Investigación y Recuento de Staphylococcus aureus

Método de recuento en placa

Apartados del Ejercicio

A. IntroducciónB. Material

C. Medios de cultivo y reactivosD. Preparación de la muestra

E. Preparación de las diluciones decimalesF. Siembra por extensión en superficie

G. Incubación de las placasH. Lectura de las placas y recuentos de colonias

I. Cálculos y expresión de los resultadosJ. Confirmación con la prueba de la coagulasa

K. Adiestramiento en la distinción y recuento de colonias de   Staphylococcus aureus L. Interpretación de los resultados del supuesto práctico

LL.- Contestación a las preguntasM.- Envío al servidor de los resultados del ejercicio

A. Introducción

Staphylococcus aureus es una especie bacteriana integrada por formas cocáceas de 0,8-1,0 mm de diámetro, que se dividen en más de un plano, por lo que se agrupan irregularmente en racimos. Son inmóviles y no forman esporas. Son grampositivas. Es una especie muy sensible a la acción del calor y de los desinfectantes.

Más del 50 % de las personas son portadoras de S.aureus en fosas nasales, garganta, forúnculos, manos o pelo. Por eso su presencia en determinados niveles en los alimentos es un signo evidente de falta de higiene en la manipulación.

Además algunas cepas de S.aureus son patógenas para el hombre porque producen enterotoxinas que dan lugar a la intoxicación estafilocócica. La dosis infectiva es alta ya que es necesario un número de al menos 106 ufc/g para producir cantidad suficiente de enterotoxina para producir la enfermedad en el consumidor.

En resumen, la presencia de un número elevado de Staphylococcus aureus en un alimento refleja higiene defectuosa por mala manipulación. Si, además, los S. aureus aislados son cepas enterotoxigénicas, suponen un riesgo para la salud.

Puede ocurrir que no se detecte S. aureus en un alimento, que el número detectado sea pequeño y que, sin embargo, exista cantidad detectable suficiente de enterotoxina estafilocócica. En este caso, los microorganismos que originaron la toxina han ido

descendiendo en número e, incluso, desapareciendo, mientras que la toxina, por su mayor resistencia, permanece en el alimento.

El método de recuento en placa se utiliza cuando se sospecha que el alimento por analizar contiene más de 100 S. aureus por gramo.

B. Material

o Pipetas de 1 estérileso Estufa de cultivo

o Asa de vidrio estéril

o Asa de cultivo

o Placas de Petri de 90 mm de diámetro

C. Medios de cultivo y reactivos

- Medio sólido selectivo Baird Parker (B P)Ver composición y preparación

- Caldo cerebro corazón (Brain Heart Infusión: BHI)Ver composición y preparación

- Plasma de conejo con ácido Etilen diamino tetraacético (EDTA)

Plasma de conejo, desecado y titulado, que evita reacciones falsas en la prueba de la coagulasa. Este producto se adquiere en casas comerciales.

D. Preparación de la muestra (Ver videoclip de preparación de muestra -requiere QuickTime-)(Esta película es más larga, en esta demo solo podrá ver 20 segundos)

Asépticamente se pesan 10 g de muestra en una bolsa Stomacher

Se diluyen en 90 mL de agua peptonada

Homogenizar la mezcla en el Stomacher durante 1 a 4 minutos (el tiempo varía segun el tipo de alimento) (defectivamente realizarlo por trituración en un vaso esterilizado de una trituradora de cuchillas -tipo batidora- a  una velocidad aproximada de 14.000 rpm y en un tiempo medio de 60-90 segundos).

E. Preparación de las diluciones decimales (Ver vídeoclip de preparación de las diluciones decimales -requiere QuickTime-)(Esta película es más larga, en esta demo solo podrá ver 20 segundos)

Según el número de microorganismos esperado y sobre la base de la dilución inicial de 10 g en 90 mL (dilución 10-1), preparar diluciones decimales de 10-

2, 10-3, etc., usando pipetas o puntas estériles para cada dilución, tomando 1 mL de la solución anterior en 9 mL de agua peptonada, y evitando que se forme espuma

Mezclar mecánicamente cada dilución en un agitador mecánico tipo vortex ( o manualmente agitándo el tubo 25 veces en 7 segundos con movimientos ascendentes y descendentes formando un ángulo de abertura aproximado de 60º entre brazo y antebrazo).

