua corriente durante 10 minutos. Teñir con Solución D de 5 a 6 minutos. Diferenciar en alcohol ácido al 1%, lavar con agua corriente 30 minutos. Colorear el fondo con la Solución E durante 10 segundos. Lavar en agua hasta que los cortes queden de color amarillo pálido (30 segundos). Deshidratar, pasar por xilol, agregando líquido de montar y cubrir con un cubreobjetos. Resultados Las mucoproteínas y mucopolisacáridos neutros se tiñen de color rojo púrpura intenso. Permite visualizar con mayor detalle la pared de Coccidioides spp y contrastarlo con los esporos. En la histoplasmosis es la técnica por elección para


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cortes histológicos, debido a que se observa con nitidez la pared del hongo “en negativo”, en contraste con la membrana plasmática bien teñida. Colorea bien la cápsula gelatinosa de Cryptococcus neoformans. En paracoccidioidomicosis, aspergilosis, candidiasis y maduromicetomas los resultados son muy buenos pero no alcanzan a superar los obtenidos con la coloración de metenamina-plata. 1.15 MUCICARMIN DE MAYER Principio Colorea los mucopolisacáridos de la cápsula de Cryptococcus spp en los cortes histológicos. Preparación del reactivo Solución A: hematoxilina férrica de Weigert A-1 Hematoxilina ---------------------------------------------------------1 g Alcohol 95%----------------------------------------------------- 100 ml A-2 Cloruro férrico (sol. Acuosa 29%)4 ml Agua destilada----------------------------------------------------95 ml Ácido clorhídrico concentrado1 ml En el momento de usar mezclar partes iguales de A-1 y A-2 Solución B: Colorante Mucicarmín Carmín-----------------------------------------------------------------1 g Cloruro de aluminio anhidro---------------------------------- 0.5 g Agua destilada----------------------------------------------------20 ml Para disolver los componentes agitar constantemente sobre un mechero con llama pequeña. Solución C: Amarillo-Metanil Amarillo-metanil -------------------------------------------------25 mg Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml Ácido acético glacial ----------------------------------------- 0.25 ml Preparar el colorante en un tubo de ensayo y calentar suavemente en la llama hasta que se torne siruposo y negro. Agregar 100 ml de alcohol 50%, dejar reposar 24 horas, filtrar y diluir con agua.


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Descripción de la técnica Tener preparados cortes parafinados de 6 micrómetros. Pasar los cortes como es habitual por xilol y la serie de alcoholes y finalmente por agua destilada. Colorear durante 7 minutos con la Solución A, lavar en agua 5 a 10 minutos y teñir con Solución B por 30 a 60 minutos o más si fuera necesario. Lavar rápidamente en agua destilada y agregar durante 1 minuto la Solución C. Rápidamente enjuagar con agua y pasar por alcohol 95%. Deshidratar, pasar por xilol y montar. Resultados La mucina se colorea en rosa intenso ó rojo, los núcleos en negro y otros elementos en amarillo. 1.16 ALCIAN BLUE DE LISON Principio Colorea loa mucopolisacáridos de la cápsula de Cryptococcus spp en los cortes histológicos. Preparación del reactivo Fijador Bouin, Bouin-hollande, formol al 10%, formol neutro, buffer fosfatos, alcohol-formol-acético. Solución A: Alcian blue BG al 1% (solución acuosa) -------------------50 ml Ácido acético al 1% (solución acuosa) ---------------------50 ml Filtrar Timol ---------------------------------------------------------------15 mg Solución B: Fast red 5 B ------------------------------------------------------50 mg Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml Solución C: Ácido fosfomolíbdico-----------------------------------------------1 g Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml


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Hematoxilina de Mayer (Hemalumbre de Ehrlich) Alumbre de hierro------------------------------------------------ 2.5 g Agua destilada----------------------------------------------------50 ml Disolver y dejar en reposo toda la noche a temperatura ambiente. Descripción de la técnica Tener preparados cortes parafinados. Pasar los cortes del agua al hemalumbre dejándolos actuar 10 a 15 minutos, lavar hasta obtener un color azul, teñir con la Solución A durante 10 minutos y enjuagar con agua destilada. Agregar la Solución C por 10 minutos, lavar rápidamente en agua destilada y teñir con la Solución B durante 10 a 15 minutos, enjuagar y montar. Resultados Los núcleos teñidos en rojo púrpura, los gránulos de mastocitos, mucina, sustancia basal de los cartílagos y ciertos tipos de fibras conjuntivas se observan en verde azulado. Las fibras de colágeno y huesos se tiñen en rojo cereza y el citoplasma y músculo en amarillo pálido. 2. LÍQUIDOS PARA MONTAR CULTIVOS 2.1 AZUL DE LACTOFENOL (LPCB) Principio Esta solución es muy útil para examinar el material fúngico tomado de los cultivos. El fenol mata el hongo, el ácido láctico es un agente aclarante que preserva la estructura del hongo, la glicerina previene la desecación y el azul de algodón o cotton blue colorea la quitina y celulosa del hongo. Preparación del reactivo Solución A Fenol en cristales ------------------------------------------------- 20 g Ácido láctico-------------------------------------------------------20 ml Glicerina------------------------------------------------------------40 ml Mezclar bien Solución B Azul cotton de Poirrier -----------------------------------------0.05 g (o Azul de Anilina)


