Instituto Politécnico Nacional

Escuela Superior de Medicina Sección de Estudios de Posgrado e Investigación

El papel de las adipocinas en el hígado graso no alcohólico

TESIS

Que para obtener el grado de

DOCTOR EN INVESTIGACIÓN EN MEDICINA

Presenta

Misael Uribe Esquivel

Tutores Doctor en Ciencias Roberto Medina Santillán – IPN ( Tutor Interno) Doctor en Ciencias Nahum Méndez Sánchez – Fundación Clínica

Médica Sur (Tutor Externo)

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México, D.F. 2008

I. Acta de Revisión II. Índice

III. Glosario IV. Relación de cuadros, gráficas e ilustraciones

i. Figura 1: Prevalencia e historia natural del hígado graso no alcohólico. Nótese que el desarrollo de cirrosis hepática puede esta precedido por la presencia de esteatosis hepática y esteatohepatitis no alcohólica. Como primer factor de riesgo se encuentra la predisposición genética, lo ambiental y lo social. En segundo lugar se mencionan características propias de cada individuo como la obesidad (la que se relaciona con la presencia de esteatosis hepática en 80% de la población de obesos con una prevalencia de 19%), diabetes, dislipidemia y uso de medicamentos, lo que en conjunto se conoce como “primer golpe”. Dentro del segundo golpe se encuentra el daño ocasionado por radicales libres, que se observa con un prevalencia del 3.6 de los sujetos obesos con esteatohepatitis no alcohólica (EHNA). En este último grupo la prevalencia para desarrollar cirrosis es de 0.3%. (Modificado de Bellentani S. et al.26

ii. Figura 2: Mecanismos patógenos y terapéuticos en el HGNA. El ejercicio y la disminución gradual de peso mejoran la sensibilidad a la insulina de manera considerable. La inflamación y las citocinas proinflamatorias juegan un papel importante en el desarrollo de resistencia a la insulina. Diversas estrategias terapéuticas han demostrado eficacia en la disminución de estas citocinas y en consecuencia en la sensibilización a la acción de la insulina, en particular con el uso de glitazonas y metformín. El empleo de antioxidantes como la vitamina E disminuye la peroxidación de los lipidos de membrana y disminuye la activación de las células estelares, mientras que el uso de vitamina C disminuye el daño que ocasionan los radicales libres. El efecto principal de N-acetilcisteína consiste en inhibir la acción de las especies reactivas de oxígeno. Tanto la betaína como los agentes hipolipemiantes disminuyen la cantidad de triglicéridos en el hepatocito, con lo cual reducen los ácidos grasos disponibles y limitan la disfunción de la mitocondria que su sobreexpresión induce.

iii. Figura 3: Estructura propuesta de los receptores de adiponectina con su región conservada (números oscuros) y dominios transmembrana (números claros).

iv. Figura 4: Relación entre fenómenos asociados con el hígado graso no alcohólico. La resistencia a la insulina, una marca de la enfermedad haya o no sobrepeso u obesidad, junto al estado de inflamación crónica de bajo grado (local y sistémica) guardan una relación inversa con los valores de adiponectina séricos

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v. Figura 5: Concentraciones de adiponectina sérica de acuerdo con la gravedad de la HS.73

vi. Figura 6: Concentraciones de leptina sérica de acuerdo con la gravedad de la HS.

vii. Cuadro 1: Signos, síntomas y estudios de laboratorio y gabinete de la EHNA

viii. Cuadro 2: Características demográficas de las series de los pacientes con HGNA

ix. Cuadro 3: Grado de esteatosis promedio y número de componentes del síndrome metabólico en 371 mujeres obesas*

x. Cuadro 4: Mecanismos de toxicidad de los ácidos grasos libres* xi. Cuadro 5: Clasificación de los métodos animales para el estudio de

esteatosis agrupados por el mecanismo predominantea xii. Cuadro 6: Secuencias de oligonucleótidos empleadas para el

análisis por PCR-RT xiii. Cuadro 7: Variables antropométricas, metabólicas y bioquímicas de

casos y controles (promedio ± DE) xiv. Cuadro 8: Variables dietéticas entre casos y controles

(promedio ± DE) xv. Cuadro 9: Distribución por cuartiles (Q) de adiponectina y leptina

entre casos (por grado de EH) y controles xvi. Cuadro 10: Modelo miltivariado1 obtenido por análisis de regresión

logística probando la concentración de adiponectina (por cuartil) como efecto protector principal.

xvii. Cuadro 11: Diferencias entre variables continuas entre casos (esteatosis hepática) y controles

xviii. Cuadro 12: Diferencias en variables categóricas entre casos (esteatosis hepática) y controles

xix. Cuadro 13: Distribución de adiponectina y leptina por cuartiles entre casos y controles

xx. Cuadro 14: Modelo multivariado por análisis de regresión logística para estimar la probabilidad de tener esteatosis hepática

xxi. Cuadro 15: Características basales de la población comparando controles normales, esteatosis y esteatohepatitis

xxii. Cuadro 16: Cuantificación relativa de los valores de mRNA de adiponectina y preprogrelina en controles, esteatosis y esteatohepatitis

V. Resumen i. Español ii. Inglés

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INDICE

VI. Introducción VII. Antecedentes

i. Definición ii. Histología iii. Uso de alcohol iv. Enfermedades concomitantes v. Epidemiología vi. Fisiopatología vii. Tratamiento

1. Reducción de peso 2. Otros tratamientos

viii. Adiponectina, estructura, función e implicaciones fisiopatológicas en el hígado graso no alcohólico

1. Estructura de la adiponectina 2. Receptores de adiponectina 3. Modo de acción de la adiponectina 4. Obesidad y resistencia la insulina 5. Implicaciones fisiopatológicas en el hígado graso no

alcohólico 6. Planteamiento del problema

VIII. Justificación i. Hipótesis

IX. Objetivos i. Generales ii. Específicos

X. Material y Métodos i. Primer estudio clínico ii. Población y muestra

1. Cuestionario sobre los antecedentes dietéticos 2. Exploración física 3. Procedimientos analíticos 4. Análisis estadístico

iii. Segundo estudio clínico 1. Población y muestra 2. Análisis estadístico

3. Tercer estudio clínico 1. Diseño y muestra 2. Métodos analíticos 3. Estudio de biopsias hepáticas 4. Análisis estadístico

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XI. Resultados

i. Primer estudio ii. Segundo estudio iii. Tercer estudio

XII. Analisis i. Primer estudio ii. Segundo estudio iii. Tercer estudio

XIII. Conclusiones XIV. Recomendaciones

i. Terapéuticas potenciales con la adiponectina XV. Sugerencias para trabajo futuro

XVI. Bibliografía

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Mecanismos Moleculares de la adiponectina en el híg ado graso no alcohólico V. RESUMEN El hígado graso no alcohólico (HGNA) es una enfermedad emergente de gran importancia en el momento actual. Se relaciona con obesidad y resistencia a la insulina y dentro de su fisiopatología se incluyen varias adipocinas como leptina, factor de necrosis tumoral alfa y adiponectina, entre otras. El objetivo de este trabajo fue investigar el efecto de adiponectina en sujetos con esteatosis hepática así como su expresión en el tejido hepático. Para tales fines, se realizaron tres estudios, dos clínicos transversales observacionales y uno experimental con técnicas estándar de histopatología y experimental con técnicas de biología molecular (World J Gastroenterology 2005;11:1737-1741, Dig.Dis.Sci 2006;51:1716-1722.). En el primero de ellos se estudiaron 98 casos y 98 controles. En general, los sujetos con esteatosis hepática (EH) fueron los de mayor edad y mayor peso, IMC, obesidad central, resistencia a la insulina (RI) y un perfil aterógeno más acentuado que los controles. Cuando adiponectina se evaluó como el efecto principal en el análisis de regresión logística multivariado, se observó un efecto protector después de aplicar control contra posibles confusores. Dicho efecto protector para la EH fue mayor conforme se incrementó el cuartil. En consecuencia, cuando se comparó el cuartil más alto de adiponectina contra el cuartil más inferior hubo una probabilidad 5.9 veces menor (la inversa de un OR de 0.17) de encontrar el hígado infiltrado de grasa (EH). Por el contrario, los altos valores plasmáticos de leptina parecen asociarse a la posibilidad de descubrir EH. En el segundo estudio, se identificaron 141 pacientes con EH (sujetos positivos para esteatosis), de los cuales 68 tenían esteatosis grado 1, 64 tenían esteatosis grado 2, y 9 tuvieron esteatosis grado 3. Estos pacientes fueron comparados con 111 sujetos controles. Los sujetos positivos para esteatosis mostraron concentraciones más bajas de adiponectina y más altas de leptina que los controles (p < 0.0001 y p < 0.007, respectivamente). La prevalencia del síndrome metabólico fue de 44% en los sujetos positivos para esteatosis y de 9.2% en los controles (p < 0.0001). Entre los sujetos positivos para esteatosis, la proporción más alta fue de varones comparada con los controles (p = 0.01). El efecto protector de adiponectina y el efecto de riesgo del síndrome metabólico para predecir la probabilidad de tener esteatosis se demostró mediante diferentes modelos multivariados por análisis de regresión logística. En el tercer estudio (Ann Hepatology 2008;7:67-71), la muestra se conforma con una serie de pacientes consecutivos sin hepatopatía crónica conocida, con consumo de alcohol menor de 20 g/semana y con perfil vírico negativo (hepatitis B y C) sometidos a biopsia hepática durante una operación laparoscópica (colecistectomía o funduplicatura de Nissen) abdominal. Se incluyó un total de 21 sujetos, 16 mujeres y 5 varones; la media de edad fue 35 ± 12 años. La intervención quirúrgica realizada fue

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colecistectomía en 21 casos y funduplicatura y derivación gástrica en un caso cada una. Los diagnósticos histopatológicos fueron: hígado normal, tres casos; EH, 14 casos, y esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), cuatro casos. Todos los casos de esteatohepatitis no alcohólica correspondieron al grado I de la clasificación de Brunt. Los pacientes con EHNA mostraron mayores concentraciones relativas de mRNA de adiponectina en comparación con los controles, pero no hubo diferencias entre los pacientes con esteatosis y los controles o entre los grupos con HGNA. Se obtuvo una tendencia no significativa a presentar valores mayores de mRNA de preprogrelina en los pacientes con HGNA (controles 0.89 ± 0.94, esteatosis 1.41 ± 1.42 y esteatohepatitis 1.84 ± 0.59). Los resultados de este conjunto de trabajos sugieren a) que los valores altos de adiponectina se acompañan de un efecto protector contra la EH. b) que la adiponectina, leptina y el síndrome metabólico son de utilidad para predecir la gravedad de la esteatosis que acompaña a la obesidad. Asimismo, c) el último trabajo experimental sugiere que el hígado humano puede producir adiponectina in vivo en circunstancias patológicas como el HGNA, lo cual sugiere que la producción hepática de grelina podría jugar un papel en la perpetuación del depósito hepático de triglicéridos característico de la EH.

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Molecular Mechanisms of Adiponectin in Non-alcoholi c fatty liver disease Abstract Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is an emergent disease of great importance. It is related to obesity and insulin resistance and in its pathophysiology several adipokines, including leptin, tumor necrosis factor alpha, adiponectin and grehelin are involved. The aim of this study was to investigate the effect of adiponectin in subjects with steatosis as well as its expression in liver tissue. For this issue to be addressed, three studies were performed, two clinical – cross-sectional designed – and one basic (World J Gastroenterology 2005;11:1737-1741, Dig.Dis.Sci 2006;51:1716-1722.). In the first study, 98 cases and 98 controls were studied; in general, subjects with steatosis had greater age, weight, Body Mass Index (BMI), central obesity, insulin resistance and a more accentuated atherogenic profile than controls. When adiponectin was evaluated as being the primary effect on the multivariate logistic regression analysis, a protective effect was observed after it was adjusted for confounders. This protective effect for steatosis was greater as the quartile was increased. In consequence, when the higher adiponectin quartile was compared against the lowest, a probability 5.9 times lower (inverse of an OR of 0.17) to find steatosis was observed. On the contrary, higher plasmatic values of leptin seemed to increase the possibility of finding steatosis. In the second study, 141 patients were identified with steatosis (subjects positive for steatosis, cases) of which 68 had grade 1 steatosis; 64 had grade 2 steatosis and 9 had grade 3 steatosis. These patients were compared to 109 controls. Cases showed low adiponectin concentrations and higher leptin concentrations than controls (p < 0.0001 y p < 0.007, respectively). Prevalence of metabolic syndrome was found in 44% of cases and 9.2% for controls (p < 0.0001). Between cases, the higher proportion for steatosis was seen in males (p = 0.01). The protector effect of adiponectin and the risk of the metabolic syndrome to predict steatosis were demonstrated by different models using multivariate logistic regression analyses. In the third study (Ann Hepatology 2008;7:67-71), population sample was conformed by a series of patients without known chronic liver disease, alcohol consumption less than 20g per week and with negative viral profile (hepatitis B and C) undergoing liver biopsy during an abdominal laparoscopic surgery (Cholecystectomy or Nissen Fundoplication). 21 subjects were included, 16 females and 5 male patients; mean age was 35 ± 12 years. The surgical intervention performed was Cholecystectomy in 21 cases, Nissen Fundoplication and gastric derivation one for each. Histopathological diagnoses were: normal liver, 3 cases, steatosis; 14 cases and non-alcoholic steatohepatitis (NASH), 4 cases. All cases with NASH corresponded to grade I of Brunt classification. These patients showed greater relative concentrations of adiponectin mRNA compared to controls, but no differences were found between patients with steatosis and controls or between groups and NAFLD. A non-significative tendency of greater levels of

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mRNA preproghrelin values was found in patients with NAFLD (controls 0.89 ± 0.94, steatosis 1.41 ± 1.42 and NASH 1.84 ± 0.59). These results suggest that high adiponectin levels are associated with a protector effect for steatosis. Adiponectin, leptin and metabolic syndrome are of utility to predict the severity of steatosis that accompanies obesity. Nevertheless, the human liver can produce adiponectin in vivo during pathologic circumstances like NAFLD, which suggests that liver production of ghrelin could play a role in the perpetuation of the deposit of triglycerides characteristic of steatosis.