F. Siembra por extensión en superficie  (Ver vídeoclip de la siembra -requiere QuickTime-)(Esta película es más larga, en esta demo solo podrá ver 20 segundos)

A partir de la "serie de diluciones decimales" , y por duplicado, se siembra 0,1 mL de cada dilución sobre la superficie bien seca de agar Baird-Parker contenido en placas de Petri

Diseminar con asa de vidrio estéril (asa de Driglasky).

G. Incubación de las placas (Ver vídeoclip de incubación -requiere QuickTime-)(Esta película es más larga, en esta demo solo podrá ver 20 segundos)

Invertir las placas de Petri e incubarlas en estufa a 37 ºC durante 48 horas, con lectura a las 24 horas.

H. Lectura de las placas y recuentos de colonias (Ver vídeoclip del recuento -requiere QuickTime-)(Esta película es más larga, en esta demo solo podrá ver 20 segundos)

Seleccionar para el recuento las placas inoculadas con la dilución que contengan entre 20 y 200 colonias típicas.

El aspecto de las colonias típicas de Staphylococcus aureus sobre agar Baird-Parker es el siguiente: redondas, de bordes lisos, convexas, de 2-3 mm de diámetro, húmedas, brillantes, negras, con un borde blanco fino, rodeadas de una zona opaca y de un halo claro de 2-5 mm.

El cloruro de litio y el telurito potásico que forman parte del medio inhiben el desarrollo de la flora competitiva; el piruvato sódico y la glicocola favorecen el crecimiento de los estafilococos.

El medio de cultivo es opaco, debido a que se le incorpora emulsión de yema de huevo. S. aureus sintetiza una lipasa que, al actuar sobre la lipoproteina de la yema de huevo, produce un aclaramiento alrededor de las colonias. Alrededor de las colonias se forma también una zona opaca como consecuencia de la formación de un precipitado de sales de calcio y magnesio, insoluble en ácidos grasos. Esta zona opaca se hace más visible a partir de las 24 horas de incubación.

El aclaramiento del medio que rodea a las colonias junto con el color negro brillante de las mismas, son las caracteristicas típicas mas visibles de las colonias típicas.

Las colonias que no presentan ese color negro brillante o que no tienen alrededor un halo claro de lipolisis son consideradas atípicas y desechadas.

Colonias típicas

Colonias atípicas

Recuento de colonias sospechosas.

Seleccionar para el recuento aquellas placas que contengan entre 20 y 200 colonias típicas. Una vez contadas estas colonias en las placas elegidas se deben hacer pruebas confirmativas, en particular la prueba de la coagulasa. Si las colonias contadas son coagulasa positivas entonces expresaremos el recuento como ufc/g de S.aureus coagulasa positivo.

Para ello la cifra obtenida en las placas se multiplica por el factor de dilución de la placa, lo que da como resultado el recuento total de S. aureus coagulasa positivo en 0,1 gramo del producto analizado. Esta cifra, multiplicada por 10, expresa el recuento total de S. aureus por gramo o mililitro de muestra.

I. Cálculos y expresión de los resultados

Cálculos:

En las placas que se ha efectuado el recuento, multiplicar por el inverso de la dilución y expresar el resultado como Unidades Formadoras de Colonias por g de alimento (UFC/g).

N = C x D x 10

donde: N= Unidades formadoras de colonia por gramo de muestra (UFC/g o UFC/mL).   C= Media del número de colonias en las dos placas.   D= Factor o inverso de la dilución.

Expresión de los resultados:

Media del número de colonias típicas en las dos placas x inverso de la dilución x 10 = UFC/g o UFC/mL

J. Confirmación con la prueba de la coagulasa (Ver vídeoclip de la prueba de la Coagulasa -requiere QuickTime-)(Esta película es más larga, en esta demo solo podrá ver 20 segundos)

Se seleccionan, como minino, dos colonias típicas para su confirmación. Con este fin, se investiga la capacidad de la cepa en estudio para producir Coagulasa.