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Agua destilada c.s.p.--------------------------------------------20 ml Mezclar bien Solución A y Solución B, conservar a temperatura ambiente por más de 6 meses. Control de Calidad Colocar una gota del reactivo entre porta y cubre, observar con 40x, chequear ausencia de esporas de hongos y bacterias 2.2 COLORANTE DE GUEGUEN Principio Este líquido resulta útil para montar el material fúngico tomado de los medios de cultivo Preparación del reactivo Azul cotton de Poirrier -----------------------------------------0.10 g Sudán III ----------------------------------------------------------0.10 g Tintura de iodo fresca --------------------------------------20 gotas Ácido láctico----------------------------------------------------- 100 ml Disolver en un mortero el Sudán III con el ácido láctico, pasarlo a un erlenmeyer y calentar hasta obtención de un líquido límpido de color cereza. Dejar reposar 24 horas, disolver en un mortero el azul cotton de Poirrier con el Sudán III-láctico, agregar el iodo y filtrar por lana de vidrio. Conservar en frasco color caramelo. Control de Calidad Colocar una gota del reactivo entre porta y cubre, observar con 40x, chequear ausencia de esporas de hongos y bacterias 3.- SOLUCIONES DE TRABAJO 3.1 SOLUCION MADRE DE ANTIBIÓTICOS (SMA) Cloranfenicol ---------------------------------------------------------1 g Estreptomicina* -------------------------------------------------- 0.5 g Agua destilada estéril ----------------------------------------- 100 ml Se mantiene en heladera. Se adiciona a los medios de cultivo en concentración final de 100 µg / ml


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*Puede utilizarse otro aminoglucósido 3.2 SOLUCIONES MADRES DE VITAMINAS Se utiliza el Agar Trichophyton (Difco), disponible comercialmente A) Tiamina (Clorhidrato) --------------------------------------10 mg Agua destilada pH: 4-5 --------------------------------------- 100 ml B) I-Inositol ----------------------------------------------------- 250 mg Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml Esterilizar en autoclave a 120º C durante 10 minutos y conservar a 4ºC (heladera) C) Ácido nicotínico ---------------------------------------------10 mg Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml Esterilizar en autoclave a 120ºC durante 10 minutos y conservar a 4-5ºC (heladera) D) I-Histidina --------------------------------------------------- 150 mg Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml Esterilizar en autoclave a 120ºC durante 10 minutos y conservar a 4-5ºC (heladera) 3.3 SOLUCIÓN MADRE DE CICLOHEXIMIDA Cicloheximida----------------------------------------------------- 1 mg Acetona pura------------------------------------------------------- 3 ml Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml Disolver la cicloheximida en acetona pura y luego agregar agua destilada. Tener mucho cuidado por la toxicidad de la cicloheximida 4.- MEDIOS DE CULTIVO Consideraciones generales Los medios de aislamiento primario deben tener un pH: entre 6.5 y 7.2. Las condiciones ácidas que se utilizan en algunos medios de cultivo, son para inhibir el crecimiento bacteriano, pero también disminuye el desarrollo de algunos hongos.


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Por lo tanto, es preferible agregar agentes antibacterianos (100 µg / ml de cloranfenicol/estreptomicina) al medio de cultivo, para reducir la contaminación bacteriana. 4.1 AGAR GLUCOSADO DE SABOURAUD (SDA) Principio Medio poco utilizado ya que normalmente se usa la modificación de Emmons. Puede no crecer Blastomyces dermatitidis. Disponible comercialmente Peptona ------------------------------------------------------------- 10 g Glucosa ------------------------------------------------------------- 40 g Agar ------------------------------------------------------------------ 15 g Agua deionizada --------------------------------------------- 1000 ml Mezclar los ingredientes y hacerlos hervir hasta disolución completa. Esterilizar a 121ºC durante 15 min., distribuir en tubos solidificar en plano inclinado Modificación: Añadir SMA (100 µg/ml) Control de calidad Aspecto: medio sólido, ámbar, transparente pH final a 25ºC: 5.6± 0.2 Trichophyton mentagrophytes: Crece Staphylococcus epidermidis: Inhibición parcial o total en el medio con cloranfenicol 4.2 AGAR SABOURAUD DEXTROSA modificado por Emmons (SABE) Principio Es el medio estándar para la recuperación y mantenimiento de una gran variedad de hongos aislados de materiales clínicos. Tiene como ventaja su simple preparación y la obtención de colonias con caracteres macroscópicos típicos, su desventaja radica en que al tener una fuente de carbohidratos fácilmente utilizable por los hongos, estos desarrollan vegetativamente en forma exuberante pero con escasa fructificación, lo cual limita la identificación de la especie fúngica. Preparación del medio Dextrosa ------------------------------------------------------------ 20 g


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Peptona ------------------------------------------------------------- 10 g Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g Agua destilada------------------------------------------------ 1000 ml pHfinal: 6.8-7.0 Disolver los ingredientes calentando hasta ebullición, distribuir 7 ml por tubo de ensayo y autoclavar a 120 ºC, 15 minutos, enfriar los tubos en posición inclinada (pico de flauta, sin fondo). Modificación: Añadir SMA (50 mg/l) Control de Calidad Aspecto: medio sólido, ámbar, transparente PH final a 25ºC: 7.0± 0.2 Aspergillus spp. : Crece Staphylococcus epidermidis: inhibición parcial o total en el medio con cloranfenicol 4.3 AGAR MIEL DE SABOURAUD (SAB+M) Miel de abejas ----------------------------------------------------40 ml Peptona ------------------------------------------------------------- 10 g Extracto de levaduras ---------------------------------------------5 g Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g Agua destilada c.s.p…………………………………….1000 ml Disolver los ingredientes calentando hasta ebullición Enfriar y tomar el pH: 6.8-7.0 Agregar Carbonato de Calcio……………………………….5 gr Mezclar y distribuir 7 ml por tubo de ensayo y autoclavar a 121 º C 15 minutos. Enfriar los tubos en posición inclinada. Modificación: Añadir SMA (100 µg/ml) 4.4 LACTRIMEL (LAC) Miel de abejas ----------------------------------------------------40 ml Harina de trigo----------------------------------------------------- 10 g Leche ------------------------------------------------------------- 200 ml


