guia micologia 2009

Cátedra Micología Médica e Industrial

GUÍA PARA EL ESTUDIO de

E U M Y C E T O S de

Interés en Medicina Veterinaria

2.009

Prof. Bact. Enso Hugo Reinoso Bact. Dr. Reynaldi, Francisco José Bact. Dra. Córdoba Susana Beatriz Bact. Dra. Rosa Diana Ester

CURSO DE MICROBIOLOGÍA II Facultad de Ciencias Veterinarias UNLP.

CCÁÁTTEEDDRRAA DDEE MMIICCOOLLOOGGÍÍAA MMÉÉDDIICCAA EE IINNDDUUSSTTRRIIAALL CARRERA de MICROBIOLOGíA

-Fac. Cs. Veterinarias. UNLP-

Avda. 60 y 118. La Plata (1900) Argentina. Teléfono: 0221- 4236663 / 64 int. 421. Fax: 0221- 4253276. E-mail:E-mail: [email protected]

Guía para el estudio de EUMYCETOS de Interés en Medicina Veterinaria Página 1 de 30


MICOSIS SUPERFICIALES

LOCALIZACION ENFERMEDAD AGENTE ETIOLOGICO

Piel, cuero cabelludo

Microsporias Microsporum spp.

DERMATOFITOSIS Piel, pelo, uña Tricofíceas Trichophyton

spp.

Capa córnea de piel lampiña

Epidermofíceas Epidermophyton floccosum

CANDIDIASIS (Moniliasis)

Pliegues cutáneos, uñas, mucosas

Candidiasis Candida spp.

DIAGNOSTICO DE MICOSIS SUPERFICIALES

Dermatofitosis y Candidiasis

El término micosis fue empleado por primera vez por Virchow en 1858 para designar a las afecciones del hombre y animales producidas por Eumycetos (hongos).

Clasificación Las micosis pueden ser superficiales o profundas, según se localicen

en la capa córnea de la piel y sus faneras, mucosas y semimucosas o por el contrario, más profundamente en la dermis, tejido celular subcutáneo y diversos órganos y/o sistemas del cuerpo humano y animal.

Etiología La mayoría de los agentes etiológicos de las micosis superficiales

son queratófilos (queratinolíticos), son en general parásitos absolutos o viven saprofíticamente sobre la piel y pelos. Las diferencias especiales persisten por transmitirse del enfermo al sano, por contagio directo o indirecto, produciendo lesiones poco inflamatorias y benignas, pero



contagiosas, originando focos epidémicos en familias, escuelas, asilos, criaderos de animales, majadas, rebaños, etc.

En las micosis profundas los hongos se localizan en la dermis, músculo, huesos, pulmones y secundariamente por diseminación linfática y sanguínea a otros órganos internos, como así también tienen tendencia a localizaciones mas superficiales (piel y mucosas). Actúan como parásitos accidentales, ya que viven en forma saprófita en el suelo sobre restos vegetales o animales e infectan al hombre y animales (fuente común exterior) mediante la inhalación o inoculación traumática . Algunos de estos hongos son de distribución universal y otros están vinculados a zonas de características geográficas y climáticas particulares, donde influyen la temperatura, humedad, tipo de suelo, etc., que se denominan áreas endémicas.

Fuentes de infección : Están en relación con la etiopatogenia de las micosis.

Micosis superficiales : Algunas son propias del hombre y otras de los animales, pero otras

veces son comunes al hombre y a los animales domésticos (perro, gato, vacunos, equinos, etc.) y sus agentes mantienen su ciclo vital por contagio interhumano, interanimal, del animal al hombre, del suelo a estos y rara vez del hombre al animal. (Fig. 1 y 2).

Micosis profundas : Se dividen según su etiopatogenia en :

a) Exógenas, son producidas por los hongos del medio ambiente. b) Endógenas, por hongos propios del hombre o animales que

viven sobre piel y mucosas o vías respiratorias altas.

Causas predisponentes La edad, el sexo, hábitos, condiciones higiénico-ambientales,

alteraciones del estado general, etc. influyen tanto en las micosis superficiales como profundas.

PUERTAS DE ENTRADA

♦ Superficiales (capa córnea) : Se origina por contacto directo, animal x animal, hombre x animal,

hombre x hombre ; o indirecto : suelo x animal, fomites x animal, etc. Por ejemplo : Microsporias, Tricofitias, Dermatofilosis, etc.

♦ Subcutáneas : Por inoculación a través de micro o macrotraumas. Por ejemplo : Esporotricosis, Micetomas, Feohifomicosis

(Phaeohypomycosis), etc.



♦ Profundas : Se realiza por inhalación de elementos fúngicos infectantes a partir de

una misma fuente exógena. Se infecta primariamente el pulmón y luego disemina a otros órganos por vía linfática o hemática (micosis profundas sistémicas).

Por ejemplo : Histoplasmosis, Coccidioidomicosis, Criptococosis, etc. Estas también pueden ingresar por traumatismo cutáneo.

DERMATOFITOSIS- DERMATOFICIAS O TIÑA (sinónimos)

Son lesiones de la capa córnea de la piel y sus faneras (piel y/o uña, pelo del cuero cabelludo, barba y bigote), provocadas por agentes fúngicos denominados Dermatofitos.

Causan micosis superficial. Es una de las infecciones más frecuentes en el hombre.

El estrato córneo favorece la entrada de los hongos por el pH, humedad, lípidos, proteínas. Los dermatofitos tienen lipasas, proteasas que degradan.

Determinadas condiciones del huésped, como ingesta de corticoides, obesidad, piel macerada, favorecen la invasión por dermatofitos.

