instituto politÉcnico nacional escuela superior de...
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA SUPERIOR DE MEDICINA
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
“PARTICIPACIÓN DE LA ANGIOTENSINA II Y LAS ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO EN EL DESARROLLO DE LA
HIPERTROFIA RENAL EN LA DIABETES MELLITUS TEMPRANA INDUCIDA EN RATAS”
TESIS QUE PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRÍA EN CIENCIAS EN FARMACOLOGÍA
PRESENTA:
L.O. IVAN ALEJANDRO ESQUIVEL
DIRECTORES DE TESIS
DR. PEDRO LÓPEZ SÁNCHEZ
DR. MAXIMILIANO IBARRA BARAJAS
MAYO 2010
Índice General Páginas
1. INTRODUCCIÓN………………………..….……………………..1
1.1 Diabetes mellitus…………………….……………………………………1
1.1.2 Definición. ……………………………………………………………..1
1.1.3 Clasificación……………………………………………………….……1
1.1.4 Epidemiología de la diabetes mellitus tipo 2 en nuestro país.…...…..3
1.1.5 Complicaciones de la diabetes mellitus …………………..………….4
1.1.6 Nefropatía diabética ……………………….…………………….……6
1.1.7 Hipertrofia renal ……………………………………………….…….11
1.1.8 Modelos experimentales para generar Diabetes Mellitus…………..12
1.2 Sistema renina angiotensina ………………………..……………….…13
1.2.1 Componentes del sistema renina angiotensina……………………...14
1.2.2 Farmacología del sistema renina angiotensina…..………….………22
Páginas
1.3. Concepto de radical libre…………………………..…………………..22
1.3.1 Estrés oxidativo…………………………………………………….…23
1.3.2 Antioxidantes………………………………………………………….23
1.3.3 Vitamina C…………………………………………………………….24
1.3.4 Vitamina E……………………………………………………………26
2. JUSTIFICACIÓN………………………..………….…………….28
3. HIPÓTESIS…………………………………………………….……29
4. OBJETIVOS….………………………………………………….….30
4.1 OBJETIVO GENERAL………………………………………………..30
4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS…………………………………………30
5. MATERIAL Y MÉTODOS..…………….…….……………..31
5.1 Materiales…………………….……………….…….…………………..31
Páginas
5.1.1 Material biológico y grupos experimentales…………………..……31
5.1.2 Material Farmacológico…………………………….……….……….32
5.2 Métodos……………………………………………….……..………….32
5.2.1 Inducción del modelo de diabetes…………….……………………..33
5.2.2 Recolección de muestras……………………………..……………….34
5.2.3 Estudio histológico con técnica de hematoxilina y eosina…….…...34
5.2.4 Cuantificación relativa del receptor AT1 en la corteza renal por
inmunoblot……………………………………….……………...……..……35
5.2.5 Medición de Ang II plasmática……….………………………………36
5.2.6 Análisis Estadístico…...…………………………………...…………36
6. RESULTADOS……………………………………………………..37
6.1 Modelo experimental de Diabetes mellitus…………………………..38
6.1.1 Determinación sanguínea de glucosa….…………………………….38
Páginas
6.1.2 Peso Corporal…………………………………………………..…….39
6.1.3 Ingesta de Agua………………………………………………..……..40
6.1.4 Ingesta de Alimento…………………………………………………..41
6.1.5 Volumen de orina……………………………………………..………42
6.1.6 Peso renal…………………………………….……………….……….43
6.1.7 Coeficiente de masa renal…………………………….…….………..44
6.2 Histología……………………………………………………….……….45
6.3 Comparación de tratamientos…………………………………………46
6.4 Peso renal en los diferentes tratamientos…………….………………48
6.5 Coeficiente de masa renal……………………………………..……….49
6.6 Medición de angiotensina plasmática………………………………...50
6.7 Expresión del receptor AT1…………………………………….……..51
Páginas
7. DISCUSIÓN………………………..……………………………..…52
8. CONCLUSIONES…………………………………….……….….55
9. BIBLIOGRAFÍA………………………..….………….…………..56
Indice de figuras Páginas
Figura1. Instituciones……………………………………………………….………….2
Figura 2. México…………………….……………………………………………..........4
Figura 3. Evolución de la nefopatia diabética……………………………..………8
Figura 4. Causas de nefropatía diabética…………………………………………11
Figura 5. Señalización intracelular del receptor AT1……………………………15
Figura 6. Receptor AT1 vista tridimensional…………………………………...…17
Figura 7. Componentes del sistema renina angiotensina…………...…………18
Figura 8. Síntesis de Angiotensina II…………………………………………….....19
Figura 9. Relación de radicales libres con la hipertrofia renal……………...…21
Figura 10. Estructura de vitamina C………………..………...………………….....26
Figura 11. Estructura de la vitamina E………...…………….………………..……27
Figura 12. Protocolo de los grupos…………………………………………………31
Figura 13. Esquema temporal del experimento…………….………………..……32
Figura 14. Concentración de glucosa sanguínea tomada a los siete días de Diabetes mellitus…………………………………………………………………………38
Figura 15. Comparación del peso corporal entre los grupos de CTRL y DM…………………………………………………………………………………………39
Páginas
Figura 16. Ingesta de agua de 24 horas del grupo CTRL y el grupo de DM………………………………………………………………………………….….….40
Figura 17. Comparación de la ingesta de alimento durante 24 horas del grupo CTRL y el grupo deDM…………………………...…………..…………………….….41
Figura 18. Volumen de orina de 24 horas de las ratas CTRL y el grupo de DM……………………………………………………..………………………...…….….42
Figura 19. Peso renal de las ratas CTRL y diabéticas…………………….….….43
Figura 20. Coeficiente masa renal de ratas CTRL y diabéticas…...…….……..44
Figura 21. Cortes histológicos de corteza de riñón de una rata CTRL y una rata diabética………………………………………………...……………………….…45
Figura 22. Histología de los grupos tratados con vitamina C y E……………..46
Figura 23. Histología de los grupos con diferentes tratamientos……….…….47 Figura 24. Peso renal de las ratas CTRL y DM con los diferentes tratamientos………………………………………………………………………….….48
Figura 25. Coeficiente de masa renal de los grupos con los diferentes tratamientos………………………………………………………………………..……49
Figura 26. Medición de Ang II plasmática………………………………………….50
Figura 27. Determinación de la expresión del receptor AT1 mediante tecnica de inmunoblot ……………....………………………………………………………….51
Indice de tablas Páginas
Tabla 1. Características de receptores a Ang II……………………………….….17 Tabla 2. Respuestas fisiológicas y patológicas de receptores a Ang II …….20
Abreviaturas
ADA……………………………….……..ASOCIACION AMERICANA DE DIABETES ADN………………………………………..……….ACIDO DEXOSIRRIBUNUCLEICO ATP…………………………………………………..……….ADENOSIN TRIFOSFATO Ang I…………………………………….……………………………..ANGIOTENSINA I Ang II………………………………………………………………….ANGIOTENSINA II AO………………………………………………………………………ANTIOXIDANTES
ARAS………………………. ANTAGONISTA DEL RECEPTOR ANGIOTENSINA II CTRL…………………………………………………………………...……….CONTROL DM……………………………………………………………...…DIABETES MELLITUS ECA……………………...…………ENZIMA CONVERTIDORA DE ANGIOTENSINA EO………………………………………………………..…………ESTRÉS OXIDATIVO ER……………………………………………………………….ESPECIES REACTIVAS ERN……………………………..…………ESPECIES REACTIVAS DE NITROGENO EROS…………………………………..……..ESPECIES REACTIVAS DE OXIGENO HR………………………………….……………………………..HIPERTROFIA RENAL IECAS…..INHIBIDORES DE LA ENZIMA CONVERTIDORA DE ANGIOTENSINA IP……………………………………………………………………INTRAPERITONEAL IV…………………………………………………………………………INTRAVENOSA NAD…….NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTIDO EN SU FORMA OXIDADA NADH..NICOTINAMIDA ADENINA DINUCLEOTIDO EN SU FORMA REDUCIDA NADPH ………………………………………………………………….NICOTINAMIDA
ADENINA DINUCLEOTIDO FOSFATO EN SU FORMA REDUCIDA
mARN………………………………….…….ACIDO RIBONUCLEICO MENSAJERO MBG…………………………………….……..MEMBRANA BASAL GLOMERULAR ND……………………………………………..…………….NEFROPATIA DIABETICA NOM………………………………………..……………NORMA OFICIAL MEXICANA OMS……………………………….…….ORGANIZACION MUNDIAL DE LA SALUD PVDF……………………………………………………FLOURURO DE POLIVDIENO SDS……………………………………………………DODECIL SULFATO DE SODIO STZ……………………………………………………………….ESTREPTOZOTOCINA VC…………………………………………………………………………….VITAMINA C VE……………………………………………………….……………………VITAMINA E
Resumen La diabetes mellitus se define como un síndrome endocrino de la alteración de la insulina
que da como respuesta un mal metabolismo de la glucosa, teniendo como respuesta altos
niveles de concentración en sangre. La diabetes mellitus tipo II tiene una incidencia
elevada nivel mundial. Una de sus principales complicaciones es la nefropatía diabética.