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Mecanismos Moleculares de la adiponectina en el híg ado graso no alcohólico VI. INTRODUCCION La cirrosis criptogénica es la causante de 3 a 31% de todos los casos de hepatopatía y condiciona de 7 a 14% de los trasplantes hepáticos. Como dato interesante, el porcentaje de cirrosis criptogénica disminuyó al demostrarse que 70% de estos casos se debe a secuelas de hígado graso no alcohólico.1-3 En 1980 Ludwig3 y colaboradores acuñaron el nombre de esteatohepatitis no alcohólica, nombrando así a un síndrome clínico-patológico en esa época no bien reconocido que se presenta de manera predominante en mujeres con obesidad y diabetes en quienes no existe el antecedente de consumo y/o abuso de alcohol, pero que después de practicarles una biopsia hepática muestran cambios histopatológicos similares a los que se observan en la hepatitis alcohólica.3 En los últimos 20 años se desató un interés creciente por determinar las características clínicas, epidemiológicas, fisiopatológicas y terapéuticas de este síndrome, en especial frente a la adición del síndrome de resistencia a la insulina, que parece formar parte de esta entidad patológica y de otras entidades que la rodean. VII. ANTECEDENTES

i. Definición El término hígado graso no alcohólico (HGNA) incluye alteraciones mínimas que van desde la esteatosis hepática hasta la cirrosis e insuficiencia hepáticas.4 Esta enfermedad ha recibido diferentes denominaciones entre las que se encuentran hepatitis grasa, enfermedad de Laënnec no alcohólica, hepatitis diabética, hepatopatía parecida a la alcohólica y esteatohepatitis no alcohólica (EHNA).5 La diversidad de términos asociada a la falta de sensibilidad y especificidad de las pruebas no invasivas para el diagnóstico de HGNA ha dificultado su precisión diagnóstica, así como el establecer su incidencia y prevalencia. Desde 1980 y durante los siguientes 20 años surgieron diversos criterios diagnósticos,3,4,6-8 que en forma global toman en consideración los siguientes aspectos:9

ii. Histología Biopsia hepática con datos de degeneración grasa macrovesicular moderada a avanzada, e inflamación (lobular o portal) que se puede acompañar o no de cuerpos de Mallory, fibrosis o cirrosis (Figura 1).

iii. Uso de alcohol Falta de consumo de etanol confirmado por miembros de la familia,por los médicos de atención primaria o pruebas de laboratorio. En el momento actual no existen elementos que determinen la dosis discriminatoria de alcohol.

iv. Enfermedades concomitantes Ausencia de otras enfermedades hepáticas activas. La falta de un consenso internacional que defina al HGNA produjo diversas definiciones operativas que van desde la rigurosidad histopatológica10 hasta la flexibilidad de recientes estudios epidemiológicos.11 La Asociación Americana para el Estudio de las Enfermedades del Hígado publicó un consenso internacional para el diagnóstico de EHNA en el año 2003. (Cuadro 1).12

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i. Cuadro 1. Signos, síntomas y estudios de laboratorio y gabinete de la EHNA* Síntomas y hallazgos físicos

� Fatiga (guarda pobre correlación con el estadio histológico) � Dolor en hipocondrio derecho (puede confundirse con litiasis) � Hepatomegalia � Alteraciones de la motilidad intestinal y sobrecrecimiento

bacteriano � Constipación (en especial en niños) � Medidas antropométricas (el perímetro de la cadera indica

obesidad central) � Acantosis nigricans (sobre todo en niños) � Lipomatosis. � Lipoatrofia/lipodistrofia. � Paniculitis (característica rara; se observa en particular en la

enfermedad de Weber-Christian). � Déficit neurológico (parálisis de los músculos oculares, así

como sordera probablemente heredada por la madre y diabetes).

� Eritema palmar, angiomas cutáneos y esplenomegalia (cirrosis).

� Insuficiencia hepática subaguda. Laboratorio

� Elevación moderada de los valores de AST y ALT; rara vez excede más de diez veces el valor inferior normal de manera más característica, son menores a 1.5 veces el valor normal alto.

� ALT > AST; valores de AST > ALT sugieren fibrosis importante o cirrosis (esta relación se puede alterar en pacientes que reciben hipoglucemiantes orales).

� Elevación de gammaglutamiltransferasa y fosfatasa alcalina. � Hiperglucemia (causada por la asociación con diabetes, la

cual se presenta hasta en un tercio de los pacientes). � Se han descrito depósitos de IgA en cortes histológicos de

pacientes con EHNA y los valores séricos de IgA se encuentran elevados en 25 % de los casos.

� Dislipidemia (casi siempre por triglicéridos) en alrededor de 20 a 25 % de los casos.

� Anticuerpos antinucleares en cerca de un tercio de los pacientes.

� Índices del metabolismo del hierro anormales (de manera habitual, aunque no en todos los casos, indican hemocromatosis)

Imágenes � Ultrasonido, tomografía computarizada e imagen por

resonancia magnética: son poco sensibles para determinar el grado de esteatosis cuando es menor de 25 a 30%.

� Ninguna de estas modalidades puede identificar de manera eficiente el grado de fibrosis y el estadio de la enfermedad.

� Espectroscopia por resonancia magnética; contenido de grasa y concentración de ATP en la grasa hepática.

AASLD, Consenso del 200312 *no todos coinciden simultáneamente a un caso dado.

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En consideración de que la resistencia a la insulina juega un papel

importante en la fisiopatología del HGNA y la EHNA, la determinación de un marcador de resistencia a la insulina en la evaluación de estos pacientes resulta razonable. Sin embargo, la determinación de resistencia a la insulina merece consideraciones metodológicas importantes que quedan fuera de los objetivos de este trabajo.

v. Epidemiología De acuerdo con el criterio diagnóstico utilizado la prevalencia del HGNA es de 2.8 a 25% en la población general.11,13,14 Recientemente se publicó una prevalencia promedio de 16%, en la que se incluyeron poblaciones con características demográficas variadas.15

Esta prevalencia es mucho mayor en grupos de alto riesgo, donde alcanza valores de 70 a 86%, por ejemplo en pacientes obesos y/o diabéticos.16,17 La relación EHNA/HGNA (se utilizan los dos acrónimos para hígado graso esteatohepatitis no alcohólica=EHNA, Esteatosis hepática + inflamación y fibrosis e hígado graso no alcohólico=HGNA, solo Esteatosis) se estima en alrededor de 1:10, si se toman como base estudios histopatológicos.18 La importancia clínica de estos datos radica en que hasta 90% de los casos con diagnóstico de cirrosis criptogénica son consecuencia de HGNA.19 Las anomalías vinculadas con esta entidad patológica se describieron hace más de 20 años y desde entonces se determinó su importancia en el desarrollo y evolución de la enfermedad (Cuadro 2).

ii. Cuadro 2. Características demográficas de las series de los pacientes con HGNA

Autor N Edad (años)

Femenino (%)

Diabetes (%)

Obesidad (%)

Hiperlipidemia (%)

Ludwig3 20 54 65 50 90 67 Diehl21 39 52 81 55 71 20 Lee7 49 53 78 51 69 NR* Powell6 42 49 83 36 95 81 Bacon8 33 47 42 21 39 21 Matteoni4 132 53 53 33 70 92 Angulo22 144 51 67 28 60 27 Ruhl11 5,724 39 32 6 15 NR* Marchesini23 304 41 55 91 78 76

*No reportada

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Uno de los elementos que juega un papel protagónico es la obesidad, la cual también ejerce efectos deletéreos en el pronóstico de otras enfermedades hepáticas distintas al HGNA.20-23 A pesar de que la obesidad se encuentra relacionada de manera habitual con el HGNA, no se observa en todos los casos. En diversas cohortes de pacientes obesos, la prevalencia de HGNA varía de 50 a 90%, con una mayor prevalencia en pacientes de género femenino.14 Se estima que 65% de los pacientes con valores elevados de alanina aminotransferasa se pueden explicar por el sobrepeso y la obesidad.11 Los hábitos alimentarios son un factor importante en el desarrollo de EHNA, incluso en pacientes que no son obesos, y así, de los indicadores que acompañan con más frecuencia el desarrollo de EHNA, son el porcentaje de energía total y el porcentaje total de grasa ingerida, en particular este último, los que se encuentran aumentados hasta en seis veces en los enfermos con EHNA.24 De igual manera se observa que los pacientes con EHNA muestran un consumo más de colesterol por día, así como un consumo menor de grasa poliinsaturada y fibra. Sin duda, estos datos son de gran valor para el desarrollo de estrategias de tipo alimentario que disminuyan la prevalencia de la enfermedad, incluso, en pacientes que no son obesos.24

Si se toman en consideración los factores genéticos y ambientales que

influyen en la historia natural del HGNA, se estima que hasta 0.3% de los pacientes con predisposición genética puede desarrollar cirrosis hepática (Figura 1).

i. Figura 1 . Prevalencia e historia natural del hígado graso no alcohólico. Nótese que el desarrollo

de cirrosis hepática puede esta precedido por la presencia de esteatosis hepática y esteatohepatitis no alcohólica. Como primer factor de riesgo se encuentra la predisposición genética, lo ambiental y lo social. En segundo lugar se mencionan características propias de cada individuo como la obesidad (la que se relaciona con la presencia de esteatosis hepática en 80% de la población de obesos con una prevalencia de 19%), diabetes, dislipidemia y uso de medicamentos, lo que en conjunto se conoce como “primer golpe”. Dentro del segundo golpe se encuentra el daño ocasionado por radicales libres, que se observa con un prevalencia del 3.6 de los sujetos obesos con esteatohepatitis no alcohólica (EHNA). En este último grupo la prevalencia para desarrollar cirrosis es de 0.3%. (Modificado de Bellentani S. et al.26)

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vi. Fisiopatología Todavía no se determina por completo la fisiopatología del HGNA, si se incorporan los múltiples factores que intervienen en su desarrollo. Se conocen cambios muy bien establecidos que desencadenan el daño citopático en estos enfermos, como la acumulación de lípidos dentro de los hepatocitos, de manera principal en forma de triglicéridos.5 Con base en los estudios epidemiológicos se ha observado que los principales factores de riesgo para desarrollar HGNA guardan relación estrecha con el síndrome de resistencia a la insulina, por lo que la respuesta del hígado a este síndrome ha sido determinante para entender esta entidad patológica.24-26

La infiltración grasa del hígado surge como respuesta a una gran variedad de estímulos nocivos que incluyen hipoxia, toxinas, inflamación sistémica, neoplasias malignas, ayuno, deficiencias nutricionales y diversas alteraciones metabólicas.17,18 Aunque el hígado graso es en sí mismo una alteración benigna, puede participar en la progresión de la fibrosis hacia la cirrosis y a la insuficiencia hepática.8 Los efectos de la obesidad y la consecuente infiltración grasa del hígado afectan en forma deletérea la evolución de las hepatopatías crónicas y de las hepatopatías terminales. Ratziu y colaboradores demostraron que los pacientes con cirrosis criptogénica y cirrosis por infección con el virus de hepatitis C que presentan obesidad tienen una calificación de Child más alta que aquéllos con las mismas características pero sin obesidad, e incluso la mortalidad acumulada es mayor para los que presentan obesidad.24 En pacientes con infección con el virus de la hepatitis C, el índice de masa corporal es un predictor independiente tanto de fibrosis como de esteatosis;27 la misma relación se observa en pacientes sin infección por el virus de la hepatitis C.28

Efecto del hipersulinismo

Una de las consecuencias más importantes de la obesidad es el hiperinsulinismo,29 que se considera uno de los principales elementos en el desarrollo del síndrome metabólico.30 Existe una relación directa entre el grado de infiltración grasa del hígado y la sensibilidad a la insulina que es independiente del índice de masa corporal, la distribución de grasa intraabdominal y la obesidad general,31 aunque se reconoce que la obesidad visceral guarda relación con el tamaño y contenido graso del hígado.32 En torno a la distribución de la grasa corporal, la relación cintura/cadera es uno de los factores que más influyen en el incremento del riego relativo de desarrollar esteatosis hepática (OR 3.7).32

Existe una relación clínica directa importante entre el número de componentes del síndrome metabólico y el grado de esteatosis hepática (Cuadro 3). La presencia de cuatro componentes del síndrome metabólico –distribución de grasa corporal, intolerancia a la glucosa, hipertensión y dislipidemia se correlacionan en forma significativa con el grado de infiltración grasa del hígado. Los efectos del síndrome metabólico influyen no sólo en el grado de esteatosis, ya que el grado de fibrosis hepática muestra una correlación directa con la concentración de glucosa en ayunas, la relación cintura/cadera, el índice de masa corporal y la presencia de diabetes mellitus. De hecho, uno de los predictores más importantes del desarrollo de cirrosis hepática en pacientes obesas es la presencia de diabetes.17

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iii. Cuadro 3. Grado de esteatosis promedio y número de componentes del síndrome

metabólico en 371 mujeres obesas*

Núm. de componentes N Grados de esteatosis

0 81 1.1 ± 0.90

1 142 1.39 ± 0.97

2 111 1.72 ± 0.95

3 37 2.19 ± 0.95

*Modificado de Marceau et al.17

Estres oxidativo

Diversos mecanismos han sido propuestos para explicar el daño del hepatocito en los pacientes obesos, los cuales se han postulado como mecanismos adaptativos ante el incremento en la capacidad de oxidación de sustratos, con el consecuente aumento en el transporte de electrones en modelos animales obesos, lo que induce una concentración local creciente de las especies reactivas de oxígeno.33 Estas adaptaciones al estrés crónico incluyen la inhibición del gen de la ciclina D-1, activación aumentada del transductor de señal y del activador de la transcripción 3 (Stat-3, por sus siglas en inglés), agotamiento del ATP hepático e inhibición de los estados replicativos del ciclo celular. 34 En pacientes con EHNA y diabetes se constatan cambios en el funcionamiento de la mitocondria, alteraciones estructurales secundarias al aumento en la liberación de ácidos grasos libres, así como una β-oxidación de los ácidos grasos más activa que favorece la formación de radicales libres.35

Junto a este aumento en la producción de especies reactivas del oxígeno, en modelos animales se demuestra que el hígado de los animales obesos es mucho más sensible a los estímulos nocivos, en especial en la respuesta al factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) y a las endotoxinas. De manera adicional existen alteraciones inmunitarias que pueden influir en el desarrollo de fibrosis, en particular se comprueba disminución de los fagocitos en las zonas 1 y 2 de los ácinos hepáticos de ratas obesas. Los mecanismos moleculares que intervienen en esta sensibilización no están claros del todo; sin embargo, la sobreexpresión del interferón gamma (IFN-γ) ante la exposición de lipopolisacáridos parece ser uno de los mecanismos más importantes.36

El metabolismo de los ácidos grasos libres muestra ciertas peculiaridades que influyen en el desarrollo de resistencia a la insulina y se reflejan en las alteraciones hepáticas que condicionan el desarrollo de HGNA. Es de amplia aceptación que la mayor disponibilidad y utilización de los ácidos grasos libres contribuye al desarrollo de resistencia a la insulina en el músculo esquelético; además, se ha observado que los ácidos grasos libres estimulan la producción endógena de glucosa y se les ha documentado diversos mecanismos de toxicidad

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directa e indirecta que en conjunto pueden influir en el daño ocasionado en el HGNA (Cuadro 4).12

iv. Cuadro 4. Mecanismos de toxicidad de los ácidos grasos libres*

• Alteraciones estructurales de membrana (efecto detergente) a altas concentraciones

• Inhibición de la ATP-asa de Na+/K+ • Inhibición de la glucósis • Desacoplamiento de la β-oxidación mitocondrial • Disfunción mitocondrial generalizada • Activación sostenida de los receptores alfa activados por el

proliferador del peroxisoma • Activación aberrante de receptores nucleares • Genotoxicidad de los aldehídos reactivos derivados de la

peroxidación de lípidos. • Formación de ácidos grasos tóxicos ésteres de etilo • ¿Activación de la cinasa de proteína mitógenia activada?

