Identificación de subproductos y posibles daños celulares en Helicobacter pylori por acción del cloro y el ozono en agua potable.

Jefe de proyecto: Ma. Teresa Orta de Velásquez

ParticipantesAcadémicos: M. en C. Isaura Yáñez Noguez, Dr. Ignacio Monje Ramírez,Fac. de medicina: Dra. Yolanda López Vidal, Dr. Gonzalo Castillo

Becarios:Maestría. Beatriz Casasola RodríguezLicenciatura. Priscila Ivette Román RománMarié Andreé Pierdat GallardoSalvador Rangel Guadalupe

Proyecto Interno: 9361

Vigencia: 2010-2011

Helicobacter pylori es una bacteria asociada a gastritis crónica y adenocarcinoma.

• Helicobacter pylori

• GRAM (-)• 2-6 FLAGELOS UNIPOLARES• 2 FORMAS MORFOLÓGICAS (COCOIDE, BACILAR)• FORMA COLONIAS TRANSLUCIDAS DE 1 mm• MICROAEROFÍLICA• (2-5% O2 Y 5-10% CO2) EL O2 ES SU ACEPTOR FINAL DE ELECTRONES

• TEMPERATURA ÓPTIMA 37 º C• NEUTRÓFILA CON CRECIMIENTO ÓPTIMO PH: 5.5-8• REQUIERE MEDIOS COMPLEJOS, COMPLEMENTADOS CON

AGAR SANGRE Y SUPLEMENTOS DENT Y SKIRROW• ES DETECTADA AL AGREGAR TRIFENILTETRAZOLIO (TTC)• UREASA, CATALASA Y OXIDASA (+)• CATABOLIZA GLUCOSA SOLAMENTE• AMINOÁCIDOS Y UREA, FUENTE DE NITRÓGENO

Debido a su importancia, ha cobrado interés a nivel mundial:

En 1994 (IARC) y (OMS), lo clasificaron como carcinógeno de clase I dentro de los agentes causales.

2005 Marshall y Warren obtuvieron el premio nobel en medicina por el descubrimiento de la implicación de la bacteria en úlceras pépticas y gástricas.

*OMS 2008 México Mundial

• 50% de la población mundial está infectada

• 80% en países en desarrollo• Infectados con H. pylori

• 20% desarrollará cáncer gástrico

• 20% desarrollarán úlcera péptica.

Formas morfológicas transmisibles de H. pylori

BacilarEn cuerpo humano y

condiciones de laboratorio

Viable , Cultivable. Apta para pruebas

médicas

Cocoide Forma resistente en el

ambiente acuático

Viable no cultivable (VNC)

Apta para pruebas de desinfección en

condiciones naturales

No viable

• Azevedo et al. 2007 proponen que la forma cocoide es la forma en la que la bacteria se encuentre en el medio ambiente

Detección

• Inmunoensayo enzimático• Prueba de actividad de ureasa• Hibridación fluorescente in situ FISH:

(Fluorescent In Situ Hybridization)• PCR (polymerase chain reaction) en tiempo real

• Debido a que la forma (VNC) es la que se encuentra presente en los sistemas acuáticos, se utilizan diversos métodos que no involucran el crecimiento de la bacteria.

- PCR Técnica cuantitativa- PCR Detecta en tiempo real la amplificación de nuestro genoma de interés.

Se ha detectado HELICOBACTER PYLORI en:

• Agua superficial (Cutzamala).

• Agua residual tratada usada para riego (Xochimilco).

• Agua residual sin tratamiento (Gran Canal/Río de los Remedios).

Métodos más empleados para Desinfección

• Económico y eficaz• Buenas propiedades residuales• 1.1 mg/L residual

• Formación de trihalometanos en presencia de materia orgánica

(vegetal o animal) - Bromoformo

- Cloroformo

• Ozono

• Alto potencial de oxidación• Rápida descomposición• 0.1-0.4 mg/L residual

• Formación de subproductos en presencia de materia orgánica y bromuros.