Esta inicia con una respuesta hipertrófica que a la larga conlleva a fibrosis del tejido renal.
Si bien, son varios los factores que interfieren en esta hipertrofia, es de especial interés
para nosotros estudiar el papel de los radicales libres de oxigeno y el sistema renina-
angiotensina en su génesis. El objetivo de este trabajo fue determinar si el tratamiento
con vitaminas C o E o el captopril reducen la hipertrofia renal en un modelo de diabetes
mellitus inducido por estreptozotocina. Para cumplir el objetivo utilizamos ratas Wistar
macho de 250 +/- 30 g. inducidas con diabetes con la administración de estreptozotocina
de 65 mg/Kg de peso por vía intraperitoneal en una dosis única. Posteriormente
administramos los antioxidantes vitamina E (500 mg/kg/día) y vitamina C (700 mg/kg/día)
y el captopril 5 mg/kg/día) via oral solas durante una semana. Observamos cambios de
hipertrofia renal mediante el peso de riñón húmedo y el coeficiente de hipertrofia (peso
renal /peso corporal). Los resultados obtenidos demostraron que al administrar los
tratamientos con los antioxidantes vitamina C y vitamina E y Captopril administrados por
vía oral previnieron la hipertrofia renal en la primera semana de diabetes mellitus
experimental. La administración de los diferentes tratamientos administrar disminuyó la
expresión del receptor en AT1 en la corteza de riñón durante la diabetes mellitus
temprana. Los niveles de angiotensina II plasmática en la diabetes mellitus disminuyó con
la vitamina E mientras que en las ratas control con Captopril aumento significativamente
la concentración de manera significativa.
Summary
Diabetes mellitus is defined as an endocrine syndrome of impaired insulin
response gives a poor glucose metabolism, with the high levels of
concentration response in blood. Diabetes mellitus type II has a high incidence
worldwide. One of its major complications is diabetic nephropathy. This begins
with a hypertrophic response that ultimately leads to renal tissue fibrosis. While
there are several factors that interfere in this hypertrophy, is of particular
interest for us to study the role of oxygen free radicals and the renin-
angiotensin system in its genesis. The aim of this study was to determine
whether treatment with vitamins C or E or captopril reduced renal hypertrophy
in a model of streptozotocin-induced diabetes mellitus. To achieve the aim we
used male Wistar rats 250 + / - 30 g. diabetes induced by streptozotocin
administration of 65 mg / kg weight intraperitoneally a single dose. Then
administer the antioxidants vitamin E (500 mg / kg / day) and vitamin C (700 mg
/ kg / day) and captopril 5 mg / kg / day) orally for one week alone. Changes of
renal hypertrophy observed by wet kidney weight and the coefficient of
hypertrophy (kidney weight / body weight). The results showed that by
administering the treatments with the antioxidants vitamin C and vitamin E and
orally administered Captopril prevented renal hypertrophy in the first week of
experimental diabetes mellitus. The administration of different treatments given
decreased AT1 receptor expression in the kidney cortex during early diabetes
mellitus. The plasma levels of angiotensin II in diabetes mellitus with vitamin E
decreased while the control rats with captopril significantly increased the
concentration significantly.
Agradecimientos
Mi gratitud sincera al Dr. Maximiliano Ibarra Barajas por brindarme su amistad y
darme parte de su tiempo colaborando de una manera importante en este
trabajo de investigación. Al Dr. Pedro López Sánchez por hacer que vea las
cosas de otra manera compartiéndome su conocimiento y honestidad cuando
lo necesite. A la Dra. Liliana Anguiano Robledo por su paciencia y los consejos.
A la Dra. Rosa Amalia Bobadilla Lugo por la forma amable y su sonrisa
expresada hacia mi todo el tiempo. También quiero darle infinitamente las
gracias al Dr. Ignacio Valencia Hernández por todas facilidades y apoyo que
me brindo durante la maestría. Quiero extender estos agradecimientos a la gente del laboratorio de
farmacología cardiovascular de la FES Iztacala Juan Javier López, Elizabeth
Guzmán Hernández, Paty y mi sinodal Itzell Gallardo Ortiz por el exhausto
apoyo y afecto que dieron en mis experimentos muchas gracias!¡!
Gracias a M en C MVZ Ma. Eugenia Aguilar Nájera, por su apoyo y confianza en
mi durante el tiempo de convivencia con ella durante la maestría. Claro que no
podían faltar la Dra. Ma. Elena Hernández Campos, el Dr. Ángel Miliar García y la
Dra. Adriana Jarillo Luna por su apoyo, aliento y estimulo para seguir adelante.
A mis amigos del rock Miguel Ángel Núñez, Arturo Hernández, Pablito Rock,
Josué Coronel y Pablo Rivera que a pesar de ya no verlos siempre alentaban a
seguir adelante y no rendirme.
Un sincero y gigante agradecimiento a la comunidad del CICS Unidad Santo
Tomas IPN que si mencionara a todos los que me ayudaron no me
alcanzarían los renglones para anotarlos, gracias por confiar en mí y por todo
el apoyo, facilidades e inspiración que me dieron para tener este logro.
Gracias al amado universo, gracias a mis maestros y gracias a mi real ser por
permitirme pertenecer a esta gran creación de manera perfecta y en armonía,
con todo el mundo.
Se expande este agradecimiento al apoyo de los donativos PAPIIT IN223009,
DGAPA UNAM y PAPCA 2009, FES-IZTACALA UNAM y CONACYT 102022.
Gracias, Gracias Dios Mío por darme esta oportunidad…
Dedicatoria
Este trabajo de investigación quiero dedicarlo desde lo más interno de mi ser al
creador universal por darme el amor, la luz y energía para poder ser un
eslabón más en esta gran creación.
Ofrezco esta tesis a mis padres Felipe y Patricia, y a mi hermano Rafael con
todo mi corazón por el apoyo, disciplina y amor que me dieron durante la
realización de la maestría.
También a Lizeth por toda su compañía y amor que me entrego durante todo
momento.
A mi RLS por abrirme los ojos y enseñarme el buen camino de la vida.
Ya que sin todos ellos no hubiera sido igual…
“A un anciano sabio se acercó un joven y le pidió que le enseñase el camino para
hacerse sabio. El noble sabio lo llevó hasta el arroyo y allí le hizo meter la
cabeza en el agua, donde se la detuvo pese a los desesperados esfuerzos que
hacia el presunto discípulo por escapar de la inesperada trampa. Por fin el
sabio le soltó y una vez dejado reposar le preguntó:- ¿Qué deseabas cuando
tenías la cabeza bajo el agua?- ¡Aire, Maestro!- ¿No querías mejor riquezas, no
buscabas placeres, las caricias de la mujer que amas, no las extrañabas?- ¡No
maestro yo quería aire!- ¿No buscabas a tus padres, no cuidabas de tus amigos,
no te importaban tus compromisos?- ¡No maestro, yo solo deseaba aire!- Pues
bien, así con esa misma fuerza que habéis deseado el aire, desead la sabiduría,
y seréis sabio- dijo el anciano y se marchó”
Gral. Adolfo Terrones Benítez
1
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Diabetes mellitus (DM)
1.1.2 Definición
Actualmente la enfermedad conocida como diabetes mellitus se define como un
grupo heterogéneo de desórdenes endócrinos que se presentan son resultado de
la alteración en la secreción de insulina, un defecto en la acción de la misma o
ambos, estos eventos conducen a un mal metabolismo de la glucosa teniendo
como respuesta una alta concentración del carbohidrato en sangre. 13
1.1.3 Clasificación
Una herramienta útil para la investigación, el diagnóstico y la terapéutica de una
enfermedad es una clasificación adecuada de la misma ya que permite determinar
la etiología y evolución de la patología en especial si existen diversos tipos como
es el caso de la DM. Se han tenido diversas clasificaciones a lo largo del tiempo,
pero en la actualidad existen dos clasificaciones principales. Una de ellas
generada por la OMS (Organización Mundial de la Salud), es la que clasifica en
tres tipos que son: tipo 1, tipo 2 y gestacional. La segunda clasificación fue
propuesta por la Asociación Americana de Diabetes (ADA) en 1997, en la que su
comité la divide en 4 grupos diferentes (figura 1): a) DM tipo 1
b) DM tipo 2
c) Diabetes gestacional
d) Otros tipos de DM
2
Figura 1. Instituciones
En nuestro país existe la Norma Oficial Mexicana (NOM-015-SSA2-1994) rige la
prevención, tratamiento y control de la diabetes. La clasificación de esta
enfermedad es muy extensa, hasta puede resultar confusa, debido a que los
diferentes organismos la dividen en diferentes categorías; además, cada tipo tiene
causas y orígenes distintos, aunque, sus efectos patológicos son muy similares
una vez que comienza. Sin embargo, la mayor parte de los casos puede ubicarse
en las categorías más conocidas que son la tipo 1 también llamada
insulinodependiente y la tipo 2 o diabetes mellitus no insulinodependiente. 13 ,30, 39
a) DM tipo 1
Es conocida como insulinodependiente o diabetes juvenil ya que se presenta
principalmente en pacientes jóvenes, aunque puede manifestarse en cualquier
etapa de la vida. El paciente requiere de la administración de insulina por la nula
producción que tiene de la hormona, debido a la destrucción autoinmune de las
células beta de los Islotes de Lanhergans del páncreas.