* Modificado de Neuschwander et al.12

Los efectos de los ácidos grasos libres también incluyen cambios en la producción de factores transportadores de proteínas y factores de transcripción determinantes del funcionamiento, en especial se observa una regulación a la baja en el casete transportador A1 unido a ATP (ABCA1, por sus siglas en inglés) debido a la supresión o inhibición del factor de transcripción nuclear del receptor X alfa del hígado (LXRα, por sus siglas en inglés), inhibición que se suscita tanto a nivel transcripcional como postranscripcional. 37,38

Además de los efectos adversos de las altas concentraciones de ácidos grasos libres, otros de los mecanismos que intervienen en el síndrome de resistencia a la insulina son los que se relacionan con el gen Rad (ras asociado con la diabetes, por sus siglas en inglés), el cual interfiere con funciones celulares esenciales (crecimiento, diferenciación, transporte vesicular y transducción de señales); PC-1 (una glucoproteína de membrana que participa en la resistencia a la insulina), la cual reduce la actividad de la cinasa de tirosina inducida por la insulina; leptina, que induce la desfosforilación del sustrato 1 del receptor de insulina, 5,16 sustrato que promueve la translocación de la proteína transportadora de glucosa GLUT-4,12 un factor de crecimiento del hepatocito, con lo que se eleva hasta 300 veces por encima de sus valores habituales.39 El factor de crecimiento de los hepatocitos juega un papel importante en la actividad regenerativa del hígado, pero sus efectos metabólicos son especialmente destacados en el metabolismo de los carbohidratos. En estudios que se realizaron con hepatocitos de rata cultivados, el factor de crecimiento de los hepatocitos inhibió la utilización

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de glucógeno que promueve la insulina, además de favorecer la inhibición de la glucogenogénesis al disminuir la actividad de la sintetasa de glucógeno e incrementar la de la fosforilasa de glucógeno.40

Citocinas y TNF- α

La sensibilidad a la insulina también es regulada por otros mediadores peptídicos. El tejido adiposo, y en especial la grasa mesentérica ya que su flujo venoso se dirige de manera directa al hígado, es una fuente importante de citocinas y hormonas peptídicas que regulan a la baja la actividad metabólica. Uno de sus representantes más conspicuos es el TNF- α, el cual proviene sobre todo del tejido adiposo en ausencia de infecciones activas o alteraciones inflamatorias. Cabe agregar que en condiciones normales los valores circulantes del TNF- α son un correlato del volumen de grasa corporal.41 En modelos experimentales de ratones con resistencia a la insulina e HGNA se observa un estado de inflamación crónica que se caracteriza por los valores elevados de TNF- α.41

Empero, la resistencia a la insulina de los pacientes con HGNA es independiente de la presencia de diabetes, obesidad y dislipidemia, 42 lo cual indica que si bien comparten características y mecanismos fisiopatológicos similares, existen diferencias intrínsecas importantes.43

Todo parece indicar que la inflamación regula en forma importante la resistencia a la insulina, sobre todo al activar al factor de transcripción nuclear κB, encargado de regular la expresión de citocinas proinflamatorias como el TNF- α y la IL-8. 43 Otro dato que apoya la importancia de las citocinas proinflamatorias en el HGNA es el hecho de que el metronidazol y la polimixina pueden prevenir el desarrollo de HGNA en pacientes obesos con cirugía intestinal derivativa44 que reciben nutrición parenteral, lo que pone de relieve el papel que desempeñan las citocinas/endotoxinas en el desarrollo del HGNA.

Se dispone de diversos modelos animales para el estudio del HGNA, y todos desarrollan resistencia a la insulina por diferentes vías. Sobre esta base, se pueden introducir modificaciones genéticas (o no) en los diferentes modelos animales con el fin de producir esteatosis, y aunque el desenlace final de todos estos modelos es el desarrollo de esteatosis y en menor o mayor grado fibrosis, los mecanismos subyacentes no parecen ser iguales en todos los casos, algo a tener en cuenta al considerar datos fisiopatológicos y terapéuticos derivados de los mismos (Cuadro 5).45

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v. Cuadro 5. Clasificación de los métodos animales para el estudio de esteatosis agrupados por el mecanismo predominantea

• Aumento en la “incorporación de grasa” (incremento en la síntesis o en la captación). • Ratones con modificaciones genéticas con incremento de la lipogénesis hepática.

PEPCK-n-SREBP-1α Ap2-n-SREBP-1c A-bZIP/F C/EBPα KO adiposo-específico aP2 de la toxina de la difteria Stat 5B KO Sobreexpresión de IGF-II específico de las células β

• Ratas o ratones sin modificaciones artificiales pero con mutaciones naturales que incrementan la lipogénesis hepática.

ob/ob db/db fa/fa KKAy

• Ratas o ratones normales con entornos que inducen incrementos en la lipogénesis hepática.

Dietas altas en sucrosa Dietas altas en fructosa Dietas altas en grasa

Dietas deficientes en arginina Dietas altas en grasas / dietas altas en sucrosa ± infección vírica. Tratamiento con fragmentos urinarios de pacientes con lipodistrofia congénita generalizada. Ingesta crónica de alcohol.

• Disminución de la eliminación hepática de “salida” • Ratones con eliminación específica de genes que regulan la oxidación de ácidos

grasos. PPAR- α KO AOX KO KO aromatasa (femeninos)

• Ratones sin modificaciones artificiales pero con mutaciones que inhiben la oxidación de ácidos grasos.

Esteatosis visceral juvenil • Ratones o ratas sin modificaciones artificiales con entornos que inhiben la oxidación de

ácidos grasos. • Dietas deficientes en metionina/colina. • Tratamiento con antagonistas de estrógenos • Tratamiento con glucocorticoides • Tratamiento con etomoxir

* IGF: factor de crecimiento similar a la insulina * Modificado de Cotéis et al. 46

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Teoría de los dos golpes metabólicos Durante la historia natural de la esteatohepatitis no alcohólica, se

diferencian dos momentos determinantes en la evolución del HGNA. La teoría de la agresión múltiple postula dos agresiones (Figura 1); la primera surge a partir del incremento del tejido adiposo, que ocasiona una elevación de los ácidos grasos libres y la infiltración grasa del hígado (esteatosis).

Este cambio estructural sensibiliza al hígado al estímulo de los metabolitos del estrés oxidativo con la consiguiente necrosis e inducción de apoptosis. De manera paralela se observa un incremento en la expresión del TNF- α que favorece la apoptosis, quimiotaxis y activación de las células estelares. Se produce asimismo un mayor requerimiento de energía por la alteración funcional y morfológica de las mitocondrias, lo que motiva la transformación de la esteatosis en esteatohepatitis (segunda agresión).26

vii. Tratamiento Tomando en cuenta los diferentes procesos fisiopatológicos que intervienen en el desarrollo y progresión del HGNA, las modalidades terapéuticas comparten esta misma diversidad con resultados distintos. Las estrategias de tratamiento comparten aspectos primordiales, como contrarrestar los efectos del síndrome de resistencia a la insulina, para cuyo logro se recurre a medios que abordan diferentes disciplinas (Figura 2).

Ejercicio

Metformín Peso Glitazona

Sensibilidad a la insulina

EHNA HGNA

Tratamiento

Vitamina C Vitamina E N-acetilcisteína Hipolipemiantes y betaína

Resistencia a la insulina

Citosinas TNT-α

Peroxidación Daño por Daño por Acidos radicales libres oxígeno grasos

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i. Figura 2. Mecanismos patógenos y terapéuticos en el HGNA. El ejercicio y la disminución

gradual de peso mejoran la sensibilidad a la insulina de manera considerable. La inflamación y las citocinas proinflamatorias juegan un papel importante en el desarrollo de resistencia a la insulina. Diversas estrategias terapéuticas han demostrado eficacia en la disminución de estas citocinas y en consecuencia en la sensibilización a la acción de la insulina, en particular con el uso de glitazonas y metformín. El empleo de antioxidantes como la vitamina E disminuye la peroxidación de los lipidos de membrana y disminuye la activación de las células estelares, mientras que el uso de vitamina C disminuye el daño que ocasionan los radicales libres. El efecto principal de N-acetilcisteína consiste en inhibir la acción de las especies reactivas de oxígeno. Tanto la betaína como los agentes hipolipemiantes disminuyen la cantidad de triglicéridos en el hepatocito, con lo cual reducen los ácidos grasos disponibles y limitan la disfunción de la mitocondria que su sobreexpresión induce.

Otro elemento a considerar en el tratamiento del HGNA es la divergencia en la respuesta terapéutica entre los modelos experimental, animal y humano, los cuales no siempre guardan una adecuada concordancia.

De manera típica, el tratamiento de los pacientes con HGNA se enfoca en controlar las anomalías asociadas, como obesidad, diabetes mellitus y dislipidemia. 1. Reducción de peso La reducción del peso mejora la sensibilidad a la insulina, 46,47 por lo que un programa de reducción del peso forma parte del tratamiento del HGNA porque resulta de ayuda. Se dispone de varios estudios publicados48-56 donde se demuestran los resultados del control del peso por medio de la dieta. Dichos estudios adolecen de diversas deficiencias metodológicas, lo que limita la contundencia de los efectos del control dietético en el HGNA que en esos estudios se pone de manifiesto. Hasta este momento, está demostrado que el control dietético mejora las variables bioquímicas de los enfermos con HGNA, aunque no fue posible confirmar en todos los casos si dicha mejora bioquímica tiene un correlato morfológico en la biopsia hepática. Los cambios histológicos se vuelven más evidentes después de una disminución del peso de 11 a 20 kg durante un año.49 Es notable cómo en casos de disminución abrupta del peso es dable observar mejoría histológica sin variación de los marcadores bioquímicos.51 Los cambios bioquímicos e histológicos se consiguen sólo en condiciones controladas en las que el manejo dietético se basa en dietas muy bajas en calorías (500 calorías/día). Sin embargo, se requiere al menos una disminución de 10% del peso corporal para conseguir modificaciones en las variables bioquímicas.54 En la actualidad se considera que una pérdida gradual del peso constituye el primer paso (y uno de los más útiles) en el manejo de los pacientes con esteatosis sin complicaciones.55,57 Se debe tener especial consideración con respecto a la disminución gradual del peso, ya que hasta una quinta parte de los pacientes, en particular aquéllos con una disminución del peso pronunciada y acelerada, desarrolla fibrosis e inflamación portal.52 Un incremento en los niveles circulantes de ácidos grasos libres derivados de la movilización del tejido adiposo puede causar esta respuesta paradójica. En consecuencia, aumenta su concentración intrahepática, lo cual favorece el estrés oxidativo, la peroxidación de lípidos y la liberación de citocinas, todos ellos factores que acentúan el daño hepático.

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Por lo anterior, se recomienda que el objetivo inicial del control del peso sea una pérdida del 10% en un periodo de seis meses, es decir, una pérdida aproximada de 450 a 900 g por semana.58 En los pacientes con HGNA pero sin obesidad se debe hacer mayor énfasis en el cambio de los componentes de la dieta y no tanto en la reducción de la ingesta calórica, además de favorecer la actividad física.46 Al parecer, estos pacientes se han de vislumbrar como candidatos a la terapia farmacológica. En el caso de los enfermos con HGNA, diabetes mellitus y/o dislipidemia, la primera medida terapéutica consiste en lograr un adecuado control del peso, y esto se debe a que no siempre el buen control de la glucemia y los lípidos va seguido de una mejoría en la condición hepática.57

2. Otros tratamientos El uso de agentes sensibilizadores de la acción de la insulina es una de las estrategias que pareciera ser más eficaz desde el punto de vista fisiopatológico. El empleo de tiazolidinedionas en estudios pilotos de un año de duración muestra resultados positivos, con una adecuada tolerancia al tratamiento. No obstante, estos resultados deben reproducirse en grandes estudios poblacionales controlados con placebo y con un adecuado seguimiento para que sea posible determinar su seguridad en pacientes con HGNA.57 El uso de rosiglitazona disminuye las concentraciones de enzimas hepáticas en forma paralela a la reducción de la resistencia a la insulina.59 Otro de los sensibilizadores de la insulina es el metformín, el que en modelos animales produjo reducción de la hepatomegalia y el grado de esteatosis, así como normalización de los valores circulantes de las aminotransferasas,60 de manera similar a lo que se observa en humanos.61

El uso de diversos antioxidantes ha mostrado cierta utilidad en el tratamiento del HGNA, un grupo de fármacos dentro del que se incluyen la vitamina E, la vitamina C, betaína, N-acetilcisteína y reducción del hierro.57 La vitamina E es un potente antioxidante de particular valía en el tratamiento de la peroxidación de lípidos de la membrana y para prevenir la activación de las células estelares.62 Las dosis de entre 400 y 1,200 UI/día mejoran los valores bioquímicos de la función hepática y de marcadores de inflamación como el factor transformador del crecimiento β.63 El empleo simultáneo de vitaminas D y C produce mejores resultados que el placebo.64

La betaína es un componente normal del ciclo metabólico de la metionina que induce un aumento en los niveles de S-adenosilmetionina; con ello ejerce un efecto protector sobre el hígado contra el daño que causan los triglicéridos que produce la ingesta de alcohol. 65 Su uso a largo plazo determina la disminución de los valores de las enzimas hepáticas, pero no regresión o detención del daño histológico.66

El uso de N-acetilcisteína también produce mejoría significativa en los valores de las aminotransferasas. Como precursora del glutatión, la N-acetilcisteína incrementa los valores de este compuesto en el hepatocito, lo que limita el daño que ocasionan las especies reactivas de oxígeno a dicho nivel y por ende se la considera un agente protector contra el estrés oxidativo.67 El uso de agentes hipolipemiantes (como el clofibrato, que disminuye la concentración de

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triglicéridos hepáticos inducida por el consumo de alcohol) ha mostrado resultados contradictorios en los pacientes con HGNA.68