Los dermatofitos son filamentosos, tienen artroconidias, éstas constituyen factores de virulencia, ya que son las que se depositan sobre el estrato córneo y germinan.

Desarrollan a 28ºC.

Tienen 2 tipos de reproducción 1. Asexuada, anamorfa o imperfecta. 2. Sexuada, teleomorfa o perfecta.



POSICION TAXONOMICA DE LOS DERMATOFITOS

Estado imperfecto o asexual

(anamorfo) Estado perfecto o sexual

(teleomorfo)

Reino Fungi Fungi Fhylum forma Deuteromycota

(Fungi imperfecti) Ascomycota

Clase Hyphomycetes Ascomycetes Orden Moniliales Onygenales Familia Moniliaceae Arthrodermataceae Géneros ♦ Microsporum

♦ Trichophyton ♦ Epidermophyton

Arthroderma

Las dermatoficias son provocadas por los anamorfos de los 3 géneros de hongos:

• Epidermophyton • Microsporum • Trichophyton.

Fueron descriptos por Emmons en 1934. La descripción se basa en el estudio de los esporos. Los géneros engloban a 40 especies de dermatofitos conocidos.

Sobre la base de su hábitat natural y especificidad de huésped se los clasifica en :

⇒ ANTROPOFILICOS : Infectan al hombre y en raras ocasiones a animales. ⇒ ZOOFILICOS : Son patógenos para animales, pero pueden infectar al hombre. ⇒ GEOFILICOS :



Habitan en el suelo y sirven de fuente de infección para hombre y/o animales.

Agentes etiológicos (de hallazgo más frecuente). Clasificación según la fuente de infección

ANTROPOFILOS GEOFILOS ZOOFILOS • Epidermophyton

floccosum • Microsporu

m gypseum • Microsporum canis

• Microsporum audouinii • Trichophyton mentagrophytes var. mentagrophytes

• Trichophyton rubrum • Trichophyton

mentagrophytes var. interdigitalis

• Trichophyton verrucosum

• Trichophyton tonsurans • Trichophyton violaceum • Trichophyton schoenleinii

HONGOS GEOFILICOS QUE AFECTAN ANIMALES AGENTE ETIOLOGICO LOCALIZACION HUESPED Microsporum cookei Piel glabra Perro, mono Microsporum fulvum Piel glabra, cuero

cabelludo Perro, mono

Microsporum gypseum Piel glabra, cuero cabelludo

Perro, mono, gato, caballo, roedor

Microsporum nanum Piel glabra Cerdo Microsporum persicolor Piel glabra Perro, roedor FISIOPATOLOGIA DE LAS INFECCIONES POR DERMATOFITOS

Para que ocurra la invasión del estrato córneo de la piel por dermatofitos deben acontecer los siguientes eventos : 1. Contacto y adherencia de las artroconidias a los corneocitos. 2. Germinación de las artroconidias. 3. Penetración del estrato córneo por los tubos germinativos. 4. Formación de nuevas artroconidias dentro de las células.

Las artroconidias origina nuevos tubos germinativos que crecen y se ramifican dentro de la capa córnea engrosada dando lugar a un micelio fúngico dentro de ella. Son hongos queratófilos.



En el organismo forman una trama para fijarse. El dermatofito no puede llegar a la dermis y muere. No puede crecer rápido porque la descamación lo elimina.

CONDICIONES QUE FAVORECEN EL DESARROLLO DE LOS DERMATOFITOS

• La epidermis está compuesta por células muertas carentes de mecanismos inmunes defensivos y lejos de los tejidos con capacidad de respuesta inflamatoria.

• La piel está bien hidratada por secreción ecrina y perspiración. • Temperatura más baja, pH 5.5-6.7, aerobiosis.

Métodos de estudio Pasos a seguir 1. Diagnóstico clínico presuntivo (sugerido por el médico). 2. Preparación previa del paciente (las indicaciones deberán ser

impartidas por el Laboratorio de Micología). 3. Toma de muestra (de preferencia las deberá tomar el médico

adjuntando resumen de Historia Clínica). 4. Conservación de la muestra (se mantendrán a temperatura

ambiente, en recipientes de boca ancha, cerrados, secos, protegidos de la humedad).

5. Remisión de la muestra a Micología (deberá realizarse siguiendo las normas de Bioseguridad y en el menor tiempo posible a partir del momento de toma de la muestra).

6. Procesamiento de la muestra (se seguirán los protocolos de rutina). 7. Observación microscópica en fresco con: HOK al 10-40%. 8. Cultivos en Agar Sabouraud, Lactrimel + ATB y Antimicóticos. 9. Incubación a 28ºC no menos de 3 semanas. 10.Informe. 11.Tratamiento (lo implementará el médico tratante).

Preparación previa del paciente: • La lesión debe estar libre de toda medicación, evitar pomadas, talcos

y jabones. • Las uñas cepilladas con agua y jabón, baño de agua y sal (para

ablandar las uñas del pie que son hiperqueratósicas). • Suspensión de toda medicación antifúngica oral y tópica durante la

semana previa a la toma de muestras.

Toma de muestra : ♦ Pelo

Se procederá a extraer por rasurado de los pelos del cuerpo con bisturí, y con pinza estéril los pelos rotos. Si la depilación causa dolor, se cortarán con tijera a ras de la piel.



♦ Escarificación : Las escamas de piel y/o uña se colectarán mediante raspado con bisturí estéril. Se raspará la perifería de la lesión porque por hipersensibilidad retardada la lesión cura en el centro. El crecimiento del hongo es centrífugo (de adentro hacia afuera). Uñas : Se tomará la muestra del lecho subungueal, se extraerá la muestra del borde libre de la/s uña/s con bisturí o gubia.