3
b) DM tipo 2
Este tipo es el más común y afecta del 90 al 95% del total de pacientes que
presentan esta enfermedad. Se manifiesta por un complejo mecanismo
fisiopatológico, en el que la principal característica es la insuficiente producción de
insulina y una deficiente utilización periférica de glucosa por los tejidos (resistencia
a la insulina), esto quiere decir que los receptores de las células que se encargan
de facilitar la entrada de la insulina a la propia célula están alterados. Aparece a
menudo en etapas adultas de la vida, y de manera frecuente se asocia con la
obesidad. 13, 30
1.1.4 Epidemiologia de la DM tipo 2 en nuestro país Las actuales condiciones de vida en México han hecho de esta enfermedad sea
un importante problema de salud pública ya que ocupa el primer lugar de
mortalidad en los casos totales de muerte por enfermedad y la prevalencia que se
tiene es que uno de cada diez mexicanos la padece. La DM es una enfermedad
que aparece en un rango de edad de entre 35 y 45 años de edad. Tiene mayor
incidencia en estados del norte del país, seguido del centro y el sur. De manera
interesante se han observado más casos en la población urbana que en la
población rural debido a la dieta y a estilos de vida de cada tipo de comunidad.34
(figura 2)
4
Figura 2. México
1.1.5 Complicaciones de la diabetes mellitus Uno de los principales peligros de la DM es su avance silencioso, de manera que
el paciente frecuentemente no se percata de que padece la enfermedad. Sin
embargo, cuando la enfermedad es diagnosticada se requiere una cuidadosa
atención médica para retardar la aparición de complicaciones. La ausencia de un
buen control de la diabetes genera descompensaciones que pueden deberse a la
hiperglucemia, generando complicaciones agudas o crónicas. Los principales
órganos que afecta la diabetes mellitus son: vasos sanguíneos, corazón, ojos,
riñón y nervios. Las complicaciones crónicas son:
5
a) Aterosclerosis: Es la enfermedad que afecta los grandes vasos (coronarios,
cerebrovasculares y periféricos), produciendo en ellos cambios como, el
engrosamiento de la íntima y de la túnica media y como consecuencia
engrosamiento de la pared y estrechamiento de la luz arterial y cambios
bioquímicos.
b) Complicaciones oculares: El ojo del paciente diabético puede resultar
afectado por diversos procesos patológicos, donde el más importante es la
retinopatía diabética, la cual consiste en la aparición de microaneurismas,
pequeñas hemorragias intrarretinianas, edema macular y exudados.
c) Complicaciones cutáneas: La diabetes favorece las infecciones, origina
lesiones vasculares microangiopáticas y permite la expresión cutánea de
otras metabolopatías asociadas a la DM.
d) Nefropatía diabética (ND): Esta es la tercera causa de insuficiencia renal
terminal. Esta definida por la presencia persistente de proteinuria, también
denominada microalbuminuria, con valores superiores a 500mg/24h de
proteínas totales o 300mg/24h de albúmina. En la DM tipo II hay una
incidencia del 30 %, siendo mayor la incidencia en los pacientes masculinos
que en los femeninos.15
6
1.1.6 Nefropatía Diabética La ND es un síndrome caracterizado por alteraciones morfológicas y funcionales a
nivel renal se caracteriza por presentar hiperfiltración glomerular, hipertrofia renal
con incremento en la excreción de albúmina (microalbuminuria), incremento del
grosor de la membrana basal glomerular (MBG) y expansión mesangial con
acumulación de la matriz extracelular de proteínas como colágeno, fibronectina y
laminina (figura 3). Las alteraciones glomerulares que cursan en la ND son de dos
tipos:
a) Glomeruloesclerosis difusa, que consiste en un engrosamiento difuso y
homogéneo de la membrana basal de los capilares glomerulares. Esta alteración
siempre se encuentra presente y puede ser la única lesión detectable en las fases
tempranas o preclínicas de la glomerulopatía diabética.
b) Glomeruloesclerosis nodular, esta lesión glomerular consiste en nódulos de
eosinófilos sin proliferación celular y rodeados en su periferia por capilares
glomerulares de aspecto normal. representa una lesión más específica, es menos
frecuente que la forma difusa.
Otro grupo de lesiones glomerulares asociadas a la ND lo constituyen las lesiones
hialinas, que consiste en el depósito local de sustancia eosinófila en la pared de
algunos capilares glomerulares o en el seno de la cápsula de Bowman. Entre las
lesiones vasculares destacan la arteriosclerosis hialina que no se distingue de la
de los pacientes no diabéticos, excepto por su intensidad y porque no siempre se
relaciona con la coexistencia de hipertensión arterial o de edad , siendo muy
común que se afecten arteriolas glomerulares eferentes. Cuando la enfermedad
renal se detecta en sus comienzos (durante la microalbuminuria), existen varios
tratamientos que pueden ayudar a evitar que la enfermedad renal progrese. A
7
medida que la enfermedad renal progresa se destruye un mayor número de
glomérulos aumentando la proteinuria generando macroalbuminuria.
La hipertensión normalmente acompaña a la ND, con disfunción endotelial,
anormalidades del metabolismo de lípidos, resistencia a la insulina y glicosilación
de proteínas. Además de ser la manifestación más temprana de la ND, la
albuminuria es un marcador de una morbilidad y mortalidad cardíaca aumentada
en los pacientes con DM tipos 1 y 2.
Las manifestaciones clínicas de la DM tipo 1, así como de la tipo 2, pueden ser
muy parecidas, sin embargo, en la tipo 1 el fenómeno de hipertensión puede
aparecer como hallazgo de una ND incipiente, conforme ascienden los niveles de
microalbuminuria. En la evolución de la nefropatía se elevan progresivamente la
excreción de albúmina 1, 22.Mientras que en la DM tipo 2, el daño renal se observa
menos uniforme, aunque pueden aparecer otras etiologías de la enfermedad renal
crónica (nefropatía vascular hipertensiva, ateroembolia). Alrededor del 15% de los
pacientes llegan a la insuficiencia renal terminal sin haber presentado
albuminuria.22
8
Figura 3. Evolución de la nefropatía diabética
9
De esta forma, el hallazgo de microalbuminuria es un indicador para evaluar una
posible enfermedad cardiovascular y en donde podemos incidir para reducir los
factores de riesgo cardiovasculares (por ejemplo, reducción de LDLs, tratamiento
antihipertensivo, cese del hábito de fumar, institución de ejercicio, etc.).
Adicionalmente, existe evidencia que sugiere que la reducción del colesterol
puede reducir la proteinuria. Otros estudios han demostrado que con el buen
control de la glicemia por periodos prolongadosdisminuyen en las complicaciones
microvasculares crónicas incluyendo la enfermedad renal.
En las primeras etapas de la ND se observan riñones hipertróficos, aumento del
filtrado glomerular y microalbuminuria, la que al principio es intermitente y aparece
en relación al mal control metabólico y/o el ejercicio físico intenso y luego se
presenta en forma permanente. Estas modificaciones tempranas pueden ser
producidas por una vasodilatación renal, especialmente de la arteriola aferente, lo
que conducirá al aumento del flujo y de la presión intraglomerular, aun cuando
deben influir también los cambios estructurales y de superficie que pudieran
producirse por la hipertrofia renal concomitante. Es importante resaltar las
alteraciones del sistema renina angiotensina, de las prostaglandinas, y de la
sustancia natriurética auricular que presenta la mayoría de los pacientes
diabéticos. Se puede presentar un desequilibrio entre los sistemas dilatador y
vasoconstrictor, de tal forma que se observa un predominio de los primeros que
junto con los factores antes mencionados provocan un estado hiperfiltrante y un
aumento de la presión intraglomerular. La presión intraglomerular parece ser el
factor decisivo en el desarrollo de expansión mesangial y el daño posterior de
algunos glomérulos. El daño irreversible de los mismos lleva a modificaciones
hemodinámicas del resto, estableciéndose un mecanismo de auto perpetuación de
la lesión, independiente de las modificaciones metabólicas. 27
10
La clasificación para la enfermedad renal asociada a la DM más utilizada es la
descrita por Mogensen, que la divide en cinco etapas:
Etapa I: En la que se demuestra aumento de la excreción de albúmina basal
postejercicio y con un tratamiento optimizado de la diabetes se puede revertir.