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Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g Agua destilada c.s.p.---------------------------------------- 1000 ml Disolver los ingredientes calentando hasta ebullición, distribuir 7 ml por tubo de ensayo y autoclavar a 121 º C 15 minutos. Enfriar los tubos en posición inclinada. Modificación: Añadir SMA (100 µg/ml) 4.5 AGAR BANANA-AVENA-LECHE (ABAL) Una banana licuada---------------------------------------------200 g Harina de avena -------------------------------------------------- 10 g Leche ------------------------------------------------------------- 200 ml Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g Agua destilada c.s.p ---------------------------------------- 1000 ml Licuar la banana con leche, disolver los restantes ingredientes calentando hasta su ebullición, distribuir 7 ml por tubo de ensayo y autoclavar a 121 º C, 15 minutos. Enfriar los tubos en posición inclinada. 4.6 AGAR PAPA GLUCOSADO (APA) Papa pelada-------------------------------------------------------- 20 g Glucosa ------------------------------------------------------------- 10 g Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g Agua destilada c.s.p.---------------------------------------- 1000 ml Pelar y rallar la papa, disolver la glucosa en el agua y agregar los demás ingredientes. Hervir 20 minutos y filtrar por gasa y rectificar volumen a 1000 ml. Fraccionar 7 ml por tubo y esterilizar a 121º C durante 15 min, enfriar los tubos en posición inclinada. 4.7 AGAR CEREBRO CORAZÓN (BHI Agar) Este medio se recomienda para la recuperación de hongos patógenos exigentes como Histoplasma capsulatum y Blastomyces dermatitidis, especialmente para sus formas levaduriformes. Con este propósito puede agregarse 5% de sangre ovina estéril cuando el medio está fundido y enfriado a 45-50 º C. Se encuentra disponible comercialmente. Seguir indicaciones del fabricante para su preparación.


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Modificación: Añadir SMA (100 µg/ml) Control de Calidad Aspecto: Ámbar claro a semitransparente, sin precipitado (cuando no está adicionado de sangre) PH final a 25ºC: 7.4± 0.2 Candida albicans: crece bien Neisseria meningitidis ATCC 13090: crecimiento aceptable a bueno Sporothrix schenckii: conversión a levadura a 37ºC 4.8 AGAR V8 (V8) Se utiliza para la formación de ascosporos de levaduras. Jugo vegetal V8 ------------------------------------------------ 150 ml Agua de levadura*--------------------------------------------- 850 ml Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g Ajustar a pH: 7.0 * Agua de levadura: hervir 1 litro de agua durante 30 minutos con 40 g de levadura prensada. Enfriar y llevar a 1 litro.Dejar reposar en heladera 48 horas, utilizar el sobrenadante (850 ml). Disolver los ingredientes calentando hasta ebullición. Fraccionar 7 ml por tubo y autoclavar a 121 º C durante 15 min, enfriar los tubos en posición inclinada. Los ascosporos de levaduras, desarrollados en este medio son fácilmente identificados en extendidos teñidos con la técnica de KY, ya que son ácido resistente. 4.9 MEDIO DE GORODKOWA (GOR) Se utiliza para la formación de ascosporos de levaduras Glucosa -----------------------------------------------------------1.25 g Peptona ---------------------------------------------------------------5 g Cloruro de sodio ------------------------------------------------2.50 g Extracto de carne ---------------------------------------------------5 g Agar ------------------------------------------------------------------ 10 g


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Agua destilada-------------------------------------------------- 500 ml Fraccionar 7 ml por tubo y esterilizar a 121 º C durante 15 minutos, enfriar los tubos en posición inclinada. Los ascosporos de levaduras, desarrollados en este medio son fácilmente identificados en extendidos teñidos con la técnica de KY, ya que son ácido resistente 4.10 MEDIO DE THAYER-MARTIN (TM) Este medio de cultivo disponible comercialmente, es usado para aislamiento de especies de Neisseria spp, y también Nocardia spp. 4.11 AGAR AGUA (AA) Estimula la formación de conidios. Recomendable para hifomicetes de pigmentación oscura (dematiáceos) e incluso para dermatofitos poco o nada esporulados. Favorece la esporulación de hongos saprofitos. Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g Agua destilada------------------------------------------------ 1000 ml Calentar hasta disolver los componentes, autoclavar a 121º C durante 15 min., distribuir en placas de petri Control de Calidad Microsporum canis: abundante producción de macroconidios. 4.12 AGAR CZAPEK (ACZ) Se utiliza en el cultivo de hongos saprofitos, especialmente Aspergillus spp. y Penicillium spp. Es el medio de referencia para la identificación de Aspergillus spp. También está disponible comercialmente. Nitrato sódico --------------------------------------------------------3 g Fosfato dipotásico --------------------------------------------------1 g Sulfato magnésico----------------------------------------------- 0.5 g Cloruro potásico-------------------------------------------------- 0.5 g Sulfato ferroso ---------------------------------------------------0.01 g