El ácido ursodesoxicólico es un epímero del ácido quenodesoxicólico y debido al reemplazo que llevan a cabo los ácidos biliares endógenos posee propiedades hepatoprotectoras que se derivan de la disminución de ácidos biliares hidrófobos que origina, además de disminuir la lesión hepatocítica que determina el estrés oxidativo en los pacientes con HGNA. También está comprobado que disminuye la producción de TNF- α.69 El uso de ácido ursodesoxicólico produce mejoría significativa en la concentración de aminotransferasas cuando se utiliza por periodos no menores de 12 meses.70 No obstante, dicha mejoría bioquímica continúa mostrando su importancia cuando se la compara con los valores que se encuentran en la sangre de pacientes que sólo reciben tratamiento con dieta.71,72 En fecha reciente, el grupo de los autores comprobó una mejoría bioquímica y del grado de esteatosis medida por ultrasonido en pacientes en quienes usaron ácido ursodesoxicólico comparados con pacientes en quienes el tratamiento consistió sólo en dieta a mediano plazo.72

viii. Adiponectina, estructura, función e implicaci ones fisiopatológicas en el

hígado graso no alcohólico 1. Estructura de la adiponectina La adiponectina consta de un dominio del carboxilo terminal globular y de un dominio del amino terminal colagenoso;73,74 el dominio globular guarda homología con los dominios respectivos de las colágenas VIII y X. La adiponectina pertenece a la familia del complemento 1q, conocido por formar multímeros caracterís-ticos.75-77 los estudios de filtración en gel y de gradientes de velocidad revelan que la adiponectina sérica circula como especies de diferente peso molecular.78 Pajvani et al.79 demostraron que la adiponectina existe en dos diferentes complejos en el suero, uno de ellos un hexámero [de peso molecular bajo (PMB), ~180 kDa] y el otro un complejo de 12 a 18 subunidades [de peso molecular alto (PMA), 400 kDa]. Los datos experimentales indican que el disulfuro se enlaza con todos los monómeros de adiponectina. La formación del enlace de disulfuro depende de la cisteína-39 de la región variable del amino terminal como molécula necesaria. Los polimorfismos de nucléotidos únicos (G84R, G90S, Y111H y I164T) modifican la formación de este enlace del disulfuro, y pueden alterar la capacidad de la adiponectina de formar multímeros mayores que un trímero, con lo cual se afecta su actividad biológica.78 Un reciente estudio controversial de Tsao et al.80

sugiere que la mayor parte de la adiponectina sérica circula bajo la forma de PMA (> 80%) mientras que el resto lo hace bajo las formas hexamérica (< 10%) y trimérica (< 10%). Otros aspectos importantes sobre la estructura de la adiponectina se refieren a las modificaciones postranscripcionales, en particular a la hidroxilisil-hidroxilación de cuatro residuos de lisina en el domino colagenoso (K68, K71, K80 y K104) que resulta crítica para su actividad sensibilizante a la insulina con respecto a la inhibición de la producción de glucosa por el hígado.81

Wong et al 77 describieron una familia de proteínas con gran homología con la adiponectina que designaron como CTRP1-7, la cual exhibe estructura y

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propiedades biológicas similares; sin embargo, la importancia fisiológica de estas proteínas se desconoce. 2. Receptores de adiponectina Hay dos receptores de adiponectina distintos (AdipoR1 y AdipoR2). El AdipoR1 humano y de ratones es idéntico en un 96.8% y el AdipoR2 humano y de ratones es idéntico en un 95.2%. El AdipoR1 se localiza en el cromosoma 1p36.13-q41, mientras que el AdipoR2 se localiza en el cromosoma 12p13.31.82,83 El AdipoR1 codifica una proteína de 375 aminoácidos con una masa molecular pronosticada de 42.4 kDa, mientras que el AdipoR2 codifica una proteína de 311 aminoácidos con una masa molecular pronosticada de 35.4 kDa. Ambos receptores están relacionados estructuralmente, con una similitud de 66.7%.84 Ambos usan la cinasa de AMP como segundo mensajero, pero no parece que se acople a la proteína G. El AdipoR2 también activa al receptor alfa activado por el proliferador del peroxisoma (PPAR-α, por sus siglas en inglés) y a la cinasa de proteína activada por el mitógeno p38 (p38-MAPK, por sus siglas en inglés). El AdipoR1 tiene mayor expresión en el músculo esquelético, mientras que el AdipoR2 es más abundante en hígado.85 (Figura 3).

i. Figura 3. Estructura propuesta de los receptores de adiponectina con su región conservada (números oscuros) y

dominios transmembrana (números claros).

AdipoR1 y AdipoR2 son receptores con siete dominios transmembrana, con

un dominio N-terminal interno y otro C-terminal externo (Figura 3). El análisis Scatchard plot revela que hay dos sitios de unión para la adiponectina globular: los sitios de unión de alta afinidad (constante de disociación (Kd) ≈ 0.06 µg/ml-1, equivalente a 1.14 nM del trímero de adiponectina globular) y los sitios de unión de afinidad intermedia (Kd ≈ 0.80 µg/ml-1, equivalente a 14.4 nM del trímero de adiponectina globular). En contraste, hay sitios de unión de afinidad intermedia (valor Kd ≈ 6.7 µg/ml-1, equivalente a 49.1 nM del hexámero de adiponectina de longitud total) y de afinidad baja para la adiponectina de longitud total (valor Kd de aproximadamente 329.9 µg/ml-1, equivalente a 2,415 nM del hexámero de adiponectina de longitud total).84

358 294 Extracelular

119 55

NH2 72 Intracelular

356 292

NH2 136

COOH COOH

AdipoR1 AdipoR2

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3. Modo de acción de la adiponectina El AdipoR1 presenta una gran afinidad por la adiponectina globular y una baja afinidad por la adiponectina de longitud total. En contraste, el AdipoR2 muestra una afinidad intermedia por ambos tipos de adiponectina, de las cuales la de longitud total podría ser la determinante de sus efectos en el hígado.84

Los estudios in vitro en hepatocitos, rabdomiocitos y adipocitos muestran que la activación de la AMPK es necesaria en los efectos de señalamiento de la adiponectina.86-88 La activación de la AMPK puede constituir un mecanismo común a través del cual las adipocitocinas incrementan la sensibilidad a la insulina. 89,90 Al respecto, y como dato de interés, una vía de señalamiento mediada por la AMPK ha sido implicada en el mecanismo de acción del metformín y las tiazolidinedionas. 91-93

La adiponectina estimula la oxidación de ácidos grasos, la captación de glucosa y la producción de lactato en los rabdomiocitos. En el hígado, estimula la oxidación de ácidos grasos y reduce la gluconeogénesis, lo cual puede tener relación con la disminución aguda de la glucosa que causa la adiponectina in vivo.88 El efecto sobre la sensibilidad hepática a la insulina puede explicarse en forma parcial por la regulación a la baja de los genes objetivo PPAR-α, como CD36, oxidasa de acilcoenzima A y el desacople de la proteína 2, todo lo cual indica una posible activación de PPAR- α por parte de adiponectina.94 En realidad, la adiponectina misma ha sido descrita como un gen objetivo PPAR-γ.95

Los efectos sensibilizantes a la insulina de adiponectina se acompañan de propiedades antiinflamatorias. La adiponectina de longitud total inhibe la expresión de numerosas moléculas de adhesión sobre la superficie de las células endoteliales como la molécula 1 de adhesión de la célula vascular, selectina E y la molécula 1 de adhesión intercelular, todas éstas inducidas por el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α).96 Esta misma adiponectina de longitud total suprime también los cambios inflamatorios que induce TNF- α en las células endoteliales al bloquear la activación del factor nuclear κB, sin afectar la activación mediada por TNF- α de la cinasa N-terminal c-Jun, p38 y la cinasa de proteína B (Akt).97 De manera adicional, los efectos antiinflamatorios de adiponectina incluyen suprimir la formación de colonias de leucocitos, reducir la actividad fagocítica y disminuir la secreción de TNF- α por los macrófagos.74,98 Kumada et al.99 demostraron que adiponectina regula a la alza con la mayor rapidez a IL-10 y que incrementa selectivamente la expresión de los inhibidores tisulares de las metaloproteinasas 1 en el ámbito del mRNA y las proteínas, mientras en los macrófagos derivados de monocitos humanos no se modifican el mRNA, los niveles de proteínas ni las actividades de MMP-9, lo cual parece indicar que adiponectina puede modular la respuesta inflamatoria por medio de IL-10. Para finalizar, adiponectina puede participar en la angiogénesis por medio de su capacidad para estimular los señalamientos dependientes de AMPK, los cuales pueden conducir a la síntesis del factor angiógeno en el músculo esquelético88,84,86,100-104 y a la angiogénesis inducida por hipoxia,105 así como a respuestas celulares antiapoptósicas en las células endoteliales.106

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4. Obesidad y resistencia a la insulina Hay adiponectina abundante en la circulación con concentraciones entre 2 y 20 mg/ml, que representan hasta 0.05% de las proteínas séricas totales.107-108 Los valores de adiponectina sérica son más bajos en los sujetos obesos si se comparan con los de los sujetos delgados,108-110 aunque en un estudio no se estableció dicha diferencia.111 La adiposidad visceral ha mostrado ser un predictor negativo independiente de los valores séricos de adiponectina112 y tanto la expresión del mRNA de adiponectina adiposo como los valores plasmáticos de adiponectina están disminuidos en la mayoría de los modelos experimentales de obesidad.94,113 Los estudios longitudinales en primates sugieren que la adiponectina disminuye con la ganancia de peso114 y los estudios en pacientes que se sometieron a cirugía bariátrica (pérdida > 20% del peso corporal) muestran un aumento significativo en los niveles circulantes de adiponectina 6 a 12 meses después de la operación.115-117 Aunque Hoffstedt et al.111 no encontraron diferencias en la concentración de adiponectina sérica entre sujetos obesos y quienes no lo eran, mostraron que la tasa de secreción de adiponectina por el tejido celular subcutáneo era menor en los sujetos obesos al compararlos con los no obesos. El TNF- α se expresa a niveles más altos en el tejido adiposo de los pacientes obesos que en el de los controles saludables, y se ha visto que debilita la sensibilidad a la insulina tanto in vivo como in vitro.118-121 Varios autores sostienen la hipótesis de que los niveles aumentados de TNF- α en el tejido adiposo de los sujetos obesos regula a la baja la producción de adiponectina (Figura 4).122

i. Figura 4. Relación entre fenómenos asociados con el hígado graso no alcohólico. La resistencia a la insulina, una marca de la enfermedad haya o no sobrepeso u obesidad, junto al estado de inflamación crónica de bajo grado (local y sistémica) guardan una relación inversa con los valores de adiponectina séricos

Inflamación

Adiponectina sérica

E s t e a t o s i s C i r r o s i s

Hígado graso no alcohólico

R e s i s t e n c i a a la i n s u l i n a

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Numerosos estudios sostienen la hipótesis de que la adiponectina funciona como un sensibilizador de la insulina.

En un estudio, 123 los sujetos obesos sensibles a la insulina mostraron

niveles de adiponectina más altos que los sujetos obesos con resistencia a la insulina, a pesar de que el peso y el IMC eran iguales en ambos grupos. En forma similar, los valores de adiponectina en sujetos sensibles a la insulina que no eran obesos fueron más elevados que los encontrados en otros sujetos no obesos pero que se clasificaron como resistentes a la insulina. En consecuencia, la concentración de adiponectina ha demostrado ser un indicador del estado de resistencia a la insulina.

Hay una fuerte relación estadística inversa entre adiponectina y diabetes.

Esta relación se apoya en estudios genéticos en los que la identificación de polimorfismos que resultan en hipoadiponectinemia se vincula con resistencia a la insulina y el análisis de enlace ha identificado al gen 3q27 codificador de la adiponectina como un locus susceptible para el síndrome metabólico y la diabetes.124 Además, estudios recientes muestran que la hipoadiponectinemia predice el riesgo de desarrollar diabetes tipo 2, más allá de que falten otros indicadores de resistencia a la insulina. 125,126

5. Implicaciones fisiopatológicas en el hígado gras o no alcohólico Xu et al.127 demostraron que la adiponectina disminuye el contenido hepático de grasa en ratones. Ellos administraron adiponectina a ratones con hepatopatías por grasa con lo cual aliviaron tanto la esteatosis como la hepatomegalia, efectos que se atribuyeron en parte a una mejoría en la oxidación de los ácidos grasos así como a una reducción en la síntesis de éstos, ambos en el ámbito del hígado. El incremento en la oxidación hepática de lípidos que induce adiponectina puede también desempeñar un papel en el efecto benéfico que la misma ejerce en el metabolismo hepático de la glucosa. De manera adicional, con un grupo de colaboradores demostraron que los valores altos de adiponectina protegen contra el hígado graso no alcohólico en humanos (Figura 5),128 pero Bugianesi et al.129 no encontraron una correlación con la actividad necroinflamatoria. Con el recurso de métodos no invasivos para determinar el contenido de lípidos intramiocelular y hepático, Maeda et al.130 mostraron que los valores de adiponectina séricos guardaban una relación inversa con el contenido de grasa hepático, pero no se observaba ninguna relación con el contenido de grasa intramiocelular.

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i. Figura 5. Concentraciones de adiponectina sérica de acuerdo con la gravedad de la HS.73

Vuppalanchi et al.131 hicieron evidente que los pacientes con

esteatohepatitis no alcohólica presentan la homeostasis de glucosa posprandial y de lípidos alterada, emitieron la hipótesis de que los valores de adiponectina séricos responden por debajo de lo óptimo a las comidas en los pacientes con esteatohepatitis no alcohólica si se los compara con la respuesta en los controles con obesidad.

Se comprueba una expresión más alta de AdipoR2 en el tejido hepático de los pacientes con esteatohepatitis no alcohólica al compararlos con los que sólo presentan esteatosis simple y el tejido hepático restante normal. Sin embargo, Kaser et al.132 demostraron que el AdipoR2 teñido fue menor en las biopsias de sujetos con esteatohepatitis no alcohólica comparados con las de sujetos con esteatosis simple. Esta expresión regulada a la alza y la densidad disminuida de AdipoR2 en la esteatohepatitis no alcohólica puede explicarse por una desregulación postranscripcional.

21

20

19

18

17

16 15

14

0

20.67

15.82

14.82

ANOVA p = 0.001

Controles HS HS grado 1 grado 2-3

P r o m e d I o d e a d i p o n e c t i n a (µg/mL)

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Estudios experimentales muestran que células estelares en reposo producen la adiponectina y que ello induce la apoptosis mediada por caspasa en células estelares activadas. Estos datos indican que adiponectina puede ocupar un lugar en la terapia antifibrótica de la enfermedad hepática crónica, en particular en la esteatohepatitis no alcohólica.133 Para finalizar, datos recientes permiten comprender mejor la relación entre adiponectina y disfunción hepática e indican que la hormona puede servir como indicador de colestasis134 y efectos pleiotrópicos que incluyen variables funcionales y hemodinámicas de la fisiopatología del hígado.135

6. Planteamiento del problema La epidemia de obesidad en México representa un problema de salud pública con múltiples implicaciones. El aumento de su prevalencia se asocia con un incremento de la mortalidad por hepatopatías crónicas, que representan la cuarta causa de mortalidad general en el país.136 De esas hepatopatías, una de las que presenta mayor prevalencia es el HGNA, enfermedad emergente de gran importancia en el momento actual. La prevalencia en la población general es de alrededor de 15% y se asocia a obesidad y resistencia a la insulina.137-139 Su potencial progresión a esteatohepatitis, cirrosis y hepatocarcinoma alertan a la comunidad médico-científica sobre su importancia y necesidad de evaluación cuidadosa.140, 141 El HGNA es además un cofactor de otras hepatopatías crónicas, como la hepatitis C.141 El HGNA es una enfermedad emergente de gran importancia en el momento actual. Con frecuencia, es una entidad que se relaciona con obesidad y resistencia a la insulina. Como se comenta en párrafos previos, la adiponectina estimula la oxidación de ácidos grasos, captación de glucosa y producción de lactato en los rabdomiocitos. En el hígado, estimula la oxidación de ácidos grasos y reduce la gluconeogénesis.