Etapa II: Aparecen lesiones histopatológicas mínimas, persiste el aumento del
filtrado glomerular y la microalbuminuria aparece en forma intermitente. En esta
etapa no se conoce si se pueden revertir estas alteraciones.
Etapa III: (Nefropatía incipiente), se acentúan las lesiones y alteraciones
funcionales y se puede observar aumento incipiente de la presión arterial. Hay
microalbuminuria persistente.
Etapa IV: Corresponde a la nefropatía clínica con el síndrome clínico completo:
macroproteinuria, a veces síndrome nefrótico, hipertensión arterial, retinopatía
diabética y grados variables de insuficiencia renal.
Etapa V: Corresponde a la ND en etapa de insuficiencia renal avanzada con el
cuadro clínico del síndrome urémico.28
11
1.1.7 Hipertrofia renal (HR)
La hipertrofia es el paso inicial de la evolución de la ND. Hay evidencias de que
demuestran que al iniciar la enfermedad de DM la HR se hace presente por el
incremento de la tasa de filtración glomerular. Esta hipertrofia puede estar dada
por diversos factores dentro los cuales los resumimos en el siguiente cuadro
(figura 4):9, 11, 14 49.
Figura 4. Causas de ND
12
1.1.8 Modelos experimentales para generar DM:
Los modelos experimentales que actualmente están siendo utilizados en las
investigaciones de DM en todo el mundo se basan en el uso de fármacos y
animales transgénicos, existiendo para estos últimos una gran variedad de cepas.
La inducción de DM experimental en animales de laboratorio usando fármacos que
se basan en la destrucción de las células β pancreática s. Este método es muy
conveniente y bastante simple. Entre los compuestos más utilizados en la
actualidad son haloxano y estreptozotocina (STZ). El haloxano es un agente
antineoplásico que ocasiona diabetes tipo 1 por destrucción selectiva de células β
del páncreas..
La STZ es una nitrosourea sintetizada por el microorganismo Streptomyces
achremogenes. Se le han atribuido propiedades antineoplásicas y antibióticas, y
es comúnmente utilizado en la inducción de diabetes mellitus debido a su efecto
tóxico específico de las células β pancreáticas. La STZ entra a la célula β a través
del transportador de glucosa GLUT2 y causa alquilación del ADN. El daño al ADN
induce la activación de poli ADP-ribosilación, un proceso que es más importante
en la actividad diabetogénica de la STZ que el daño mismo al ADN. La poli ADP-
ribosilación produce una disminución del NAD+ y ATP. Al aumentar la
desfosforilación del ATP, y se provee el sustrato para la xantina oxidasa,
resultando en la formación de radicales súper óxido. Consecuentemente, también
son producidos peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilos. Además, la STZ
libera cierta cantidad tóxica de óxido nítrico, el que inhibe la actividad celular y
también participa en el daño al ADN. Como resultado de la acción de STZ, se
produce la destrucción de la célula β pancreática por necrosis y el consecuente
estado diabetogénico.
13
El rango de dosis utilizada es bastante amplio. En el caso de las ratas, es
frecuente que se utilice una dosis intravenosa (IV) única de 40 a 70 mg/Kg de
peso. Este rango también es eficaz cuando se aplica dosis única intraperitoneal
(IP), pero dosis menores a 40 mg/Kg pueden ser insuficientes para la inducción de
DM. 42
Nosotros utilizamos una dosis única IP de 65 mg/kg de STZ, esta dosis produce
DM en el mayor número de ratas con una baja tasa de mortalidad, produce
alteraciones metabólicas e histológicas similares a las típicas de la nefropatía
diabética de larga evolución en el ser humano. Este modelo es ampliamente
utilizado y nos permitirá estudiar la evolución de la enfermedad ya que es similar
que en el humano.
1.2 Sistema renina angiotensina (SRA)
La angiotensina II (Ang II), es una hormona y componente activo del sistema
renina-angiotensina (SRA). Es un octapéptido multifuncional que tiene numerosos
efectos entre los que están, regular la presión arterial a través de la contracción de
los vasos aumentando la resistencia periférica en conjunto con la retención de
sodio y agua en el riñón, aumentando en la actividad del sistema nervioso
simpático, estimulando a nivel central la sed y aumentando la liberación de
vasopresina y aldosterona (hormona antidiuretica) que produce vasoconstricción y
reabsorción de agua en el túbulo colector de las nefronas. La Ang II también
produce efectos patológicos, tal como se manifiesta en la remodelación del
miocardio después de infarto de miocardio y en remodelación vascular en la
hipertensión.42
14
1.2.1 Componentes del sistema renina angiotensina a) Renina
Es conocida como una glicoproteína su substrato, el angiotensinógeno, sobre el
que actúa rompiendo un enlace Leucina-Valina. La renina activa se produce en
grandes cantidades en el aparato yuxtaglomerular del riñón, y es la responsable
de la cascada renina-angiotensina-aldosterona que produce la mayoría de la Ang
II circulante. Sin embargo, existen múltiples sitios extrarenales que expresan
mARN de la renina, como el sistema vascular, la glándula adrenal y el cerebro.8
b) Angiotensinógeno
Es otra glicoproteína de peso molecular de entre 56-60 KDa producida en el
hígado y liberada a la circulación. Su síntesis está regulada por mecanismos a
largo plazo, se estimula por glucocorticoides, hormona tiroidea y Ang II. Los
niveles de Angiotensinogeno aumentan durante las infecciones y el daño tisular.
La expresión del RNAm se ha demostrado en distintos tejidos, incluyendo al riñón,
y esta regulada de manera diferente, dependiendo de los de distintos factores de
transcripción.7
c) Enzima convertidora de angiotensina (ECA)
La ECA o quininasa II es una dipeptidilcarboxipeptidasa, que se produce en las
células endoteliales del pulmón que separa dipéptidos del extremo carboxilo
terminal de diversos polipéptidos (bradiquinina, sustancia P, neurotensina y otros)
es bastante selectiva y esta regulada por varios factores, como afinidad,
concentración de sustratos y dependencia de cloro. La ECA puede actuar sobre la
Ang I (Ang I) produciendo Ang II.16
15
d) Receptores a Ang II
La acción de la Ang II en el organismo es mediada por dos receptores de alta
afinidad localizados en la membrana plasmática, los receptores AT1 y AT2.
Aunque se han descrito otros dos receptores, el AT3 y AT4. El AT3 inicialmente
descrito en líneas celulares neuronales. El receptor AT4, que se distribuye en el
corazón, pulmón, riñón, el cerebro y el hígado. Desde el punto de vista
farmacológico los receptores AT3 y AT4 no se han caracterizado, estos
receptores no están todavía incluidos en una clasificación definitiva de mamíferos
en los receptores, tal como se define por la Unión Internacional de Nomenclatura
en Farmacología.
El receptor AT1 pertenece a la familia de receptores de membrana y cuenta con
siete dominios transmembranales acoplado a proteínas Gq. (figura 5)
Figura 5. Señalizacion intracelular del receptor AT1
Actualmente se sabe que el receptor AT1 se compone aproximadamente de 359
aminoácidos y se caracteriza por regular la mayor parte de las funciones de la Ang
16
II. Estos receptores se encuentran principalmente en vasos sanguíneos, aunque
también están presentes en células musculares lisas, en la adventicia y en el
endotelio. En roedores se han descrito dos subtipos o isoformas del receptor AT1
que son el AT1A y el AT1B.
Figura 6. Receptor AT1 vista tridimensional
Otro subtipo del receptor de Angiotensina II, es el receptor AT2, expresado en
niveles altos en tejidos fetales y disminuye rápidamente después del nacimiento.
Sin embargo se ha encontrado niveles detectables en adultos en páncreas,
corazón, riñones, glándulas suprarrenales, cerebro y vasos sanguíneos. Algunas
de las funciones descritas de este receptor son contrarias al receptor AT1 por lo
que se considera antagonista fisiológico de las acciones del receptor AT1.
En la tabla 1 podemos ver características generales de los receptores AT1 y AT2:
17
RECEPTORES DE ANGIOTENSINA II
AT1 AT2 Gen at1 at2
Estructura 7 dominios trasmembranales y
359 aminoácidos (rata, humano)
7 dominios trasmembranales
y 363 aminoácidos (rata,
humano)
Peso molecular 50 kDa 44 kDa
Agonista No se conoce CGP42112A
Antagonistas Losartán, vasartan PD123319,PD12377
Efector Gq/11 Gq
Tabla 1. Características de receptores a Ang II
El sistema renina angiotensina fue inicialmente considerado como un sistema de
circulación sistémica. Sin embargo, con el paso del tiempo se ha descrito que
muchos de sus componentes se localizan en tejidos y órganos, teniendo como
conclusión que algunos órganos tienen su propio sistema de síntesis de
angiotensina II. Por ejemplo en órganos como el corazón, cerebro, vasos
sanguíneos, hígado y riñón.