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Sacarosa------------------------------------------------------------ 30 g Agar ------------------------------------------------------------------ 15 g Agua deionizada ---------------------------------------------1.000 ml Calentar hasta disolver todos los componentes, esterilizar a 121ºC durante 15 min., distribuir en placas de Petri Control de Calidad Apariencia: ámbar pálido, sólido transparente. pH final a 25 ºC: 7.3± 0.2 Aspergillus flavus: crece colonia amarilla-verde 4.13 AGAR SABOURAUD CON CICLOHEXIMIDA Y CLORANFENICOL (SCC) Es un medio selectivo utilizado para el aislamiento de hongos patógenos a partir de muestras muy contaminadas con hongos saprofitos y bacterias. Se utiliza fundamentalmente en el aislamiento de dermatofitos y hongos dimórficos. Inhibe algunas especies de hongos de interés médico (Candida no albicans, Aspergillus, Zygomycetes, Cryptococcus neoformans, etc). Se utilizan preparados comerciales, se preparan de acuerdo con las instrucciones del fabricante Control de Calidad Aspecto: Agar firme, amarillento, transparente. Trichophyton mentagrophytes: Crece Aspergillus flavus: Inhibición parcial o completa Staphylococcus epidermidis: inhibición parcial o total 4.14 AGAR PAPA- ZANAHORIA (APZ) Idóneo para estimular la esporulación de hongos miceliales, muy indicado para la identificación de hongos dematiáceos. Papa rallada-------------------------------------------------------- 10 g Zanahoria rallada ------------------------------------------------- 20 g Agar ----------------------------------------------------------------- 18 g Agua ------------------------------------------------------------ 1000 ml 4.15 AGAR DIXON Modificado (DXN)


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Utilizado en el cultivo de Malassezia spp. Puede modificarse añadiendo cloranfenicol o bien cloranfenicol y cicloheximida. Extracto de malta ------------------------------------------------- 36 g Peptona ---------------------------------------------------------------6 g Oxgall, desecada -------------------------------------------------- 20g Tween 40 ---------------------------------------------------------10 ml Glicerol -------------------------------------------------------------- 2 ml Acido oleico -------------------------------------------------------- 2 ml Agar ------------------------------------------------------------------ 12 g Agua deionizada1000 ml Calentar bien, disolver todos los componentes, esterilizar a 121 ºC durante 15 min., distribuir en placas de Petri Control de Calidad Aspecto: Blanco amarillento, no muy sólido pH final: 6.0 Malassezia restricta: Crece En el medio inhibidor Malassezia restricta: Crece Aspergillus flavus: Inhibición parcial o completa Staphylococcus epidermidis: Inhibición parcial o completa 4.16 MEDIO Dermatophyte Test Medium (DTM) Peptona ------------------------------------------------------------- 10 g Dextrose ------------------------------------------------------------ 10 g Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g Rojo Fenol ---------------------------------------------------------40 ml Cl 0.8 M ------------------------------------------------------------- 6 ml Cicloheximida-----------------------------0.5 g (ó 500mg. disueltos en 2 ml de acetona) Sulfato de gentamicina-----------------0.1g (ó 100 mg disueltos en 2ml de agua destilada) Cloramfenicol-----------------------------250 mg (disueltos en 10 ml de etanol) Agua destilada------------------------------------------------ 1000 ml


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Disolver la peptona, la dextrosa y el agar en agua. Calentar a BM. Agregar el rojo Fenol agitando. Ajustar el pH con HCl, agitándola agregar la Gentamicina (o Streptomicina), agitando. Fraccionar en frascos de 200 ml. Autoclavar a 121º C durante 10 minutos. Enfriar a 50 º C y agregar el cloramfenicol. (para 200 ml de medio, 5ml de antibiótico). El pH final debe ser 5.5 ± 0.1.Distribuir a razón de 7 ml por tubo, en tubos de ensayo estériles. Enfriar en bisel y guardar, listos para su uso, en la heladera. Solución Rojo Fenol Rojo fenol ----------------------------------------------------------- 0.5g HONa 0.1 N ------------------------------------------------------15 ml. Agua destilada-------------------------------------------------- 100ml. Solución HCl 0.8 M HCl 1N---------------------------------------------------------------8 ml. Agua destilada-----------------------------------------------------2 ml. 5.- MÉTODOS DE PRESERVACIÓN DE CULTIVOS 5.1 METODO DE SABOURAUD Se utiliza para conservar algunas cepas de Zygomicetes y formas miceliares no esporuladas, evita el pleomorfismo especialmente de los dermatofitos. Medio de Cultivo Peptona ---------------------------------------------------------------3 g Agar --------------------------------------------------------------------2 g Agua destilada c.s.p. ----------------------------------------- 100 ml pH final: 6.8-7.0 Fraccionar en tubos y autoclavar a 121ºC, 15 minutos. Enfriar los tubos en posición inclinada. Solución de Aceite Aceite neutro ó mineral estéril. Autoclavar por 2 horas a 121ºC y luego calentar en una estufa de secado a 100 ºC por 1-2 horas para evaporar la humedad remanente.