-Bromato (25 μg/L)-Bromoformo

• Cloro• Hipoclorito y monocloramina (NH2Cl)

H. pylori ha mostrado resistencia a los niveles

habituales de cloro, por lo que la bacteria puede

permanecer viable el tiempo suficiente para llegar a

la población.

Buscar alternativas eficaces en los procesos de tratamiento de agua

potable y de reuso.

El tratamiento con ozono es una tecnología factible de desinfección

(Thanomsub 2002). Usó cultivos aplicando altos tiempos de contacto.

Daño en membrana

Desinfección

Objetivos específicos:

1. Cuantificar la densidad celular de H. pylori, para determinar la inactivación

aplicando la técnica de PCR en tiempo real.

2. Determinar posibles alteraciones en el DNA de H. pylori aplicando la técnica

de PCR el tiempo real.

3. Determinar posibles alteraciones en la estructura celular de H. pylori por

medio de microscopía electrónica.

4. Evaluar subproductos derivados de la desinfección con ozono .

OBJETIVO

Helicobacter

pylori

Establecer las dosis del ozono y cloro, así como tiempos de contacto necesarios para inactivar la bacteria H. pylori inoculada en una muestra sintética y en agua de pozo.

Suspensión bacterianaEn agua

Concentración conocida con PCR-tiempo real

Medición de concentración de

la densidadcon PCR-tiempo

real

Medición de subproductos por cromatografía de

gases

Daño en membranaMicrografía electrónica

METODOLOGÍA

13 ml de agua6x106 UFC de H. pylori

3 min 5 min 10 min

Resultados

Determinación de la solubilidad del

ozono en agua destilada

Para realizar los ensayos de desinfección

fue necesario obtener una solución

acuosa saturada de ozono, ya que no es

posible ozonizar directamente las

muestras sintéticas con H. pylori. Debido

a que se trabaja con volúmenes muy

pequeños de agua y las dosis de ozono

son bajas.

El Dr. Castillo de la Facultad de medicina recomendó promover las formas cocoides y realizar los ensayos de desinfección dentro de un periodo de 22 días posteriores.

Se realizaron diferentes ensayos, sin embargo no se observó crecimiento bacteriano en ninguna de las placas de agar.

Probablemente la bacteria sufre lisis por choque osmótico al entrar en contacto con el agua destilada.

Se efectuó el mismo ensayo, sustituyendo el agua destilada por Solución Salina Isotónica para determinar tiempo de vida de la forma bacilar de H. pylori en ella, sin embargo tampoco se obtuvo crecimiento de H. pylori en ninguna de las placas. Se determinó un tiempo de vida corto de la forma bacilar de H. pylori en agua destilada.

Debido a los resultados obtenidos se evaluó la posibilidad de trabajar con las formas cocoides, ya que estas son las que se encuentran en medios acuáticos como forma de resistencia de la forma bacilar de H. pylori.

Helicobacter pylori será proporcionada por la Facultad de Medicina (UNAM. 26695)

Suspensión celulares con 3x105 UFC/mL

Se incubó a temperatura ambiente en condiciones aeróbicas para inducir la transformación de las formas bacilares a formas cocoides.

Se realizaron tinciones de Gram de las 3 suspensiones a los 5, 6 ,7 y 10 días. En todos los casos se observaron formas bacilares y formas cocoides, pero las estructuras cocoides fueron aumentando

progresivamente y cada vez se observaron menos formas bacilares.

Al décimo día se obtuvo una suspensión que contiene más del 80% de las formas cocoides. (Tinción Gram)

Con esta suspensión se pretende trabajar para realizar los ensayos de desinfección.Los resultados que se obtengan serán de mayor relevancia debido a que las formas

cocoides de Helicobacter pylori juegan un papel importante en el proceso de transmisión por su capacidad de persistencia en ambientes acuáticos.

RESULTADOS

Bacilar

Cocoide

Obtención de las formas cocoides

Suspensión bacterianaFORMAS COCOIDES

Concentración inicial con PCR-tiempo real

Medición de concentración

con PCR-tiempo real

Medición de subproductos por cromatografía de

gases

Daño en membranaGenotoxicidad

ACTIVIDADES SEGUNDO AÑO