Por otro lado, la grelina es una hormona peptídica que se produce en el estómago y otros órganos , entre ellos el hígado y la vesícula biliar.142 La grelina estimula la saciedad en el hipotálamo y sus concentraciones séricas se reducen después de la ingesta de alimentos e incrementan durante el ayuno.143 Los pacientes obesos y los pacientes con HGNA presentan hipogrelinemia en relación con su resistencia a la insulina.144,145 Asimismo, acaban de describirse los efectos de la grelina sobre el metabolismo de lípidos en modelos experimentales.146 Tras su administración intravenosa en ratas, la grelina induce el incremento del contenido hepático de triglicéridos al activar la expresión de la carboxilasa de acetil-CoA. Mediante dos estudios, el presente proyecto intenta explicar el efecto protector de la adiponectina y, en un tercero, el papel que juega la grelina en la expresión de la adiponectina y sus receptores en el tejido hepático de pacientes con HGNA.

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VIII. JUSTIFICACION El proyecto servirá para tener un mejor conocimiento de la fisiopatología del HGNA, de los mecanismos moleculares que intervienen y con ello poder prevenir una de las enfermedades hepáticas con mayor incidencia en la población mexicana.

Los resultados de un estudio epidemiológico nacional señalan que la cirrosis criptogénica fue la tercera causa de hepatopatía crónica en México, sólo detrás de las principales causas que son el alcohol y la hepatitis C. Tal como se señala en párrafos anteriores, obesidad y esteatohepatitis no alcohólica guardan na estrecha relación.147 Asimismo, mediante un estudio ecológico, el grupo autoral observó recientemente que las tasas de mortalidad por cirrosis hepática en las cuatro regiones nacionales se asociaron en la última década con la presencia de obesidad.148

Se trata de abordar un problema importante de salud pública con dos estudios de tipo clínico y uno adicional de tipo básico. Es urgente la implementación de programas preventivos eficaces para reducir la incidencia de HGNA, esteatohepatitis no alcohólica y cirrosis criptogénica, así como de otras enfermedades crónico-degenerativas.

i. Hipótesis La adiponectina ejerce un efecto protector contra el desarrollo de esteatosis hepática y su expresión en el hígado, al igual que la de sus receptores, se relaciona con la expresión de grelina.

IX. OBJETIVOS i. Objetivos generales

1) Investigar el efecto protector de la adiponectina en el hígado graso no alcohólico (trabajo No. 1 anexo). 2) Investigar el papel de adiponectina, leptina y síndrome metabólico como elementos predictivos de esteatosis relacionada a la obesidad (trabajo No. 2 anexo). 3) Investigar los mecanismos moleculares mediante los cuales actúa la adiponectina, en particular investigar si se expresa en biopsias hepáticas de pacientes con hígado graso o con esteatohepatitis. 4) Concomitantemente investigar el papel de la grelina sobre la expresión de adiponectina (trabajo No. 3 anexo).

ii. Objetivos específicos 1) Determinar las concentraciones de adiponectina y leptina en pacientes con HGNA y controles. 2) Determinar el papel sobre la esteatosis de las adipocinas en pacientes con HGNA y controles con síndrome metabólico. 3) Determinar el grado de expresión de adiponectina y grelina en pacientes con HGNA y controles en tejido hepático.

X. MATERIAL Y MÉTODOS i. Primer estudio clínico ii. Población y muestra.

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Se condujo un estudio transversal en la unidad de Diagnóstico Clínico de la Fundación Clínica Médica Sur. El hospital proporciona servicios de atención de la salud sobre todo a pacientes de ingresos medios y altos de la ciudad de México y alrededores del área metropolitana. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Fundación Clínica Médica Sur, de conformidad con las normas éticas de la Declaración de Helsinki de 1983, y se obtuvo el consentimiento informado escrito de todos los pacientes antes de ingresar al estudio. La población de la muestra fue integrada a partir de series consecutivas de pacientes asintomáticos que fueron referidos a la unidad de Diagnóstico Clínico por sus compañías como parte de una exigencia anual de sus empleos, no por una enfermedad sintomática. El estudio incluyó 196 individuos que aceptaron participar, de los cuales en 98 se encontró EH (27 mujeres, 71 varones) y 98 fueron controles (37 mujeres y 61 varones sin EH). Los casos con EH y los controles fueron una serie de sujetos asintomáticos consecutivos reclutados en la unidad de Diagnóstico Clínico. Los estudios de ultrasonografía en tiempo real se llevaron a cabo con los sujetos en ayunas. Se utilizó un transductor de 3.5 MHz para obtener las imágenes siguientes: vista sagital del lóbulo hepático derecho y el riñón derecho, vista transversa del segmento lateral izquierdo del hígado y el bazo, vista transversa del hígado y el páncreas y cualquier área focal de ecotextura alterada (Elegra; Siemens Medical Systems, Mountain Grove, CA). La gravedad de la ecogenicidad está graduada como sigue: grado 0, ecogenicidad normal; grado 1, leve, incremento difuso de ecos finos en el parénquima hepático con visualización normal del diafragma y de los límites de los vasos intrahepáticos; grado 2, moderado, incremento difuso de ecos finos con compromiso incipiente de la visualización de los vasos intrahepáticos y del diafragma; grado 3, incremento marcado de ecos finos con visualización deficiente o sin ella de los límites de los vasos intrahepáticos, el diafragma y la parte posterior del lóbulo hepático derecho. Los patrones sonográficos incluyen lo siguiente: 0, homogéneo, normal; 1, nódulos hiperecoicos; 2, múltiples lesiones hiperecoicas confluyentes; 3, nódulos hipoecoicos; 4, áreas irregulares hiperecoicas e hipoecoicas; 5, compromiso difuso. 149 No se encontraron discrepancias entre los resultados de la primera y la segunda evaluación. En la segunda evaluación, todos los estudios de cada sujeto fueron revisados por un especialista ajeno al estudio. 1. Cuestionario sobre los antecedentes dietéticos Los participantes llenaron un cuestionario de frecuencia de la alimentación especificando las medidas de las porciones habituales. El cuestionario incluyó preguntas sobre la frecuencia y marca de los suplementos multivitamínicos o de vitaminas individuales. Las respuestas se escanearon de manera subsecuente y en forma electrónica y el consumo diario de varios nutrimentos se determinó mediante el software SNUT, un programa desarrollado por el Instituto Nacional de Salud Pública, en la ciudad de México, 150 apropiado para la población mexicana con el propósito de estimar el consumo dietético de energía; proteínas; carbohidratos; grasa total, saturada, poliinsaturada y monoinsaturada; vitaminas; minerales, y antioxidantes.

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2. Exploración física Se midió el peso corporal, con ropa ligera y sin calzado, en los 0.10 kg más cercanos. La estatura se midió hasta los 0.5 cm más cercanos. El IMC se calculó con el peso (kg) dividido por la estatura al cuadrado (m2). El perímetro de la cintura se midió en el punto medio entre el borde inferior de la caja torácica y el borde superior de la cresta iliaca hasta el 0.1 cm más cercano, y el perímetro de la cadera se midió en forma similar en el punto más sobresaliente entre la cadera y los glúteos. El porcentaje de grasa corporal se midió por impedancia bioeléctrica (analizador de grasa corporal Omron modelo HBF-306INT). 3. Procedimientos analíticos Los valores de insulina se midieron mediante un ensayo inmunoenzimométrico (MEIA; Abbott Diagnostics), con coeficientes de variación interensayo e intraensayo menores de 3 por ciento.

La glucosa plasmática en el estado de ayuno se midió en duplicado con un analizador automatizado. El coeficiente de variación para una medición simple fue 1.5%. Las concentraciones de colesterol, colesterol HDL y triglicéridos se midieron por métodos colorimétricos enzimáticos, por medio de los ensayos CHOL, HDL-cholesterol plus (de segunda generación) y TG (Roche Diagnostics Co., Indianapolis, IN), respectivamente. La concentración de LDL se calculó mediante la fórmula de Friedewald.151

La valoración de la resistencia a la insulina (RI) se llevó a cabo con el Homeostasis Model Assessment (HOMA-IR). La resistencia a la insulina fue valorada por medio del HOMA-IR que describieron en forma original Matthews et al.152 El HOMA-IR fue calculado usando la fórmula siguiente: HOMA-IR = insulina en ayunas µU/mL) x glucosa en ayunas (mmol/L)/22.5; valores > 2.522 indican un índice alto de RI. Los valores de leptina y adiponectina plasmáticos se determinaron por radioinmunoensayo con equipos RIA (Linco Research, St. Charles, MO, USA). Los coeficientes de variación intraensayo e interensayo fueron menores de 5 por ciento. 4. Análisis estadístico El Promedio ± DE fue usado para describir las distribuciones de las variables continuas y para ello se recurrió a la comparación de casos con controles. Se aplicó la prueba no paramétrica U de Mann-Whitney para comparar estas variables a causa de la distribución anormal de algunas variables. Las distribuciones de adiponectina y leptina, acordada en cuartiles, se compararon entre casos (por grado EH) y controles. Se recurrió a la prueba χ2 para tendencias lineales para probar la correlación dosis-respuesta. Se practicó el análisis de regresión logística para probar la distribución de la adiponectina por cuartiles como un efecto protector principal ante la probabilidad de EH, con control de confusores potenciales. Se derivó la razón de momios (OR, por sus siglas en inglés) para el coeficiente de regresión exponencial y se calcularon los intervalos de confianza [IC] al 95%. Todos los análisis estadísticos se llevaron a cabo con un programa estadístico, SPSS/PC v12.0 (Chicago, IL).

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iii. Segundo estudio clínico 1. Población y muestra Se trata de un estudio transversal llevado a cabo en la unidad de Diagnóstico Clínico de la Fundación Clínica Médica Sur (hospital universitario con subespecialidades). El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Fundación Clínica Médica Sur, de conformidad con las normas éticas de la Declaración de Helsinki de 1983. Se obtuvo el consentimiento informado escrito de todos los participantes antes de que ingresaran al estudio. Los estudios de ultrasonografía, el cuestionario sobre los antecedentes dietéticos, exploración física y procedimientos analíticos se llevaron a cabo tal como se describieron en el primer estudio clínico. La población de la muestra fue integrada a partir de series consecutivas de pacientes asintomáticos que fueron referidos a la unidad de Diagnóstico Clínico por sus compañías como parte de una exigencia anual de sus empleos, no por una enfermedad sintomática. 2. Análisis estadístico Los valores promedio y sus desviaciones estándar (DE) se usaron para describir las distribuciones de las variables continuas en las comparaciones entre los sujetos positivos para esteatosis y los controles. Se aplicó la prueba no paramétrica U de Mann-Whitney porque la distribución de algunas de estas variables no era normal. Las comparaciones de la distribución de adiponectina y leptina entre sujetos positivos para esteatosis y los controles se hicieron por cuartiles. La prueba χ2 para la tendencia lineal se usó para probar la relación dosis-respuesta. El análisis de regresión logística con controles ante confusores potenciales se condujo para probar si el cuartil de adiponectina tiene un efecto principal protector en la determinación de la probabilidad de esteatosis hepática. En forma similar, se desarrolló un modelo para los componentes individuales del síndrome metabólico para probar si este síndrome se relaciona con un riesgo mayor de desarrollar esteatosis hepática. La razón de momios (OR, por sus siglas en inglés) se derivó del coeficiente de regresión exponencial y se calcularon los intervalos de confianza (IC) al 95%. Todos los análisis estadísticos se condujeron por medio del programa estadístico SPSS/PC v12.0 (Chicago, IL, USA).

iv. Tercer estudio clínico 1. Diseño y muestra Se trata de un estudio clínico transversal llevado a cabo en la Unidad de Hígado de la Fundación Clínica Médica Sur, así como el departamento de cirugía del Hospital Manuel Gea González. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Fundación Clínica Médica Sur conforme a la declaración de Helsinski de 1983; asimismo, se obtuvo el consentimiento informado de todos los pacientes antes de su ingreso en el estudio. La muestra la conforma una serie de pacientes consecutivos sin hepatopatía crónica conocida, consumo de alcohol menor de 20 g/semana y con perfil vírico negativo (hepatitis B y C), sometidos a biopsia hepática durante una operación laparoscópica (colecistectomía o funduplicatura Nissen) abdominal.

El cuestionario sobre los antecedentes dietéticos, exploración física y procedimientos analíticos (lípidos, glucosa y resistencia a la insulina) se llevaron a cabo como se describió en el primer estudio clínico.

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2. Métodos analíticos Se obtuvo una muestra sanguínea de todos los participantes mediante venopunción, a la cual se le separó el suero mediante centrifugación. Se efectuaron pruebas para determinar la función hepática en cada muestra, como la aspartato aminotransferas, alanina aminotransferasa, fosfatasa alcalina, gammaglutamil transpeptidasa, bilirrubina total, directa e indirecta, proteínas totales, albúmina, globulinas y tiempo de protrombina. 3. Estudio de biopsias hepáticas Después de su obtención, las muestras fueron separadas en dos fragmentos. El primer fragmento se fijó en parafina para su estudio histopatológico, en el cual se realizaron tinción de hematoxilina-eosina y tinciones especiales de acuerdo con el caso (Masson, azul Prusia, etc.). El segundo fragmento se congeló a -70°C y más tarde se extrajo RNA total con la técnica de un solo paso mediante isotiocianato de guanidina (Trizol Reagent, InvitroGen). Se obtuvo DNA complementario a partir de 1 µg de RNA total (Trascriptor first strand cDNA synthesis kit, Roche), utilizando 60 µM de Random Primer, 20 U de RNAse Inhibitor, 1 mM de cada dNTP y 10 U de transcriptasa. Para la amplificación por reacción en cadena de polimerasa se usaron 2 µL de cDNA, 100 nM de cada sonda y 200 nM de cada oligonucleótido, de acuerdo con el siguiente protocolo: un ciclo de preincubación a 95°C por 10 segundos; 60°C por 30 segundos, 72°C por 1 segundo y un ciclo final de enfriamiento a 4°C por 30 segundos. Las sondas y ol igonucleótidos usados para la amplificación de cada gen se determinaron con el programa ProbeFinder v2.04 (www.roche-applied-science. com). En el Cuadro 6 se muestran las secuencias de oligonucléotidos usadas para cada determinación. Se realizó una cuantificación relativa de cada gen con β-actina como gen de referencia, usando valores “crossing point” para obtener la relación adiponectina/β- actina y grelina/β-actina.

i. Cuadro 6. Secuencias de oligonucleótidos empleadas para el análisis por PCR-RT

Gen Oligonucleótidos

Adiponectina cctggtgagaagggtgagaa anterógrados caccgatgtctcccttagga inversos Grelina tcaggacatcctctgggaag anterógrados cttgtgggcgatcacttgt inversos B-actina attggcaatgagcggtcc anterógrados ggatgccacaggactccat inversos

4. Análisis estadístico Se usaron el promedio y la desviación estándar (DE) para describir la distribución de variables continuas, y se compararon casos y controles. Se aplicó a prueba U

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de Mann-Whitney para comparar entre variables no paramétricas. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el software SPSS v12.0 (Chicago, IL). Se consideraron estadísticamente significativas las diferencias con valor de p < 0.05.