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Procedimiento Sembrar el hongo previamente aislado, en el medio de cultivo para preservación. Incubar hasta obtener el crecimiento deseado. Cubrir con aceite neutro ó mineral, colocar tapón de goma estéril y sellar con parafina. Se conserva a temperatura ambiente. 5.2 METODO DE CASTELLANI O DEL AGUA DESTILADA El método descripto por Castellani es una técnica económica y sencilla de realizar. Permite la conservación de varios hongos filamentosos y levaduras por más de 1 año. Procedimiento para levaduras Fraccionar 2-3 ml de agua destilada en viales con cierre hermético para prevenir la evaporación y/ó la contaminación. Autoclavar a 121º C por 15 minutos. Tomar con un ansa 2 ó 3 colonias de un cultivo de 24-48 horas y suspenderlas en el vial. Las cepas se conservan a temperatura ambiente o refrigeradas. Procedimiento para hongos filamentosos En un cultivo activamente esporulado, agregar de 2-3 ml de agua estéril. Con un ansa estéril remover las esporas de la colonia sin romper el agar. Se toma la suspensión de esporas con una pipeta estéril y se la transfiere a un vial estéril de cierre hermético. Las cepas se conservan a temperatura ambiente o refrigeradas. 5.3 PRESERVACIÓN DE CEPAS POR CONGELACIÓN Es un método sencillo que permite la conservación de varios hongos filamentosos y levaduras por varios años. Este medio preserva bien Candida spp y Saccharomyces spp pero no es recomendado para Cryptococcus neoformans por su baja recuperación. Procedimiento para hongos filamentosos Preparar cultivos activamente esporulados en criotubos a rosca, con agar en pico de flauta. Luego conservar los viales en freezer a -70º C. Procedimiento para levaduras


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Glicerol -------------------------------------------------------------30 ml Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml Fraccionar 1 ml en crioviales, esterilizar a 12 ºC por 15 min y mantenerlos a 5ºC. Suspender 2-3 colonias de un SAB de 24-48 horas de incubación. Luego conservar los viales en freezer a – 70º C. 6.- PRUEBAS PARA IDENTIFICACIÓN DE ESPECIES FÚNGICAS 6.1 PRUEBA DEL TUBO GERMINATIVO (TG) Es el método rápido para la identificación presuntiva de Candida albicans. Procedimiento Se utiliza 0.3 a 0.5 ml de un pool de suero fresco, suero bovino ó equino en tubo de hemólisis. Tocar una colonia de levadura de la placa de 24 horas y suspenderla en el suero. Incubar a 35 ºC por 2 a 3 horas. Ubicar una gota de la suspensión en un portaobjeto, colocar cubreobjeto y observar en microscopio a 400x Control de Calidad Positivo: C. albicans ATCC 60193 Negativo: C. parapsilosis ATCC 66029 6.2 AGAR HARINA DE MAIZ CON TWEEN 80 (CORN-MEAL AGAR) Se utiliza para observar la producción de clamidosporos de Candida albicans y la micromorfología y distribución de las blastoconidias y artroconidias y pseudohifas para diferenciar las distintas especies de Candida. También puede ser usado para la producción de pigmento para identificar Trichophyton rubrum y Trichophyton mentagrophytes para este fin se le agrega al medio 10 g de dextrosa. Procedimiento Se encuentra comercialmente disponible, pero puede prepararse con harina de maíz (polenta) Harina de maíz ---------------------------------------------------- 40 g


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Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g Tween 80 (polisorbato)------------------------------------------10ml Agua destilada------------------------------------------------ 1000 ml Si se utiliza harina de maíz, se calienta con agua a 60º C durante 1 hora. Filtrar y completar a 1 litro con agua. Agregar el agar, el Tween 80 hervir y autoclavar. 6.3.a AGAR CROMOGÉNICO PARA LEVADURAS Es útil para la detección de infecciones mixtas de distintos materiales como orina, sangre, heridas, flujos vaginales, esputos, etc. Este medio permite la identificación presuntiva de algunas levaduras. El medio contiene sustratos enzimáticos unidos a compuestos cromógenos que producen un color determinado en presencia de la enzima específica. Algunas especies de levaduras desarrollan un color característico. Existen diferentes medios comerciales en nuestro mercado, los cuales desarrollan distintos colores según las especies que pueden detectar. 6.3.a.1 CHROMagar (CHROMagarTM ) Verde: C. albicans Azul: C. tropicalis Rosa (aspecto seco): C. krusei 6.3.a.2 Brilliance Candida Agar (Oxoid) Azul: C. albicans Verde: C. tropicalis Rosadas (aspecto seco): C. krusei 6.3.a.3 Agar Candida ID II (BioMerieux) Azul: C. albicans Rosa:C. tropicalis,C. lusitaniae y C. kefyr Procedimiento Los medios 6.3.a.1 y 6.3.a.2 se preparan según instrucciones del fabricante. El medio 6.3.a.3 se comercializa directamente en placas. Todos pueden mantenerse varios días en heladera al abrigo de la luz. Las placas sembradas se incuban a 28 º C - 35 º C durante 48 a 72 horas. 6.3.b AGAR CROMOGÉNICO PARA LEVADURAS LIPOFÍLICAS (CMA)