♦ Lesiones mucosas: Utilizar hisopo embebido en solución fisiológica estéril.

DIAGNOSTICO DE LABORATORIO

1. Observación microscópica Micosis superficiales : Material proveniente de piel, pelos, uñas (material queratínico en general).

• Material biológico + HO K 40 % + temperatura (llama veladora del mechero Bunsen). Colocar cubreobjetos y observar entre 5 y 15 minutos (x 10, x 45 aumentos).

• Material biológico + Lactofenol + cubreobjetos. Observar luego de 30 o 60 minutos (x 10, x 45 aumentos).

• En escamas de piel y uñas : se pueden observar filamentos hialinos de 4-5 μm de diámetro, ramificados y tabicados, también artrosporados.

• En pelos : Los géneros Microsporum y Trichophyton atacan en su mayoría los pelos, invadiéndolos por fuera (Ectothrix) o por debajo de la epidermícula (Endothrix). Las artrosporas de acuerdo a su tamaño son clasificadas como microides (<5μm) y megasporadas (>5μm)

• La observación microscópica directa en fresco con una gota de OHK 40% es la técnica mas utilizada en el Laboratorio de Micología Médica.

2. Características culturales Todos los hongos o la gran mayoría (mohos y levaduras) crecen en

medios apropiados a temperatura ambiente (20ºC y 30ºC). A esta temperatura desarrollan los agentes de las micosis superficiales (óptimo 28ºC) y también las formas saprófitas de los hongos patógenos primitivos.

Los medios de cultivo de elección son:

* Agar papa glucosa. * Agar Sabouraud + antibiótico * Dermatofito Test Medium (D.T.M). * Lactrimel (Leche, harina, miel). * Mycobiotic.



* Medio de arroz. Microcultivos : se realizan cuando es necesario observar la normal disposición del micelio de fructificación, para seguir el crecimiento de la reproducción conidial o algún elemento fúngico en particular. Identificación de los cultivos (colonias) de los Dermatofitos: ⇒ Macroscopía:

Color de la superficie, reverso, textura, forma, elevación, margen o borde, producción de pigmento con o sin liberación al medio, velocidad de crecimiento, etc.

⇒ Microscopía: Se hace disgregación. Morfología, tamaño, agrupación de las conidias. Micelio vegetativo hialino, tabicado, con hifas en raqueta, pectinadas, espiraladas, cuerpos nodulares, candelabros fávicos, clamidosporos, etc.

⇒ Siembra en medios que permitan la esporulación ⇒ Pruebas fisiológicas:

Ureasa, requerimientos nutricionales, perforación del pelo "in vitro". Tolerancia a altas temperaturas, prueba de producción de pigmentos, etc.

BREVE DESCRIPCION DE LOS AGENTES ETIOLOGICOS DE PRESENTACION MÁS FRECUENTE

GENERO Epidermophyton: Epidermophyton floccosum (Harz) Langeron & Milochevitch

• Características de la colonia: en Agar Sabouraud el desarrollo es lento. Son aterciopeladas, a veces algodonosas, amarillo pálido ocre o amarillo mostaza, reverso amarillo tanino con centro marrón. El centro puede plegarse hasta tomar aspecto cerebriforme. Las colonias se tornan blancas, flocosas y estériles.

• Microscopía: Las macroconidias son clavatas surgen en racimos, y se desarrollan con

crecimiento lateral o terminal de la hifa madre, poseen 2-5 células, 10-40 x 6-12 μm. No forma microconidias. No invaden el pelo. Se forman clamidosporas y artroconidias En cultivos viejos.

• Fisiología: Test de perforación del pelo “in vitro” negativo.

Patogenicidad




La E. floccosum produce lesiones eritematosas, escamosas y pruriginosas. Aunque es poco frecuente en animales ya que es un Dermatofito antropofílico.

• Distribución: mundial.

GENERO Microsporum: • Descripción del género: El crecimiento de las colonias varía de rápido a lento, algodonosa a

glabra, pulverulenta, blanca, amarilla, a veces con tintes salmón, reverso color crema, rojizo o amarillento. Macro y microconidias están presentes, solas o en racimos en el final o a un lado de la hifa.

Las macroconidias emergen en grupos en ángulos agudos, 2 a muchas células, paredes delgadas a gruesas, equinuladas a rugosas, con forma de huso o cigarro, hialinas. Microconidias con 1 célula, lisa y de paredes delgadas, hialinas, ovoides a clavata, solitarias.

Patogenicidad : Afectan pelo y piel de hombre y/o animales. La pteridina es un

metabolito presente en Microsporum canis, M. audouinii, M. distortum, M. ferrugineum, al iluminar con lámpara de Wood produce fluorescencia (+) color amarillo-verdoso

El ataque al pelo es ectothrix.

• Teleomorfo: Arthroderma (Ascomycetes, Onygenales: Arthrodermataceae).

PRINCIPALES ESPECIES PATOGENAS

1. Microsporum canis 2. Microsporum gypseum 3. Microsporum audouinii 4. Microsporum nanum GÉNERO Trichophyton:

• Descripción del género: Colonias glabras o algodonosas, blancas, rosadas, amarillentas o color

crema. Reverso marrón, rojo, violeta o amarillo. Las macroconidias tienen 2 células o más con forma de cilindro o forma de cigarro, hialinas 20-50 x 4-8 μm, y las microconidias cuando están presentes son terminales o están a lo largo de hifas, la pared generalmente es delgada, lisa, hialina, con 1 célula, ovoide, piriforme a clavata.