XI. RESULTADOS i. Primer estudio

Se estudiaron 98 casos y 98 controles. Los varones representaron 72.4% de los casos y 62.2% de los controles (p = 0.17). Se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los casos EH y los controles en los valores promedio por edad, variables antropométricas (cintura, cadera, IMC, porcentaje de grasa corporal), RI, enzimas hepáticas (aminotransferasa de alanina, aminotransferasa aspártica y fosfatasa alcalina) y las concentraciones séricas de leptina y adiponectina (Cuadro 7). i. Cuadro 7. Variables antropométricas, metabólicas y bioquímicas de casos y controles

(promedio ± DE)

Variable

Casos (n = 98)

Controles (n = 98) p1

Edad (a)

48.5 (11.3)

44.4 (11.9)

0.012

Peso (kg) 82.1 (12.5) 72.0 (17.4) <0.00012 Estatura (cm) 167.8 (8.9) 168.1 (9.4) 0.96 Cintura (cm) 98.7 (9.1) 85.1 (11.1) <0.00012 Cadera (cm) 107.4 (9.6) 99.6 (6.4) <0.00012 Relación cintura/cadera 0.92 (0.07) 0.85 (0.09) <0.00012 IMC 29.2 (3.7) 24.7 (3.0) <0.00012 Grasa corporal (%) 31.2 (6.7) 26.3 (6.4) <0.00012 Alcohol (g/d) 5.5 (10.9) 4.5 (6.6) 0.95 Cigarrillos (n/d) 3.6 (8.2) 3.6 (9.9) 0.90 Glucosa (mmol/L) 5.86 (2.26) 4.91 (0.59) <0.00012 Insulina (pmol/L) 65.28 (36.8) 36.11 (22.91) <0.00012 Indice HOMA 2.5 (1.9) 1.2 (0.9) <0.00012 Acido úrico (µmol/L) 374.72 (77.32) 333.08 (83.27) 0.0032 Proteína total (g/L) 71 (4) 70 (5) 0.56 Albúmina (g/L) 41(3) 41 (3) 0.39 Bilirrubina total (µmol/L) 17.1 (9.91) 15.56 (6.49) 0.30 Bilirrubina directa (µmol/L) 2.56 (4.27) 2.39 (1.19) 0.39 Bilirrubina indirecta (µmol/L) 14.19 (6.32) 12.99 (6.15) 0.11 ALT (U/L) 32.0 (17.2) 24.6 (7.2) <0.00012 AST (U/L) 42.8 (29.5) 26.6 (14.3) <0.00012 Fosfatasa alcalina (U/L) 69.7 (23.4) 63.9 (20.4) 0.042 Colesterol total (mmol/L) 5.61 (1.08) 5.09 (0.84) <0.00012 Colesterol LDL (mmol/L) 3.57 (0.83) 3.25 (0.74) 0.0032 Colesterol HDL (mmol/L) 0.96 (0.23) 1.06 (0.26) 0.0032 Triglicéridos (mmol/L) 2.56 (2.4) 1.71 (1.31) <0.00012 Leptina (µg/mL) 12.5 (8.5) 9.10 (5.6) 0.006 Adiponectina (µg/mL) 15.3 (9.0) 20.7 (10.8) <0.00012

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En general, los sujetos EH EH fueron los de mayor edad, de mayor peso, IMC, obesidad central, RI, y un perfil aterógeno más acentuado que los controles.Cuando se analizó la dieta, los casos EH manifestaron un patrón con un consumo calórico promedio más grande para todos los macronutrimentos (Cuadro 8). Algunos valores promedio para el consumo de vitaminas también resultaron más altos en los casos de EH que en los controles.

i. xiv. Cuadro 8. Variables dietéticas entre casos y controles (promedio ± DE)

Variable Casos (n = 98)

Controles (n = 98) p1

Calorías (kcal/d)

2 329 (1 143)

1 891 (718)

0.0012

Proteínas (g/d) 80 (45) 68 (24) 0.032 Carbohidratos (g/f) 290 (139) 239 (115) 0.0032 Fructosa (g/d) 36 ( 26) 29 (21) 0.022 Glucosa (g/d) 30 (22) 23 (17) 0.022 Grasa total (g/d) 79 (46) 64 (25) 0.0052 Ácidos grasos saturados (g/d) 27 (18) 21 (9) 0.006 Ácidos grasos monoinsaturados (g/d) 37 (21) 30 (11) 0.006 Ácidos grasos poliinsaturados (g/d) 15 (8) 13 (7) 0.022 Hierro (mg/d) 14 (6) 12 (5) 0.032 Zinc (mg/d) 17 (8) 16 (7) 0.24 Cobre (mg/d) 2 ( 1) 2 (1) 0.55 Manganeso (mg/d) 17 (13) 18 (36) 0.032 Selenio (µg/d) 38 (21) 36 (21) 0.24 Vitamina C (mg/d) 233 (227) 183 (117) 0.042 Caroteno (UI/d) 6 873 (4185) 5 995 (4 818) 0.032 α-Caroteno (µg/d) 415 (347) 348 (450) 0.012 β-Caroteno (µg/d) 3 140 (2054) 2 708 (2045) 0.02 Luteína-xantina (µg/d) 1 608 (1107) 1 624 (1138) 0.89 Vitamina E (µg/d) 8 (4) 8 (4) 0.48 Tocoferol total (mg/d) 24 (12) 20 (10) 0.02 α -Tocoferol (mg/d) 10 (5) 9 (4) 0.022 β -Tocoferol (mg/d) 1 (4) 1 (5) 0.012 γ -Tocoferol (mg/d) 13 (8) 11 (6) 0.06 δ -Tocoferol (mg/d) 2 (2) 2 (1) 0.07 Colesterol (mg/d) 270 (203) 222 (118) 0.09 Alcohol (mg/d) 3 (7) 3 (5) 0.60 Cafeína (mg/d) 166 (206) 116 (171) 0.012

1 Pruebas U de Mann-Whitey 2 Diferencia significativa

Las concentraciones de adiponectina y leptina se dividieron de acuerdo con

una distribución por cuartiles. El Cuadro 9 muestra las diferencias de esa distribución por casos dividida por grados de EH y controles. El gradiente

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observado de dosis-respuesta fue más significativo para adiponectina que para leptina.

ii. Cuadro 9. Distribución por cuartiles (Q) de adiponectina y leptina entre casos (por grado de EH) y controles

Casos (EH) Cuartil de

adiponectina Controles n %

Grado I n %

Grado II n %

Grado III n %

Q1 14 14.3 14 29.2 21 46.7 0 0 Q2 23 23.5 15 31.3 9 20.0 2 40.0 Q3 29 29.6 10 20.8 9 20.0 1 20.0 Q4 32 32.7 9 18.8 6 13.3 2 40.0 Total 98 100 48 100 45 100 5 100 x² para la tendencia lineal = 11.7. p = 0.001

Casos (EH) Cuartil de

Leptina Controles n %

Grado I n %

Grado II n %

Grado III n %

Q1 30 30.6 9 18.8 9 20.0 1 20.0 Q2 25 25.5 15 31.3 8 17.8 1 20.0 Q3 23 23.5 11 22.9 15 33.3 0 0.0 Q4 20 20.4 13 27.1 13 28.9 3 60.0 Total 98 100 48 100 45 100 5 100.0 x² para la tendencia lineal = 4.8. p = 0.03.

Cuando adiponectina se evaluó como el efecto principal en el análisis de regresión logística multivariado, se observó un efecto protector después de aplicar control contra posibles confusores (Cuadro 10). Dicho efecto protector para la EH fue mayor conforme se incrementó el cuartil. En consecuencia, cuando se comparó un paciente del cuartil más alto de adiponectina contra uno del cuartil más inferior (categoría de referencia) hubo una probabilidad 5.9 veces menor (la inversa de un OR de 0.17) de encontrar EH. Por el contrario, los altos valores plasmáticos de leptina parecen incrementar la posibilidad de descubrir EH.

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iii. Cuadro 10. Modelo miltivariado1 obtenido por análisis de regresión logística probando la concentración de adiponectina (por cuartil) como efecto protector principal.

Cuartil OR IC 95 % p

Q1 1

Q2

0.33

0.10 - 1.02

0.05²

Q3

0.24

0.07 - 0.77

0.02²

Q4

0.17

0.04 - 0.67

0.01²

1 Modelo controlado por género (mujer vs. varón), edad (> 45 vs. <45a), leptina (cuartiles), IMC (<25, 25-29.9, >30), consumo de calorías (kca/d), colesterol total (> 240 vs. < 240 mg/dL), colesterol HDL (< 40 vs. > 40 mg/dL), cintura (> 102 cm en varones, > 88 cm en mujeres) e índice HOMA (> 2.5 vs. < 2.5). 2 Diferencias significativas

ii. Segundo estudio Se identificaron 141 pacientes con esteatosis hepática (sujetos positivos para esteatosis), de los cuales 68 tenían esteatosis grado 1, 64 tenían esteatosis grado 2, y 9 tuvieron esteatosis grado 3. Estos pacientes fueron comparados con 111 sujetos saludables. El Cuadro 11 muestra una comparación de las variables continuas (de laboratorio, demográficas y antropométricas) entre los sujetos positivos para esteatosis y los controles.

i. Cuadro 11. Diferencias entre variables continuas entre casos (esteatosis hepática) y controles

Variable Casos (N=141)

Controles (N=109)

Valor p*

Adiponectina (µg/mL)

15.2 ± 8.4

20.6 ± 10.7

<.0001

Lpetina (µg/mL) 12.5 ± 8.6 9.1 ± 5.6 .007 Años (a) 49.9 ± 11.6 44.8 ± 11.6 .004 IMC (kg/m²) 29.0 ± 3.9 24.7 ± 11.6 <.0001 Cintura (cm) 99.5 ± 10.0 85.5 ± 11.5 <.0001 Grasa corporal (%) 30.7 ± 6.4 26.4 ± 6.2 <.0001 Nitrógeno de urea (mg/dL) 13.6 ± 3.2 13.4 ± 3.7 .25 Creatinina (mg/dL) 1.0 ± 0.2 0.9 ± 0.2 .19 Ácido Úrico (mg/dL) 6.2 ± 1.5 5.7 ± 1.4 .001 Insulina (µU/mL) 9.3 ± 5.5 5.2 ± 3.3 <.0001 Glucosa (mg/dL) 108.9 ± 43.7 88.8 ± 10.7 <.0001 HOMA-IR 2.6 ± 1.9 1.2 ± 0.8 <.0001 Proteínas Totales 7.1 ± 0.4 7.0 ± 0.5 .49 Albúmina (g/dL) 4.1 ± 0.3 4.1 ± 0.3 .41 Bilirrubina (mg/dL) 1.0 ± 0.5 0.9 ± 0.4 .33 Directa (mg/dL) 0.2 ± 0.3 0.1 ± 0.1 .02 Indirecta (mg/dL) 0.8 ± 0.4 0.7 ± 0.4 .008 AST (U/L) 32.8 ± 18.1 24.8 ± 7.6 <.0001 ALT (U/L) 44.2 ± 32.7 26.5 ± 13.9 <.0001 Fosfatasa alcalina (U/L) 69.6 ± 23.2 62.9 ±19.9 .01

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Globulina total (g/dL) 2.9 ± 0.4 2.9 ± 0.4 .54 Colesterol (mg/dL) 215.6 ± 42.2 196.9 ± 32.7 <.0001 LDL (mg/dL) 138.1 ± 33.7 125.8 ± 28.6 .001 HDL (mg/dL) 37.4 ± 9.1 41.3 ± 10.3 .001 Triglicéridos (mg/dL) 225.6 ± 189.7

152.4 ± 113.7

<.0001

Nota: los valores se presentan como promedios ± DE *Prueba U de Mann-Whitney Abreviaturas; IMC, Índice de masa corporal; HOLA, valoración del modelo de homeostasis (índice de resistencia a la insulina); LDL, colesterol de lopiproteínas de baja densidad; HDL, colesterol de proteínas de alta densidad; AST, aminotransferasa de aspartato; ALT, aminotransferasa de alanina.

Los sujetos positivos para esteatosis mostraron concentraciones más bajas de adiponectina y más altas de leptina que los controles (p < 0.0001 y p < 0.007, respectivamente) y tuvieron mayor IMC, perímetro de la cintura y porcentaje de grasa corporal que los controles (p < 0.0001). Ellos también tuvieron valores HOMA-IR más altos (p < 0.0001). Los individuos positivos para esteatosis mostraron un perfil de lípidos más aterógeno que los controles (colesterol total, CLDL y triglicéridos más altos y C-HDL más bajo; todos p < 0.001). Estos índices de la función hepática indican que los sujetos positivos para esteatosis presentaban un daño hepático mayor que los controles. El Cuadro 12 muestra las diferencias en las variables que definen el síndrome metabólico entre los sujetos positivos para esteatosis y los controles. Todos los criterios del síndrome metabólico, excepto el CHDL, fueron estadísticamente diferentes entre los dos grupos.

i. Cuadro 12. Diferencias en variables categóricas entre casos (esteatosis hepática) y controles

Variable Casos

(N=141) n %

Controles (N=109)

n % Valor p*

Género (varón)

111

78.7

69

63.3

.01

Cintura (>88 en mujeres;>102 en varones) 59 41.8 10 9.2 <.0001 Hipertensión (>130/85 mmHg) 49 34.8 17 15.6 .001 C-HDL (<40 en varones; <50 en mujeres) 107 75.9 75 68.8 .25 Triglicéridos (> 150) 89 64.0 40 37.0 <.0001 Glucosa (> 110) 20 14.2 3 2.8 .002 Síndrome metabólico 62 44.0 10 9.2 <.0001 HOMA-IR (> 2.5)

32 33.3 4 4.2 <.0001

*Prueba exacta de Fisher

La prevalencia del síndrome metabólico fue de 44% en los sujetos positivos para esteatosis y de 9.2% en los controles (p < 0.0001). Entre los sujetos positivos para esteatosis, la proporción más alta fue de varones comparada con los controles (p

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= 0.01). Cuando la distribución de los valores séricos de adiponectina y leptina se expresó en cuartiles, se comprobó un gradiente con significancia estadística que exhibió una reducción de los valores de adiponectina y un incremento de los de leptina en los sujetos positivos para esteatosis y un patrón inverso en los controles (Cuadro 13).

i. Cuadro 13. Distribución de adiponectina y leptina por cuartiles entre casos y controles

Variable Casos

(N=141) n %

Controles (N=109)

n % Valor p*

Adiponectina † <.0001 Q1 45 33.3 14 14.0 Q2 37 27.4 22 22.0 Q3 29 21.5 30 30.0 Q4 24 17.8 34 34.0 Leptina .05 Q1 20 20.2 29 29.6 Q2 24 24.2 26 26.5 Q3 25 25.3 24 24.5 Q4 30 30.3 19 19.4