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Procedimiento Preparar según las instrucciones del fabricante con el agregado de 10 ml de Tween 40 por litro. 6.3.c AGAR CREMOPHOR EL (EL Slant) Procedimiento SDA ………………………………………………………………..65g Cremophor EL (sigma)………………………………………….10 ml Agua destilada……………………………………………c.s.p.1000ml Mezclar los ingredientes y hacerlos hervir hasta disolución completa. Esterilizar a 121ºC durante 15 min., distribuir en tubos solidificar en plano inclinado. 6.3.d AGAR TWEEN ESCULINA (TE Slant) Procedimiento Peptona …………………………………………………………….10g Glucosa …………………………………………………………….10g Extracto de levadura………………………………………………..2g Tween 60…………………………………………………………..5 ml Citrato férrico amónico…………………………………………..0.5g Esculina ……………………………………………………………..1g Agar ………………………………………………………………...15g Agua destilada ……………………………………… ...c.s.p.1000ml Mezclar los ingredientes y hacerlos hervir hasta disolución completa. Esterilizar a 121ºC durante 15 min., distribuir en tubos solidificar en plano inclinado. 6.4 AGAR LECHE CON TWEEN 80 Se utiliza para observar la producción de clamidosporos y tubo germinativo de Candida albicans y C. dubliniensis del resto de las especies de Candidas. Esta técnica tiene la ventaja que realiza dos métodos diagnósticos en una misma prueba. También permite ver producción o ausencia de seudohifas y la disposición del micelio y blastosporas.

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Agar --------------------------------------------------------------------2 g Tween 80 ----------------------------------------------------------- 1 ml Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml Autoclavar a 121 º C por 20 minutos. Agregar a 56 º C 1 ml de leche descremada en polvo estéril. Control de Calidad Positivo: C. albicans ATCC 60193 Negativo: C. tropicalis ATCC 66029 Procedimiento Fraccionar en tubos. En el momento de usar, fundir el medio y preparar un portaobjetos con tres mililitros del agar, como para inmunodifusión. Sembrar con una estría en la superficie y cubrir con un cubreobjeto previamente flameado a la llama. Se incuba en una placa de Petri con un dispositivo similar al empleado para microcultivos (Ver AMID) 6.5 AGAR SEMILLA DE GIRASOL El medio contiene ácido cafeico (extracto semilla de girasol) que permite la detección de la enzima fenol-oxidasa producida únicamente por Cryptococcus neoformans / C. gatti. Esta reacción enzimática da como producto final melanina, la cual es absorbida por la pared del hongo dando un color marrón claro. Glucosa ---------------------------------------------------------------1 g Creatina -----------------------------------------------------------0.78 g Agar ----------------------------------------------------------------- 18 g Cloranfenicol -----------------------------------------------------0.05 g Extracto de semilla de girasol* ----------------------------- 350 ml Calentar hasta disolución. Distribuir en frascos con tapa a rosca entre 50 a 100 ml. Autoclavar a 121º C durante 15 min. *Preparación del extracto: Pulverizar las semillas de girasol, pesar 70g del mismo y suspenderlo en 350ml de agua destilada, hervir y filtrar con gasa. Autoclavar a 121º C durante 15 min. Mantener en heladera en frasco con cierre hermético.


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Control de calidad C. neoformans ATCC 66031 C. albicans ATCC 60193 Procedimiento En el momento de utilizar, fundir el medio y plaquear. Sembrar el material o un subcultivo fresco de Agar Sabouraud de la colonia en estudio, incubar a 28ºC durante 96 horas. 6.6. a AGAR TABACO Permite la detección de la enzima fenoloxidasa producida por Cryptococcus neoformans. Esta reacción tiene como producto final la melanina, la cual le da al hongo una coloración marrón característica. Tabaco -------------------------------------------------------------- 50gr Agua destilada------------------------------------------------ 1000 ml Hervir durante 30 minutos en baño de María. Filtrar a través de gasa, corregir volumen a 1000 ml, Agar ----------------------------------------------------------------- 20 gr pH: 5.4. Autoclavar a 121ºC durante 15 minutos. Plaquear 20 ml de medio en cajas de Petri de 90 mm de diámetro. Control de calidad Candida albicans: color blanco Cryptococcus neoformans: Color marrón Procedimiento Sembrar el material o un subcultivo fresco de Agar Sabouraud de la colonia en estudio, incubar a 28 ºC durante 96 horas. 6.6. b AGAR TABACO Modificado Permite la detección de la enzima fenoloxidasa producida por Cryptococcus neoformans. Esta reacción tiene como producto final la melanina, la cual le da al hongo una coloración marrón característica.


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Es utilizado como una prueba más para diferenciar C. albicans de C. dubliniensis. Se rompen 2 atados de cigarrillos (Malboro) y se vuelca el tabaco en un erlenmeyer con 1l de agua destilada. Hervir durante 30’a Baño de María. Filtrar a través de gasa y corregir volumen a 1l Agregar 20 g de agar, mezclar bien. Ajustar el pH a 5.4 Autoclavar a 121°C durante 15 min. Plaquear a razón de 20 ml por placa. Procedimiento Sembrar el material o un subcultivo fresco de Agar Sabouraud de la colonia en estudio, incubar a 28 ºC durante 96 horas. Interpretación Candida albicans: colonia color blanco o crema, lisa, borde liso. Observación microscópica del borde a las 48 h: Clamidosporas (-) Candida dubliniensis: colonia color pardo amarillenta, rugosa, borde festoneado. Observación microscópica del borde a las 48 hs: Clamidosporas (+) Cryptococcus neoformans: colonia color marrón 6.7 AGAR DE STAIB (Guizotia abyssínica). Agar semillas de alpiste Utilizado para aislar Cryptococcus spp. y Cryptococcus neoformans. Este último es el único que al metabolizar la guizotia abyssinica (alpiste), produce melanina originando un color marrón oscuro. El cloranfenicol lo convierte en medio selectivo. También puede ser útil en la diferenciación de Candida dubliniensis Glucosa ------------------------------------------------------------- 10 g Creatinina---------------------------------------------------------0.78 g Cloranfenicol -----------------------------------------------------0.05 g Difenilo (disuelto en 10 ml de etanol 95%) ------------- 100 mg Guizotia abyssinica----------------------------------------------- 70 g Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g Agua deionizada --------------------------------------------- 1000 ml Moler las semillas y añadir 350 ml de agua, esterilizar en autoclave y filtrar. Añadir agua hasta 1000 ml, agregar el resto de los componentes excepto el difenilo.