Las microconidias predominan, y pueden agruparse en clusters, o aisladas a lo largo de la hifa. Pueden formarse hifas en raqueta, cuerpos nodulares, clamidosporas.

• Teleomorfo : Arthroderma, (Ascomycota, Onygenales : Arthrodermataceae).

• Patogenicidad : Ataca piel, pelo y uña. El ataque al pelo puede ser endo o ectothrix.

PRINCIPALES ESPECIES PATOGENAS

1. Trichophyton mentagrophytes 2. Trichophyton verrucosum 3. Trichophyton equinum



____________________________________________________________________________________ CANDIDIASIS - CANDIDOSIS (MONILIASIS) CANDIDIASIS: Su agente etiológico más reconocido es Candida albicans, aunque otras varias especies han sido descriptas como patógenos emergentes. Condiciones predisponentes facilitan la infección y colonización por estos hongos, así, en pacientes diabéticos, obesos y en la gravidez, la CANDIDIASIS (Moniliasis) de la piel y anexos y/o mucosas es frecuente, siendo las extracutáneas las formas más graves, como las vinculadas con vías respiratorias, aparato digestivo, riñón y las diseminadas o sistémicas. Otras condiciones que favorecen la colonización por Candida son: • Aumento de humedad y maceración de la piel • Uso indiscriminado de antibióticos, hormonas, corticoides, antineoplásicos,

etc. • Pacientes con cancer, diabéticos, transplantados y HIV+/(SIDA). PATOGENICIDAD (VIRULENCIA). • Variabilidad fenotípica



• Adherencia a células de los tejidos del huesped • Capacidad invasiva por formación de pseudomicelio (filamentización). • Elaboración de enzimas (proteinasas, lipasas, fosfolipasas), que favorecen el

ingreso por degradación de sustancias tisulares que usan como nutrientes. ECOLOGIA Y DISTRIBUCION Las levaduras del genero Candida están ampliamente distribuidas en la naturaleza, pudiendo vivir en forma saprófita o como parásitas en el organismo del hombre y de otros animales. Sólo algunas especies son consideradas participantes de la flora microbiana normal del hombre y los animales, toda vez que pueden ser aisladas de boca, piel y vagina de individuos normales. TAXONOMIA • Clase-forma: Deuteromycetes (Fungi imperfecti) • Subclase: Blastomycetidae • Orden: Cryptococcales • Familia: Cryptococcaceae • Especies: Candida albicans, C. stellatoidea, C. parapsilosis, C. tropicalis, C.

krusei, C. pseudotropicalis, , C. guilliermondii, etc. Diagnóstico de laboratorio. - Muestras: Los materiales clínicos a ser examinados pueden incluir los raspados de uñas, piel y mucosas, secreciones bronquiales, LCR, orina, heces, materiales de biopsias y necropsias, etc. Es uno de los parámetros más importantes para el diagnóstico presuntivo, haciéndose necesario el exámen microscópico (directo en fresco o previa coloración de Gram, Azul de Metileno, Giemsa, etc.) del material clínico. A partir de este exámen pueden obtenerse valiosas informaciones, tales como: cantidad de levaduras presentes, diámetro de las células y número de brotaciones, presencia o ausencia de pseudomicelio, etc. Los raspados de piel y uñas (materiales queratínicos) son examinados entre porta y cubreobjetos, utilizando (OH)K al 40% en caliente, que permite mayor contraste en la visualización de los elementos micóticos, también pueden usarse (OH)Na al 10 o 20% y Lactofenol. En las muestras de biopsias o autopsias los exámenes histopatológicos son de notable interés cuando se realizan coloraciones de PAS. Grocott o Gomori.



- Observación microscópica directa: Células esféricas, ovales, cilíndricas, etc. brotantes de 3 a 6 um de diámetro, con paredes finas, generalmente dispuestas en aglomerados y entremezcladas a numerosas hifas septadas hialinas y pseudomicelio (Pseudofilamentos). A partir de este exámen puede obtenerse valiosas información, como, cantidad de levaduras presentes, diámetro de las células y número de brotaciones, presencia o ausencia de pseudomicelio, etc. - Cultivos: Los medios de cultivo para este fin son los universalmente conocidos como Agar Sabouraud con alguna que otra variante y adicionados de antibióticos como Cloranfenicol 0.1 mg/ml. o Penicilina y Estreptomicina (20 U/ml y 40 mg/ml respectivamente). Entre 24 horas y 10 dias, incubación a 28 y 37ºC. El uso de Cicloheximida (Actidione) retarda y/o inhibe el crecimiento de algunas especies de Candida en concentraciones de 0.5 mg/ml siendo recomendable la siembra de algunos medios sin esta droga. - Macromorfología de las colonias. Aspecto: cremoso (humedas y lisas), rugosas, cerebriformes, etc. Color: blanco, blanco sucio, salmón, parduzcas, etc. - Identificación de especies: se basa fundamentamente en la micromorfología: • Forma y dimensiones del micelio vegetativo y de fructificación. • Modo de reproducción asexual • Presencia de pseudomicelio y clamidosporos. Estos y la filamenticación de las

levaduras se logra sembrando en medios ricos en polisacáridos, Tween 80 (tensioactivo) y azul tripán que permite una óptima observación microscópica. Los medios recomendables para estos estudios son: Agar harina de maiz + Tween 80 + Azul tripán y el Agar papa + zanahoria + bilis (P.C.B.)