En la figura 7 se esquematiza la vía de síntesis de Ang II tisular y sistémica así
como la interacción con sus receptores y su respuesta. 45
18
Figura 7. Componentes del sistema renina angiotensina
19
Actualmente se han descrito algunas vías alternas que producen angiotensina II
como se muestra en el siguiente cuadro: 37
Figura 8. Síntesis de angiotensina II
Al aumentar la síntesis de Ang II en el organismo se pueden estimular los
receptores a angiotensina produciendo internalización de los receptores o efectos
fisiológicos y/o patológicos que se muestran en la tabla 2:
20
RESPUESTAS FISIOLÓGICAS Y PATOLÓGICAS DE RECEPTORES A ANGIOTENSINA II
RESPUESTAS FISIOLÓGICAS RESPUESTAS PATOLÓGICAS
- Contracción - ↑ tono vascular, resistencia
periférica y TA
- Crecimiento celular - Hipertrofia y hiperplasia
- Apoptosis - Muerte celular
- Producción de colágeno - ↑deposición de matriz
extracelular
- Respuesta inflamatoria - Remodelación vascular
- Migración vascular - Ateroesclerosis
Tabla 2. Respuestas fisiológicas y patológicas de Ang II
Los efectos a largo plazo mediados por los receptores a la Ang II que influye en el
crecimiento, la adherencia y la migración celular, así como la deposición de la
matriz intercelular en la vasculatura y el riñón, se asocian con cambios de
remodelación, hipertrofia, así como los procesos que participan en la
aterosclerosis. Entre estos efectos esta la generación de especies reactivas de
oxígeno como el peróxido de hidrógeno y aniones superóxido que juegan un papel
fisiopatológico en la alteración de tono vascular, inflamación, isquemia, la
hipertensión, y aterosclerosis. 45
21
Figura 9. Relación de radicales libres con la hipertrofia renal
La enzima xantina oxidasa, oxidasas mitocondriales y el ácido araquidónico son
los principales fuentes de especies reactivas de oxigeno en el tejido no vascular,
mientras que las oxidasas no mitocondriales, la NADH / NADPH oxidasa parece
ser el fuente más importante de anión superóxido (O2) en las células vasculares.
Esta enzima produce la transferencia de electrones a NADH o NADPH del oxígeno
molecular y la producción de anión superóxido. (figura 9)45
22
1.2.2 Farmacología del SRA
En de la farmacología del sistema renina angiotensina podemos mencionar que
con inhibidores de la ECA (IECA’s) o los antagonistas de receptor AT1 (ARA’s),
así como a los inhibidores de la renina. Y todos ellos se han empleado como
antihipertensivos. Por otro lado estudios realizados en animales y humanos que la
administración de estos fármacos producen efectos nefroprotectores.43, 25, 45
Podemos mencionar que el tratamiento de la hipertensión arterial con ARA’s como
el Losartán, previene la insuficiencia renal terminal y el desarrollo de hipertrofia
cardiaca.41, 43
Existen diversos estudios en pacientes diabéticos que padecen hipertensión
arterial, que cuando son tratados con IECA’s, como el Captopril, se reduce el
riesgo de muerte, diálisis o de trasplante de riñón, así como la tasa de progresión
de albuminuria.24
1.3. Concepto de radical libre (RL) Un RL es una molécula o fragmento de molécula, que contiene uno o más
electrones desapareados en su orbital externo. Tienen una vida media del orden
de milisegundos y tiene gran reactividad, aunque esta varía según el tipo de
radical libre. Estas moléculas, se encuentran implicadas en el inicio y desarrollo de
diversas enfermedades. Como hipertensión arterial, cáncer, lupus, etc.
La evidencia del papel patológico de estos compuestos ha dado lugar a
numerosas vías de investigación con el fin de desarrollar atrapadores, inhibidores
o moduladores de los mismos. En el medio biológico, los radicales libres son
23
compuestos generalmente oxigenados y se les llaman especies reactivas de
oxígeno (ERO). Debido a que los organismos se desarrollan en presencia de
oxígeno, están asociados con la generación de estas ERO, estas son tóxicas y se
consideran responsables del daño oxidativo de macromoléculas biológicas como
el ADN, lípidos, carbohidratos y proteínas. Se cree que están implicadas en
muchos procesos patológicos como cáncer, DM, patologías cardiovasculares. Sin
embargo también están asociados procesos fisiológicos como en el
envejecimiento, el daño causado por el ejercicio físico agotador, y otros. Existen
también radicales libres nitrogenados o especies de reactivas de nitrógeno (ERN),
cuya importancia ha crecido considerablemente en los últimos tiempos.6, 19,33, 35, 36
1.3.1 Estrés oxidativo (EO) El EO se conoce como el desequilibrio bioquímico propiciado por la producción
excesiva de especies reactivas (ER) y RL, que provocan daño oxidativo a las
macromoléculas y que no puede ser contrarrestado por los sistemas antioxidantes
(AO) de defensa. El daño celular que producen las EO y los RL, ocurre en los
enlaces de proteínas, los fosfolípidos poliinsaturados de las membranas celulares,
hidratos de carbono y ácidos nucleícos, lo que provoca varios cambios
bioquímicos y fisiológicos en la célula, por la activación de una reacción en
cadena.19
1.3.2 Antioxidantes
Para equilibrar la respuesta oxidante el organismo dispone de una serie de
defensas AO que contrarrestan la generación de RL. Un antioxidante es una
entidad química que a bajas concentraciones, y en comparación con el oxidante,
24
retarda o previene la oxidación de un sustrato, el cual incluye a lípidos, proteínas,
hidratos de carbono y ADN. Podemos mencionar enzimas AO, como la superóxido
dismutasa, glutatión peroxidasa y catalasa.20, 21, 42
Además podemos referir otros AO exógenos como las VC y VE que actúan como
captadores de RL que intervienen cuando hay superproducción de RL y los
sistemas enzimáticos están desbordados, previniendo así las reacciones en
cadena.
1.3.4 Vitamina C
La VC se considera un poderoso antioxidante de origen natural y quizá es el
menos tóxico de los AO naturales. Es soluble en agua, y se encuentra en
concentraciones elevadas en muchos tejidos, el plasma contiene alrededor de 60
μmol/L. Las plantas y la mayoría de los animales pueden sintetizarla a partir de la
glucosa, pero los humanos, otros primates superiores y los cobayos no poseen
todas las enzimas para su síntesis, teniendo que ser incorporada con la dieta.
Cuando la VC reacciona con ERO se oxida a dihidroascorbato, que será reciclado
a ácido ascórbico por el enzima dihidroascorbato reductasa. Por ello, el
dihidroascorbato se encuentra en concentraciones mucho más bajas que el
ascorbato.5
La VC es efectiva para inactivar al radical anión superóxido, el peróxido de
hidrógeno, el radical hidroxilo y el oxígeno singulete. En solución acuosa reacciona
con especies reactivas de nitrógeno, previniendo la nitración de moléculas diana.
La VC es una molécula que posee tanto propiedades AO como prooxidantes,
dependiendo de la concentración de hierro tisular, aunque no ha podido
demostrarse su efecto prooxidante in vivo. Cuando la cantidad de VC es baja,
ejerce un efecto antioxidante, uniéndose al radical superóxido o hidroxilo y
25
formando radical semihidroascorbato, que posteriormente es reducido por el
glutatión. Sin embargo, en condiciones de alta concentración tisular de hierro, el
ácido ascórbico es capaz de catalizar la reacción de Fenton que consiste en la
reducción del H2O2 por iones de metales de transición, sobre todo el ion ferroso
(Fe+2) y, en menor medida, el cuproso (Cu+) y otros iones. El peróxido de
hidrógeno o agua oxigenada (H2O2) es una molécula relativamente estable en
ausencia de catalizadores que promuevan su descomposición. Se podían oxidar
moléculas orgánicas por mezclas de peróxido de hidrógeno y Fe+2 (reactivo de
Fenton). Fueron Haber y Weiss quienes dieron una primera explicación del
mecanismo de reacción: el Fe+2 reduce al H2O2, que a su vez se descompone en
el radical hidroxilo y el ion hidroxilo y por lo tanto, generar ion ferroso, que a su vez
facilita la producción de radical hidroxilo mediante la reacción de Haber-Weiss. Las
mayores fuentes de ascorbato en la dieta son las frutas, especialmente los
cítricos, el kiwi, las cerezas y el melón. También forma parte de la composición de
algunos vegetales como tomates, coliflor, coles de Bruselas, col, brócoli. El
contenido de estos vegetales, puede exceder los 100 mg ascorbato / 100 g peso
fresco. La eficacia de absorción decrece cuando aumentan estos niveles. Se ha
demostrado que la biodisponibilidad de la VC es similar tanto en los alimentos
naturales, como en los artificiales.23
Figura 10. Estructura de vitamina C
26
1.3.4 Vitamina E Bajo esta denominación se incluye una familia de compuestos fenólicos llamados
tocoferoles y tocotrienoles. En el organismo existen 4 tipos principales de
tocoferoles: alfa, beta, gamma y delta tocoferol. Estos grupos de compuestos son
altamente lipofílicos, tienden a concentrarse en las membranas biológicas y en
lipoproteínas plasmáticas. Es probablemente el antioxidante más potente del
organismo, en cuanto a su capacidad como bloqueador de la cadena de
lipoperoxidación.