*x² - para tendencia lineal † Quince valores perdidos Cincuenta y tres calores perdidos

Para probar la eficacia de adiponectina y del síndrome metabólico para predecir la probabilidad de tener esteatosis se examinaron diferentes modelos multivariados por análisis de regresión logística. El Cuadro 14 muestra un modelo que ilustra el efecto protector de adiponectina (expresado como cuartiles) y el efecto riesgoso del síndrome metabólico (expresado de acuerdo con el número de criterios usados) cuando dichas variables son corregidas por covariables (edad, IMC y género).

i. Cuadro 14. Modelo multivariado por análisis de regresión logística para estimar la probabilidad de tener esteatosis hepática

Variable Razón de

momios IC 95 % Valor p

Adiponectina (cuartil µg/mL) Q1 1 Q2 0.31 0.12-0.83 .02 Q3 0.35 0.13-0.93 .04 Q4 0.26 0.08-0.82 .02 Síndrome metabólico (número de criterios) 0 1 1 3.7 1.0-13.4 .05 2 2.1 0.6-7.2 .27 3 7.1 1.6-31.4 .01

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4+ 16.1 1.5-176.6 .02 Edad (a) 1.05 1.02-1.08 .004 IMC (kg/m2) 1.45 1.26-1.66 <.0001 Género (varones contra mujeres) 1.0 0.40-2.47 .99

iii. Tercer estudio Se incluyó un total de 21 sujetos, 16 mujeres y 5 varones; la media de edad fue 35 ± 12 años. La intervención quirúrgica realizada fue colecistectomía en 21 casos y funduplicatura y derivación gástrica en un caso cada una. Los diagnósticos histopatológicos fueron: hígado normal, tres casos; esteatosis hepática, 14 casos, y esteatohepatitis no alcohólica, cuatro casos. Sólo dos pacientes con esteatosis grado 1 presentaron elevación de ALT (51 y 62 UI/L, respectivamente) y un paciente con esteatosis grado 2 mostró hipoalbuminemia (3 g/dL); el resto de pacientes no presentó alteraciones en las pruebas de función hepática. Todos los casos de esteatohepatitis no alcohólica correspondieron a grado I de la clasificación de Brunt. Se estudiaron las variables antropométricas, bioquímicas y metabólicas de acuerdo con la siguiente distribución: grupo 1, hígado normal; grupo 2, esteatosis y grupo 3, esteatohepatitis no alcohólica.

El Cuadro 15 muestra el promedio y desviación estándar de las variables estudiadas. El grupo de pacientes con esteatosis y esteatohepatitis presentó significativamente mayor índice de HOMA-IR (1.85 ± 1.3 y 2.6 ± 1.7, respectivamente, contra 0.53 ± 0.15; p < 0.05), así como mayores valores séricos de triglicéridos (147.4 ± 130.2 mg/dL y 202.2 ± 92.7 mg/dL, respectivamente, contra 81 ± 8.1 mg/dL; p < 0.05) en relación con los controles; sin embargo, no se encontraron diferencias significativas en el IMC y la relación cintura-cadera. Se observó una tendencia no significativa a presentar mayores niveles de PCR ultrasensible en las pacientes con HGNA (p = 0.08). Los pacientes con EHNA mostraron mayores concentraciones relativas de mRNA de adiponectina en comparación con los controles, pero no hubo diferencias entre los pacientes con esteatosis y los controles o entre los grupos con HGNA. Se obtuvo una tendencia no significativa a presentar valores mayores de mRNA de preprogrelina en los pacientes con HGNA (controles 0.89 ± 0.94, esteatosis 1.41 ± 1.42 y esteatohepatitis 1.84 ± 0.59) (Cuadro 16). iv. Cuadro 15. Características basales de la población comparando controles normales,

esteatosis y esteatohepatitis Variable Control

(N = 3) Esteatosis (N = 14)

Esteatohepatitis (N = 4)

Sexo (% femenino) 100% 71.4% 25% Edad (años) 35 ± 3.6 37.4 ± 14 30.2 ± 4.5 IMC (kg/m2) 24.7 ± 3.7 33.4 ± 13.6 27.9 ± 3.6 Relación cintura-cadera

0.86 ± 0.07 0.86 ± 0.09 0.77 ± 0.05

Presión sistólica 105 ± 5 113.6 ± 8.4 112.5 ± 5

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(mmHg) Presión diastólica (mmHg)

69 ± 10.1 75 ± 8 82.5 ± 5

HOMA-IR 0.53 ± 0.15 1.85 ± 1.3 † 2.6 ± 1.7† Triglicéridos (mg/dL) 81 ± 8.1 147.4 ± 130.2† 202.2 ± 92.7† Colesterol (mg/dL) 162.6 ± 32 182.8 ± 38.8 174 ± 18.8 HDL (mg/dL) 41.9 ± 7.1 37.7 ± 7.7 36.3 ± 2.9 LDL (mg/dL) 104.6 ± 23.8 116.2 ± 23.8 97.2 ± 14.3 PCR (UI/L) 1.4 ± 1.2 4.4 ± 4.4 2.6 ± 1.3 † p < 0.05 en relación con controles

i. Cuadro 16. Cuantificación relativa de los valores de mRNA de adiponectina y preprogrelina en controles, esteatosis y esteatohepatitis

Relación Gen/β-actina

Control (N = 3)

Esteatosis (N = 14)

Esteatohepatitis (N = 4)

Adiponectina 8.69 x 10-12 ± 1.4 x 10-11 6.99 x 10-9 ± 2.49 x 10-8 6.1 x 10-10 ± 7.53 x 10-10 † Preprogrelina 0.89 ± 0.94 1.41 ± 1.42 1.84 ± 0.59

† p < 0.05 en relación con controles

XII. ANALISIS i. Primer estudio

En este estudio se exploró el papel de las concentraciones séricas de adiponectina y leptina en sujetos con y sin EH. Se observaron grandes diferencias en el IMC y la obesidad abdominal (relación cintura/cadera de 0.92 contra 0.85). Se constataron datos similares respecto de la sensibilidad a la insulina (HOMA-IR 2.5 contra 1.2), una característica común en los sujetos con HGNA.153 De manera adicional se encontró que los altos valores plasmáticos de leptina se relacionaban con EH. Sin embargo, el principal hallazgo de este estudio fue que los valores altos de adiponectina se asociaban a un efecto protector contra la EH. ¿Cómo se explican estos resultados? Primero, se sugiere que las concentraciones de adiponectina están reguladas sobre todo por la composición corporal y que las concentraciones plasmáticas de esta adipocina presentan una correlación inversa con el porcentaje de grasa corporal y la masa de grasa corporal.154 La caída en la concentración de adiponectina, la hipoadiponectinemia, se ha implicado en el desarrollo de RI,155 hiperlipidemia,156 y de varias enfermedades que se relacionan con el aumento de RI. Como el desarrollo de RI y la hiperlipidemia causan acumulación de grasa en el hígado, 153,157 se supone que la hipoadiponectinemia esté relacionada con el desarrollo de hígado graso.

Segundo, se ha informado que adiponectina suprime el ingreso de ácidos grasos al hígado, 158 realza las acciones hepáticas de la insulina, 159 estimula el receptor alfa activado por el proliferador del peroxisoma160 e incrementa la oxidación de ácidos grasos.161 Por medio de estos mecanismos, la hipoadiponectinemia puede condicionar el mayor ingreso de ácidos grasos al

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hígado y reducir su metabolismo, lo cual conduce a la progresión del hígado graso. Además, se sabe que adiponectina previene la progresión del hígado graso a partir de datos provenientes de modelos animales. 162

Tercero, un estudio reciente mostró que en sujetos con EHNA se verifica hipoadiponectinemia y activación del sistema del factor de necrosis tumoral alfa cuando se compararon con controles seleccionados por edad, IMC y género. Además, los valores de adiponectina fueron más bajos en los individuos con EHNA. De manera adicional, Hui et al.163 encontraron que las concentraciones bajas de adiponectina siempre se asociaron con grados altos de EH. En el estudio presente, se encontraron resultados similares, esto es, se determinaron concentraciones bajas de adiponectina en sujetos con EH grados 2 y 3 (Figura 5).

Otro hallazgo interesante que se hizo evidente en este estudio fue el de la relación entre la actividad de las aminotransferasas séricas y los grados de EH cuando se compararon con los de los sujetos sin EH. Aunque la actividad de las aminotransferasas séricas se ha propuesto como marcador de enfermedad hepática, la misma no goza de aceptación universal. Como otro dato de sumo interés, Ruhl y Everhart164 intentaron ampliar la comprensión de la enfermedad hepática en la población de Estados Unidos y para ello presentaron un análisis de datos procedentes del Third National Health and Nutrition xamination Survey (NHANES III). Con el recurso de dichos datos, examinaron la prevalencia de una aminotransferasa de alanina (ALT) anormal, que fue definida como una ALT > 43 U/L para varones o mujeres. Después de eliminar a individuos con consumo de alcohol moderado a alto, hepatitis B o C, saturación de transferrina elevada o antecedentes de diabetes mellitus, los autores usaron una ALT elevada como un HGNA. Después de estas exclusiones, ellos encontraron que 2.8% de la población tenía una ALT elevada. Una ALT alta se asocia con la población más joven, de género masculino, en mexicoestadounidenses, metabolismo de la glucosa afectado y RI, obesidad y medidas de adiposidad central, así como concentraciones más altas de leptina, triglicéridos y péptido C. En análisis multivariados, la adiposidad central, insulina y concentraciones de leptina fueron los factores vinculados más frecuentes. Se concluyó que estos factores son los principales determinantes de la asociación entre concentraciones elevadas de ALT y peso corporal alto. De manera adicional, Yokohama et al.,165 en un estudio reciente llevado a cabo en 791 varones trabajadores japoneses, encontraron que las concentraciones de adiponectina en sujetos con actividad de transaminasas aumentada son significativamente más bajas que en aquéllos que muestran actividad de la enzima normal, lo cual implica que la hipoadiponectinemia contribuye a incrementar la actividad de las transaminasas. Los análisis de regresión simple sirvieron para dar apoyo al hallazgo. De manera conjunta, estos resultados parecen sugerir que la hipoadiponectinemia puede resultar en la acumulación de grasa en el hígado, con el desarrollo de hígado graso causante de una actividad promedio incrementada de las transaminasas mientras conduce a un estado de RI al atenuar estos eventos.

Considerando la gran cantidad de grasa que forma parte de la composición corporal de los sujetos con EH, altas concentraciones de leptina estuvieron

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asociadas a estos pacientes, en especial aquéllos con esteatosis severa (Cuadro 8 y Figura 6).

i. Figura 6. Concentraciones de leptina sérica de acuerdo con la gravedad de la HS.

Un aumento en la concentración de leptina sugiere que la obesidad es el

resultado de la resistencia a la leptina, quizá un efecto ambiental.166 En este estudio, las diferencias en las variables de la dieta fueron evidentes, con alto consumo de calorías, carbohidratos totales y grasas totales (Cuadro 7); no obstante, es inconveniente ser categórico, si se considera que la resistencia a la leptina puede ser producto de un complejo juego de diversos factores.166,167 Los sujetos con EH (en particular con los grados II y III) presentan altas concentraciones de leptina (Figura 6). Este resultado es similar al de otros reportes, 168 pero no se encuentra en todas las series. Hui et al.163 encontraron este patrón sólo en varones, pero otros informes no están de acuerdo con estos hallazgos.169 Juntas, estas opiniones indican que la

13

12

11

10

9

0

12.89

12.15

913

ANOVA p = 0.005

Controles EH EH grado 1 grado 2-3

P r o m e d I o d e l e p t i n a (µg/mL)

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concentración de leptina se relaciona con la ganancia de peso y la RI, pero su papel en el HGNA dista de comprenderse bien. Para finalizar, cuando se analizan las dietas de los sujetos, los que padecen EH informan un patrón con un promedio calórico, grasa total y consumo de hierro mayor que el de los controles. Llama la atención que los modelos animal y humano sugieren que los factores dietéticos pueden afectar en forma directa la infiltración grasa del hígado y causar daño oxidativo en diferentes tipos de hepatopatías, como el hígado graso alcohólico.170 Un estudio reciente de Musso y colaboradores171 hizo evidente que los hábitos dietéticos pueden favorecer la esteatohepatitis de manera directa al modular la acumulación hepática de triglicéridos y la actividad antioxidante, y también de manera indirecta al afectar la sensibilidad a la insulina y el metabolismo posprandial de triglicéridos. Si se toman en forma conjunta estas observaciones, es posible postular que el uso de intervenciones alimentarias específicas puede prevenir la EH. En conclusión, los resultados de este estudio sugieren que los valores altos de adiponectina se acompañan de un efecto protector contra la EH.

ii. Segundo estudio Los resultados obtenidos indicaron que las concentraciones plasmáticas de adiponectina y leptina así como el síndrome metabólico son útiles como marcadores predictivos de esteatosis hepática severa. Estos hallazgos permiten a los autores considerar que, cuando se vincula con el síndrome metabólico, la esteatosis hepática relacionada con la obesidad es una forma de esteatosis más seria que debe distinguirse del hígado graso benigno. En los individuos obesos, el síndrome metabólico que vincula a la diabetes mellitus tipo 2, dislipidemia e hipertensión con un patrón de distribución del tejido adiposo visceral o masculino es un factor de riesgo más importante para muchas comorbilidades de la obesidad que la obesidad en sí.172

¿Cuál es el papel de las adipocitocinas en esta forma tan seria de esteatosis? Estudios recientes han demostrado que las adipocitocinas y su desregulación en la obesidad abdominal o visceral pueden participar en el desarrollo del síndrome metabólico.173-175 La adiponectina presenta una actividad sensibilizante de la insulina periférica y hepática.176 La concentración plasmática de adiponectina alta es un factor de riesgo negativo para la diabetes tipo 2 entre la población proclive a padecer diabetes177-179 y guarda una relación más cercana con la sensibilidad a la insulina y la insulinemia en ayunas que con la adiposidad y la glucemia.180 Si se toma en cuenta que la resistencia a la insulina es el elemento patogénico más importante tanto en el síndrome metabólico como en la esteatosis hepática asociada a la obesidad, estos datos clínicos y experimentales sugieren que adiponectina puede desempeñar un papel significativo en el desarrollo del síndrome metabólico. La resistencia a la insulina causa alteraciones en el almacenamiento de lípidos y en la lipólisis en los tejidos sensibles a la insulina, lo cual puede condicionar un flujo de ácidos grasos mayor desde el tejido adiposo hacia el hígado con producción de esteatosis.181

En humanos, las concentraciones de leptina y adiponectina circulantes muestran una alta correlación con los indicadores de obesidad. Así, mientras la leptina sérica correlaciona de manera positiva182 con el porcentaje de grasa corporal, la adiponectina sérica muestra una correlación negativa.180 Existe la

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creencia de que leptina daña el señalamiento de insulina y condiciona resistencia a la insulina. Sin embargo, en pacientes lipoatróficos hipoleptinémicos la restitución de leptina mejora la tolerancia a la glucosa y reduce las concentraciones de insulina sérica.183,184 Ello sugiere con toda claridad que leptina puede encerrar propiedades sensibilizantes de la insulina. En este estudio se observaron concentraciones de leptina altas en los sujetos positivos para esteatosis y la prevalencia de EH entre pacientes que cayeron dentro del cuarto cuartil para las concentraciones de leptina fue las más alta de todas las muestras examinadas (30.3% contra 19.4% para los controles; p = 0.05). Este hallazgo concuerda con el hecho de que la expresión y secreción de leptina reflejan la masa grasa corporal185 y mantienen una correlación alta con el tamaño del adipocito.186 Los papeles de la leptina en la EH relacionada con la obesidad son diversos. Algunas evidencias indican que la concentración de leptina es un marcador de fibrosis, pero la leptina también es comúnmente considerada el candidato más importante en el proceso patogénico del “segundo golpe”, sobre todo a raíz de la hepatotoxicidad y mortalidad incrementadas después de administrar endotoxinas.187, 188 No obstante, de acuerdo con un estudio reciente que realizaron Angulo et al., 189 el papel de la leptina en la fibrosis hepática asociada al HGNA es poco claro. Estos investigadores no pudieron constatar una relación entre la gravedad de la fibrosis y las concentraciones de leptina y asumieron que la respuesta de leptina se relaciona con estímulos como la edad, género y cantidades de grasa e hiperinsulinemia, aunque ello no esté de acuerdo con los datos provenientes de los estudios de investigación in vitro y básicos.190

Las concentraciones de adiponectina fueron más bajas en sujetos con esteatosis hepática (15.2 ± 8.4 µg/mL contra 20.6 ± 10.7 µg/mL; p < 0.0001), y una concentración aumentada de adiponectina (cuarto cuartil) se acompañó de una prevalencia menor de esteatosis hepática (34% contra 14%; p < 0.001). Este efecto protector también fue evidente en el modelo multivariado (OR = 0.26, IC 95% = 0.08-082; p = 0.02). Se encontró que aquéllos con las concentraciones de adiponectina sérica más altas tenían 5.8 veces menos probabilidades de esteatosis y se consideró que adiponectina ejerce un efecto independiente importante en el proceso patogénico del HGNA.