La formación de clamidosporos y la filamentización (tubos germinativos) o efecto de Reynolds & Braude, 1956 (suero o albúmina de huevo inoculados con levaduras, incubados a 37ºC, hasta 3 horas) se utiliza como identificación precoz de Candida albicans. - Características fisiológicas: Utilización de H. de C. (Auxanogramas) y derivados nitrogenados (NO3K), Zimogramas (Pruebas de fermentación de H. de C. con producción de ácidos orgánicos y dióxido de carbono detectados por medio de indicadores de pH y formación de gas), acción proteolítica y producción de ureasa, entre otros, son aplicados para la determinación de especies de Candida. Reproduccion sexual. Se estimula sembrando las cepas aisladas en medios pobres, por ej. Acetato agar, Gorodkowa, Agar Extracto de malta, Bloque de yeso y zanahoria. Las formas perfectas de Candida (Ascomycetes, Subclase Hemiascomycetidae) se designan con el nombre Hansenula, Picchia, Kluycveromyces, Metschnikowia, etc. Patogenicidad. El conejo es el animal más sensible a la infección experimental por Candida albicans (la rata y el ratón también lo son). Todas las cepas de esta especie, inoculadas por vía intravenosa en la cantidad de 1 ml de suspensión al 1% de cultivos en solución



fisiológica, provocan la muerte del animal en 3 a 7 días; el 50% de las cepas de Candida tropicalis producen el mismo efecto. Las otras especies de Candida no son patógenas en las mismas condiciones de experimentación. En la autopsia aparecen pulmones fuertemente congestivos, riñones hipertrofiados que presentan microabscesos distribuidos en la región cortical. PRUEBAS ESPECIALES PARA LA IDENTIFICACION DE Candida albicans. A. FORMACION DE TUBOS GERMINATIVOS O “EFECTO R.B.” (Reynolds & Braude, 1956). La germinación de tubos de una longitud de una y media a tres veces el diámetro de la célula que le dio origen, se produce después de 2 a 3 horas de incubación a 37ºC en suero y plasma sanguíneo, albúmina de huevo, etc. siendo un método eficiente en la identificación rápida de C. albicans, que luego se confirma con el test de asimilación de la sacarosa, para diferenciarla de Candida stellatoidea, ya que ambas cepas tienen esta propiedad de originar brotamientos digitiformes. B. FILAMENTIZACION Y PRODUCCION DE CLAMIDOSPORAS. La formación de blastosporas en la filamentización, tipo Mycotorula y clamidosporas terminales globosas son características de C. albicans. OBSERVACION: debe diferenciarse la presencia de clamidosporas de C. dubliniensis y C. stellatoidea a través de características morfológicas y pruebas fisiológicas. C. SENSIBILIDAD A LA CICLOHEXIMIDA. El medio de Sabouraud + Actidione a 0.05% es utilizado para probar la resistencia de especies de Candida, haciendo la lectura a las 24-48 horas. Son resistentes a esta droga C. albicans, C. guillermondi, C. stellatoidea y C. pseudotropicalis. D. TERMOTOLERANCIA. Incubación a 37 y 42 ºC. Ejemplo: a 42ºC, C. albicans................. (+) positivo C. dubliniensis.......... (-) negativo E. MEDIOS DE CULTIVO DIFERENCIALES. CHROM Agar CANDIDA (Medio cromogénico). Peptona ..................................... 10 gr Glucosa...................................... 20 gr Cloranfenicol.............................. 0.5 gr Sustrato cromogenico................ 2 gr Agua destilada csp.................... 1000 ml Incubación 30ºC y 37ºC, 48 horas (como mínimo). Características: C. albicans ........ colonias VERDES C. tropicalis....... colonias AZULADO-PURPUREO



C. glabrata......... colonias ROSADO OSCURO C. krusei............. colonias ROSADO PALIDO C. parapsilosis... colonias BLANCO GRISACEO Micromorfología presentada por algunas especies de Candida (cultivos en lámina en medio “Agar harina de maiz-Tween 80” después de una incubación de 72 horas). 1. Candida albicans. Clamidosporas terminales globosas, pseudomicelio tipo “mycotorula” con blastosporas ovoides o globosas. 2. C. parapsilosis. Pseudomicelio ramificado tipo “mycocandida” con células muy grandes, con blastosporas globosas u ovoides. 3. C. tropicalis. Clamidosporas piriformes pueden observarse, pseudomicelio tipo “mycotorula y “mycotoruloides”, con blastosporas ovoides o semiglobosas. 4 C. krusei. Pseudomicelio tipo “mycocandida”, con células alargadas y delgadas, blastosporas ovoides predominantemente cilíndricas. 5. C. guilliermondi. Pseudomicelio fino y ramificado tipo “mycocandida”, blastosporas ovoides o cilíndricas.



___________________________________________________________________ HISTOPLASMOSIS (Enf. de Darling, Reticuloendoteliosis - Darling, 1906) Histoplasma capsulatum anamorfo Emmonsiella capsulata (Mohos heterotálicos de la Clase Ascomycetes, Fam. Gymnoascaceae). La zona endémica de la histoplasmosis comprende regiones tropicales y subtropicales, templadas húmedas, con una temperatura de 10 a 15ºC y una humedad relativa ambiente entre 70 y 80%. En la República Argentina su zona de endemia comprende la pampa húmeda involucrando Pcia. de Buenos Aires, Santa Fe, Entre Ríos, Córdoba, La Pampa, Tucumán y Salta.