Figura 11. Estructura de la vitamina E
La VE secuestra radicales peroxil lipídicos dando lugar a la generación de
hidroperóxidos lipídicos y radical tocoperoxilo. Este último puede ser reducido por
el ascorbato y el glutatión oxidado a la respectiva quinona.
El alfa-tocoferol es el AO más eficiente de la fase lipídica. Contiene grupos metilos
adyacentes a los grupos hidroxilo fenólicos y están óptimamente posicionados en
las membranas. Los tocoferoles tienen capacidad de captar energía del oxígeno
27
singulete e interacciona con peroxinitritos. Los niveles de VE en plasma en
humanos son de alrededor de 22 μmoles/L; se encuentra en tejidos como el
hígado, el riñón, tejido adiposo o adrenal.
La dieta humana está compuesta por multitud de alimentos que contienen VE. Las
fuentes ricas de VE son los aceites vegetales (girasol, maíz, de soja y de semilla
de algodón), y productos hechos a partir de estos aceites como la margarina o la
mayonesa. Contribuyen considerablemente a los suplementos en VE el germen
de trigo, las nueces y algunos vegetales de hojas verdes.14
28
2. JUSTIFICACIÓN La DM es una enfermedad que tiene una incidencia elevada en la población
mexicana y es un grave problema de salud pública en varios países del mundo.
Cuando la enfermedad no se controla de una manera adecuada se asocia a altas
tasas de mortalidad y varias complicaciones crónicas, una de sus principales
complicaciones es la nefropatía diabética. Un aspecto importante es que HR se
ha considerado como el paso inicial que conlleva a la falla renal. Si bien son
varios los factores que intervienen en esta HR, es de especial interés para
nosotros estudiar el papel del SRA en su génesis, especialmente el papel de los
ROS que se producen tras la activación el receptor AT1, sin embargo se
desconoce su participación en el desarrollo de la HR producida en la DM
temprana.
29
3. HIPÓTESIS En etapas tempranas de la DM se estimula la actividad del SRA provocando como
consecuencia altos niveles de Ang II plasmática y/o una mayor expresión del
receptor AT1, dando como resultado un aumento en la producción de ROS que
promueven HR en la diabetes en ratas.
30
4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL
Determinar si cambios estructurales renales tempranos están relacionados con la
Ang II y las ERO en un modelo de diabetes mellitus inducido por STZ.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
A) Determinar la glucemia, la ingesta de agua, la ingesta de alimento y la
diuresis en ratas controles y diabéticas después de 7 días de inducción
con STZ.
B) Determinar el peso del riñón y el coeficiente de masa renal como
indicadores de hipertrofia renal en ratas controles y diabéticas después
de 7 días de inducción con STZ.
C) Realizar un estudio histológico en riñones de ratas controles y diabéticas
después de 7 días de inducción con STZ.
D) Estudiar si la administración de AO como son las VC y VE, así como el
captopril modifican el peso renal, el coeficiente de masa renal y la
histología del riñón de ratas controles y diabéticas después de 7 días de
inducción con STZ.
E) Determinar la expresión del receptor AT1 en corteza renal de ratas
controles y diabéticas después de 7 días de inducción con STZ.
F) Medir la concentración de Ang II en plasma de ratas controles y
diabéticas después de 7 días de inducción con STZ.
31
5. MATERIAL Y MÉTODOS
5.1 Materiales
5.1.1 Material biológico y grupos experimentales: Se utilizaron 60 ratas macho de la cepa Wistar, con un peso de 250+/-30 grs.,
procedentes del bioterio del Escuela Superior de Medicina del Instituto Politécnico
Nacional. Las ratas se mantuvieron en jaulas colectivas, en condiciones reguladas
de luz, temperatura y humedad, durante un periodo de 8 días, separándose en
jaulas metabólicas en los periodos establecidos para la toma de muestras. Se
dividieron en grupos control y con diabetes mellitus en combinación con los
diferentes tratamientos (figura 12):
Figura 12. Protocolo de los grupos
32
5.1.2 Material Farmacológico:
- Estreptozotocina (Sigma)
- Buffer citrato 0,05 M, pH 4
- Pentobarbital
- Captopril
- Vitamina C
- Vitamina E
5.2 Métodos Con el fin de establecer los valores basales de los parámetros a evaluar de todos
los animales en estudio, previo a la inducción de diabetes, se midieron valores de
peso, glicemia, creatinina plasmática y urinaria, ingesta de agua, diuresis y
proteinuria Las ratas fueron mantenidas por ocho días para estudiar las
modificaciones en los parámetros fisiológicos durante diabetes mellitus. En el
experimento se administraron los diferentes tratamientos a cada grupo a partir de
haber determinado la hiperglucemia.
33
Figura 13. Protocolo experimental. Los fármacos se administraron 2 días después
de la inducción de la diabetes mellitus.
5.2.1 Inducción del modelo de diabetes:
Las ratas fueron administradas vía IP con 65 mg/Kg de STZ, disuelta en
amortiguador de citratos pH= 4 al 0.05M (1 ml/Kg de peso vivo). Transcurridas 48
horas post-administración de STZ, se determinó la glucemia a través de tiras
reactivas y los animales que presentaron valores superiores a más de 200 mg/dl
se utilizaron en el presente estudio.
34
5.2.2 Recolección de muestras: Sanguíneas: Las muestras de sangre se obtuvieron de la aorta abdominal en
presencia de heparina al momento del sacrificio de rata, la sangre se centrifugó a
3000 rpm y 4º C. Posteriormente se recolectó el plasma en tubos Eppendorf, se le
agregó inhibidores de proteasas (minicomplete) y se almacenó a -70º C hasta su
uso. Urinarias: Se recolectó orina de 24 horas, para determinacion de proteínas y
diuresis en cajas metabólicas individuales.
Renales: se obtuvieron ambos riñones, el derecho se utilizó para el estudio
histológico y el riñon izquierdo se obtuvo la corteza para WB.
5.2.3 Estudio Histológico con técnica de hematoxilina y eosina El riñón derecho se perfundió con formaldehído al 4% y permaneció en esta
solución hasta su procesamiento. Los riñones se lavaron con abundante agua
para retirar el exceso de formaldehído y se llevó a cabo la deshidratación del tejido
mediante la exposición durante 20 minutos a concentraciones crecientes de
alcohol (metanol) al 50, 60, 80, 90 100 %. Se hicieron cortes sagitales, coronales
en los riñones, para meterlos en casettes e incluirlos en parafina para elaborar
cubos y realizar los cortes en el micrótomo. Posteriormente se colocó los cortes en
portaobjetos con gelatina, eliminamos la parafina por calentamiento en una estufa
durante algunas horas para no dañar el tejido, sumergimos en xilol durante 5
minutos para retirar los excesos de parafina. La hidratación se realizó por
exposición del tejido durante 5 minutos a concentraciones descendentes de
alcohol al 100, 90, 80, 70 % y finalmente en agua. Se tiño con hematoxilina
durante 2 min y después se lavaron con agua corriente para después colocarlos
10 min en eosina. Posteriormente se realizó una deshidratación por el método ya
35
mencionado. Al final se cubren con adhesivo y portaobjetos para observarlos al
microscopio óptico.
5.2.4 Cuantificación relativa del receptor AT1 en la corteza renal por inmunoblot
Los riñones se disecaron y se obtuvó la corteza. Se colocaron 50 miligramos de
tejido en viales con 1000 µl de RIPA con una mezcla de inhibidores de proteasas
(complete mini, Roche). Los tejidos se homogenizaron y se centrifugaron a 10000
rpm a 4°C durante 10 minutos. La concentración de proteínas se determinó por el
método de Lowry. La proteína se desnaturalizó a 100ºC por 10 minutos con un
amortiguador de LAEMLI y β-mercaptoetanol. Las muestras se congelaron a -70
°C hasta su uso.