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Esterilizar a 121ºC 15 min. Enfriar a 45ºC. Añadir el difenilo antes de dispensar el medio en las placas Control de Calidad C. neoformans: colonias color marrón oscuro Cryptococcus spp: colonias claras 6.8 MEDIO DE SALKIN Solución de Cicloheximida: 1.6 mg en 10 ml de agua destilada Solución de Rojo de Fenol: 500 mg en 100 ml de agua destilada. Base Agar-agar ----------------------------------------------------------- 20 g Agua destilada-------------------------------------------------- 700 ml Esterilizar en autoclave 15 minutos a 1 atm. Suplemento Medio Base de Nitrógeno(YNB) ----------------------------- 6.7 g Solución cicloheximida -----------------------------------------10 ml Solución Rojo de fenol -----------------------------------------30 ml Agua destilada-------------------------------------------------- 260 ml Glicina --------------------------------------------------------------- 10 g Esterilizar por filtración Para preparar el medio mezclar 70:30 Base fundida y enfriada a 45ºC y Suplemento. Fraccionar en tubos de hemólisis estériles en pico de flauta. Control de Calidad C. neoformans: el medio no vira de color Cryptococcus gattii: el medio vira al color rojo en 1-5 días 6.9 MEDIO CGB Solución A (Suplemento)


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Glicina --------------------------------------------------------------- 10 g PO

4H

2K----------------------------------------------------------------1 g

SO4Mg-----------------------------------------------------------------1 g

Tiamina.ClH ------------------------------------------------------- 1 mg L-canavanina ----------------------------------------------------30 mg Agua destilada csp -------------------------------------------- 100 ml Ajustar el pH a 5.6 .Esterilizar por filtración Solución B Azul de bromotimol sódico ------------------------------------ 0.2 g Agua destilada----------------------------------------------------50 ml Base Mezclar 440 ml de agua destilada, 20 ml de Solución B y 10 g de agar. Autoclavar 15 minutos a 1 atm. Para preparar el medio mezclar una parte del Suplemento con 9 partes de la Base fundida y enfriada a 45ºC. Envasar en tubos de hemólisis estériles en pico de flauta. Control de Calidad C. neoformans: el medio no vira de color Cryptococcus gattii: el medio vira al color azul en 1-5 días. 6.10 MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DE UREASA Se basan en la capacidad de algunos microorganismos en producir la enzima ureasa, la cual puede ser detectada por diferentes métodos. Los medios utilizados contienen urea, que en presencia de la enzima se desdobla en dióxido de carbono y amonio, elevando el pH y produciendo un cambio de color en el indicador rojo de fenol del amarillo al fucsia 6.10.1 UREA DE CHRISTENSEN Procedimiento El medio base se prepara de acuerdo a las indicaciones del fabricante. Autoclavar a 120ºC durante 15 minutos. Adicionar la solución de urea estéril al 40%, al medio


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base fundido y enfriado a 45°C. Fraccionar 3 ml por tubo, enfriar los tubos en posición inclinada. Sembrar el agar, incubar a 28ºC 72 horas. Control de Calidad T. mentagrophytes: positivo (rojo) T. rubrum: negativo (amarillo) 6.10.2 TEST DE UREA RÁPIDO Tiene la ventaja que su lectura se realiza entre 3 a 5 minutos. Solución A Solución madre de rojo de fenol al 0.01% Mantener en heladera Solución B Solución de urea al 10% Mantener en heladera Procedimiento En el momento de usar, colocar en un tubo de hemólisis 0.5 ml de la Solución A y agregar 1 gota de Solución B. Tomar algunas colonias de levaduras con un hisopo estéril e introducirlo en el tubo, dejar de 3 a 5 min y realizar la lectura final. Control de Calidad T. mentagrophytes: positivo (rojo) T. rubrum: negativo (amarillo) 6.10.3 TABLETAS DE UREA (Rosco) Procedimiento Seguir instrucciones del fabricante del producto comercial 6.11 ASIMILACIÓN DE TREHALOSA (Tabletas Rosco) Procedimiento


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Seguir instrucciones del fabricante del producto comercial 7. HEMOCULTIVOS (por Lisis Centrifugación) TUBOS PARA RECOLECCIÓN DE HEMOCULTIVOS Saponina--------------------------------------------------------------5 g Polianetol sulfonato de sodio --------------------------------- 0.5 g Solución fisiológica -------------------------------------------- 100 ml Fraccionar en tubos con tapa a rosca esterilizables en autoclave, 1 ml por tubo. Autoclavar 15 minutos a 1 atm. 8. REACTIVOS PARA INMUNODIAGNÓSTICO 8.1REACTIVOS PARA INMUNODIFUSIÓN Solución buffer fosfatos pH 7.4 M/15 Na2HPO4---------------------------------------------------------------------- 80,8 ml M/15 NaH2PO4---------------------------------------------------------------------- 19,2 ml Gel de Agar Agua destilada------------------------------------------------ 99.0 ml Solución buffer de fosfatos-------------------------------- 1.0 ml NaCl------------------------------------------------------------ 0.85 g Fenol ----------------------------------------------------------- 0.3 ml Agar purificado----------------------------------------------- 1.0 g PEG 6000------------------------------------------------------ 1.0 g

Se prepara la solución fisiológica fenolada al 3‰: Al agua destilada se le agregan el NaCl y el fenol. Luego se agrega el agar y el PEG y se mezclan durante 5 minutos. Se lleva a baño de agua a 100 °C hasta su disolución completa y se distribuye en tubos con tapa a rosca con 5 y 15 ml por tubo y se conserva a 4 °C hasta su utilización.