Siembra en BHI para realizar la prueba de la coagulasa

Las colonias típicas seleccionadas se siembran en caldo infusión cerebro-corazón (B.H.I. Brain Heart Infusion) contenido en tubos.

Incubar a 37 ºC durante 18-24 horas

Añadir 0,1 mL del cultivo sobre Plasma de Conejo

En un tubo de 10 x 75 mm se vierten 0,3 mL de plasma de conejo EDTA reconstituido. Se añade 0,1 mL del cultivo obtenido en caldo BHI.

Incubar a 37ºC durante 6 horas

Incubar a 37 ºC y examinar a las 6 horas de incubación.

Coagulasa positiva

La reacción es positiva cuando el coágulo formado es firme.

Coagulasa negativa

La reacción es negativa cuando no se cuagula el plasma.

K. Adiestramiento en la distinción y recuento de colonias de Staphylococcus aureus

Analice cada placa, y conteste a la pregunta, en la columna de la derecha, haciendo clic sobre la letra (en azul), que precede a la contestación u opción que crea correcta

Estas colonias en el medio de Baird Parker presentan :

a   ) características típicas de S. aureus

b   ) características atípicas de S. aureus

Estas colonias en el medio de Baird Parker presentan :

a   ) características típicas de S. aureus

b   ) características atípicas de S. aureus

Estas colonias en el medio de Baird Parker presentan :

a   ) características típicas de S. aureus

b   ) características atípicas de S. aureus

Estas colonias en el medio de Baird Parker presentan :

a   ) características típicas de S. aureus

b   ) características atípicas de S. aureus

Estas colonias en el medio de Baird Parker presentan :

a   ) características típicas de S. aureus

b   ) características atípicas de S. aureus

En esta placa de Baird Parker :

a   ) aparecen colonias típicas de S. aureus

b   ) no aparecen colonias típicas de S. aureus

En esta placa de Baird Parker :

a   ) aparecen colonias típicas de S. aureus

b   ) no aparecen colonias típicas de S. aureus

En esta placa de Baird Parker :

a   ) aparecen colonias típicas de S. aureus

b   ) no aparecen colonias típicas de S. aureus

En esta placa de Baird Parker :

a   ) aparecen colonias típicas de S. aureus

b   ) no aparecen colonias típicas de S. aureus

L. Interpretación de los resultados del supuesto práctico

Los resultados obtenidos en los duplicados de este supuesto práctico han sido los siguientes

Placas de Baird Parker(Haga clic sobre la placa para verla a más aumento)

  Duplicado A Duplicado B

10-

1

10-

2

10-

3

Prueba de la coagulasa

Colonia #1

Colonia #2

LL.- Contestación a las preguntas

Una vez interpretado los resultados conteste a las siguientes preguntas haciendo clic en los radiobotones de la opción correcta

1.- Han dado valores superiores a 200 colonias por placa las diluciones:

 a) 10-1

 b) 10-1 y 10-2 

 c) 10-1 , 10-2 y 10-3

2.-Para realizar el recuento he escogido las placas de la dilución:

 a) 10-1

 b) 10-2 

 c) 10-3

3.- El factor de dilución (D) de las placas que he escogido para realizar el recuento es de:

 a) 10

 b) 100

 c) 1000

4.-El número de colonias que han crecido en la placa A de la dilución 10-3 ha sido aproximadamente de :

 a) 25

 b) 35

 c) 45

5.- La confirmación con la prueba de la coagulasa ha dado el resultado siguiente :

 a) las 2 colonias confirmadas como coagulasa positiva

 b) las 2 colonias como coagulasa negativas y por lo tanto no confirmadas como S. aureus

 c) una colonia coagulasa positiva y la otra colonia coagulasa negativa

6.- El número de unidades formadoras de colonia por gramo de muestra ha sido de:

 a) 3.300

 b) 33.000

 c) 330.000