Los extractos de las muestras se hirvieron durante un minuto, se centrifugaron a
10000 rpm a 4°C. Se tomó el volumen necesario de los sobrenadantes para cargar
100 µg de proteína por carril del gel para correr la electroforesis a 88 Volts para
separar las proteínas por peso molecular. Inmediatamente después de la
electroforesis las proteínas del gel se transfirieron a 18 Volts a la membrana de
PVDF (fluoruro de polivinidieno), durante 1 hora en presencia del amortiguador de
transferencia. Para bloquear los sitios reactivos de la membrana de PVDF se
incubó con leche descremada al 5% en TBS-T (TBS con Tween 20 al 0.05%)
durante 2 horas a 4°C. Posteriormente se lavó tres veces con TBS-T y se incubó
toda la noche a 4°C con IgG de chivo anti-AT1, (Santa Cruz) 1:500 en leche 5%
en TBS-T. La membrana de PVDF se lavó tres veces la membrana con TBS-T y
se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente con IgG de conejo anti-IgG de
chivo, acoplada a peroxidasa (Santa Cruz) 1:10000 en leche 5% en TBS-T. Por
último la membrana de PVDF se lavó nuevamente con TBS-T y las bandas se
36
revelaron con un kit de luminol (Santa Cruz) en películas fotográficas Kodak. Las
bandas se detectaron en un analizador de imágenes (Fuji) y la intensidad se midió
por densitometría.
5.2.5 Medición de Ang II plasmática
Se colectó sangre para obtener plasma, en la presencia de inhibidores de
proteasas (complete mini, Roche) para evitar la degradación de Ang II. Las
muestras de plasma se congelaron a -70ºC hasta la posterior determinación de
Ang II, para lo cual se utilizaron las columnas de extracción en fase sólida SPEC
(Varian). La cuantificación de Ang II se realizó por el método de ELISA utilizando
el kit de Spi-bio que consiste en el reconocimiento y la unión de Ang II a un
anticuerpo monoclonal específico, fijado previamente a las paredes del pozo en
donde se lleva a cabo la reacción. Posteriormente la Ang II unida es fijada
covalentemente al anticuerpo por glutaraldehído, vía el grupo amino. Después de
un tratamiento desnaturalizante, la Ang II reacciona nuevamente con el anticuerpo
anti-Ang II acoplado a la acetilcolinesterasa. Posteriormente la placa se lavó para
eliminar cualquier sustancia que no haya formado el complejo y se adicionó el
reactivo de Ellman a cada pozo, originando un producto de color amarillo
cuantificable en el espectrofotómetro a 412 nm.
5.2.6 Análisis estadístico
El número de repeticiones fue de 4 a 6 animales por grupo para este estudio y los
resultados se expresan como la media ± desviación estándar. Todos los datos
fueron analizaron con ANOVA de una vía seguido de comparación de medias
mediante el método de Bonferroni. Para todos los resultados obtenidos se tomó
como nivel de significancia estadística un valor de p<0.05.
37
6. RESULTADOS Al final de los tratamientos obtuvieron las muestras de riñón y se determinó el
peso húmedo de los riñones, el coeficiente de masa renal y examen histológico. El
peso de los riñones aumento de manera significativa el del grupo de los diabéticos
sin tratamiento en comparación con el control sin tratamiento vemos que el peso
del riñón en las ratas diabéticas aumento de peso durante la primera semana y
este fue significativo. Sin embargo si comparamos los pesos de los riñones de las
ratas diabéticas con los diferentes tratamientos y de las ratas control con los
diferentes tratamientos observamos que los tratamientos previnieron el desarrollo
de la HR en la diabetes mellitus temprana, sugiriéndonos que el tratamiento con
los antioxidantes VC y VE asi como el captopril evitan y/o previenen la HR.
Aunque al medir los túbulos contorneados proximales de los riñones no se
observo diferencia significativa en ninguno de los grupos. En los cortes
histológicos observamos que en el grupo de las ratas diabéticas aparecen células
proinflamatorias que pueden ser un indicio de que la hipertrofia renal esta presente
y estas disminuyen con los diferentes tratamientos. La angiotensina II plasmática
se ve incrementada, las ratas control con tratamiento con captopril sugeriendo que
esta condición aumenta por que se activan otras vías de síntesis de Ang II como
algunas cinasas.
38
6.1 Modelo experimental de DM. 6.1.1 Determinación sanguínea de glucosa Después de la inducción de la DM con STZ (65 mg/kg) por la vía IP, se determinó
a las 48 hrs. la glucosa sanguínea para verificar si los animales desarrollaron
hiperglucemia (valores mayores de 200 mg/dl). A los 7 días de exposición a la
hiperglucemia se determinó nuevamente la concentración de glucosa en sangre,
arrojando los siguientes resultados 105 ± 11 mg/dl en las ratas control, mientras
que en las ratas con DM se obtuvo una concentración de glucosa en sangre de
309 ± 102 mg/dl (Figura 14).
Figura. 14 Concentración de glucosa sanguínea tomada a los siete días de DM.
N=6. Los valores se expresan como el promedio ± desviación estándar. *p<0.05
39
6.1.2 Peso corporal
Después de siete días de hiperglucemia se observó que el peso de las ratas
diabéticas fue ligeramente menor que el de las ratas control aunque esta
disminución no fue significativa. Así se encontró que el peso en el grupo control
fue de 288.33 ± 5.81 grs. en tanto las ratas en el grupo de DM tuvieron 260.83 ±
7.16 grs. (Figura 15).
Figura 15. Comparación del peso corporal entre los grupos CTRL y DM. N=6. Los
valores se expresan con el promedio ± desviación estándar. *p<0.05.
40
6.1.3 Ingesta de agua
Para medir la ingesta de agua se colocaron las ratas en cajas metabólicas durante
48 hrs. pero solo se midió el consumo de 24 hrs., las ratas diabéticas consumieron
mayor cantidad de agua (polidipsia) 217 ± 13.7 ml. comparado con el consumo de
los animales del grupo control 35.5 2 ±.17 ml., siendo esta diferencia significativa
(Figura 16).
Figura 16. Ingesta de agua durante 24 hrs. del grupo CTRL y el grupo de DM
después de la semana de padecimiento. N=6. Los valores se expresan como el
promedio ± desviación estándar. *p<0.05.
41
6.1.4 Ingesta de alimento El la Figura 17 se muestra la ingesta de alimento en 24 hrs. observamos un
aumento significativo en el consumo de alimento (polifagia) en el grupo de las
ratas diabéticas 42.83 ± 3.37 grs. comparado con el grupo CTRL 23.66 ± 1.21 grs.
Figura 17. Comparación de la ingesta de alimento durante 24 hrs. del grupo CTRL
y el grupo de DM después de una semana de hiperglucemia. N=6. Los valores se
expresan como el promedio ± desviación estándar. *p<0.05
42
6.1.5 Volumen de orina
En relación al volumen de orina observamos que en las ratas diabéticas aumento
la cantidad de orina excretada (poliuria) en 24 horas 199.16 ± 12.44 ml.
comparado con el volumen excretado por el grupo control 11.33 ±.1.36 ml., siendo
esta diferencia significativa (Figura 18).
Figura 18. Volumen urinario durante 24 hrs de las ratas CTRL y diabéticas
después de la semana de padecimiento. N=6. Los valores se expresan con el
promedio ± desviación estándar. *p<0.05
Con los resultados anteriores confirmamos la caracterización del modelo de DM
inducido por STZ.
43
6.1.6 Peso renal
En cuanto al peso renal encontramos un aumento significativo en las ratas con DM
1.92 ± 0.37 grs. comparado con el control 1.40 ± 0.10 grs (Figura 19).
Figura 19. Peso renal de las ratas CTRL y diabéticas. N=6. Los valores se
expresan como el promedio ± desviación estándar. *p<0.05
44
6.1.7 Coeficiente de masa renal El coeficiente de masa renal se obtuvo al dividir el peso del riñón entre el peso
corporal de la rata, observamos que en el grupo de las ratas diabéticas un
aumento significativo comparado con el CTRL (0.007 ± 0.0003 y 0.004 ± 0.0005
respectivamente; Figura 20).
Figura 20. Coeficiente masa renal de ratas CTRL y diabéticas. N=6. Los valores se
expresan como el promedio ± desviación estándar. *p<0.05.
45
6.2 Histología
Se realizaron cortes histológicos de corteza renal y se tiñeron con hematoxilina y
eosina. Las imágenes muestran en la corteza renal de ratas DM una aglomeración
de infiltrado de células proinflamatorias, probablemente asociado con el desarrollo
de daño renal que se presenta en etapa temprana de la DM.
Control Diabetes Mellitus
Figura 21. Cortes histológicos de corteza de riñón de una rata CTRL y una rata
diabética.
46
6.3 Comparación de los diferentes tratamientos
Sin embargo vemos que este infiltrado de células es disminuido con los diferentes
tratamientos y son marcados en las diferentes imágenes que están a continuación.