En este estudio, la prevalencia del síndrome metabólico fue de 44% en los sujetos positivos para esteatosis y de 9.2% en los controles (p < 0.0001), mientras que la resistencia a la insulina se detectó en 33.3% de los sujetos positivos para esteatosis y en 4.2% de los controles (p < 0.0001). Además, en Estados Unidos la prevalencia del síndrome metabólico varía de acuerdo con el criterio diagnóstico seleccionado. En general, la prevalencia es de 23.7%, aunque varía en forma muy amplia entre las poblaciones,191 hasta alcanzar el 58.3% entre las mujeres mexicoestadounidenses con edades comprendidas entre los 40 y 74 años.192 En fecha reciente, la prevalencia del síndrome metabólico en la población mexicana se estimó en 26.6% de acuerdo con los criterios NCEP-III.193

Marchesini et al.194 valoraron la prevalencia del síndrome metabólico en 304 pacientes con HGNA consecutivos sin diabetes evidente sobre la base de tres o más criterios sin contar los cinco que definen los U.S. National Institutes of Health (perímetro de la cintura, glucosa, C-HDL, triglicéridos y presión arterial). Ellos encontraron que la prevalencia del síndrome metabólico se incrementó con el

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aumento del IMC de 18% en los sujetos de peso normal a 67% en los obesos. El análisis de regresión logística confirmó que la presencia del síndrome metabólico implicaba un riesgo alto de EHNA entre sujetos con HGNA (OR = 3.2, IC 95% = 1.2-8.9; p < 0.026) después de corregir para género, edad y masa corporal. En particular, el síndrome metabólico se asoció con un riesgo alto de fibrosis grave (OR = 3.5, IC 95% = 1.1-11.2; p < 0.032).

Parece que la presencia de EH ejerce un efecto negativo sobre la salud total del individuo. Esto puede ser de particular importancia dado que muchos hepatólogos creen que un hígado graso aislado es un hallazgo si consecuencias. Esta información también es relevante para aquellos grupos con una alta prevalencia de HGNA, como los de la población hispánica de Estados Unidos, entre quienes la prevalencia (45%) es casi del doble que entre la población negra.195 La identificación correcta de sujetos con el síndrome metabólico resulta crítica en estos grupos. Estas sugerencias se apoyan en datos recientes procedentes de un estudio llevado a cabo en 30 pacientes bien caracterizados con EHNA, que se sometieron a una prueba terapéutica con el agente sensibilizante de la insulina rosiglitazona. Dicho estudio mostró correlaciones entre los datos histológicos y las valoraciones por imágenes de la esteatosis, una buena variedad de pruebas de laboratorio, y pruebas específicas para la valoración de la glucemia y de la resistencia a la insulina.196

En conclusión, adiponectina, leptina y el síndrome metabólico son de utilidad para predecir la gravedad de la esteatosis de la obesidad. Aunque estas observaciones no permiten dilucidar el mecanismo(s) que subyace a la asociación entre adipocitocinas, síndrome metabólico y EH, la existencia de una vía común es probable.

iii. Tercer estudio El HGNA es una enfermedad crónico-degenerativa con alta prevalencia en México, que se presenta en 30% de la población general y en 60 a 90% de la población obesa.197 La persistencia de sus factores patogénicos induce progresión de la enfermedad en 20% de los pacientes a EHNA, con un riesgo de 3% a 20 años de desarrollar cirrosis.198 Además, la enfermedad presenta un impacto negativo en la función y sobrevida del hígado después del trasplante, lo que ha llevado a considerar a las formas severas de la enfermedad como una contraindicación para el trasplante.199

Hasta ahora, el único tratamiento que ha demostrado beneficio en pacientes con esteatohepatitis no alcohólica es la modificación del estilo de vida y el tratamiento específico de los trastornos asociados.200 La inducción e inhibición genética hepatocelular de genes participantes en el metabolismo de ácidos grasos es un potencial blanco terapéutico para reducir el contenido hepático de triglicéridos y la actividad necroinflamatoria de la enfermedad.

En estados de resistencia a la insulina, se presentan valores altos de mRNA de TNF-αen tejido adiposo y concentraciones séricas elevadas de IL-6.201 La IL-6 es una citocina que participa en la regeneración hepatocelular y en mejorar la sensibilidad a la insulina al activar a las proteínas supresoras de la señalización de citocinas (SOCS, por sus siglas en inglés).202,203 En el contexto experimental, se ha demostrado que IL-6 reduce el grado de esteatosis y la intensidad de la lesión por isquemia-reperfusión en el injerto de hígado graso no alcohólico en ratas.204 El

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hígado humano no produce adiponectina en circunstancias normales; sin embargo, la estimulación in vitro con IL-6 induce la expresión de mRNA de adiponectina en células humanas de hepatocarcinoma HepG2.205

En un estudio previo, los autores demostraronque los pacientes con esteatosis hepática presentan hipoadiponectinemia.206 En el presente estudio, proponen que en respuesta a la estimulación por IL-6 y otros factores, los hepatocitos son capaces de producir adiponectina, como una posible respuesta compensatoria a la hipoadiponectinemia. En el grupo de pacientes con EHNA estudiado, la concentración relativa de mRNA de adiponectina aumentó casi 1,000 veces en relación con los pacientes con hígado sano; no obstante, las concentraciones circulantes permanecieron en valores relativamente bajos. La inducción exógena de adiponectina en los hepatocitos podría representar una oportunidad terapéutica viable para reducir la concentración hepática de triglicéridos y la actividad necroinflamatoria en pacientes con esteatohepatitis no alcohólica mediante su antagonismo con el TNF- α y su efecto directo sobre el metabolismo de ácidos grasos y la sensibilidad hepática a la insulina.

La grelina es una hormona multifuncional que acaba de integrarse a la investigación del metabolismo de lípidos hepático. Los pacientes con hígado graso no alcohólico cursan con hipogrelinemia.207 Se ha demostrado que el hígado humano puede producir grelina en condiciones normales.208 En el presente estudio, se estudió la expresión hepática de preprogrelina en sujetos con hígado normal y en pacientes con HGNA para investigar la posibilidad de sobreexpresión local de grelina, la cual podría contribuir a la perpetuación del depósito hepático de triglicéridos mediante la inducción de enzimas lipogénicas. Aunque no resultó estadísticamente significativa, se constató una tendencia a presentar valores mayores de mRNA de preprogrelina de acuerdo con el estadio de la enfermedad comparado con los controles.

Este estudio emplea técnicas de biología molecular en tejido hepático humano en el que se extrapolan los resultados de estudios experimentales y clínicos para ayudar a esclarecer la patogénesis del hígado graso y en particular de la EHNA. Tal vez no resulte posible demostrar diferencias en las tendencias encontradas por el número de pacientes en cada grupo, en especial en el grupo control, lo que implica la comisión de un error tipo II; empero, la obtención de tejido hepático humano normal es difícil de justificar desde la perspectiva ética.

En conclusión, este estudio demuestra que el hígado humano puede producir adiponectina in vivo en circunstancias patológicas como el hígado graso no alcohólico y sugiere que la producción hepática de grelina podría jugar un papel en la perpetuación del depósito hepático de triglicéridos en la esteatosis hepática.

XIII. CONCLUSIONES Los resultados de este trabajo sugieren que los valores altos de adiponectina se acompañan de un efecto protector contra la EH. La adiponectina, leptina y el síndrome metabólico son de utilidad para predecir la gravedad de la esteatosis que acompaña a la obesidad. Aunque estas observaciones no permiten dilucidar el mecanismo(s) que subyace a la asociación entre adipocitocinas, síndrome metabólico y EH, la existencia de una vía común es probable y el hígado humano puede producir adiponectina in vivo en circunstancias patológicas como el HGNA,

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lo cual sugiere que la producción hepática de grelina podría jugar un papel en la perpetuación del depósito hepático de triglicéridos característico de la EH.

XIV. RECOMENDACIONES i. Terapéuticas potenciales con la adiponectina

No existen reportes donde se informe la existencia de alguna forma de agonista AdipoR sintético, pero se dispone de numerosos estudios interesantes en los que se destaca que algunas opciones farmacológicas ejercen fectos favorables en el estado de la adiponectinemia y, por lo tanto, podrían ser benéficas en el tratamiento del hígado graso no alcohólico.

Reconocido el hecho de que adiponectina es un gen con objetivo PPAR-γ, se evaluó el efecto que ejercen las tiazolidinedionas en los valores de adiponectina. En un pequeño estudio comparativo, doble ciego, controlado con placebo y con grupo paralelo de rosiglitazona y terapia concurrente con sulfonilurea, Yang et al.208 mostraron un aumento del doble en los valores séricos de adiponectina en los pacientes con diabetes tipo 2 tratados con esta combinación por seis meses. El análisis de regresión lineal multivariado mostró que si se usaba la rosiglitazona era la variable simple significativamente relacionada con los cambios plasmáticos de adiponectina. El monto de variación de los cambios en los valores plasmáticos de adiponectina debidos al tratamiento fueron de alrededor de 24%. Los resultados de este estudio incrementan la comprensión de los efectos benéficos de la activación exógena de PPAR-γ en los pacientes con diabetes tipo 2 y hacen crecer la posibilidad de una terapia orientada en adiponectina contra la resistencia a la insulina y el hígado graso no alcohólico. El sistema endocanabinoide representa una nueva vía para entender la fisiopatología de la obesidad. Más allá de su potencial beneficio terapéutico a través de la modulación que ejerce en la conducta frente a la alimentación, lipólisis, síntesis de ácidos grasos y actividad antifibrógena,209 el antagonista CB1 sintético rimonabanto ha mostrado que incrementa la expresión del mRNA de adiponectina en el tejido adiposo in vitro.210 Lo anterior ha sido confirmado por el estudio de reciente publicación RIO-Lipids,211 un estudio extenso controlado por placebo, aleatorizado, multicéntrico en el que se comparan la terapia doble ciego con placebo o rimonabanto a una dosis de 5 o 20 mg diarios por 12 meses, en adición a una dieta hipocalórica en pacientes con sobrepeso u obesos con dislipidemia. Los resultados del estudio mostraron que una dosis de 20 mg de rimonabanto causó un incremento de 46.2% en los valores plasmáticos de adiponectina, que resultó parcialmente independiente de sólo la pérdida de peso.

XV. SUGERENCIAS PARA TRABAJO FUTURO En el momento actual el HGNA es reconocido como condición patológica frecuente en nuestra población y con el incremento en la prevalencia de obesidad (definida a través del IMC) durante las últimas décadas, se espera que cada día se incremente el número de individuos referidos para su evaluación por presentar alteraciones en las pruebas de funcionamiento hepático e HGNA. Por lo anterior,

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se ha sugerido que la presencia de esteatosis podría utlizarse como marcador de syndrome metabólico. De este grupo de pacientes, un porcentaje estará en riesgo de desarrollar cirrosis critogénica y de acuerdo obsrvaciones previas, los sujetos con HGNA tienen un riesgo mayor de morir por complicaciones cardiovasculares. Por lo anterior, será importante el diagnóstico oportuno de estos sujetos. Preferentemente con estudios no invasivos que subtituyan a la biopsia hepática. Asimismo, sera importante estudiar el papel que juega el consumo de alcohol en este grupo de pacientes, haciendo una historial clínica detallada con el objeto de diferenciar la esteatosis inducida por el alcohol de aquella de origen no alcohólico. En este sentido será muy importante para el patologo el utilizar una adecuada terminología para las alteraciones histológicoas observadas en la esteatohepatitis no alcohólica.Finalmente, el tratamiento de estos pacientes es otra área muy impotante de investigación. Particularmente nuestro grupo de investigación está interesado en el desarrollo de un fármaco que incremente o estimule la producción de adiponectina.Que sin duda alguna será de gran importancia para prevenir otras comorbilidades y la mortalidad de este grupo de pacientes.

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SIGLARIO ABCA1: casete transportador A1 unido a ATP ALT: aminotransferasa de alanina AST: aminotransferasa de aspartato EH: esteatosis hepática EHNA: esteatohepatitis no alcohólica HDL: lipoproteínas de alta densidad HGNA: hígado graso no alcohólico HOMA-IR: Homeostasis Model Assessment, para valorar la resistencia a la

insulina IC: intervalo de confianza IFN-γ: interferón gamma IL-8: interleucina 8 IMC: índice de masa corporal LDL: lipoproteínas de baja densidad LXRα: factor de transcripción nuclear del receptor X alfa del hígado OR: razón de momios p38-MAPK: cinasa de proteína activada por el mitógeno p38 PCR: proteína C reactiva PMA: peso molecular alto –de la adiponectina- PMB: peso molecular bajo -de la adiponectina- PPAR-α: receptor alfa activado por el proliferador del peroxisoma RI: resistencia a la insulina RIA: radioinmunoanálisis Stat-3: transductor de señal y activador de la transcripción 3

M Uribe-Esquivel

TNF-α: factor de necrosis tumoral alfa