Fuentes de infección. Suelo y cuevas. Depósitos de guano de aves marinas, criaderos de aves (gallineros). Casas y edificios viejos, ricos en deyecciones de murciélagos y pájaros. Puerta de entrada y vías de diseminación. La puerta de entrada es fundamentalmente inhalatoria y en el 95% de los casos la primoinfección es subclínica o asintomática, solo revelable por una intradermorreacción (+) positiva a histoplasmina. Por vía hematógena se produce la diseminación del hongo a otros órganos y concomitantemente aparecen localizaciones mucocu-táneas. Síntomas frecuentes. El paciente presenta, tos, fiebre elevada, expectoración muco-purulenta, hemoptisis, disnea, astenia, anorexia, disfagia, sialorrea, pérdida de peso, etc. Lesiones pulmonares. Radiológicamente se demuestran calcificaciones únicas o múltiples, infiltrados con adenopatías hiliares, granuloma hipertrófico (histoplas-moma), cavidades apicales y fibrosis (cicatrizal). Lesiones extrapulmonares. Hígado, bazo (hepato-esplenomegalia), SNC, huesos, adenopatías múltiples y cutáneo-mucosas con úlceras francas de bordes netos, pápulo-pústulas, etc. en boca, nariz, laringe, genitales son descriptas con frecuencia. En los pacientes inmunocomprometidos las lesiones en general son múltiples y polimorfas. H. farciminosum es el causante de la linfangitis epizoótica equina o histoplasmosis del caballo. Diagnóstico de laboratorio. Extendidos de secreciones o improntas de biopsias fijadas con alcohol metílico y coloreadas con May Grunwald Giemsa (3 gotas/cc agua durante 30 min.) demuestran microscópicamente elementos levaduriformes ovoides, con pared gruesa de 3 a 5 um de tamaño preponderantemente dentro de macrófagos o células gigantes. Estas levaduras presentan una tinción en casquete característica. Cultivos: en Agar glucosado + extracto de levadura + Actidione + Cloranfenicol, Lactrimel, Agar glucosado sangre, Agar extracto de



levaduras (AEL), etc. incubados a 37ºC durante 20 a 30 días presentan colonias levaduriformes, pastosas, blanco sucio o parduzcas, que presentan elementos ovoides semejantes a la forma parasitaria. Medios de cultivos incubados con muestras positivas a 25-30ºC, luego de una semana de incubación, presentan colonias con micelio aéreo blanco algodonoso y parduzcas con el tiempo. El exámen microscópico revela microconidios redondos o piriformes, lisos o equinulados (2 a 5 micras de diámetro) que pueden ser sésiles a los lados de las hifas o unidos a cortos conidióforos laterales. Tardíamente aparecen característicos macroconidios (7 a 10 um), grandes, redondos o piriformes y tuberculados. Tinciones especiales (Histopatológicas). Extendidos, improntas y cortes histológicos teñidos con PAS, Gomori-Grocott facilitan la pesquisa microscópica de Histoplasma. Hematoxilina-eosina es una tinción importante para la demostración celular indicativa de ausencia o presencia de resistencia específica por parte del huésped.



______________________________________________________________________ ESPOROTRICOSIS. La Esporotricosis, “Enfermedad de los jardineros de rosas” (Koneman), “la enfermedad de las mulitas” (Uruguay), es una micosis profunda subaguda o crónica de distribución universal producida por Sporothrix schenckii de Hoog. Este eumyceto (hongo) vive en el medio exterior sobre vegetales diversos vivos o muertos, sobre todo madera, paja y musgos, necesitando para su multiplicación activa, temperaturas superiores a 13ºC y una húmedad relativa ambiente elevada. En la mayoría de los casos, los conidios de S. schenckii ingresan por inoculación traumática en la piel de hombres y animales por espinas y astillas vegetales, virutas de madera y paja contaminadas o por rasguño y mordeduras de animales silvestres (armadillos, ratas, iguanas, etc.) o elementos transportadores circunstanciales de esporas del hongo.



La forma clínica más frecuente es la Linfangíticonodular que se origina como un chancro de inoculación con escasa supuración, seguido de nódulos dermoepidérmicos en número variable a lo largo de los linfáticos y afectando los ganglios regionales, conformando asi la tríada: chancro de inoculación, linfangitis y adenopatía regional. Con menos frecuencia se observa la forma Cutánea localizada o fija que se presenta como lesiones dermoepidérmicas inflamatorias, de superficie granulomatosa o verrucosa, que simula otras enfermedades, y excepcionalmente formas extracutáneas (pulmonar, sistémica, del SNC, etc.). Diagnóstico micológico. En el examen microscópico directo en fresco es dificil establecer la presencia de las típicas células asteroides de S. schenckii. El material conveniente para el estudio micológico es el pus de los bordes del chancro de inoculación o el de la punción de nódulos reblandecidos (Muestra de elección, pues está libre de contaminantes ambientales y flora bacteriana asociada). Los extendidos (frotis) coloreados con los métodos de tinción microbiológicos tradicionales son de poca utilidad, ya que los elementos fúngicos se colorean mal aunque el pus y los cortes histológicos seriados de tejidos parasitados, coloreados por métodos de PAS y Gomori asociados a H/E son de valor diagnóstico. En estos preparados se puede demostrar por microscopía las formas parasitarias de S. schenckii, en general en número escaso de células levuliformes esféricas, ovales o elongadas tipo cigarro o “navette” (de los franceses) de 2-4 x 6-10 um de tamaño y con escaso brotamiento. Con H/E las células parasitarias se presentan envueltas en un material eosinofílico (“cuerpo asteroide”) o reacción de Splendore-Hoeppli, aunque en muchos casos de Esporotricosis los cuerpos asteroides no son encontrados. La confirmación de Esporotricosis se realiza fundamentalmente por el cultivo del agente etiológico en medios como Agar miel de Sabouraud, Agar Sabouraud + sangre, Agar glucosado + extracto de levaduras (5gr/lt) + Actidione (0,5 gr/lt) y Lactrimel que permiten el cultivo y aislamiento de S. schenckii a 25ºC dentro de la semana de incubación, en forma de colonias al principio pequeñas y blancas con escasa cantidad de hifas aéreas algodonosas, que luego se torna húmeda, enrulada con aspecto membranoso aterciopeladas, que a menudo oscurecen tornándose marrones o negras con surcos radiados. En algunos aislamientos las colonias son negras desde el principio. A 37ºC las colonias son cremosas, bronceadas suaves tipo levuliformes (faz parasitaria), favoreciendo esta característica la siembras en Agar infusión cerebro-corazón. La micromorfología de S. shenckii a 25ºC presenta hifas septadas y ramificadas con pequeños conidios hialinos de pared delgada, piriformes o redondos (2-3 x 3-6 um) sobre conidióforos delicados,