Figura 22. Histologia de los grupos con tratamientos de las vitaminas C y E
47
Figura 23. Histología de los grupos con los diferentes tratamientos.
48
6.4 Peso renal en los diferentes tratamientos Como se mencionó anteriormente la hiperglucemia incrementó significativamente
el peso renal (Figura 19). Los tratamientos con vitamina C, vitamina E, captopril y
la combinación de vitaminas C y E no modificaron el peso del riñón en los
animales control. Interesantemente estos tratamientos previnieron el aumento de
peso renal en los animales diabéticos (Figura 24).
Figura 24. Peso renal de las ratas CTRL y DM con los diferentes tratamientos.
N=6. Los valores se expresan como el promedio ± desviación estándar. *p<0.05.
49
6.5 Coeficiente de masa renal De manera similar al peso renal los tratamientos con vitamina C, vitamina E,
captopril y la combinación de vitaminas C y E no modificaron el coeficiente de
masa renal en los animales control sin embargo estos tratamientos previnieron el
aumento de la masa renal observado en los animales diabéticos (Figura 25).
Figura 25. Coeficiente renal de los grupos con los diferentes tratamientos. N=6.
Los valores se expresan como el promedio ± desviación estándar. p<0.05.
50
6.6 Medición de Angiotensina II plasmática Como se puede observar en la Figura 26 la concentración de Ang II plasmática no
fue modificada por la DM. Interesantemente el tratamiento con captopril tuvo un
efecto dual sobre la Ang II plasmática con aumento en el control y disminución en
la DM. Además el tratamiento con vitamina E disminuyo notablemente la Ang II en
el grupo diabético.
Figura 26. Medición de Ang II plasmática N=6. Los valores se expresan como el
promedio ± desviación estándar. p<0.05.
51
6.7 Expresión del receptor AT1 en corteza renal Con la finalidad de establecer si DM se asocia con cambios en la cantidad del
receptor AT1 en el riñón, se evaluó la expresión de este receptor en corteza renal,
encontrándose que existe un aumento notable en la expresión del receptor AT1 en
el grupo de DM comparado con el control. La aplicación de los diferentes
tratamientos en las ratas control no modifico la expresión del receptor AT1
mientras que en el grupo diabético los tratamientos previnieron el aumento en el
receptor AT1 (Figura 27). AT1 β-actina
Figura 27. Expresión del receptor AT1 en los diferentes grupos. N=6. Los valores
se expresan como promedio ± desviación estándar. p<0.05.
52
7. DISCUSIÓN La finalidad de este estudio, fue analizar el efecto del tratamiento con
antioxidantes como la vitamina C y E así como un inhibidor de la enzima
convertidora de angiotensina sobre el peso del riñón, el coeficiente de masa renal,
la expresión de receptor AT1 y la concentración plasmática de Ang II durante la
diabetes mellitus temprana en un modelo experimental inducido con STZ.
La reproducción de la diabetes mellitus experimental se ha realizado con
diferentes procedimientos como el haloxano, pancreotomía y algunos virus; sin
embargo uno de los más utilizados es el de la administración de estreptozotocina
por vía intraperitoneal, el cual presenta una evolución de la enfermedad similar al
humano. Lo cual permite examinar con facilidad los cambios que se presentan en
alguna etapa de la enfermedad, así como las complicaciones siendo de especial
interés para este estudio los cambios a nivel renal. 30, 44
La DM provoca diversas complicaciones desde sus etapas tempranas como
resultado de diversas reacciones químicas y de la activación o alteración de
causado por el efecto de glucosa; así como cambios químicos y funcionales de las
proteínas y lípidos. 13
Aunque esta hipertrofia renal, es considerada el primer paso de evolución de la
nefropatía diabética. La hipertrofia es seguida de fibrosis y esclerosis; hasta llegar
a una nefropatía diabética.38
Se ha reportado que en etapas tempranas de la diabetes mellitus se produce
hipertrofia tubular proximal debido al aumento de la proteina Ornitina
descarboxilasa que es una enzima de la síntesis de poliaminas que inducen
hipertrofia. Regulando la expresión de proteínas de la matriz extracelular como el
colágeno, fibronectina, permitiendo la acumulación de la matriz extracelular.47
53
Después de una semana de haber inducido la DM, un elemento que utilizamos
para medir el daño renal en la DM temprana fue pesar los riñones después de
sacrificar a las ratas y la obtención del coeficiente de masa renal. En las ratas
diabéticas sin tratamiento en comparación con las ratas control sin tratamiento
estos parámetros se encuentran aumentados significativamente lo que indica que
se presenta una hipertrofia renal. Lo que nos permite inferir que hay cambios
renales tempranos provocados por la DM. Al analizar los resultados del peso renal
y coeficiente de masa renal con la administración de los diferentes tratamientos
observamos que modifico tal efecto, ya que se vio un efecto preventivo del daño
renal, a través de la acción antioxidante de las vitaminas C y E que disminuyen
posiblemente el daño del estrés oxidativo provocado por ROS en la DM temprana.
La administración del captopril en las ratas diabéticas también previno la
hipertrofia renal en la DM temprana ya que hay la probabilidad de que bloquee
vías de señalización del ciclo celular de la hipertrofia en el riñón. Lo cual corrobora
los estudios clínicos que se enfocan en pacientes diabéticos que se han hecho
sobre la administración de los antioxidantes como la vitamina C y E, así como el
captopril utilizados como nefroprotectores en la DM.24, 38, 38, 70
El SRA, en particular la Ang II y sus receptores de la angiotensina tiene
participación diversas patologías, tales como diferentes tipos de cáncer (por
ejemplo, próstata, páncreas, mama y pulmón cáncer) y enfermedades metabólicas
(por ejemplo, la obesidad y la diabetes tipo 2 mellitus).1
El aumento de Ang II plasmática en la diabetes mellitus experimental de este
trabajo no es evidente; pero hay reportes de que el aumento de Ang II esta
relacionado con el aumento de hipertrofia y fibrosis, ya que estimula células
inflamatorias y activa algunos factores de crecimiento como NFκβ. En las ratas
control con captopril el dato que obtuvimos fue que la Ang II esta aumentada lo
cual puede ser debido a que a pesar de que ya no hay síntesis de Ang II por la vía
54
de la ECA, sugiere que pueden existir otras vías de sintesis o enzimas como la
carboxipeptidasa, catepsina G o quimasa que al no haber síntesis de Ang II
intenten compensar esta disminución y alteren la regulación de la síntesis de Ang
II, en condiciones basales en este lapso de tan corto tiempo. Mientras que si
observamos en las ratas diabéticas con la administración de VE la Ang II
plasmática disminuyo significativamente. Sin embargo tenemos que en las ratas
diabéticas con VE disminuyo significativamente la angiotensina II teniendo un
mejor efecto antioxidante que la VC probablemente porque la vida media de la VE
es mas larga que la VC 54,50.
Por otro lado, en los datos obtenidos en estudios de la medición de la expresión
del receptor AT1 en corteza de riñón se ha visto que esta aumentado en la DM,
además de que se ha descrito que este aumento se involucra con el daño renal.
Coincidiendo con nuestros datos en la medición de la expresión del receptor AT1
es mayor en las ratas diabéticas sin tratamiento comparado con los demás grupos
de ratas con y sin los diferentes tratamientos; este aumento puede ser explicado
por las vías de señalización activadas durante la diabetes mellitus, ya que el SRA
en esta enfermedad esta sensibilizado.3
La hipótesis que tenemos es que en la DM se encuentra sensibilizado el SRA y se
activa la angiotensina II que estimula el receptor AT1, con ello es muy
posiblemente favorece la producción de especies reactivas de oxigeno y las
cuales participan de manera importante el desarrollo de la HR, por ello el
tratamiento con antioxidantes como la VC o la VE o captopril producen efectos
nefroprotectores.
55
7. CONCLUSIONES En base a los resultados obtenidos y discutidos en el presente estudio, se
concluye:
La hiperglucemia induce incremento del peso renal y del coeficiente de
masa renal sugiriendo desarrollo de hipertrofia renal durante la primera
semana del padecimiento.
La administración de antioxidantes como la vitamina C (500mg/kg), E
(700mg/kg) y captopril (5 mg/kg) administrados por vía oral cada 24 hrs
durante una semana previenen el incremento del peso renal y normalizan el
coeficiente de masa renal en la diabetes mellitus experimental.
Con los resultados obtenidos hasta el momento es posible identificar que el
sistema renina angiotensina participa en la hipertrofia renal en la diabetes
mellitus temprana.
La angiotensina II plasmática aumenta significativamente en las ratas
control con captopril y disminuye significativamente en el grupo de diabetes
con vitamina E.
La expresión del receptor AT1 medida en los western blot observamos que
esta aumentado significativamente en la diabetes mellitus.
56
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