Solución buffer de citrato-cloruro de sodio pH 8,2 Citrato trisódico -------------------------------------------------------- 5 g


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Solución salina isotónica ------------------------------------------- 100 ml Mezclar bien hasta disolución total del citrato, envasar en un frasco con tapa a rosca. Mantener a temperatura ambiente. Solución de Azul de Coomasie Azul brillante de Coomasie R-250--------------------------------- 1 g Etanol--------------------------------------------------------------------- 90 ml Acido acético glacial-------------------------------------------------- 20 ml Agua destilada---------------------------------------------------------- 90 ml Disolver el azul en etanol y luego agregar el ácido acético y el agua destilada. Esta solución puede reutilizarse muchas veces. PREPARACIÓN DE LAS LÁMINAS O PLACAS

Se funde el agar en baño de agua a ebullición y se deja enfriar hasta 55-60 °C Se vierte un tubo de 15 ml, si se realiza la ID en placa Para preparar portaobjetos, primero se diluye 1 ml de agar en 7 ml de agua destilada y se cubre el portaobjetos con una capa muy fina y se deja secar hasta formar una película seca y opaca. Luego se agregan 2,5 ml de agar sin diluir. Se deja solidificar y se puede mantener a 4 °C hasta una semana. Los portaobjetos así preparados deben conservarse en cámara húmeda. 8.2 AGAROSA PARA CONTRAINMUNOELECTROFORESIS Agarosa ---------------------------------------------------------------1 g PEG 6000-------------------------------------------------------------1 g Buffer veronal pH 8.2 ----------------------------------------- 100 ml Merthiolate® 1/100 ----------------------------------------------- 1 ml Mezclar. Disolver por calentamiento. Envasar en tubos de ensayo (10 ml) Se utiliza 3 ml por portaobjeto. Recubrir uno o varios portaobjetos con 3 ml de agarosa al 1 % en solución acuosa caliente y dejar enfriar 10 minutos. Se pueden conservar en cámara húmeda a 4 ºC durante una semana.


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9. MEDIOS PARA DETERMINAR LA SENSIBILIDAD A LOS ANTIFÚNGICOS 9.1 MEDIO DE SHADOMY MODIFICADO Solución 1 YNB ----------------------------------------------------------------- 6.7 g l-asparagina ------------------------------------------------------- 4.5 g Glucosa ------------------------------------------------------------- 10 g Cloranfenicol --------------------------------------------------- 100 mg Alcohol 99º --------------------------------------------------------- 2 ml Agua destilada csp -------------------------------------------- 100 ml Disolver el cloranfenicol en el alcohol y agregar 50 ml de agua. Calentar la solución a 35-40ºC, agregar el YNB, l-asparagina y la glucosa mientras se revuelve. Luego se completa a 100 ml con agua destilada. Se esteriliza por filtración con membrana de 0.45 μm o filtro Seitz . Solución 2 PO

4H

2Na.H2O---------------------------------------------------0.37 g

PO4HK2------------------------------------------------------------0.96 g

Agar (Oxoid Nº1)-------------------------------------------------- 10 g Agua destilada csp -------------------------------------------- 900 ml Se disuelve el agar en 900 ml de agua destilada calentando hasta ebullición y se agregan los fosfatos, enfriar lentamente hasta 60ºC y se mide pH(6.8-7.2) Llevar a volumen final de 900 ml y esterilizar en autoclave 20 minutos a 1 atm. Después de autoclavar enfriar a 55-60ºC y agregar asépticamente la Solución 1 mientras se agita. Mantener a 45-55ºC mientras se fracciona en frascos estériles (100 ml). 9.2 MUELLER-HINTON CON GLUCOSA Y AZUL DE METILENO Agar Mueller-Hinton---------------------------------------------- 37 g Glucosa ------------------------------------------------------------- 20 g Azul de metileno 1% -------------------------------------------0.1 ml Agua destilada csp ------------------------------------------ 1000 ml Disolver el agar y la glucosa en el agua y calentar. Agregar el azul de metileno. Fraccionar en frascos (100 ml) y autoclavar 15 minutos a 1 atm. 9.3 MEDIO RPMI PARA REALIZAR CIM Medio RPMI ---------------------------------------------------- 1 sobre


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MOPS------------------------------------------------------------ 34.53 g Glucosa ------------------------------------------------------------- 18 g Agua destilada csp ------------------------------------------ 1000 ml Disolver 1 sobre de RPMI en 600-700 ml de agua destilada en un matraz aforado de 1000 ml. Disolver el MOPS en 50 ml de agua destilada en un Erlenmeyer. Agregar la solución de MOPS al RPMI Añadir la glucosa y mezclar hasta disolución completa. Ajustar el pH a 7 con NaOH 40%. Agregar agua destilada hasta volumen de 1000 ml. Esterilizar por filtración y envasar en frascos de vidrio estériles de 100-200 ml cada uno. Conservar en heladera.

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