algunas veces agrupándose en tipo margarita o roseta en los cultivos jóvenes, luego los conidios se encuentran aislados sobre conidióforos y a lo largo de las hifas, presentando paredes gruesas y oscuras. En este momento la mayor proporción de estos conidios le confiere intensidad de color a las colonias. Estudios de biología molecular de Sporothrix shenckii lograron identificar en la actualidad a varias especies que antiguamente se agrupaban todas como S. shenckii. Histopatología. En general el estudio de las biopsias de las lesiones esporotricósicas establece una reacción inflamatroria mixta, purulenta y granulomatosa, frecuentemente acompañada de fibrosis.

______________________________________________________________________ COCCIDIOIDOMICOSIS (Enfermedad de Posadas. Posadas - Wernicke, 1892). Es una enfermedad aguda, generalmente benigna y limitada al sistema respiratorio, tornándose raramente crónica o generalizada. Es endémica en áreas desérticas del sud-oeste de los Estados Unidos, México, América Central y América del Sur. Su agente etiológico es el Coccidioides immitis, hongo dimórfico, del suelo, que en los medios usuales de cultivo y a temperatura ambiente (25-28ºC) forma colonias algodonosas o vellosas blancas, compuestas por hifas hialinas y septadas. Muchas cepas producen abundante cantidad de artroconidios rectangulares (en forma de barril), que miden 2.5-3 x 4-6 micras. Estas se forman por tabicación de las hifas, que luego aparecen separadas alternadamente por pequeñas células vacías, que se rompen liberando los artroconidios o enthosporas.



Vehiculizadas por el viento contaminan el aire e infectan al hombre y animales, en general por inhalación. En los tejidos del hospedador el C. immitis toma una forma característica de esférula o esporangio-quiste. Diagnóstico micológico. Se basa en: 1.- Examen microscópico 2.- Cultivo del agente etiológico a temperatura ambiente 3.- Inoculación en animales sensibles 1.- Examen microscópico: se hace en fresco, entre porta y cubreobjetos con una gota de solución fisiológica estéril, las muestras pueden ser diversas, de acuerdo con la localización de la enfermedad, por ejemplo: esputo, lavado bronquial, pus de abscesos, ganglios, biopsias de diferentes órganos y lesiones cutáneas, LCR, etc. Al examen microscópico en fresco de los materiales biológicos se observan elementos fúngicos esféricos, denominados esférulas o esporangios (esporangio-quistes) de 20 a 60 um de diámetro, con una membrana gruesa y refringente, de doble contorno, que en su interior poseen un número variable de endosporas de 3-5 um de diámetro, que ocupan la totalidad del citoplasma; también pueden encontrarse esporangios de primoinfección, de forma ovalada, más grandes y con endosporas pequeñas ameboides, depositadas en la periferia interna de la membrana celular. Sobre las esférulas o esporangios de reinfección de algunos cortes histológicos coloreados por hematoxilina-eosina, se establece la presencia de material eosinófilo radiado envolviendo la pared celular (Reacción de Splendore-Hoeppli). Además en los tejidos pueden observarse formas inmaduras de esférulas y también esférulas vacías, como consecuencia de la liberación de las endosporas. Otras veces los esporangios se presentan agrupados en paquetes o masas rodeados por una membrana, conformando soros. 2.- Cultivos: se utilizan medios de cultivo como el Agar miel o glucosado de Sabouraud, Lactrimel u otros medios sólidos con el agregado de extracto de levadura, sangre, etc. Para inhibir el crecimiento de bacterias y otros hongos (contaminantes del medio ambiente) se adiciona a los medios, antibióticos antibacterianos y antifúngicos como: Cloranfenicol 0.05 gr/litro y Cicloheximida 0.5 gr/litro. También puede usarse Penicilina + Estreptomicina + Cicloheximida, u otros antibióticos de amplio espectro. A temperaturas de incubación de 25-30ºC se observan pequeñas colonias dentro de la primer semana de cultivo, con el tiempo las colonias se cubren de micelio aéreo abundante, algodonoso y blanco, que cuando madura se hace granuloso, ligeramente parduzco y rico en



enthosporas o clamidoartrosporas (artroconidios); a 37ºC de temperatura dificilmente cultiva, pero en medios especiales y con atmósfera de CO2 produce esférulas semejantes a la forma parasitaria. IMPORTANTE: El manipuleo de las cepas de C.immitis debe realizarse con sumo cuidado, pues son altamente infectantes. 3.- Inoculación en animales de laboratorio: el C. immitis es patógeno para la mayoría de los animales. En el cobayo la vía intratesticular produce a la semana una orquitis neta, que será cada vez más grave. En el pus que se obtiene directamente o por punción testicular se observan microscópicamente los distintos estadios de las esférulas (dependiendo del tiempo de inoculación). También, se utiliza el ratón por vía intraperitoneal. A partir de los tejidos infectados de estos animales, se pueden obtener cepas de este hongo por retrocultivos. Es recomendable previo a las inoculaciones, decontaminar las muestras, tratándolas con antibióticos y agregando también los mismos al agua de bebederos durante cierto tiempo, evitando asi infecciones de otro tipo, en los animales utilizados.

Enthosporas de Coccidioides inmitis. Característico del ciclo de vida saprofitito del patógeno.



______________________________________________________________________ RHINOSPORIDIOSIS



Es causada por el Rhinosporidium seeberi (Guillermo Seeber, 1896) un protista (eucariota) que se caracteriza por ser una enfermedad granulomatosa y crónica del hombre, los caballos, perros y en menor medida cabras, gatos, zorros y aves. Se presenta fundamentalmente en mucosas, como una tumoración de aspecto polipoideo y aframbuesado. En la superficie de estas lesiones aparece un puntillado blanco-amarillento típico rico en esférulas grandes llenas de esporangiosporas. Debido a que las lesiones al principio no causan mayor molestia y dado la lenta evolución de la infección, es dificil precisar la forma y momento en que ocurre la misma, aunque se suele relacionar con traumatismos. La localización predominante es la nasal. La mucosa que recubre el tabique nasal y los cornetes suele ser la primera en afectarse y a partir de ella se extiende por autoinoculación. El enfermo tiene sensación de cuerpo extraño intranasal, prurito y secresión. Con el tiempo, los pólipos son pedunculados, ocasionan obstrucción y defectos en la respiración. Los pólipos son friables y muy vascularizados, pudiendo sangrar con facilidad. La locaclización que sigue en frecuencia es la ocular, y se la ha relacionado con traumatismos de la conjuntiva ocasionados por granos de arena. La conjuntiva palpebral es la más afectada. Otras localizaciones mucosas menos frecuentes incluyen el paladar, epiglotis, genitales femeninos (simulando condilomas) y ano. En el varón se han descripto pólipos a nivel de meato urinario. Ocasionalmente se observan lesiones en otras partes del cuerpo. Los animales comunmente infectados son los solípedos. Es frecuente encontrar pólipos de variada forma y tamaño, que nacen directamente sobre la mucosa del ollar o sobre cortos pedúnculos, en rarísimos casos el parásito puede diseminarse por vía hematógena. Es bien conocida su forma parasitaria en los tejidos infectados, en los cuales microscópicamente se observan esporangios (esférulas) que alcanzan de 6 a 300 um de diámetro, dependiendo del estado de crecimiento de su ciclo biológico. Los esporangios maduros tienen una espesa pared celular, constituida por quitina y celulosa, en su interior contienen de 16.000 a 20.000 endosporas de 6-7 um de tamaño. Cuando los esporangios están completamente maduros, las endosporas son liberadas por ruptura de la pared celular. Epidemiología. La fuente de infección no ha sido aclarada definitivamente, aunque está asociada a sistemas dulceacuícolas, dado que hombres y animales que trabajan o nadan en aguas estancadas, adquieren generalmente la enfermedad, lo que sugiere que el hábitat de este hongo es acuático o subacuático. Los antecedentes de muchos pacientes están relacionados con tareas en contacto con el agua de baños naturales de ríos y entanques, obreros que recogen arena y piedras del fondo de los ríos, pescadores, buscadores de perlas, etc.



En nuestro pais la Rhinosporidiosis esta descripta en zonas de climas húmedos, templados y subtropicales como son la cuenca de los ríos Pilcomayo, Bermejo, Paraná y Rio de la Plata. La mayoria de los casos humanos y de animales han sido encontrados en la provincia de Chaco. Diagnóstico micológico. El R.seeberi no ha podido ser cultivado en medios comunes, ni reinoculado en animales de laboratorio, aunque, recientemente ha sido aislado en condiciones experimentales. El diagnóstico se basa en la observación directa de las esférulas entre porta y cubreobjetos. Histopatología. Los cortes histológicos coloreados por hematoxilina-eosina son muy útiles para la identificación del hongo en los tejidos y coloraciones especiales como Gomori-Grocott asociado a HE son mucho mejor para evidenciar las endosporas en el interior de las esférulas. La Rinosporidiosis presenta una reacción inflamatoria crónica a nivel de las submucosa o de la dermis con infiltrados linfoplasmocitarios, gran vascularización y ausencia de eosinófilos. Tratamiento. Extirpación quirúrgica de los pólipos con cauterización o electrocoagulación para evitar la extensión o recidivas de la micosis.

Histologia de rhinosporidiosis: Corte histologico de un pólipo nasal teñido con PAS X400 aumentos.




BIBLIOGRAFIA :

1. Rippon J. Micología Médica. 3º edición en Capítulo 4 y 7..

Interamericana. 2. Beneke Everett. S,. Alvin L. Rogers. Medical mycology and human mycoses STAR Publishing Company. P.O. Box 68. Belmont, California 94002. (1996). 3. Frey, R. J. Oldfield, R. C. Bridger. A colour atlas of pathogenic fungi. Wolfe Medical Publications LTD. (1979) General Editor, Wolfe Medical Atlases: G. Barry Carruthers, MD (LOND). 4. Atlas of clinical fungi. Edited by G. S. de Hoog & J. Guarro. Centraalbureau voor Schimmelcultures/Universitatt Rovira i Virgili, 1995.

guia micologia 2009

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